Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

एकल कोशिका के स्तर पर cavitation बुलबुला (s) सेल इंटरेक्शन और उसके एवज में Bioeffects जांच के लिए सतह patterning के साथ एक microfluidic प्रणाली

Published: January 10, 2017 doi: 10.3791/55106
Automatic Translation
1, 2, 1, 1, 1
1Mechanical Engineering and Materials Science, Duke University, 2Huacells Corp

Abstract

इस पांडुलिपि में, हम पहली बार एक microfluidic चिप के निर्माण के प्रोटोकॉल, सोने डॉट्स और एक ही गिलास सब्सट्रेट, ठीक है कि मिलकर बुलबुले और अलग-अलग स्थानों पर अच्छी तरह से परिभाषित और आकार के साथ पास के नमूनों की कोशिकाओं की पीढ़ी को नियंत्रित पर fibronectin लेपित क्षेत्रों के साथ वर्णन है। हम तो दो स्पंदित कुछ-microsecond समय की देरी के साथ सोने के लिए डॉट्स की एक जोड़ी रोशन लेसरों का उपयोग करके मिलकर बुलबुले की पीढ़ी का प्रदर्शन। हम उच्च गति इमेजिंग द्वारा बुलबुला बुलबुला संपर्क और जेट गठन कल्पना और कण छवि velocimetry (PIV) का उपयोग परिणामी प्रवाह क्षेत्र की विशेषताएँ। अंत में, हम macromolecule तेज के साथ कोशिका झिल्ली poration, स्थानीय झिल्ली विरूपण जुड़ी इंटीग्रिन बाध्यकारी मोतियों की विस्थापन के द्वारा निर्धारित किया, और ratiometric इमेजिंग से intracellular कैल्शियम प्रतिक्रिया सहित एकल कोशिका विश्लेषण के लिए इस तकनीक का कुछ अनुप्रयोगों प्रस्तुत करते हैं। हमारे परिणाम बताते हैं कि एक तेजी से और दिशात्मक jetting प्रवाह समर्थक हैमिलकर बुलबुला बातचीत है, जो एक सेल करीब निकटता में उगाया की सतह पर एक बेहद स्थानीय कतरनी तनाव लागू कर सकते हैं द्वारा पेश। इसके अलावा, विभिन्न bioeffects मिलकर बुलबुले के लिए सेल से गतिरोध दूरी का समायोजन करके jetting प्रवाह की ताकत फेरबदल द्वारा प्रेरित किया जा सकता है।

Introduction

वहाँ एक से बढ़ मान्यता है कि सेलुलर विविधता, जीन, प्रोटीन, और चयापचयों के स्टोकेस्टिक अभिव्यक्ति से उत्पन्न होने वाली है, एक बड़ी सेल की आबादी के भीतर मौजूद है और जीव विज्ञान में एक मौलिक सिद्धांत के रूप में कार्य करता है सेल अनुकूलन और विकास 1 के लिए अनुमति देने के लिए है। इसलिए, यह अक्सर गलत और जनसंख्या के आधार पर थोक माप का उपयोग करने के लिए अलग-अलग कक्षों और उनकी बातचीत के समारोह को समझने के लिए अविश्वसनीय है। एकल कोशिका विश्लेषण के लिए नई प्रौद्योगिकियों के विकास और जैविक औषधीय अनुसंधान के क्षेत्र में उच्च ब्याज का इसलिए है, और उदाहरण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, बेहतर कुंजी संकेत दे रास्ते और स्टेम कोशिका जीव विज्ञान और कैंसर के उपचार में 2-4 प्रक्रियाओं को समझने के लिए। हाल के वर्षों में, microfluidic प्लेटफार्मों के उद्भव बहुत एकल कोशिका विश्लेषण, जहां स्थिति, उपचार, और व्यक्ति की कोशिकाओं से प्रतिक्रिया के अवलोकन के उपन्यास विश्लेषणात्मक रणनीतियों 5 के साथ प्रदर्शन किया गया है मदद की है।

Cavitation निभाता उच्च तीव्रता से कैंसर के इलाज सहित जैव चिकित्सा अनुप्रयोगों की एक विविध रेंज में एक महत्वपूर्ण भूमिका ध्यान केंद्रित अल्ट्रासाउंड (HIFU) 6, सदमे की लहर lithotripsy से गुर्दे की पथरी के गैर इनवेसिव विखंडन (SWL) 7, दवा या जीन डिलीवरी sonoporation 8, और hydrodynamic बुलबुला cavitation 9,10 द्वारा कोशिकाओं या ऊतकों की हाल ही में सूचना दी विनाश से। इस के बावजूद, cavitation बुलबुला (s) जैविक ऊतक कोशिकाओं और के साथ बातचीत के गतिशील प्रक्रियाओं को अच्छी तरह से नहीं समझा गया है। यह अल्ट्रासाउंड, सदमे तरंगों, और स्थानीय हाइड्रोलिक दबाव द्वारा उत्पादित cavitation दीक्षा और बुलबुला गतिशीलता में randomness की वजह से है; इसके अलावा, वहाँ विशेष रूप से एकल कोशिका के स्तर पर, जैविक कोशिकाओं के स्वाभाविक जटिल और तेजी से प्रतिक्रिया को हल करने की तकनीक को सक्षम करने की कमी है।

