Esta técnica demuestra una forma eficiente de preparación defectuosa replicación retroviral acciones que codifica un oncogén humano, y, posteriormente, utilizado para la inducción de la enfermedad mieloproliferativa en el modelo de ratón.
Nuestros estudios de laboratorio de las enfermedades mieloproliferativas humanos inducida por oncogenes como Bcr-Abl o receptor del factor de crecimiento derivado de oncogenes (ZNF198-FGFR1, Bcr-PDGFR, etc.) Somos capaces de modelar y estudiar una enfermedad parecida a la humana en nuestro modelo de ratón, mediante el trasplante de células de médula ósea previamente infectadas con un retrovirus que expresan el oncogén de interés. Replicación defectuosa retrovirus que codifica para un oncogén humano y un marcador (GFP, RFP, gen de resistencia a antibióticos, etc) es producido por un protocolo de transfección transitoria con células 293T, un ser humano línea de células epiteliales renales transformado por el producto del gen E1A de adenovirus. 293 células tienen la extraña propiedad de ser altamente transfectable por fosfato de calcio (Capo 4), con hasta un 50-80% la eficiencia de transfección puede lograrse fácilmente. En este sentido, co-transfectar 293 células con un vector retroviral que expresan el oncogén de interés y un plásmido que expresa las funciones de embalaje gag-pol-env, como por ejemplo el genoma de un solo embalaje construye kat o PCL, en este caso el Ecopak plásmido. La transfección inicial se mejora aún más mediante el uso de la cloroquina. Las existencias de virus ecotropic, recogidos como sobrenadante de cultivo de 48 horas. después de la transfección, se pueden almacenar a -80 ° C y se utiliza para la infección de líneas celulares a la vista de la transformación y en estudios in vitro, las células primarias o como las células de médula ósea de ratón, que luego pueden ser utilizados para el trasplante en nuestro modelo de ratón .
Cuatro puntos críticos que aseguran el éxito de una acción viral buena:
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
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293T cells | cell-line | Split 1:3 to 1:4 every 3 days, otherwise they will tend to clump with replating and will not transfect as well. | ||
293T cell medium | DMEM/hi-glu + 10 % FBS + 1% Pen/Strep + 1% L-Glutamine (1% NEAA, optional). We obtain our tissue culture slutions from CellGro. | |||
coding DNA plasmid | Twice purified by CsCl. MSCV backbone, encoding oncogene and marker of choice (Neo, GFP, etc.) | |||
EcoPak | also called pMCV-Ecopac: ecotropic packaging plasmid, encoding gag-pol-env | |||
2x HBS | For 500 ml: 8.0 g NaCl + 0.37 g KCl + 106.5 mg Na2HPO4 (anhydrous; 201.1 mg if 7xH2O) + 1.0 g dextrose (D-glucose) + 5.0 g HEPES powder. Dissolve in 450 ml dH2O (milli-Q), adjust pH to 7.05 with NaOH, then complete to 500 ml with dH2O. Sterile filter thru 0.45 µ filter. Store at room temperature, with the cap on tight. | |||
2M CaCl2 | Sigma | |||
miliQ H2O | sterile-filtered | |||
Chloroquine | 1000x stock is 25 mM in PBS- (w/o Ca2+/Mg2+), stored at -20C. Add fresh to the medium when needed. | |||
6 cm plates | for tissue culture | |||
Incubator | for tissue culture. Set at 37C, 10% CO2. | |||
10 cc sterile syringes | Sterile. One per virus type. | |||
18G needles | single use, one per virus type. | |||
45 um syringe filters | ||||
5 ml plastic tubes | Sterile, to mix transfection solution, for up to 2 plates at a time (2 ml). We use Falcon tubes. | |||
50 ml conical tubes | ||||
cryovials | 2 and 4 ml, for virus aliquots. |
All reagents used in the transfection must be sterile-filtered (CaCl2, 2x HBS, miliQ H2O) and kept sterile.