Abstract
في هذه المخطوطة، علينا أولا وصف بروتوكول تصنيع رقاقة ميكروفلويديك، مع نقاط الذهب والمناطق المغلفة فبرونيكتين على الركيزة الزجاج نفسها، التي تسيطر على وجه التحديد توليد فقاعات جنبا إلى جنب والخلايا الفردية نمط قريب مع مواقع محددة جيدا والأشكال. نحن ثم تثبت توليد فقاعات جنبا إلى جنب باستخدام اثنين من الليزر نابض إلقاء الضوء على زوج من النقاط الذهبية بزمن تأخير بضعة-ميكروثانية. نحن تصور التفاعل فقاعة فقاعة وتشكيل الطائرة من قبل التصوير فائق السرعة وتميز مجال تدفق الناتجة باستخدام السرعة بواسطة الصور الملتقطة للجسيمات (التعريف الشخصية). وأخيرا، فإننا نقدم بعض تطبيقات هذه التقنية لتحليل خلية واحدة، بما في ذلك خلايا الغشاء poration مع امتصاص جزيء، محلية تشوه غشاء يحددها النزوح من الخرز ملزم إنتغرين المرفقة، والاستجابة الكالسيوم داخل الخلايا من التصوير ratiometric. نتائجنا تظهر أن تدفق النفث السريع والاتجاه هو للمحترفينالتي تنتجها التفاعل جنبا إلى جنب فقاعة، والتي يمكن فرض إجهاد القص المترجمة للغاية على سطح خلية نمت على مقربة. وعلاوة على ذلك، bioeffects مختلفة يمكن أن يتسبب من خلال تغيير قوة تدفق النفث عن طريق ضبط المسافة المواجهة من الخلية إلى فقاعات جنبا إلى جنب.
Introduction
هناك اعتراف متزايد بأن عدم التجانس الخلوية، الناشئة عن التعبير العشوائية من الجينات والبروتينات، والأيض، يوجد ضمن مجموعة من السكان خلية كبيرة وبمثابة المبدأ الأساسي في علم الأحياء للسماح للتكيف الخلية وتطورها 1. لذلك، غالبا ما يكون غير دقيق ولا يمكن الاعتماد عليها لاستخدام القياسات معظم السكان على أساس لفهم وظيفة الخلايا الفردية وتفاعلاتها. تطوير تقنيات جديدة لتحليل خلية واحدة ولذلك من فائدة عالية في الأبحاث البيولوجية والدوائية، ويمكن استخدامها، على سبيل المثال، لفهم أفضل لمسارات الإشارات الرئيسية وعمليات بيولوجية الخلايا الجذعية وعلاج السرطان 2-4. في السنوات الأخيرة، وظهور منصات ميكروفلويديك سهلت كثيرا تحليل وحيدة الخلية، حيث أجريت لتحديد المواقع، والعلاج، ومراقبة الاستجابة من الخلايا الفردية مع استراتيجيات تحليلية جديدة 5.
يلعب التجويف دورا هاما في مجموعة متنوعة من التطبيقات الطبية الحيوية، بما في ذلك علاج السرطان من خلال كثافة عالية تركز الموجات فوق الصوتية (HIFU) 6، وتجزئة غير الغازية من حصى الكلى التي كتبها موجة صدمة تفتيت الحصوات (SWL) 7، المخدرات أو الجينات تسليم بواسطة صوتنة الخلايا 8، وتدمير ذكرت مؤخرا من الخلايا أو الأنسجة الهيدروديناميكية 9،10 فقاعة التجويف. على الرغم من هذا، والعمليات الديناميكية للفقاعة التجويف (ق) التفاعل مع الأنسجة البيولوجية والخلايا لم يتم فهمها جيدا. ويرجع ذلك إلى العشوائية في التجويف بدء وفقاعة ديناميات المنتجة بواسطة الموجات فوق الصوتية، وموجات الصدمة، والضغط الهيدروليكي المحلي هذا. علاوة على ذلك، هناك نقص تمكين التقنيات لحل استجابات معقدة بطبيعتها وسريعة من الخلايا البيولوجية، وخاصة على مستوى خلية واحدة.
وبسبب هذه التحديات، فإنه ليس من المستغرب أن دراسات قليلة جدا لها النحلذكرت ن للتحقيق في التفاعلات فقاعة خلية تحت ظروف تجريبية تسيطر عليها بشكل جيد. على سبيل المثال، غشاء poration من الخلايا الفردية محاصرين في تعليق 11 ولقد ثبت تشوه كبير من خلايا الدم الحمراء في الانسان 12 التسرع باستخدام الفقاعات واحدة ولدت ليزر في قنوات ميكروفلويديك. هذه التقنية الأخيرة، ومع ذلك، يمكن أن تنتج فقط تشوه صغير جدا في الخلايا حقيقية النواة بسبب وجود نواة 13. وعلاوة على ذلك، فإنه من الصعب رصد bioeffects المصب عند معالجة الخلايا في تعليق. في دراسات أخرى، تم الإبلاغ عن الموجات فوق الصوتية الإثارة من متجهة خلية microbubble (أو وكيل الموجات فوق الصوتية على النقيض) لإنتاج poration الغشاء و / أو ردود الكالسيوم داخل الخلايا في الخلايا الملتصقة واحدة 8. غشاء poration من الخلايا الملتصقة واحدة يمكن أيضا أن تنتج عن طريق استخدام فقاعات جنبا إلى جنب ولدت ليزر في طبقة السائل رقيقة تحتوي على امتصاص ضوء التريبان حل الأزرق 14، أوقبل فقاعة غاز تتأرجح الناتجة عن نبضات الليزر ميكروثانية اضاءة من خلال الركيزة استيعاب بصريا في microchambers 15. بالمقارنة، الركيزة استيعاب بصريا لديها ميزة على التريبان حل الزرقاء تمتص الليزر لأن هذه الأخيرة هي سامة على الخلايا. الأهم من ذلك، فقاعات ولدت ليزر هي أكثر يمكن السيطرة عليها من حيث حجم فقاعة، والمكان من فقاعات متحمس سمعيا. ومع ذلك، في كل هذه الدراسات السابقة، لم تسيطر على شكل الخلية، والتوجه، وشروط الانضمام التي قد تؤثر بشكل كبير على استجابة الخلايا وbioeffects التي تنتجها الضغوط الميكانيكية 16.
للتغلب على هذه العوائق في الدراسات السابقة، وقد وضعنا مؤخرا نظام تجريبي لتوليد فقاعة، الزخرفة الخلية، والتفاعلات فقاعة فقاعة خلايا، في الوقت الحقيقي واختبارات بيولوجية من استجابة الخلايا في شريحة ميكروفلويديك شيدت باستخدام مزيج فريد من ميتاليك التصنيع الدقيقiques. ثلاثة السمات الرئيسية التي تميز نظام تجريبي لدينا من الآخرين في هذا المجال هي: 1) الزخرفة من النقاط الذهب ميكرون الحجم على الركيزة الزجاج لتمكين امتصاص الليزر الموضعي لتوليد فقاعة 17؛ 2) الزخرفة من الجزر ميكرون الحجم من المصفوفة خارج الخلية (ECM) للالتصاق الخلية على الركيزة نفسه للسيطرة على كل من الموقع وهندسة الخلايا الفردية. و3) ضغط البعد عن مجال التفاعل فقاعة فقاعة خلية من 3D إلى الفضاء 2D شبه لتسهيل التصور في الطائرة من التفاعلات فقاعة فقاعة، النفث مجالات التدفق، تشوه الخلايا، وbioeffects، كل المأسورة في واحد تسلسل التصوير مبسط (1D الشكل).