क्योंकि इन चुनौतियों में से है, यह आश्चर्य की बात नहीं है बहुत कुछ अध्ययनों मधुमक्खी है किn अच्छी तरह से नियंत्रित प्रयोगात्मक शर्तों के तहत बुलबुला सेल बातचीत की जांच को सूचना दी। उदाहरण के लिए, व्यक्ति की कोशिकाओं की झिल्ली poration निलंबन 11 में फंस रहे हैं और मानव लाल रक्त कोशिकाओं को 12 साल की आवेगी बड़ी विकृति microfluidic चैनलों में लेजर जनित एक बुलबुले का उपयोग प्रदर्शन किया गया है। बाद तकनीक, तथापि, केवल बहुत छोटे विरूपण नाभिक 13 की मौजूदगी की वजह से कोशिकाओं में उत्पादन कर सकते हैं। इसके अलावा, यह जब निलंबन कोशिकाओं के इलाज में नीचे की ओर bioeffects नजर रखने के के लिए मुश्किल है। अन्य अध्ययनों में, झिल्ली poration और / या एकल पक्षपाती कोशिकाओं में intracellular कैल्शियम प्रतिक्रियाओं के उत्पादन के लिए एक सेल बाध्य microbubble (या अल्ट्रासाउंड विपरीत एजेंट) के अल्ट्रासाउंड उत्तेजना 8 सूचित किया गया है। एकल पक्षपाती कोशिकाओं की झिल्ली poration भी एक पतली परत तरल में लेजर जनित मिलकर बुलबुले का उपयोग कर प्रकाश को अवशोषित Trypan नीले समाधान 14 से युक्त द्वारा उत्पादित किया जा सकता है, याmicrosecond लेजर दालों microchambers 15 में एक ऑप्टिकली अवशोषित सब्सट्रेट के माध्यम से irradiating द्वारा उत्पन्न एक oscillating गैस बुलबुला द्वारा। जब तुलना में, ऑप्टिकली अवशोषित सब्सट्रेट क्योंकि कोशिकाओं को विषाक्त उत्तरार्द्ध है लेजर को अवशोषित Trypan नीले समाधान के ऊपर एक फायदा है। इससे भी महत्वपूर्ण बात, लेजर जनित बुलबुले ध्वनिक उत्साहित बुलबुले से बुलबुला आकार और स्थान के संदर्भ में अधिक चलाया हुआ है। फिर भी, इन सभी पिछले अध्ययनों में, सेल आकार, अभिविन्यास, और आसंजन की स्थिति नियंत्रित नहीं कर रहे थे, जो काफी हद तक सेल प्रतिक्रिया और यांत्रिक तनाव 16 द्वारा उत्पादित bioeffects प्रभावित कर सकते हैं।

पिछले अध्ययनों में इन खामियों को दूर करने के लिए, हमने हाल ही में बुलबुला पीढ़ी, सेल patterning, बुलबुला बुलबुला सेल बातचीत, और वास्तविक समय microfabrication techn का एक अनूठा संयोजन का उपयोग करके निर्माण एक microfluidic चिप में सेल प्रतिक्रिया की bioassays के लिए एक प्रायोगिक प्रणाली विकसित की हैiques। तीन मुख्य विशेषताएं है कि क्षेत्र में दूसरों से हमारे प्रायोगिक प्रणाली भेद हैं: 1) माइक्रोन आकार गिलास सब्सट्रेट पर सोने डॉट्स की patterning बुलबुला पीढ़ी 17 के लिए स्थानीय लेजर अवशोषण सक्षम करने के लिए; 2) एक ही सब्सट्रेट पर कोशिका आसंजन के लिए बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) की माइक्रोन आकार द्वीपों के patterning दोनों स्थान और व्यक्ति की कोशिकाओं की ज्यामिति को नियंत्रित करने के लिए; और 3) एक अर्ध-2 डी अंतरिक्ष के लिए 3 डी से बुलबुला बुलबुला सेल बातचीत डोमेन के आयाम के संपीड़न बुलबुला बुलबुला बातचीत के विमान में दृश्य की सुविधा के लिए, प्रवाह क्षेत्र, सेल विरूपण, और bioeffects jetting, सभी में कब्जा एक सुव्यवस्थित इमेजिंग अनुक्रम (चित्रा -1)।

