Summary
Esta técnica demuestra una forma eficiente de preparación defectuosa replicación retroviral acciones que codifica un oncogén humano, y, posteriormente, utilizado para la inducción de la enfermedad mieloproliferativa en el modelo de ratón.
Abstract
Nuestros estudios de laboratorio de las enfermedades mieloproliferativas humanos inducida por oncogenes como Bcr-Abl o receptor del factor de crecimiento derivado de oncogenes (ZNF198-FGFR1, Bcr-PDGFR, etc.) Somos capaces de modelar y estudiar una enfermedad parecida a la humana en nuestro modelo de ratón, mediante el trasplante de células de médula ósea previamente infectadas con un retrovirus que expresan el oncogén de interés. Replicación defectuosa retrovirus que codifica para un oncogén humano y un marcador (GFP, RFP, gen de resistencia a antibióticos, etc) es producido por un protocolo de transfección transitoria con células 293T, un ser humano línea de células epiteliales renales transformado por el producto del gen E1A de adenovirus. 293 células tienen la extraña propiedad de ser altamente transfectable por fosfato de calcio (Capo 4), con hasta un 50-80% la eficiencia de transfección puede lograrse fácilmente. En este sentido, co-transfectar 293 células con un vector retroviral que expresan el oncogén de interés y un plásmido que expresa las funciones de embalaje gag-pol-env, como por ejemplo el genoma de un solo embalaje construye kat o PCL, en este caso el Ecopak plásmido. La transfección inicial se mejora aún más mediante el uso de la cloroquina. Las existencias de virus ecotropic, recogidos como sobrenadante de cultivo de 48 horas. después de la transfección, se pueden almacenar a -80 ° C y se utiliza para la infección de líneas celulares a la vista de la transformación y en estudios in vitro, las células primarias o como las células de médula ósea de ratón, que luego pueden ser utilizados para el trasplante en nuestro modelo de ratón .
Protocol
- La noche antes de la transformación de células de placas, 293T en 3-5x10 6 células / 6 cultureplate tejido cm.
Nota: Usamos células 293T por su facilidad de transfección y virus productores de células efficacyas. Estas células son deficientes en el embalaje del virus a menos que un plásmido auxiliar que se introduce.
- La primera mañana, retire suavemente medio y reemplazar con 4 ml de células 293T medicina que contiene 25 mM cloroquina. Puesto en la incubadora durante 1 hora.
Nota: la placa debe ser alrededor del 80% confluente.
- Mientras tanto, prepare el virus de la toma de la mezcla de dos platos a la vez, en tubos de 5 ml:
- 2 x 10 mg de plásmido construir retrovirales
- 2 x 5 mg envase construcción (Ecopak),
- 2 x 62 ml de CaCl
- completa a 1 ml con agua estéril O ddH 2
Nota: Mientras que los retrovirales plásmido codifica el oncogén de interés y un marcador, Ecopak codifica gag-pol-env. Junto con las células 293T, se producirá un retrovirus ecotropic (RV) específicos para las células de ratón, pero no infectar a las células humanas. La cloroquina y CaCl2 se ha demostrado que aumentar la eficiencia de transfección.
- Añadir 1 ml de 2x sterileHBS sabio de abandono a la mezcla, mientras que suavemente el tubo de vórtice.
- Inmediatamente agregar esta solución al 2 platos, 1 ml cada una, suavemente, gota a gota.
- Puesto en la incubadora de 7 a 11 hrs.
- Por la noche (7 a 11 hrs. Después), retire suavemente medio, y con mucho cuidado reemplazar con 5 ml de medio fresco 293T. Puesto en la incubadora hasta el mediodía, al día siguiente.
Nota: este paso es importante, ya que necesita quitarse la cloroquina de las células. Si se mantiene durante largos periodos de tiempo, la cloroquina es tóxico. La solución de las placas se ve borrosa, debido a una muy fina, como la precipitación de polvo de la mezcla de transfección.
Nota: Es importante hacer todos los cambios en los medios de comunicación con extrema delicadeza, ya que las células han sido sensibilizados por la cloroquina, y fácilmente puede desprenderse de la placa.
- Al día siguiente, 18 a 24 hrs. antes de recuperar el virus (en torno al mediodía), retire suavemente medio, y con mucho cuidado reemplazar con 3 ml de medio fresco 293T. Vuelva a colocar en la incubadora O / N.
- La mañana del tercer día (18 a 24 hrs. Después), aspirar suavemente el medio desde los platos con una jeringa de 10 ml equipado con una aguja de 18 G. Este sobrenadante contiene los retrovirus.
- Cambie la aguja a un filtro de jeringa de 45 mm, invertir varias veces la jeringa para mezclar la solución, así, pasar el sobrenadante a través del filtro, y la alícuota en criotubos
Nota: Como alternativa, si usted está haciendo 3 platos + de virus, la piscina todos los sobrenadantes del mismo virus en un tubo de 5 0 ml cónico. Mezclar bien, entonces sobrenadantes alícuota que contenga el retrovirus en criotubos por el filtrado.
- Los tubos que contienen los sobrenadantes completo el virus se mantiene en -80 ° C hasta su uso.