الشكل 1: رقاقة ميكروفلويديك والخطط من فحوصات مختلفة. أ) رقاقة ميكروفلويديك تجميعها مع قنوات مليئة بالحبر الأزرق التصور. ب) المنطقة داخل رقاقة ميكروفلويديك مع خلايا المزخرفة والنقاط الذهب (المسافة بين النقاط ذهبيتين في القرب هو 40 ميكرون). العديد من الأزواج من وحدات العمل يمكن ترتيبها في القناة. ج) عن قرب صورة وحدة عمل واحدة تتكون من زوج من النقاط الذهبية وخلية هيلا انضمت إلى المنطقة خلية الزخرفة. د) تخطيطي لعملية الجهاز. خلية واحدة تلتزم وينتشر على "H" جزيرة على شكل المغلفة مع فبرونيكتين. ويتم إنتاج زوج من فقاعات التجويف (جنبا إلى جنب فقاعة) مع المضادة للمرحلة التذبذب التي كتبها إلقاء الضوء على أشعة الليزر نابض على النقاط الذهب (انظر الشكل 4A)، مما يؤدي إلى توليد طائرة سريعة والمحلية تتجه نحو الخلية المستهدفة في مكان قريب. قد تكون مشوهة الخلية، porated لامتصاص الجزيئات، و / أو حفز مع استجابة الكالسيوم، تبعا للمسافة المواجهة (S د) من الخلية إلى فقاعة جنبا إلى جنب.و = "http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55106/55106fig1large.jpg" الهدف = "_ فارغة"> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
هذا البرنامج يمكن زيادة جنبا إلى جنب مع فحوصات مضان والخرز functionalized تعلق على سطح الخلية لbioeffects الناجم عن التجويف. على وجه الخصوص، هذه المنصة تفتح الطريق لفحوصات موثوقة وقابلة للقياس على مستوى خلية واحدة. حتى الآن، وقد استخدمنا جهاز لتحليل الناجم عن فقاعة، جنبا إلى جنب تشوه غشاء الخلية، poration الخلية وامتصاص الخلايا، والسلامة، موت الخلايا المبرمج، والاستجابة الكالسيوم داخل الخلايا. في بروتوكول التالية، ونحن وصف عملية رقاقة تلفيق وإجراءات لتحليل مختلف bioeffects المذكورة أعلاه. وعلاوة على ذلك، تم وصفها أيضا عمليات رقاقة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. التصنيع الدقيق
يتم تنفيذ جميع إجراءات التصنيع الدقيق في غرف الأبحاث: ملاحظة. تم تصميم قناع الكروم قبل التصنيع الدقيق، انظر الشكل 2.
الشكل 2: رسم تخطيطي للتصميم القناة في رقاقة ميكروفلويديك وأبعاد وحدات العمل. أ) تصميم قناع و microchannels محاذاة PDMS (الخضراء) وأنماط على الركيزة الزجاج (الأزرق والأحمر). ب) صورة مكبرة لتصميم قناع في قسم التمثيل في صفوف وحدة العمل. ج) رسم تخطيطي لوحدة عمل واحد تبين وجود نمط الخلية (الأزرق) وزوج من النقاط الذهب (الحمراء). وترد جميع المقاييس طول على اليمين السفلي. الرجاء انقر هنا لعرض لارنسخة الالماني من هذا الرقم.
- الذهب نقطة الزخرفة
ملاحظة: تبلغ مساحة كل نقطة الذهب تم تصميمه ليكون ضمن 25-30 ميكرون 2، بحيث تكون كبيرة بما يكفي لاستيعاب طاقة الليزر لتوليد فقاعة، ولكن صغيرة بما يكفي لتجنب الخلايا الفردية التمسك بها. ويظهر رسم تخطيطي للذهب نقطة تلفيق في الشكل 3A.- شريحة زجاجية تنظيف (في غطاء الكيميائية)
- مسح شريحة زجاجية مع الأسيتون تليها ايزوبروبيل (IPA)، ثم جففه مع تدفق N 2.
- نقع الشريحة في حل سمكة البيرانا (H 2 SO 4: H 2 O 2 = 4: 1) لمدة 10 دقيقة.
- اخراج الشريحة، شطفه بالماء DI، ثم جففه مع تدفق N 2.
- خبز شريحة زجاجية على موقد في 120 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة.
- علاج الشريحة في آشر البلازما في 100 واط لمدة 90 ثانية.
- تدور طلاء (غطاء محرك السيارة تدور الطلاء)
- بدوره على موقد والانتظار حتى تكون درجة الحرارة مستقرة عند 95 درجة مئوية.
- اتبع الإجراء طلاء:
1000 دورة في الدقيقة لمدة 5 ق مع 500 دورة في الدقيقة / ق منحدر.
ثم 3000 دورة في الدقيقة لمدة 30 ثانية مع 1000 دورة في الدقيقة / ق المنحدر. - إصلاح شريحة زجاجية تنظيف على المغطي تدور عن طريق تطبيق فراغ.
- تغطية سطح الشريحة مع P-20 وبدء صفة طلاء.
- كرر العملية لطلاء مقاوم الضوء NFR سلبية.
- خبز الشرائح في درجة حرارة 95 درجة مئوية لمدة 60 ثانية وانتظر حتى يبرد إلى درجة حرارة الغرفة.
- الليثوغرافيا الضوئية
- جبل قناع الكروم على اليجنر قناع وتأكد من أن الجانب نمط لأسفل نحو الشريحة.
- تعيين صفة ضوئيه إلى وضع التعرض الثابت مع 9 الصورة من التعرض للأشعة فوق البنفسجية وبسرعة محاذاة الركيزة الزجاج مع القناع.
- بعد إجراء التعرض للأشعة فوق البنفسجية، خبز الشرائح في 956؛ مئوية لمدة 1 دقيقة، ثم اتركها تبرد في درجة حرارة الغرفة.
- تطوير
- تطوير نمط على الشريحة في حل المطور لمدة 60 ثانية.
- إزالة الشريحة من المطور، تدفق بالماء DI، وجففه مع تدفق N 2.
- تحقق هندسة نمط تحت المجهر، وقياس وتسجيل حجم الميزة.
- ترسب الذهب (شعاع E التبخر) ورفع حالا
- خبز الشرائح عند 120 درجة مئوية لمدة 5 دقائق، وندعه يبرد إلى درجة حرارة الغرفة.
- تنظيف الشريحة مع البلازما في الجهاز رد الفعل ايون النقش (ري) لمدة 90 ق ب 500 عربة و 100 W.
- إيداع 5 نانومتر من منظمة الشفافية الدولية و 15 نانومتر من الاتحاد الافريقي على الشريحة باستخدام المبخر شعاع E 17.
- نقع الشريحة بين عشية وضحاها في كوب زجاجي يحتوي مقاومة للضوء مزيل المذيبات لإزالة يستريح الذهب على رأس NFR مقاومة.
- استرداد الشريحة، أنا دافقر مع الأسيتون تليها IPA، وجففه مع تدفق N 2.
- تجف الشريحة على طبق ساخن عند 115 درجة مئوية قبل تنظيفه في آشر البلازما الأكسجين في 100 واط لمدة 90 ثانية.
- شريحة زجاجية تنظيف (في غطاء الكيميائية)
- الجزيئي التجمع الزخرفة من قبل انطلاقه (MAPL)
ملاحظة: يتم تعيين مساحة كل جزيرة المغلفة فبرونيكتين أن يكون في حدود 700-900 ميكرون 2 لتسهيل الخلية هيلا كافية تنتشر في منطقة مربعة مع التقليل من فرص عدة خلايا تجميع في الجزيرة. ويظهر رسم تخطيطي لإعداد الجزر خلية الزخرفة في الشكل 3B.- طلاء تدور
- كرر الخطوة 1.1.2، ولكن استخدام مقاومة للضوء S1813 إيجابية ودرجة حرارة 115 درجة مئوية.