आकृति 1
चित्रा 1: microfluidic चिप और विभिन्न परीक्षणों की schematics। एक) चैनल के साथ एक इकट्ठे microfluidic चिप नीले रंग की स्याही से भर दृश्य के लिए। ख) नमूनों कोशिकाओं और सोने डॉट्स के साथ microfluidic चिप के अंदर एक क्षेत्र (निकटता में दो स्वर्ण डॉट्स के बीच की दूरी 40 सुक्ष्ममापी है)। काम इकाइयों में से कई जोड़े के एक चैनल में व्यवस्थित किया जा सकता है। ग) सोने डॉट्स की एक जोड़ी और एक हेला सेल सेल patterning क्षेत्र से पालन से मिलकर एक ही काम इकाई के ऊपर बंद छवि। घ) डिवाइस ऑपरेशन के योजनाबद्ध। एक एकल कोशिका का पालन करता है और fibronectin के साथ लेपित "एच" के आकार का द्वीप पर फैलता है। Cavitation बुलबुले (मिलकर बुलबुला) विरोधी चरण दोलन के साथ की एक जोड़ी (चित्रा -4 ए देखें) सोने डॉट्स पर स्पंदित लेजर बीम रोशन, एक तेजी और स्थानीय जेट पास के लक्ष्य सेल की ओर बढ़ने की पीढ़ी के लिए अग्रणी द्वारा उत्पादित कर रहे हैं। सेल, विकृत किया जा सकता है macromolecular तेज के लिए porated, और / या एक कैल्शियम प्रतिक्रिया के साथ प्रेरित, मिलकर बुलबुले के लिए सेल का गतिरोध दूरी (एस डी) पर निर्भर करता है।च = "http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55106/55106fig1large.jpg" लक्ष्य = "_blank"> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

इस मंच को आगे प्रतिदीप्ति assays और क्रियाशील मोती cavitation प्रेरित bioeffects के लिए कोशिका की सतह से जुड़ी साथ जोड़ा जा सकता है। विशेष रूप से, इस मंच एकल कोशिका के स्तर पर विश्वसनीय और मात्रात्मक assays के लिए रास्ता खुल जाता है। अब तक, हम मिलकर बुलबुला प्रेरित कोशिका झिल्ली विरूपण, सेल poration और intracellular तेज, व्यवहार्यता, apoptosis, और intracellular कैल्शियम प्रतिक्रिया के विश्लेषण के लिए डिवाइस का इस्तेमाल किया है। निम्नलिखित प्रोटोकॉल में, हम चिप निर्माण की प्रक्रिया और ऊपर वर्णित विभिन्न bioeffects का विश्लेषण करने के लिए प्रक्रिया का वर्णन है। इसके अलावा, चिप का संचालन भी वर्णित हैं।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Microfabrication

नोट: सभी microfabrication प्रक्रियाओं एक cleanroom में प्रदर्शन कर रहे हैं। एक क्रोम मुखौटा microfabrication के लिए पहले तैयार किया है, चित्रा 2 देख रहा है।

चित्र 2
चित्रा 2: microfluidic चिप में चैनल डिजाइन और काम इकाइयों के आयामों के योजनाबद्ध। क) गठबंधन PDMS microchannels (हरा) और कांच सब्सट्रेट (नीले और लाल) पर पैटर्न का मुखौटा डिजाइन। ख) काम कर इकाई सरणियों के एक प्रतिनिधि अनुभाग में मुखौटा डिजाइन के बढ़े छवि। ग) एक काम इकाई के योजनाबद्ध एक सेल पैटर्न (नीला) और (सोना डॉट्स की एक जोड़ी लाल) दिखा। सभी तराजू लंबाई नीचे सही पर दिखाए जाते हैं। एक Lar देखने के लिए यहाँ क्लिक करेंयह आंकड़ा की जीईआर संस्करण।