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Discussion
Cuatro puntos críticos que aseguran el éxito de una acción viral buena:
- Las células 293T produce tiene que ser muy saludable, lo que significa que se han dividido en un horario muy regular, nunca fueron crecido, y se colocan en la densidad óptima de 3,5 a 5.000.000 por 6 cm de la placa de cultivo de tejidos, por lo que llegar a una densidad del 80% de la placa en la mañana de la transfección.
- Además de la cloroquina mejora la eficiencia de transfección y el título de virus posterior, alrededor de 3 - a 5 veces, mediante la estabilización de lisosomas celulares y el aumento de la fracción de ADN que llega al núcleo. Butirato sódico (otra lisosoma estabilizador) también se ha utilizado para este propósito. La cloroquina puede ser omitido, en cuyo caso el cambio del medio de 11.07 hrs. después de la transfección en este momento no es necesario.
- La calidad del ADN es muy importante. El método preferido para la purificación tanto del vector y ADN plásmido de embalaje es el doble purificado por CsCl-bromuro de etidio centrifugación densidad de flotación. Nos gusta la concentración del ADN de al menos 1 mg / ml, y el cociente de DO 260/280 debe ser de entre 1,75 a 1,90. Qiagen-ADN purificado también va a funcionar, aunque, en manos de los autores, los resultados no son tan buenos. Es importante que el volumen combinado de las soluciones de ADN de ser pequeños (<50 en total ul por ml final) para evitar los efectos adversos de Tris y EDTA (TE) en el precipitado de fosfato de calcio.
- La elección de la gama de vector retroviral y anfitrión de la construcción de envases son importantes. Para la expresión estable de células madre hematopoyéticas murinas, un vector basado en el virus del sarcoma de mieloproliferativas se prefiere. Un esqueleto del vector común es la RI MIG, que contiene una larga secuencia de repetición MPSV terminal, un sitio de clonación múltiple para la introducción de un oncogén, y aguas abajo del sitio interno de entrada de ribosomas relacionado con el gen de aumento de proteína verde fluorescente (EGFP). Para la transducción de ratón HSC, el virus con un rango de hospederos ecotropic es óptimo, pero estas poblaciones no son estables a temperatura fisiológica y no se puede concentrar por centrifugación.
Algunos de los puntos de facturación: Si lo desea, una vez recogidas, las células 293 puede ser usado para hacer lisados de proteínas para inmunotransferencia para comprobar la expresión de proteínas codificadas por el vector retroviral (por ejemplo, los conocimientos tradicionales). También utiliza un control de codificación LacZ plásmido en placa separada en el momento de la transfección (vector de embalaje no es necesario) para comprobar si efficinecy transfección mediante el ensayo de beta-gal el momento de recoger el sobrenadante de las placas de otros. Nota: esto pondrá a prueba las células y los reactivos, pero no la calidad de los plásmidos utilizados para la fabricación de virus.
Antes de utilizar cualquier virus, el título tiene que ser determinado. Esto es fundamental a fin de coincidir con los títulos de las reservas de virus diferentes en el mismo experimento, y para garantizar la transducción eficiente de las células madre hematopoyéticas.
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Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| 293T cells | cell-line | Split 1:3 to 1:4 every 3 days, otherwise they will tend to clump with replating and will not transfect as well. | ||
| 293T cell medium | DMEM/hi-glu + 10 % FBS + 1% Pen/Strep + 1% L-Glutamine (1% NEAA, optional). We obtain our tissue culture slutions from CellGro. | |||
| coding DNA plasmid | Twice purified by CsCl. MSCV backbone, encoding oncogene and marker of choice (Neo, GFP, etc.) | |||
| EcoPak | also called pMCV-Ecopac: ecotropic packaging plasmid, encoding gag-pol-env | |||
| 2x HBS | For 500 ml: 8.0 g NaCl+ 0.37 g KCl + 106.5 mg Na2HPO4 (anhydrous; 201.1 mg if 7xH2O) + 1.0 g dextrose (D-glucose) + 5.0 g HEPES powder. Dissolve in 450 ml dH2O (milli-Q), adjust pH to 7.05 with NaOH, then complete to 500 ml with dH2O. Sterile filter thru 0.45 μ filter. Store at room temperature, with the cap on tight. | |||
| 2M CaCl2 | Sigma-Aldrich | |||
| miliQ H2O | sterile-filtered | |||
| Chloroquine | 1000x stock is 25 mM in PBS- (w/o Ca2+/Mg2+), stored at -20C. Add fresh to the medium when needed. | |||
| 6 cm plates | for tissue culture | |||
| Incubator | for tissue culture. Set at 37C, 10% CO2. | |||
| 10 cc sterile syringes | Sterile. One per virus type. | |||
| 18G needles | single use, one per virus type. | |||
| 45 um syringe filters | ||||
| 5 ml plastic tubes | Sterile, to mix transfection solution, for up to 2 plates at a time (2 ml). We use Falcon tubes. | |||
| 50 ml conical tubes | ||||
| cryovials | 2 and 4 ml, for virus aliquots. | |||
All reagents used in the transfection must be sterile-filtered (CaCl2, 2x HBS, miliQ H2O) and kept sterile. |
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References
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