- ضوئيه الانحياز
- جبل قناع الكروم على اليجنر قناع والتأكد من أن جنب مع نمط لأسفل نحو الشريحة معالنقاط الذهب.
- تعيين صفة ضوئيه إلى وضع التعرض الثابت مع 9 الصورة من التعرض للأشعة فوق البنفسجية.
- محاذاة قناع العلوي مع الشريحة السفلية باستخدام علامات المحاذاة، الواقعة على بعد نحو حافة قناع، كمرجع المكانية.
- تحقق الجزء المركزي من القناع والتحقق من أن ملامح نمط تتماشى بشكل صحيح.
- استكمال التعرض للأشعة فوق البنفسجية دون ما بعد خبز.
- تطوير
- كرر الخطوة 1.1.3 ولكن مع 45 ق التنمية قبل أن تجف على موقد والحفاظ في N 2 التخزين.
- طلاء تدور
- علاج كيميائي
- إعداد الحل تخميل: 0.5 ملغ / مل PLL-ز-PEG في 10 العازلة HEPES ملم.
- استرداد الشريحة من N 2 تخزين وتنظيفه باستخدام ري مع إعداد المعلمة: 500 عربة الضغط، قوة 100 واط، و 90 ق المدة.
- ماصة قطرة واحدة من تخميل حل على قطعة من فيلم البارافين. </ لى>
- ساندويتش الحل مع الفيلم والشرائح، والتأكد من أن جنب مع نمط ملامح لأسفل نحو الفيلم؛ تجنب تشكيل فقاعات.
- الانتظار لمدة 45 دقيقة قبل إزالة الشريحة من الفيلم.
- نقع الشريحة على التوالي في مزيل مقاومة للضوء، مزيل مقاومة للضوء وDI المياه (1: 1)، والماء DI، وتستنهض الهمم في حمام بالموجات فوق الصوتية لمدة 90 ق لكل نقع.
- تجف الشريحة على موقد لإزالة الرطوبة قبل أن ينتزع ذلك في مجفف وتخزينها في الثلاجة.
- التجمع رقاقة
- كرر الخطوات من 1.1.1-1.1.4، ولكن مع مقاومة للضوء، SU8-2025 سلبية وإعداد المعلمة المشار يسمى بروتوكول Microchem 18، لإعداد قالب السيليكون مع الضوئية الرئيسية.
- افتعال متناهية PDMS (40 مم × 25 مم × 5 مم، ث ل س س ح) ولوح PDMS صغير (800 هيكل الأخدود على نطاق ميكرون) باستخدام الطباعة الحجرية الناعمة.
- لكمة microchanneلتر بالنسبة للمنافذ وصول السوائل وتنظيفه مع الشريط وبعد ذلك مع IPA.
- حماية منطقة منقوشة الركيزة الزجاج مع بلاطة PDMS، وتطبيق ري (100 واط، 500 mTorr، 60 ثانية) لإزالة PLL-ز-PEG من المنطقة الحدودية.
- علاج متناهية مع جرعة مخفضة من ري (25 ث، 500 mTorr، 25 ق)، ثم محاذاته إلى الركيزة الزجاج المزخرفة (مع PDMS لوح صغير إزالتها)؛ جلب متناهية والركيزة الزجاج المزخرف في اتصال امتثالي تحت المجسام.
الشكل (3): الرسوم التخطيطية للالتصنيع الدقيق ورقاقة التجمع. أ) نمط من النقاط الذهب على الركيزة الزجاج. ب) إعداد الركيزة الزجاج لتنميط الخلية عبر MAPL. ج) جمعية قناة ميكروفلويديك مع الرابطة البلازما. الرجوع إلى قائمة المواد للتعريفات سو الاختصارات. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
- مرفق الخلية
يتم الاحتفاظ خلايا هيلا بشكل روتيني في DMEM تستكمل مع FBS 10٪ و 1٪ مضاد حيوي / مضاد التفتل حل في حاضنة الثقافة الخلية: ملاحظة. ويظهر رسم تخطيطي للمرفق التجميع رقاقة وخلية في الشكل 3C.- رئيس رقاقة مع برنامج تلفزيوني لمدة 30 دقيقة في 1 ميكرولتر / دقيقة، ثم ينقع حل فبرونيكتين (50 ميكروغرام / مل في برنامج تلفزيوني، 1 ميكرولتر / دقيقة) لمدة 45 دقيقة.
- في الوقت الذي تنتظر، ويعرض للتريبسين زراعة الخلايا مع 0.25٪ التربسين-EDTA، بغسلها في مستنبت، والخلايا الفردية أجهزة الطرد المركزي، وإعادة تشكيل تعليق خلية في قبل تحسنت (37 درجة مئوية) مستنبت في 5X10 6 خلايا / مل.
- استبدال حل فبرونيكتين مع برنامج تلفزيوني وتدفق رقاقة في 10 ميكرولتر / دقيقة لمدة 5 دقائق.
- حقنتعليق الخلية مستعد في رقاقة، ووقف تدفق، المشبك منفذ، والحفاظ على رقاقة في حاضنة الثقافة خلية لمدة 30 دقيقة.
- الافراج عن منفذ وتدفق رقاقة مع مستنبت الخلية في 10 ميكرولتر / دقيقة لمدة 5 دقائق. خفض معدل تدفق نضح من مستنبت إلى 0.75 ميكرولتر / دقيقة، والحفاظ على زراعة الخلايا لمدة 2 ساعة في الحاضنة.
2. الجيل فقاعة والتصور تدفق
ملاحظة: يتم عرض تخطيطي من الإعداد التجريبية في الشكل 4A لتوليد جنبا إلى جنب فقاعة والتفاعل تدفق الناتجة مع خلية واحدة نمت في مكان قريب في قناة ميكروفلويديك.
- جيل من جنبا إلى جنب مع اثنين من فقاعات الليزر والتحكم توقيت
- وضع رقاقة ميكروفلويديك على مرحلة مجهر مقلوب ومحاذاة بؤر اثنين نابض الثانية: ليزر YAG (λ = 532 نانومتر، 5-NS مدة النبضة) على زوج من النقاط الذهبية المزخرفة فصل بص 40 ميكرون.
- استخدام مولد تأخير الرقمية لتحريك الليزر اثنين مع تأخير الوقت حوالي 2.5 ميكرو ثانية لانتاج اثنين من الفقاعات التي بدأت في النقاط الذهب.
- ضبط انتاج الليزر الطاقة (~ 10 μJ) لإنتاج القطر الأقصى من فقاعات داخل 50 ± 2 ميكرون.
- مزامنة كاميرا عالية السرعة (التعرض 200 نانو ثانية و2000000 لقطة في الثانية (fps)) إلى أشعة الليزر والتقاط ديناميات التوسع فقاعة والانهيار، والتفاعل فقاعة فقاعة، وتشكيل طائرة.
- الكمي لسرعة الطائرة
- تسجيل موقف من طرف طائرة (J 1) في نهاية القريبة من فقاعة الأولى (ب 1) ونهاية البعيدة للب 1، بدءا من جيل الفقاعة الثانية (ب 2) وتنتهي مع هبوط من J 1 في نهاية البعيدة ب 1؛ انظر التخطيطي في الشكل 5A.
- تناسب خطيا على مدار الساعة من موقف للبوتح الداني (نصيحة طائرة) وينتهي البعيدة. حساب المنحدر من موقف طرف مقابل منحنى الوقت لنهاية القريبة لتحديد سرعة الطائرة. تقاطع هذين الخطين يشير إلى وقت هبوط الطائرة. مزيد من التفاصيل يمكن العثور عليها في المرجع 19.
- التصور للمجال تدفق الناجم عن فقاعة جنبا إلى جنب
- إعداد 1 ميكرون من البوليسترين (PS) تعليق حبة في الماء DI (2.6٪ ث / ت) وحقن الخرز في رقاقة ميكروفلويديك.