  1. गोल्ड डॉट patterning
    नोट: इतना है कि यह इतना बड़ा बुलबुला पीढ़ी के लिए लेजर ऊर्जा को अवशोषित करने के लिए, लेकिन छोटे पर्याप्त व्यक्ति इसे का पालन करने की कोशिकाओं से बचने के लिए प्रत्येक सोने डॉट का क्षेत्र, 25-30 माइक्रोन 2 के भीतर होना करने के लिए बनाया गया है। सोने डॉट निर्माण के लिए एक योजनाबद्ध आरेख चित्रा 3 ए में दिखाया गया है।
    1. गिलास स्लाइड सफाई (एक रासायनिक हुड में)
      1. Isopropyl शराब (आईपीए) के बाद एसीटोन के साथ कांच स्लाइड फ्लश, और फिर 2 एन प्रवाह के साथ सूखी।
      2. के लिए 10 मिनट पिरान्हा समाधान में स्लाइड (: एच 2 ओ 2 = 4 1 एच 2 अतः 4) लेना।
      3. , स्लाइड बाहर ले जाओ डि पानी से कुल्ला, और फिर 2 एन प्रवाह के साथ सूखी।
      4. 10 मिनट के लिए 120 डिग्री सेल्सियस पर एक hotplate पर गिलास स्लाइड सेंकना।
      5. 90 एस के लिए 100 डब्ल्यू पर एक प्लाज्मा आशेर में स्लाइड को समझो।
    2. स्पिन कोटिंग (स्पिन कोटिंग हुड)
      1. एक hotplate पर मुड़ें और इंतजार जब तक तापमान 95 डिग्री सेल्सियस पर स्थिर है।
      2. कोटिंग प्रक्रिया का पालन करें:
        एक 500 आरपीएम / एस रैंप के साथ 5 एस के लिए 1000 rpm;
        उसके बाद 1000 rpm / एस रैंप के साथ 30 एस के लिए 3000 rpm।
      3. एक निर्वात को लागू करने से स्पिन coater पर साफ गिलास स्लाइड को ठीक करें।
      4. P-20 के साथ स्लाइड सतह को कवर किया और कोटिंग नुस्खा शुरू करते हैं।
      5. NFR नकारात्मक photoresist के लिए कोटिंग की प्रक्रिया को दोहराएं।
      6. 60 एस के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर स्लाइड सेंकना और इंतजार जब तक यह कमरे के तापमान को शांत होता है।
    3. photolithography
      1. मुखौटा aligner पर क्रोम मुखौटा माउंट और यकीन है कि पैटर्न की ओर स्लाइड नीचे की ओर का सामना करना पड़ जाता है।
      2. यूवी जोखिम के 9 एस के साथ कठिन जोखिम मोड के लिए फोटोलिथोग्राफी नुस्खा निर्धारित करें और जल्दी से नकाब के साथ कांच के अध संरेखित।
      3. यूवी जोखिम से बाहर ले जाने के बाद, 95 पर स्लाइड सेंकना6, सी 1 मिनट के लिए, और फिर इसे कमरे के तापमान को ठंडा होने दें।
    4. विकास
      1. 60 एस के लिए डेवलपर समाधान में स्लाइड पर पैटर्न का विकास करना।
      2. डेवलपर से स्लाइड निकालें, डि पानी के साथ यह फ्लश, और एन 2 प्रवाह के साथ सूखी।
      3. एक खुर्दबीन के नीचे पैटर्न ज्यामिति की जाँच करें, और मापने के लिए और सुविधा आकार रिकॉर्ड है।
    5. सोने के बयान (ई-बीम वाष्पीकरण) और लिफ्ट बंद
      1. 5 मिनट के लिए 120 डिग्री सेल्सियस पर स्लाइड सेंकना, और यह कमरे के तापमान को ठंडा होने दें।
      2. 500 Torr और 100 डब्ल्यू पर 90 एस के लिए प्रतिक्रियाशील आयन नक़्क़ाशी (आर.आई.ई.) मशीन में प्लाज्मा के साथ स्लाइड साफ
      3. तिवारी की जमा 5 एनएम और एक ई-बीम बाष्पीकरण 17 का उपयोग कर स्लाइड पर Au के 15 एनएम।
      4. एक गिलास photoresist पदच्युत NFR के शीर्ष पर सोने के आराम को दूर करने का विरोध विलायक युक्त बीकर में रात भर भिगो दें स्लाइड।
      5. स्लाइड निकालते हैं, फ्लश मैंएसीटोन के साथ टी आईपीए द्वारा पीछा किया, और एन 2 प्रवाह के साथ सूखी।
      6. 90 एस के लिए 100 डब्ल्यू पर ऑक्सीजन प्लाज्मा आशेर में यह साफ करने से पहले 115 डिग्री सेल्सियस पर एक गर्म थाली पर स्लाइड सूखी।
  2. लिफ्ट बंद से आणविक विधानसभा patterning (MAPL)
    नोट: प्रत्येक fibronectin लेपित द्वीप के क्षेत्र के भीतर 700-900 माइक्रोन 2 एक वर्ग क्षेत्र में फैल द्वीप पर कुल एकाधिक कोशिकाओं की संभावना को कम करते हुए पर्याप्त हेला सेल की सुविधा के लिए होना तय है। सेल patterning द्वीपों की तैयारी के लिए एक योजनाबद्ध आरेख चित्रा 3 बी में दिखाया गया है।
    1. स्पिन कोटिंग
      1. दोहराएँ कदम 1.1.2, लेकिन S1813 पॉजिटिव photoresist और 115 डिग्री सेल्सियस के तापमान का उपयोग करें।
    2. गठबंधन photolithography
      1. मुखौटा aligner पर क्रोम मुखौटा माउंट और सुनिश्चित करें कि पैटर्न के साथ पक्ष के साथ स्लाइड नीचे की ओर का सामना करना पड़ रहा है करसोने डॉट्स।
      2. यूवी जोखिम के 9 एस के साथ कठिन जोखिम मोड के लिए फोटोलिथोग्राफी नुस्खा सेट करें।
      3. संरेखण के निशान, मुखौटा के किनारे के आसपास स्थित का उपयोग कर नीचे स्लाइड के साथ शीर्ष मुखौटा संरेखित, एक स्थानिक संदर्भ के रूप में।
      4. नकाब के मध्य भाग की जाँच करें और सत्यापित करें कि पैटर्न सुविधाएँ ठीक से जुड़ रहे हैं।
      5. एक के बाद सेंकना बिना यूवी जोखिम को पूरा करें।
    3. विकास
      1. 1.1.3 लेकिन एक hotplate पर सुखाने और एन 2 भंडारण में संरक्षण से पहले विकास के 45 एस के साथ कदम दोहराएँ।
  3. रासायनिक उपचार
    1. passivating समाधान तैयार: 0.5 मिलीग्राम / 10 मिमी HEPES बफर में एमएल पीएलएल-G-खूंटी।
    2. एन 2 भंडारण से स्लाइड निकालते हैं और पैरामीटर की स्थापना के साथ आर.आई.ई. का उपयोग करते हुए यह साफ: 500 Torr दबाव, 100-W शक्ति, और 90-एस अवधि।
    3. आयल फिल्म के एक टुकड़े पर समाधान passivating की पिपेट एक बूंद। </ Li>
    4. फिल्म और स्लाइड के साथ समाधान सैंडविच, यकीन है कि सुविधाओं के पैटर्न के साथ नीचे की ओर इस फिल्म की ओर का सामना करना पड़ रहा है कर रही है; बुलबुले के गठन से बचें।
    5. फिल्म से स्लाइड हटाने से पहले 45 मिनट के लिए प्रतीक्षा करें।
    6. photoresist पदच्युत, photoresist पदच्युत और डि पानी (1: 1) में लगातार स्लाइड लेना, और डि पानी, और प्रत्येक सोख लिए 90 एस के लिए एक अल्ट्रासाउंड स्नान में यह आंदोलन।
    7. एक hotplate पर स्लाइड सूखी एक desiccator में यह सील और एक रेफ्रिजरेटर में भंडारण से पहले नमी को दूर करने के लिए।
  4. चिप विधानसभा
    1. दोहराएँ 1.1.1-1.1.4 कदम है, लेकिन SU8-2025 नकारात्मक photoresist और पैरामीटर की स्थापना के साथ Microchem प्रोटोकॉल 18 बुलाया जाता है, एक photomask के साथ एक सिलिकॉन मोल्ड तैयार करने के लिए।
    2. एक PDMS microchannel (40 मिमी x 25 मिमी x 5 मिमी, एल एक्स डब्ल्यू एक्स एच) और एक छोटे से PDMS स्लैब (800 माइक्रोन चौड़ा नाली संरचना) नरम लिथोग्राफी का उपयोग बनाना।
    3. microchanne पंचद्रव उपयोग बंदरगाहों के लिए एल और स्वच्छ यह टेप के साथ और फिर आईपीए के साथ।
    4. (100 डब्ल्यू, 500 mTorr, 60 एस) परिधीय क्षेत्र से पीएलएल-G-खूंटी दूर करने के लिए PDMS स्लैब के साथ कांच सब्सट्रेट के नमूनों क्षेत्र ढाल, और आर.आई.ई. लागू होते हैं।
    5. आर.आई.ई. (25 डब्ल्यू, 500 mTorr, 25 एस) के एक कम खुराक के साथ microchannel समझो, और फिर नमूनों ग्लास सब्सट्रेट करने के लिए यह पंक्ति (छोटे PDMS स्लैब हटा साथ); microchannel और एक स्टिरियोस्कोप के तहत conformal संपर्क में नमूनों गिलास सब्सट्रेट लाने के लिए।

