प्रतिकृति - दोषपूर्ण Retrovirus 293T कोशिकाओं के क्षणिक अभिकर्मक द्वारा उत्पादन
Summary
इस तकनीक प्रतिकृति – दोषपूर्ण रेट्रोवायरल एक मानव ओंकोजीन एन्कोडिंग शेयरों को तैयार करने के लिए एक कुशल तरीका दर्शाता है, और बाद में myeloproliferative रोग के माउस मॉडल में शामिल होने के लिए इस्तेमाल किया.
Abstract
हमारी प्रयोगशाला अध्ययन मानव myeloproliferative BCR-ABL या वृद्धि कारक रिसेप्टर व्युत्पन्न ओंकोजीन (ZNF198 FGFR1, BCR-PDGFRα, आदि) जैसे ओंकोजीन द्वारा प्रेरित रोगों. हम मॉडल और हमारे माउस मॉडल में मानव की तरह एक रोग का अध्ययन अस्थि मज्जा पहले ब्याज की ओंकोजीन व्यक्त retrovirus से संक्रमित कोशिकाओं की रोपाई कर रहे हैं. प्रतिकृति – दोषपूर्ण retrovirus एक मानव ओंकोजीन एन्कोडिंग और एक मार्कर (GFP, आरएफपी, एंटीबायोटिक प्रतिरोध जीन, आदि) एक क्षणिक अभिकर्मक 293T कोशिकाओं, एक मानव गुर्दे की उपकला कोशिका adenovirus E1A जीन उत्पाद से बदल लाइन का उपयोग प्रोटोकॉल द्वारा निर्मित है. 293 कोशिकाओं को अत्यधिक कैल्शियम फॉस्फेट (4 Capo) द्वारा transfectable किया जा रहा असामान्य संपत्ति है, 50-80% अभिकर्मक आसानी से प्राप्य दक्षता के साथ. यहाँ, हम एक रेट्रोवायरल वेक्टर ब्याज की ओंकोजीन और एक प्लाज्मिड कि ढकोसला नीति वातावरण पैकेजिंग काम करता है, जैसे जीनोम एकल पैकेजिंग इस मामले में कैट या PCL, constructs EcoPak प्लाज्मिड व्यक्त व्यक्त के साथ 293 कोशिकाओं transfect सह. प्रारंभिक अभिकर्मक आगे क्लोरोक्वीन के उपयोग द्वारा सुधार हुआ है. Ecotropic वायरस का स्टॉक, संस्कृति सतह पर तैरनेवाला 48 बजे के रूप में एकत्र. बाद अभिकर्मक -80 पर संग्रहीत किया जा सकता है ° C और परिवर्तन के दृश्य में और इन विट्रो अध्ययन में सेल लाइनों, या माउस अस्थि मज्जा की कोशिकाओं के रूप में प्राथमिक कोशिकाओं, कि तब हमारे माउस मॉडल में प्रत्यारोपण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है के संक्रमण के लिए इस्तेमाल किया .
Protocol
Discussion
चार महत्वपूर्ण बिंदुओं एक अच्छा वायरल शेयर की सफलता को आश्वस्त करेगा:
- 293T उत्पादन कोशिकाओं के लिए बहुत ही स्वस्थ हो सकता है, जिसका अर्थ है वे एक बहुत ही नियमित रूप से समय पर विभाजित किया गया है, ऊंचा हो गया ?…
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| 293T cells | cell-line | Split 1:3 to 1:4 every 3 days, otherwise they will tend to clump with replating and will not transfect as well. | ||
| 293T cell medium | DMEM/hi-glu + 10 % FBS + 1% Pen/Strep + 1% L-Glutamine (1% NEAA, optional). We obtain our tissue culture slutions from CellGro. | |||
| coding DNA plasmid | Twice purified by CsCl. MSCV backbone, encoding oncogene and marker of choice (Neo, GFP, etc.) | |||
| EcoPak | also called pMCV-Ecopac: ecotropic packaging plasmid, encoding gag-pol-env | |||
| 2x HBS | For 500 ml: 8.0 g NaCl + 0.37 g KCl + 106.5 mg Na2HPO4 (anhydrous; 201.1 mg if 7xH2O) + 1.0 g dextrose (D-glucose) + 5.0 g HEPES powder. Dissolve in 450 ml dH2O (milli-Q), adjust pH to 7.05 with NaOH, then complete to 500 ml with dH2O. Sterile filter thru 0.45 µ filter. Store at room temperature, with the cap on tight. | |||
| 2M CaCl2 | Sigma | |||
| miliQ H2O | sterile-filtered | |||
| Chloroquine | 1000x stock is 25 mM in PBS- (w/o Ca2+/Mg2+), stored at -20C. Add fresh to the medium when needed. | |||
| 6 cm plates | for tissue culture | |||
| Incubator | for tissue culture. Set at 37C, 10% CO2. | |||
| 10 cc sterile syringes | Sterile. One per virus type. | |||
| 18G needles | single use, one per virus type. | |||
| 45 um syringe filters | ||||
| 5 ml plastic tubes | Sterile, to mix transfection solution, for up to 2 plates at a time (2 ml). We use Falcon tubes. | |||
| 50 ml conical tubes | ||||
| cryovials | 2 and 4 ml, for virus aliquots. |
All reagents used in the transfection must be sterile-filtered (CaCl2, 2x HBS, miliQ H2O) and kept sterile.
References
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