- توليد فقاعات جنبا إلى جنب كما هو موضح في الخطوة 2.1.1-2.1.3.
- تسجيل ديناميات جنبا إلى جنب فقاعة باستخدام كاميرا فيديو عالية السرعة بمعدل تأطير 5 M إطارا في الثانية مع زمن التعرض 100 نانو ثانية.
- تحميل تسلسل الصور المكتسبة في برنامج التعريف الشخصية التجاري.
- تقسيم كل صورة في النوافذ الاستجواب أصغر من 16 × 16 بكسل (بكسل) مع تداخل 75٪.
- تطبيق متعددة تمر التكرار والمرشحات الإقليمية للحد من الأخطاء في حساب سرعة الميدان، وإخراج النتائج في خريطة سرعة النواقل.
الشكل 4: رسم تخطيطي من الإعداد التجريبية وتسجيل الصورة. أ) إعداد التجريبي لتوليد جنبا إلى جنب فقاعة. ب) تسلسل الوقت تستخدم لأنواع مختلفة من عمليات الاستحواذ التصوير. فلوريدا: المجهري مضان، BF: حقل مشرق، IFT: الوقت interframe. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
3. وحيد الخلية تحليل وBioeffects
ملاحظة: يتم إنتاج فقاعة جنبا إلى جنب المقبل إلى الخلايا المستهدفة، ودرس bioeffects الناتجة في الطريقة التي تعتمد على المسافة المواجهة. ويصور التسلسل الزمني لأنواع مختلفة من عمليات الاستحواذ الصورة في الشكل 4B.
- poration الغشاء وامتصاص الجزيئات
ملاحظة: امتصاص الجزيئات خارج الخلية إلى الخلية المستهدفة تتميز نشر التدريجي من يوديد غشاء impermeant propidium (PI) من خلال الموقع poration على غشاء الخلية.- الخطوة التالية 1.5، استبدال مستنبت منتظمة (أي DMEM) مع الحل PI (100 ميكروغرام / مل في DMEM) على التوالي في معدل تدفق نضح من 0.5 ميكرولتر / دقيقة في كافة مراحل التجربة.
- برنامج برنامج التحكم المجهر لتحديد تلقائيا المكعب الفلورسنت PI على برج الدورية وتزامن توقيت كاميرا CCD مع الإثارة PI مضان لالتقاط الصور مضان مع ومدة التعرض من 200 مللي ثانية.
- بعد يتم محاذاة البؤر ليزر اثنين إلى زوج من النقاط الذهبية بجانب الخلية المستهدفة، سجل كل من حقل مشرق (BF) ومضان (فلوريدا) صور قبل العلاج جنبا إلى جنب فقاعة.
- استخدام برنامج حاسوبي لمراقبة المجهر لمباشرةبدء الوقت الفاصل بين تسجيل صورة مضان من الخلية المستهدفة بعد وقت قصير من الخطوة 2.1 لالتقاط تاريخ PI امتصاص.
- غشاء تشوه
- إعداد حبات 1 ميكرومتر (1٪ ث / ت، تفعيلها مع carbodiimide للذوبان في الماء) وfunctionalize لهم الببتيد 2000 (100 ميكروغرام / مل في برنامج تلفزيوني).
- الخطوة التالية 1.5، احتضان الخلايا المرفقة مع الخرز functionalized في كثافة 1X10 9 حبات / مل عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
- كرر الخطوة 2.1 لإنتاج فقاعات جنبا إلى جنب بجوار الخلية المستهدفة وتسجيل تشوه الخلايا مع كاميرا فائقة السرعة تعمل بمعدل تأطير 5000000 إطارا في الثانية.
- تحديد ثالوث 3 حبات التي تبقى على طائرة التصوير في كافة مراحل التجربة وتجميع وظائفهم، حيث (س 1، ص 1) (س 2، ص 2)، و (× 3، ص 3) الإحداثيات في التجربة.
- حساب مساحة ثالوث قبل وبالعربيةثالثا العلاج جنبا إلى جنب فقاعة باستخدام المعادلة التالية:
- حساب سلالة المنطقة على النحو التالي:
- وبناء على إحداثيات رؤوسه الثلاثة قبل وبعد العلاج فقاعة جنبا إلى جنب، وحساب المحلي الرئيسي سلالة ومنطقة سلالة التالية البروتوكولات المعمول 20،21.
- سلامة وموت الخلايا المبرمج
ملاحظة: FITC Annexin V التسميات الخلايا، بما في ذلك تلك التي أفكارك، من خلال تخريج فسفاتيديل (مخضر). PI تسميات نوى الخلايا الميتة (مضان أحمر). يستخدم التصوير مشرق الميدان لتوثيق مورفولوجيا الخلايا وللمساعدة في تحديد بقاء الخلية وموت الخلايا المبرمج.- تسجيل موقف كل خلية المعالجة في قناة ميكروفلويديك (بتسهيل من تسميات عنوان في القناة، انظر الشكل 2B
- احتضان الخلايا المعالجة في مستنبت الخلايا لمدة 2 ساعة أخرى قبل perfusing رقاقة مع الحل FITC Annexin V لمدة 15 دقيقة. خلايا الإيجابية عرض مخضر.
- كرر الخطوة 3.3.2 24 ساعة بعد العلاج جنبا إلى جنب فقاعة لدراسة bioeffects على المدى الطويل في الخلايا المستهدفة.
- استجابة الكالسيوم
- مزيج 3 ميكرولتر من FURA-02:00 المحلول (1 ملغ / مل في DMSO) مع 3 ميكرولتر من 10٪ ث / ت Pluronic F-127 في 500 ميليلتر من انخفاض سيرم لإعداد حل وضع العلامات النهائية (6 ميكرومتر).
- الخطوة التالية 1.5، استبدال خلية ثقافة المتوسط مع الحل وضع العلامات واحتضان تحت درجة حرارة الغرفة في الظلام لمدة 40 دقيقة (1 ميكرولتر / دقيقة معدل نضح).
- إعادة ملء القناة مع سيرم انخفاض (0.75 ميكرولتر / دقيقة معدل نضح) قبل بدء التجربة الخلية.
- بدء التصوير ratiometric (الطول الموجي: 340/380 نانومتر، والتعرض 50 مللي ثانية)الخلية الهدف باستخدام نظام الوكالة التجارية.
- بعد 10 ثانية من التصوير ratiometric من الخلية عند مستوى الراحة، تنتج فقاعات جنبا إلى جنب كما في الخطوة 2.1. السجل الاول مع الوقت interframe (IFT) من 0.1 الصورة لمدة 1 دقيقة، ثم زيادة IFT إلى 1 الصورة لدقيقة أخرى، وزيادة أخرى إلى 5 ثوان بعد 2 دقيقة.
- استخدام برنامج الوكالة لحساب نسبة R = F340 / F380 في المنطقة ذات الاهتمام (ROI)، الذي يتناسب مع تركيز الكالسيوم داخل الخلايا.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
منصة ميكروفلويديك الموصوفة في هذا العمل يمكن أن تستخدم لتحقيق التفاعل فقاعة فقاعة وتحليل مجموعة متنوعة من bioeffects الناجم عن التجويف على مستوى خلية واحدة. هنا، نقدم العديد من الأمثلة للتدليل مجموعة متنوعة من دراسات واختبارات بيولوجية التجريبية التي يمكن القيام بها في نظام تجريبي لدينا. سوف نوضح أولا تفاعلات عابرة من فقاعات جنبا إلى جنب مع تشكيل طائرة، التصور للمجال تدفق الناتجة، وحساب سرعة طائرة (الشكل 5A). وسوف أمثلة ذلك الحين الحالية جنبا إلى جنب فقاعة يسببها المترجمة تشوه غشاء الخلية (الشكل 5B)، أوضحت غشاء poration مع امتصاص PI (الشكل 5C)، واستجابة الكالسيوم داخل الخلايا (الشكل 5D). أمثلة أخرى، مثل بقاء الخلية وموت الخلايا المبرمج المقايسات، يمكن العثور عليها في المرجع 22.