चित्र तीन
चित्रा 3: microfabrication और चिप विधानसभा के लिए योजनाबद्ध चित्र। क) ग्लास सब्सट्रेट पर सोने डॉट्स के पैटर्न। ख) MAPL के माध्यम से सेल patterning के लिए ग्लास सब्सट्रेट की तैयारी। ग) प्लाज्मा संबंध के साथ microfluidic चैनल के विधानसभा। परिभाषा के लिए सामग्री सूची देखें ओसंक्षिप्त एफ। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

  1. सेल लगाव
    नोट: हेला कोशिकाओं नियमित तौर पर 10% FBS और एक सेल कल्चर इनक्यूबेटर में 1% एंटीबायोटिक / समसूत्रणरोधी समाधान के साथ पूरक DMEM में रखा जाता है। चिप विधानसभा और सेल लगाव के लिए एक योजनाबद्ध आरेख चित्रा -3 सी में दिखाया गया है।
    1. प्रधानमंत्री 1 μL / मिनट पर 30 मिनट के लिए पीबीएस के साथ चिप, और फिर दिखे fibronectin समाधान (पीबीएस में 50 माइक्रोग्राम / एमएल, 1 μL / मिनट) 45 मिनट के लिए।
    2. 0.25% trypsin EDTA के साथ इंतजार करते हुए, Trypsinize सेल संस्कृति, उन्हें संस्कृति के माध्यम से, सेंट्रीफ्यूज व्यक्ति की कोशिकाओं में धोने, और 5x10 6 कोशिकाओं / एमएल पूर्व गर्म (37 डिग्री सेल्सियस) संस्कृति के माध्यम में सेल निलंबन पुनर्गठित।
    3. पीबीएस के साथ फ़ाइब्रोनेक्टिन समाधान बदलें और 5 मिनट के लिए 10 μL / मिनट पर चिप फ्लश।
    4. इंजेक्षनचिप में तैयार सेल निलंबन, प्रवाह को रोकने के आउटलेट बंद करना, और 30 मिनट के लिए एक सेल कल्चर इनक्यूबेटर में चिप बनाए रखें।
    5. आउटलेट जारी है और 5 मिनट के लिए 10 μL / मिनट पर सेल संस्कृति के माध्यम से चिप फ्लश। 0.75 μL / मिनट के लिए मध्यम संस्कृति के छिड़काव प्रवाह की दर को कम करने और इनक्यूबेटर में 2 घंटे के लिए सेल संस्कृति को बनाए रखने।

2. बुलबुला जनरेशन और प्रवाह दर्शन

नोट: प्रयोगात्मक स्थापना का एक योजनाबद्ध मिलकर बुलबुला पीढ़ी और एक एकल कोशिका एक microfluidic चैनल में आसपास उगाई साथ परिणामी प्रवाह बातचीत के लिए चित्रा -4 ए में दिखाया गया है।

  1. मिलकर की पीढ़ी दो लेज़रों और समय पर नियंत्रण के साथ बुलबुले
    1. एक औंधा माइक्रोस्कोप के मंच पर microfluidic चिप प्लेस और दो स्पंदित एन डी के foci align: नमूनों सोने डॉट्स अलग ख की एक जोड़ी पर YAG लेजर (λ = 532 एनएम, 5-NS पल्स अवधि)y 40 माइक्रोन।
    2. दो बुलबुले सोने डॉट्स पर शुरू करने के लिए उत्पादन 2.5 μs के बारे में एक समय में देरी के साथ दो लेज़रों को गति प्रदान करने के लिए एक डिजिटल देरी जनरेटर का प्रयोग करें।
    3. 50 ± 2 माइक्रोन के भीतर बुलबुले की एक अधिकतम व्यास का उत्पादन करने के लिए लेजर उत्पादन ऊर्जा (~ 10 μJ) समायोजित करें।
    4. लेज़रों के लिए एक उच्च गति कैमरा (200-NS जोखिम और प्रति सेकंड 2 लाख फ्रेम (एफपीएस)) सिंक्रनाइज़ और बुलबुला विस्तार, पतन, बुलबुला बुलबुला बातचीत, और जेट गठन की गतिशीलता पर कब्जा।
  2. जेट वेग की मात्रा
    1. पहले बुलबुला (बी 1) और बी 1 के बाहर का अंत के समीपस्थ अंत में जेट टिप (जे 1) की स्थिति को रिकॉर्ड, दूसरी बुलबुला (बी 2) की पीढ़ी में शुरू करने और जम्मू के touchdown के साथ समाप्त बी 1 के बाहर का अंत की ओर 1; चित्रा 5 ए में योजनाबद्ध देखें।
    2. Linearly बीओटी के लिए स्थिति के समय पाठ्यक्रम फिटज समीपस्थ (जेट टिप) और बाहर समाप्त होता है। बनाम समय वक्र टिप स्थिति के ढलान की गणना समीपस्थ अंत जेट गति निर्धारित करने के लिए। दो लाइनों के चौराहे जेट touchdown समय इंगित करता है। अधिक जानकारी के संदर्भ में 19 पाया जा सकता है।
  3. मिलकर बुलबुला प्रेरित प्रवाह क्षेत्र के दृश्य
    1. 1 माइक्रोन polystyrene से (पी एस) मनका डि पानी में निलंबन (2.6% w / v) और microfluidic चिप में मोती इंजेक्षन तैयार करें।
    2. कदम 2.1.1-2.1.3 में वर्णित के रूप में मिलकर बुलबुले उत्पन्न करता है।
    3. एक 100-NS जोखिम समय के साथ के 5 एम एफपीएस एक तैयार दर पर एक उच्च गति वीडियो कैमरे का उपयोग रिकॉर्ड मिलकर बुलबुला गतिशीलता।
    4. एक वाणिज्यिक PIV सॉफ्टवेयर में अपलोड अधिग्रहीत छवि अनुक्रम।
    5. एक 75% ओवरलैप के साथ 16 x 16 पिक्सल (पिक्सल) के छोटे पूछताछ खिड़कियों में प्रत्येक छवि फूट डालो।
    6. लागू बहु-पास चलना और क्षेत्रीय फिल्टर वेग क्षेत्र गणना में त्रुटियों को कम करने के लिए, औरउत्पादन एक वेग सदिश नक्शे में परिणाम है।

चित्रा 4
चित्रा 4: प्रयोगात्मक सेटअप और छवि रिकॉर्डिंग के योजनाबद्ध। क) मिलकर बुलबुला पीढ़ी के लिए प्रायोगिक स्थापना। ख) समय अनुक्रम इमेजिंग अधिग्रहण के विभिन्न प्रकार के लिए इस्तेमाल किया। फ्लोरिडा: प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी, बीएफ: उज्ज्वल क्षेत्र, IFT: interframe का समय है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