ن الصفحات = "1"> ويبين الشكل 5A مثالا للتفاعل فقاعة جنبا إلى جنب مع تشكيل طائرة التي احتلتها التصوير فائق السرعة، ومجال تدفق الناتجة التي كشفت عنها التعريف الشخصي. على وجه التحديد، بعد توسعها القصوى، مشوهة انهيار أول فقاعة B 1 (ينتج في 0 ميكرو ثانية) غير متجانس من التوسع السريع لفقاعة الثاني ب 2 (ينتج عند 2.5 ميكرو ثانية)، مما أدى إلى تشكيل "أعلى" طائرة (J 1) في 3.4 ميكرو ثانية وتدفق النفث لاحق، كما هو موضح في 5.4 ميكروثانية. يتم تحديد متوسط سرعة الطائرة من قبل المنحدر من خط المجهزة لمنصب نهاية الداني (أو القطب) من B 1 قبل هبوط (أي اتصال مع نهاية البعيدة ب 1) في مقابل الوقت. تم العثور على متوسط سرعة الطائرة إلى زيادة 20-58 م / ث عند الحد الأقصى لقطر ب 2 زيادات 40-60 ميكرومتر. وبناء على نتائج تحليل التعريف الشخصية، وتدفق النفث الاتجاه في جميع أنحاء TANDم الفقاعة بناء على أمر من 10 م / ث، وتنحصر ضمن العرض بناء على أمر من 10 ميكرون. وبالتالي، قادرة على انتاج إجهاد القص التسرع والمترجمة والتدرج الضغط على الخلية المستهدفة نمت في مكان قريب.
مثال آخر هو مبين في الشكل 5B يوضح تشوه غشاء الخلايا الناجم عن تدفق النفث اتجاهي والمترجمة التي تنتجها جنبا إلى جنب فقاعات في المواجهة المسافة S د = 40 ميكرون. وسلط الضوء على تشويه الغشاء والانتعاش عن تشريد حبة functionalized (المشار إليها بواسطة خط منقط الصفراء) التي تعلق على الحافة الأمامية للغشاء الخلية. ويمكن حساب سلالة المنطقة المحلية من إحداثيات ثلاثية من الخرز المجاورة. ويرد التخطيطي لتغيير منطقة الحد الأقصى المحسوبة على مواقع مختلفة على سطح الخلية في المنتصف. ويمتد من الحافة الأمامية في المقام الأول (انظر الدوائر الخضراء)، في حين أن الحافة الخلفية أو اللاتيتم ضغط الجانبين األطراف للخلية (كما هو مبين من قبل الدوائر الحمراء)، مشيرا إلى عدم التجانس في تشوه الخلايا التي تنتجها تدفق النفث جنبا إلى جنب فقاعة المستحث. ويتضح التباين الزمني للسلالة المنطقة في الخلية مما يؤدي حافة على اليمين. وهي تتألف من عدد قليل من التذبذبات السريعة في البداية، تليها مساحة كبيرة ومستمرة لحوالي 100 ميكرو ثانية (FWHM) والانتعاش التدريجي لاحق على نطاق والوقت من عدة مللي ثانية.
وعلاوة على ذلك، فإن سلالة مساحة واسعة والتوتر لا يتجزأ في الخلية قد تكون الرائدة مسؤولة عن poration غشاء الخلية لوحظ في صغير S د، كما هو مبين في الشكل 5C. وفي صغير S د (أي 10 ميكرون، أو في بعض الحالات، 20 ميكرون)، وسيطة S د (أي غالبية 20 و 30 ميكرون)، والتي يسببها اضطراب غشاء المحلية، مما يؤدي إلى امتصاص بالغة من PI خارج الخلية إلىالعصارة الخلوية. إذا كانت كثافة PI داخل الخلية يحتفظ زيادة دون التشبع، يحدث النخر. في المقابل، إذا كانت كثافة PI هو أمر من حجم أقل وتصل إلى الاستقرار في غضون 10 ثانية بعد العلاج فقاعة جنبا إلى جنب، وporation للإصلاح مع بقاء الخلية المرجح أن يحدث، وهو بمزيد من الدعم من قبل الطفيف في مورفولوجيا الخلايا. في كبير S د (أي 40 ميكرون)، يذكر امتصاص PI وجدت يلي جنبا إلى جنب العلاج فقاعة، مشيرا إلى ضئيل أو عدم poration. الخلية يمكن أن يعيش مع النمو المنتظم وانتشار 22. وعموما، فقد بينت النتائج الانتقال اضح في استجابة الخلايا من نخر، من خلال poration غشاء للإصلاح، إلى غير poration في نطاق S د ≈ 20-40 ميكرومتر.
وأخيرا، وتبين لنا نتائج التصوير ratiometric من الاستجابة الكالسيوم داخل الخلايا التي تسببها فقاعات جنبا إلى جنب في الخلايا الفردية في مختلف Sد، وخاصة في نطاق دون المميتة من S د = 30-50 ميكرومتر (الشكل 5D). نسبة كثافة يتناسب مع كمية من الكالسيوم داخل الخلايا. وفي صغير S د (أي 30 ميكرون أو، في بعض الحالات، 40 ميكرون)، ويلاحظ موجة الكالسيوم السفر من الحافة الأمامية إلى الحافة بوضوح في غضون ثوان قليلة بعد العلاج جنبا إلى جنب فقاعة. بعد وصول الكالسيوم داخل الخلايا تركيز الذروة، فإنه يتحلل ببطء إلى مستوى الراحة في غضون بضع دقائق. في المقابل، في كبير S د (أي أغلبية من 50 ميكرون، أو في بعض الحالات، 40 ميكرون)، وزيادة الكالسيوم داخل الخلايا هي أخف بكثير، ولا واضحة للعيان موجة من السفر الكالسيوم يمكن تحديدها. ويمكن أيضا أن هذين الردود الكالسيوم مختلفة يمكن تمييزها من نسبة كثافة مقابل الوقت ملفاتهم الشخصية، مع وجود اختلافات كبيرة في السعة القصوى نسبة كثافة والوقت الارتفاع من مستوى يستريح إلى الذروةالقيمة. بشكل متساو مع أكبر S د (أي فوق 60 ميكرون)، أي رد الكالسيوم يمكن ملاحظتها. وتتلخص النسبة المئوية للخلايا هيلا عرض الردود الكالسيوم في مختلف S د في الشكل 5D (يمين).
جميع في كل شيء، وقد أظهرت نتائجنا أنه من خلال تغيير قوة تدفق النفث (أو تغيير S د)، ومجموعة متنوعة من bioeffects يمكن أن تنتج في خلايا هيلا الفردية في ظل ظروف ثقافة مماثلة، والتي من المرجح المترابطة مع السعة والمدة من تشوه الميكانيكية المفروضة على غشاء الخلية 22.