3. एकल कोशिका विश्लेषण और Bioeffects

नोट: मिलकर बुलबुला लक्ष्य कोशिकाओं के बगल में उत्पादन किया है, और उसके एवज में bioeffects गतिरोध दूरी पर निर्भर ढंग से अध्ययन कर रहे हैं। छवि अधिग्रहण के विभिन्न प्रकारों के लिए समय अनुक्रम चित्रा 4 बी में दिखाया गया है।

  1. झिल्ली poration और macromolecular तेज
    नोट: लक्ष्य सेल में कोशिकी अणुओं के तेज प्रगतिशील झिल्ली impermeant propidium आयोडाइड की कोशिका झिल्ली पर poration साइट के माध्यम से (पीआई) प्रसार की विशेषता है।
    1. 1.5 कदम के बाद, पीआई समाधान (DMEM में 100 माइक्रोग्राम / एमएल) प्रयोग के दौरान 0.5 μL / मिनट की एक छिड़काव प्रवाह दर पर चलाने के साथ नियमित रूप से संस्कृति के माध्यम से (यानी, DMEM) की जगह।
    2. माइक्रोस्कोप नियंत्रण सॉफ्टवेयर प्रोग्राम स्वचालित रूप से घूर्णन बुर्ज पर गड़बड़ी फ्लोरोसेंट क्यूब का चयन करें और पीआई प्रतिदीप्ति उत्तेजना के साथ सीसीडी कैमरा के समय सिंक्रनाइज़ करने के लिए प्रतिदीप्ति छवियों 200 एमएस के एक जोखिम समय के साथ पकड़ने के लिए।
    3. दो लेजर foci अगले मिलकर बुलबुला इलाज से पहले एक लक्ष्य कक्ष, रिकॉर्ड दोनों उज्ज्वल क्षेत्र (बीएफ) और प्रतिदीप्ति (फ्लोरिडा) छवियों के लिए सोने डॉट्स की एक जोड़ी के लिए गठबंधन कर रहे हैं के बाद।
    4. तुरंत करने के लिए माइक्रोस्कोप नियंत्रण सॉफ्टवेयर का उपयोगलक्ष्य सेल की एक समय चूक प्रतिदीप्ति छवि रिकॉर्डिंग शुरू शीघ्र ही कदम के बाद 2.1 पीआई तेज के इतिहास पर कब्जा करने के लिए।
  2. झिल्ली विरूपण
    1. 1-माइक्रोन मोती (1% w / वी, पानी में घुलनशील carbodiimide के साथ सक्रिय) तैयार करें और उन्हें पेप्टाइड 2000 (पीबीएस में 100 माइक्रोग्राम / एमएल) के साथ functionalize।
    2. 1.5 कदम के बाद 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 1x10 9 मोती / एमएल के घनत्व पर क्रियाशील मोतियों के साथ संलग्न कोशिकाओं सेते हैं।
    3. दोहराएँ कदम 2.1 लक्ष्य सेल के बगल में मिलकर बुलबुले का उत्पादन और एक अल्ट्रा हाई-स्पीड कैमरा के 5 लाख एफपीएस एक तैयार दर पर चलने के साथ सेल विरूपण रिकॉर्ड करने के लिए।
    4. 3 मोती है कि प्रयोग के दौरान इमेजिंग विमान पर बने रहने का एक त्रय को पहचानें और के रूप में उनके पदों (एक्स 1, y 1) (2 एक्स, वाई 2) संकलन, और (एक्स 3, वाई 3) प्रयोग में समन्वय करता है।
    5. पहले और वायुसेना तीनों के क्षेत्र की गणनामिलकर बुलबुला उपचार आतंकवाद सूत्र का उपयोग:
      1 समीकरण
    6. क्षेत्र में तनाव के रूप में की गणना:
      2 समीकरण
    7. पहले और मिलकर बुलबुला उपचार के बाद तीन कोने के निर्देशांक के आधार पर, स्थानीय प्रिंसिपल तनाव और तनाव क्षेत्र स्थापित प्रोटोकॉल 20,21 निम्नलिखित गणना।
  3. व्यवहार्यता और apoptosis
    नोट: FITC Annexin वी apoptotic लोगों सहित कोशिकाओं, लेबल, phosphatidylserine (हरी प्रतिदीप्ति) के externalization के माध्यम से। पीआई परिगलित कोशिकाओं (लाल प्रतिदीप्ति) के नाभिक लेबल। उज्ज्वल क्षेत्र इमेजिंग सेल आकृति विज्ञान दस्तावेज़ करने के लिए और सेल व्यवहार्यता और apoptosis की पहचान के साथ सहायता के लिए प्रयोग किया जाता है।
    1. Microfluidic चैनल (चैनल में पता लेबल द्वारा सुविधा में प्रत्येक में इलाज सेल की स्थिति को रिकॉर्ड, चित्रा 2 बी देखना
    2. 15 मिनट के लिए FITC Annexin वी समाधान के साथ चिप perfusing से पहले एक और 2 घंटे के लिए सेल संस्कृति के माध्यम से इलाज किया कोशिकाओं को सेते हैं। सकारात्मक कोशिकाओं हरी प्रतिदीप्ति प्रदर्शित करते हैं।
    3. दोहराएँ कदम 3.3.2 24 घंटे मिलकर बुलबुला उपचार के बाद लक्षित कोशिकाओं में लंबी अवधि bioeffects अध्ययन करने के लिए।
  4. कैल्शियम प्रतिक्रिया
    1. 3 से 10 की μL% के साथ Fura-2 AM शेयर समाधान के 3 μL (1 मिलीग्राम / DMSO में एमएल) मिश्रण डब्ल्यू / वी Pluronic एफ 127 के लिए कम सीरम मध्यम अंतिम लेबलिंग समाधान (6 माइक्रोन) तैयार करने के लिए के 500 μL में।
    2. 1.5 कदम के बाद, लेबलिंग समाधान के साथ सेल संस्कृति माध्यम की जगह है और 40 मिनट (1 μL / मिनट छिड़काव की दर) के लिए अंधेरे में कमरे के तापमान के तहत सेते हैं।
    3. सेल प्रयोग शुरू करने से पहले कम हो सीरम मध्यम (0.75 μL / मिनट छिड़काव की दर) के साथ चैनल फिर से भरना।
    4. ratiometric इमेजिंग शुरू (वेवलेंथ: 340/380 एनएम, 50-एमएस जोखिम)लक्ष्य सेल के वाणिज्यिक ने पीटीआई प्रणाली का उपयोग कर।
    5. आराम के स्तर पर सेल के ratiometric इमेजिंग, 2.1 कदम के रूप में मिलकर बुलबुले का उत्पादन का 10 S के बाद; एक interframe 1 मिनट के लिए 0.1 एस के समय (IFT) के साथ पहले रिकॉर्ड है, तो एक मिनट के लिए 1 एस के लिए IFT बढ़ाने के लिए, और 2 मिनट के बाद 5 एस के लिए आगे वृद्धि हुई है।
    6. ब्याज की क्षेत्र (आरओआई) है, जो intracellular कैल्शियम एकाग्रता के लिए आनुपातिक है में अनुपात आर = F340 / F380 गणना करने के लिए पीटीआई के सॉफ्टवेयर का प्रयोग करें।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