الرقم 5: النتائج من التفاعل جنبا إلى جنب فقاعة، تشوه غشاء الخلية، poration الغشاء، والمقايسات استجابة الكالسيوم. أ) حركة الموائع والطائرةالناجمة عن التفاعل جنبا إلى جنب فقاعة. اليسار: إطارات مختارة تظهر التفاعلات جنبا إلى جنب فقاعة مع تشكيل طائرة والميدانية التي كشفت عنها التعريف الشخصي تتدفق. أقطار القصوى من فقاعات هما حوالي 50 ± 2 ميكرون. الأوسط: تخطيطي من فقاعات النفث جنبا إلى جنب، مما يدل على محور الوسط، أصل الإحداثيات (س)، والداني والقاصي الغايات (أو أعمدة) من أول فقاعة ب 1. الصحيح: تقاس المواقف القطب (مع الخطأ = ± 1 ميكرومتر) في الدانية والقاصية من نهاية ب 1. ب) تشوه غشاء الخلية. اليسار: خط منقط الأصفر تسميات تشريد حبة PS تعلق على الحافة الأمامية للغشاء الخلية، مما يدل على تشوه غشاء المحلي والانتعاش. الأوسط: التخطيطي تبين منطقة ذروة توتر في مواقع مختلفة على سطح الخلية التي تظهر على اليسار. اليمين: دوام من السلالات منطقة في وسط الخلية مما يؤدي الحافة. Δ ε هو بس منطقة سلالة محسوبإد على السلالات الرئيسية و Δ Δ هي سلالة منطقة محسوبة على أساس التغيير الهندسة الثالوث. مزيد من التفصيل حول احتساب سلالة المنطقة، وتحليل الأخطاء في مرجع 22. ج) غشاء الخلية poration. اليسار: مشرق الصور الحقل قبل وبعد العلاج جنبا إلى جنب فقاعة والوقت الفاصل بين الصور مضان من PI امتصاص (0 و 120 ق). وتشير السهام البيضاء اتجاه تدفق النفث. الأوسط: تغيير نموذجي من متوسط كثافة PI مقابل الوقت داخل الخلايا. اليمين: نتائج إحصائية لنسبة الخلايا التي تمر نخر (الحمراء)، poration للإصلاح (الأزرق)، وغير poration (الأخضر) في مختلف S د. عدد الخلايا تعامل: N = 9، 14، 14، و 8 للS د = 10، 20، 30، و 40، على التوالي. الخطأ إحصائيات هو ± 1 / √ ن د) استجابة الكالسيوم داخل الخلايا. اليسار: تسلسل الصور ratiometric تظهر ردود الكالسيوم داخل الخلايا من الخلايا الفرديةالصورة في S د من 30 ميكرون و 50 ميكرون. وتشير السهام الحمراء الاتجاه طائرة. الأوسط: لمحات استجابة نموذجية (منحنيات الوقت نسبة) في مختلف S د. الحق: احتمال وجود استجابة الكالسيوم في مختلف S د. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| بعد المواجهة (S د) (ميكرون) | رقم رينولدز (إعادة) | وبلغ متوسط إجهاد القص (باسكال) في الطائرة YZ |
| 20 | 206.96 | 618.64 |
| 30 | 354.8 | 709.69 |
| 40 | 378.78 | 657.22 |
| 50 | 163.85 | 323.61 |
| 60 | 105.08 | 42.21 |
الجدول 1: قائمة معلمات الفيزياء تدفق من نتائج التعريف الشخصي. يقدر عدد رينولدز وبلغ متوسط إجهاد القص فيما يتعلق مسافات المواجهة مختلفة (S د). تشير الطائرة YZ لعرض القناة الطائرة × الارتفاع. ويقدر متوسط إجهاد القص من ارتفاع 0-7،7 ميكرومتر من قاع القناة بسبب ارتفاع الخلية في القناة هو حوالي 6-7 ميكرون.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
تحليل وحيدة الخلية، بالاشتراك مع التصوير الخلية الحية، وتتعزز بشكل كبير من فهمنا للعمليات ديناميكية ومتغيرة في كثير من الأحيان في الخلايا الفردية، مثل تطوير النمط الظاهري والاستجابة المناعية 23. وعلى النقيض من زراعة الخلايا التقليدية في أطباق أو قوارير، تمكن أنظمة الموائع الدقيقة مراقبة دقيقة من المكروية، وصولا الى مستوى خلية واحدة، في الوقت الحقيقي. ونتيجة لذلك، فإن التقدم في تكنولوجيا الموائع الدقيقة والتقنيات قد تحسنت إلى حد كبير سرعة نقل واستنساخ تحليل وحيدة الخلية. من خلال دمج لينة الطباعة الحجرية وسطح الزخرفة، ونظم ميكروفلويديك يمكن زيادة تهدف إلى تسهيل تحليل متعمق للاستجابة خلية واحدة لأنماط معقدة من المحفزات متغير spatiotemporally. على سبيل المثال، تم تسليمها الاشارات الميكانيكية الكيميائية عابرة أو بنجاح إلى الخلايا واحد في حين سجلت الاستجابات البيولوجية أو الميكانيكية بصورة تلقائية وتحليلها 24. على الرغم من هذا الاتجاه العام، وتطبيق على microfluidics لتحليل bioeffects الناجم عن التجويف على المستوى الخلوي كان محدودا للغاية. أبرزها، وقد تم تطبيقه فقط لالناجم عن فقاعة غشاء poration من الخلايا الفردية في تعليق محاصرين من قبل micropillars 11. في معظم الدراسات على الخلايا الملتصقة، والاستفادة من السيطرة على مورفولوجيا الخلايا للحفاظ على التناسق في التفاعلات فقاعة خلايا حيوية إما غير متوفرة أو أهملت إلى حد كبير.
لقد قمنا بتطوير نظام ميكروفلويديك للسيطرة على وجه التحديد بدء والتوسع لاحقا، وديناميات انهيار فقاعات التجويف. التفاعلات فقاعة فقاعة مع تشكيل طائرة. وشكل الخلية، والتوجه، ونمط التصاق، وبعد المواجهة من الفقاعات، وبالتالي السماح لتدفق النفث استنساخه ليتم تطبيقها على الخلايا الفردية تحت ظروف تجريبية تسيطر عليها بشكل جيد. هذا النظام ميكروفلويديك رواية مثالية لتنفيذ الحادي الأساسيudies على فقاعة التجويف (ق) -cell التفاعلات التي هي ذات الصلة لمجموعة متنوعة من التطبيقات الموجات فوق الصوتية العلاجية، مثل SWL، HIFU، وصوتنة الخلايا. لقد أثبتنا أن نظام ميكروفلويديك لدينا يمكن أن تستخدم للتحقيق في مختلف bioeffects الناجم عن التجويف، بما في ذلك الخلايا تشوه غشاء، غشاء poration، والسلامة والاستجابة الكالسيوم، بطريقة أكثر يمكن السيطرة عليها وقابلة للتكرار. وأبرزها، وتدفق النفث الاتجاه تنتجها فقاعات جنبا إلى جنب يسمح لنا للتحقيق في استجابة الممتلكات والكالسيوم الميكانيكية في الخلايا الفردية تحت ارتفاع معدلات السلالة التي لم يتم توصيفه جيدا. و، إجهاد التسرع المحلية التي تنتجها مثل هذا التدفق النفث لا يمكن أن يتحقق من خلال الطرق التقليدية وتمتد، مثل micropipette تطلع 25 واستخدام بصري 26 و ملاقط المغناطيسية 27. بو واحد وعلاوة على ذلك، وعلى النقيض من الدراسات السابقة باستخدام الموجات فوق الصوتية عوامل التباين 8،28-30 أو الليزر التي يسببهاbbles 31،32، نظام ميكروفلويديك لدينا يوفر تحكما أفضل في هندسة الخلايا والتصاق الظروف، وبالتالي تقليل تأثير كبير على الاستجابة الخلوية وbioeffects 16.
في حين لدينا تقنية موثوقة وقابلة للتكرار، لا بد من اتباع بروتوكول بحذر للتأكد من أن النظام التجريبي يرد بإخلاص. نوعية الزخرفة السطحية في متناهية هي المسؤولة في المقام الأول عن استنساخ التفاعلات فقاعة فقاعة خلية وسلسلة من bioeffects المصب. على سبيل المثال، للخلايا هيلا، يجب أن تكون مساحة كل نقطة الذهب حوالي 25-30 ميكرومتر 2 لضمان توليد فقاعة مستقرة في حين منع الخلايا من الانضمام. من ناحية أخرى، مساحة كل جزيرة المغلفة فبرونيكتين يجب أن يكون حول 700-900 ميكرون 2 لتسهيل نشر كافية من خلية واحدة في مربع مع تقليل فرصة من خلايا متعددة تشكيل المجاميع في الجزيرة. المحاذاةبين النقاط الذهب والجزر المغلفة فبرونيكتين يجب تنفيذها بدقة مع المعونة من اليجنر قناع للحفاظ على خطأ الزاوي في 1 ° والخطأ المحوري تقع ضمن نطاق 0.5 ميكرون. وعلاوة على ذلك، يوفر هذا النظام التجريبي براعة في مراقبة سلسلة من الأحداث، مع حجمها الوقت اختلفت من حيث الحجم (على سبيل المثال، وديناميات فقاعة: ميكرو ثانية، خلية تشوه: مللي ثانية، غشاء poration: الصورة، موت الخلايا المبرمج: ح). وبالتالي، فمن المهم أن التحكم بدقة توقيت التقاط صور وتسجيل كل تسلسل صقل إشارات الزناد (التي يسيطر عليها مولد تأخير الرقمي). ثقافة وحيدة الخلية يجب أن تكون بحالة جيدة في متناهية للحد من التفاوت خلية الى خلية في النمط الظاهري (ويشار في الغالب على أنها التشكل). لذلك، لا بد من الحد الأدنى 2-ح الحضانة لمرفق الخلية وتنتشر في الجزر قبل الشروع في العلاج بالخلايا المصب. فمن المستحسن أن تبقي دائما على معدل التدفق في microchannشرم أقل من 3 ميكرولتر / دقيقة، حتى أن الإجهاد تدفق القص التي تنتجها مستنبت التي يجري تداولها في الخلية هو ضمن نطاق الفسيولوجية.
واحد الحد الحالي للتقنية لدينا هو أن التفاعل جنبا إلى جنب فقاعة وتدفق النفث الناتجة يمكن تطبيقه فقط على الخلية المستهدفة مرة واحدة، لأنه لن يكون ذاب النقاط الذهب وأشعة الليزر. هذا عيب ويحد من قدرة نظام تجريبي لدينا لتقليد bioeffects المنتجة بواسطة الموجات فوق الصوتية العلاجية، حيث غالبا ما تتعرض الخلايا لأحداث التجويف. ومع ذلك، قد يكون من الممكن التخفيف هذا القيد الزمني من خلال تطبيق طبقة أخرى رقيقة من ثاني أكسيد السيليكون لحماية النقاط الذهب من التعرض المباشر في السائل 15. عموما، نظام ميكروفلويديك لدينا يوفر الظروف التجريبية تسيطر عليها بشكل جيد للتحقيق في bioeffects المنتجة من فقاعة التجويف (ق) التفاعلات -cell ولديه العديد من المزايا الفريدة. أولا، كل من حجم وموقع التجويف فقاعات في موقعنا الإلكترونينظام xperimental يمكن التحكم بدقة عن طريق ضبط طاقة الليزر الحادث تمتصه النقاط الذهب. ثانيا، موحدة الهندسة والتصاق الخلايا الفردية عن طريق الزخرفة خلية للحد من آثارها على استجابات الخلايا وbioeffects، مما يؤدي إلى نتائج أكثر استنساخه. ثالثا، وحدات عمل متوازية في تصميم رقاقة ميكروفلويديك تجعل من الممكن لدراسة bioeffects المصب، مثل نمو الخلايا وانتشار، والتعبير جيني يحتمل أن يكون، بعد التعرض التجويف، لأن كل خلية يمكن معالجتها ومراقبتها بشكل فردي. باختصار، لدينا نظام ميكروفلويديك ومنهجية خلق موثوقة التفاعلات فقاعة فقاعة لدراسة bioeffects من الخلايا الفردية مع تحسين الدقة.
تم تصميم رقاقة الحالي لتحليل خلايا هيلا الفردية. ومع ذلك، فإن تعديل الجزر نمط لخطوط خلايا الثدييات الأخرى ممكنة أيضا. ويمكن إجراء العديد من التحسينات لزيادة توسيع الطلبات،ملاعق من الشريحة. على سبيل المثال، يمكن استكشاف بدائل للجزيئات PLL-ز-PEG لوقف خلايا منقوشة الفردية من الهجرة حتى بعد 24 ساعة. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن استكشاف تصاميم رقاقة جديدة مع الصمامات ميكروفلويديك للسيطرة على المكروية المحلية من الخلايا، لذلك أن المواد الكيميائية مثل علامات مضان أو الكواشف السامة سيتم تطبيقه فقط على موقع معين، دون التأثير على الخلايا في مناطق أخرى من رقاقة . مع هذه التحسينات، ونظام ميكروفلويديك المقدمة هنا قد توفر فرصا لدراسة bioeffects على المدى الطويل من الخلايا واحدة، مثل التمثيل الغذائي، والعزل، والتمايز، والتعبير الجيني، بعد التعرض التجويف أو المحفزات الميكانيكية التي تنتجها تدفق التسرع.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent/Materials | |||
| 75 mm x 38 mm Plain Microscope Slides | Corning | 2947-75X38 | |
| Acetone | Sigma Aldrich, Co. | 320110 | ACS reagent, ≥99.5% |
| Isopropyl alcohol | Sigma Aldrich, Co. | W292907 | ≥99.7%, FCC, FG |
| Sulfuric acid | Sigma Aldrich, Co. | 320501 | ACS reagent, 95.0-98.0% |
| Hydrogen peroxide | Sigma Aldrich, Co. | 216763 | 30 wt.% in H2O |
| Primer P-20 | Microchem | MCC Primer 80/20 | |
| NFR photoresist | JSR | NFR016D2 | |
| Photomask | Photoplotstore | N/A | 4x4 Direct write mask |
| MF-319 Developer | Shipley (Rohm and Haas) | Microposit MF-319 | |
| 1165 Photoresist Remover | Dow Chemical, Co. | DEM-10018073 | 1-methyl-2-pyrrolidinone based |
| S1813 photoresist | Shipley (Rohm and Haas) | S1813 | |
| PLL-g-PEG | SuSoS | PLL(20)-g[3.5]- PEG(2) | |
| HEPES | ThermoFisher Scientific | 15630080 | |
| Paraffin film | HACH | 251764 | |
| SU-2025 photoresist | Microchem | SU-2025 | |
| PDMS | Dow Corning | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | |
| Microbore Tubing | Saint-Gobain PPL Corp. | S-54-HL | |
| Metal pins | New England Small Tube | NE-1300-01 | Cut Tube (straight), 0.025” OD x 0.017” ID x 0.50” Long |
| HeLa cells | Duke Cell Culture Facility | (307-CCL-2) HeLa, p.148 | |
| DPBS (1x) buffer | ThermoFisher Scientific | 14190144 | |
| DMEM culture medium | ThermoFisher Scientific | 11995065 | |
| Fibronectin Bovine Protein, Plasma | ThermoFisher Scientific | 33010018 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA (1x) | ThermoFisher Scientific | 25200056 | |
| Propidium Iodide | ThermoFisher Scientific | P21493 | |
| Carboxylate Microspheres 1.00 μm | Polysciences, Inc | 08226-15 | |
| Carboxylate Microspheres 2.00 μm | Polysciences, Inc | 18327-10 | |
| EDC (1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride) | ThermoFisher Scientific | 22980 | |
| Sulfo-NHS | Sulfo-NHS (N-hydroxysulfosuccinimide) | 24510 | |
| Peptite-2000 | Advanced BioMatrix | 5020-5MG | |
| FITC Annexin V | ThermoFisher Scientific | A13199 | |
| Fura-2, AM | ThermoFisher Scientific | F1221 | |
| DMSO | Sigma Aldrich, Co. | D2650 | |
| F-127 | invitrogen | P6866 | 0.2 µm filtered (10% Solution in Water) |
| Reduced serum media | ThermoFisher Scientific | 11058021 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Plasma asher | Emitech | K-1050X | O2 / Ar plasma ashing of photoresist and other organic materials |
| Mask aligner | SUSS MicroTec | Karl Suss MA6/BA6 | |
| E-beam evaporator | CHA Industries | CHA Industries Solution E-Beam | |
| RIE | Trion Technology | Trion Technology Phantom II | (oxide/ nitride/ polymer) etching |
| Stereoscope | AmScope | American Scope SM-4TZ-FRL | Stereo Microscope |
| Syringe pump | Chemyx Inc | NanoJet | |
| Cell culture incubator | NuAire | AutoFlow NU-8500 Water Jacket CO2 Incubator | |
| Biological Safety Cabinets | NuAire | NU-425-400 | |
| Water bath | VWR | 1122s | |
| Centrifuge | IEC | Centra CL2 | |
| Microscope | Zeiss | Axio Observer Z1 | |
| Nd:YAG laser (laser 1) | New Wave Research | Tempest | |
| Nd:YAG laser (laser 2) | New Wave Research | Orion | |
| Delay generator | Berkeley Nucleonics | BNC 565-8c | |
| Flash lamp | Dyna-Lite | ML1000 fiber-coupled flashtube | |
| high speed camera | DRS Hadland | Imacon 200 | |
| high speed camera | Shimadzu | HPV-X | |
| high speed camera | Vision Research | Phantom V7.3 | |
| PIV software | LaVision | DaVis 7.2 | |
| camera | Zeiss | AxioCam MRc 5 | |
| software | Zeiss | AxioVision | |
| PTI system | Horiba | S/N: 1705 RAM-X | |
| EasyRatio software | Horiba | Easy Ratio Pro 2 | version 2.3.125.86 |
| 63× objective | Zeiss | LD Plan Neofluar |
References
- Wang, D., Bodovitz, S. Single cell analysis: the new frontier in 'omics. Trends Biotechnol. 28 (6), 281-290 (2010).
- Weaver, W. M., et al.
- Gossett, D. R., et al. Hydrodynamic stretching of single cells for large population mechanical phenotyping. Proc Natl Acad Sci USA. 109 (20), 7630-7635 (2012).
- Spiller, D. G., Wood, C. D., Rand, D. A., White, M. R. H.
- Lecault, V., White, A. K., Singhal, A., Hansen, C. L. Microfluidic single cell analysis: from promise to practice. Curr Opin Chem Biol. 16 (3-4), 381-390 (2012).
- Kennedy, J. E. High-intensity focused ultrasound in the treatment of solid tumours. Nat Rev Cancer. 5 (4), 321-327 (2005).
- Zhu, S., Cocks, F. H., Preminger, G. M., Zhong, P. The role of stress waves and cavitation in stone comminution in shock wave lithotripsy. Ultrasound Med Biol. 28 (5), 661-671 (2002).
- Fan, Z., Liu, H., Mayer, M., Deng, C. X. Spatiotemporally controlled single cell sonoporation. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (41), 16486-16491 (2012).
- Itah, Z., et al. Hydrodynamic cavitation kills prostate cells and ablates benign prostatic hyperplasia tissue. Exp Biol Med. 238 (11), 1242-1250 (2013).
- Kosar, A., Sesen, M., Oral, O., Itah, Z., Gozuacik, D. Bubbly cavitating flow generation and investigation of its erosional nature for biomedical applications. IEEE Trans Biomed Eng. 58 (5), 1337-1346 (2011).
- Li, Z. G., Liu, A. Q., Klaseboer, E., Zhang, J. B., Ohl, C. D. Single cell membrane poration by bubble-induced microjets in a microfluidic chip. Lab Chip. 13 (6), 1144-1150 (2013).
- Li, F. F., Chan, C. U., Ohl, C. D. Yield Strength of Human Erythrocyte Membranes to Impulsive Stretching. Biophys J. 105 (4), 872-879 (2013).
- Li, F., M, M., Ohl, C. .D. . Shear stress induced stretching of red blood cells by oscillating bubbles within a narrow gap. Bull Am Phys Soc. 58, (2013).
- Sankin, G. N., Yuan, F., Zhong, P. Pulsating tandem microbubble for localized and directional single-cell membrane poration. Phys. Rev. Lett. 105 (7), 078101 (2010).
- Fan, Q., Hu, W., Ohta, A. T. Laser-induced microbubble poration of localized single cells. Lab Chip. 14 (9), 1572-1578 (2014).
- Chen, C. S., Mrksich, M., Huang, S., Whitesides, G. M., Ingber, D. E. Geometric control of cell life and death. Science. 276 (5317), 1425-1428 (1997).
- Yuan, F., Sankin, G., Zhong, P. Dynamics of tandem bubble interaction in a microfluidic channel. J Acoust Soc Am. 130 (5), 3339-3346 (2011).
- Microchem, SU-8 2000 Processing Guidelines. , Available from: http://www.microchem.com/pdf/SU-82000DataSheet2000_5thru2015Ver4.pdf (2000).
- Yang, C. Analysis of Tandem Bubble Interaction and Jet Formation in a Microfluidic Channel. , Duke University. (2013).
- Simon, S. I., Schmid-Schonbein, G. W. Cytoplasmic strains and strain rates in motile polymorphonuclear leukocytes. Biophys J. 58 (2), 319-332 (1990).
- Barbee, K. A., Macarak, E. J., Thibault, L. E. Strain measurements in cultured vascular smooth muscle cells subjected to mechanical deformation. Ann Biomed Eng. 22 (1), 14-22 (1994).
- Yuan, F., Yang, C., Zhong, P. Cell membrane deformation and bioeffects produced by tandem bubble-induced jetting flow. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 112 (51), E7039-E7047 (2015).
- Yin, H., Marshall, D. Microfluidics for single cell analysis. Curr Opin Biotechnol. 23 (1), 110-119 (2012).
- Tay, S., et al. Single-cell NF-kappa B dynamics reveal digital activation and analogue information processing. Nature. 466 (7303), 267-271 (2010).
- Rand, R. P., Burton, A. C. Mechanical Properties of the Red Cell Membrane: I. Membrane Stiffness and Intracellular Pressure. Biophys J. 4 (2), 115-135 (1964).
- Lim, C. T., Dao, M., Suresh, S., Sow, C. H., Chew, K. T. Large deformation of living cells using laser traps. Acta Mater. 52 (7), 1837-1845 (2004).
- Puig-de-Morales-Marinkovic, M., Turner, K. T., Butler, J. P., Fredberg, J. J., Suresh, S. Viscoelasticity of the human red blood cell. Am J Physiol Cell Physiol. 293 (2), C597-C605 (2007).
- Kudo, N., Okada, K., Yamamoto, K. Sonoporation by single-shot pulsed ultrasound with microbubbles adjacent to cells. Biophys J. 96 (12), 4866-4876 (2009).
- van Wamel, A., et al. Vibrating microbubbles poking individual cells: Drug transfer into cells via sonoporation. J Control Release. 112 (2), 149-155 (2006).
- Hu, Y., Wan, J. M., Yu, A. C. Membrane perforation and recovery dynamics in microbubble-mediated sonoporation. Ultrasound Med Biol. 39 (12), 2393-2405 (2013).
- Dijkink, R., et al. Controlled cavitation-cell interaction: trans-membrane transport and viability studies. Phys Med Biol. 53 (2), 375-390 (2008).
- Rau, K. R., Quinto-Su, P. A., Hellman, A. N., Venugopalan, V. Pulsed laser microbeam-induced cell lysis: Time-resolved imaging and analysis of hydrodynamic effects. Biophys J. 91 (1), 317-329 (2006).