microfluidic इस काम में वर्णित मंच बुलबुला बुलबुला बातचीत की जांच करने और एकल कोशिका के स्तर पर cavitation प्रेरित bioeffects की एक किस्म का विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। यहाँ, हम कई उदाहरण पेश प्रयोगात्मक अध्ययन और bioassays कि हमारे प्रायोगिक प्रणाली में किया जा सकता है की एक किस्म प्रदर्शन करने के लिए। हम पहले जेट गठन, उसके एवज में प्रवाह क्षेत्र के दृश्य, और जेट गति (चित्रा 5 ए) की गणना के साथ मिलकर बुलबुले के क्षणिक बातचीत समझाना होगा। हम मिलकर की तो वर्तमान उदाहरण बुलबुला प्रेरित होगा स्थानीय कोशिका झिल्ली विरूपण (चित्रा 5 ब), पीआई तेज (चित्रा 5C), और intracellular कैल्शियम प्रतिक्रिया (चित्रा 5 डी) के साथ pinpointed झिल्ली poration। इस तरह के सेल व्यवहार्यता और apoptosis assays के रूप में अन्य उदाहरण, संदर्भ 22 में पाया जा सकता है।

चित्रा 5 ए जेट गठन, उच्च गति इमेजिंग द्वारा कब्जा कर लिया, और उसके एवज में प्रवाह क्षेत्र PIV से पता चला के साथ मिलकर बुलबुला बातचीत का एक उदाहरण दिखाता है। विशेष रूप से, अपने अधिक से अधिक विस्तार के बाद, (0 μs में उत्पादित) पहली बुलबुला बी 1 के पतन asymmetrically (2.5 μs में उत्पादित) 2 दूसरा बुलबुला बी का तेजी से विस्तार से विकृत है, एक "ऊपर की ओर 'के गठन के लिए अग्रणी जेट 3.4 μs पर (जे 1) और बाद में jetting प्रवाह, 5.4 μs में दिखाया गया है। औसत जेट गति बी 1 के समीपस्थ अंत (या ध्रुव) touchdown से पहले की स्थिति के लिए एक फिट लाइन की ढलान से निर्धारित होता है (यानी, बी 1 के बाहर का अंत के साथ संपर्क) समय बनाम। औसत जेट गति जब बी की अधिकतम व्यास 40 से 2 बढ़ जाती है 60 माइक्रोन के लिए 20 से 58 मीटर / s से बढ़ाने के लिए पाया जाता है। PIV विश्लेषण, tand आसपास दिशात्मक jetting प्रवाह के परिणामों के आधार परउन्हें बुलबुला 10 मीटर / एस के आदेश पर है और 10 माइक्रोन के आदेश पर एक चौड़ाई के भीतर ही सीमित है। यह एक लक्ष्य सेल पास उगाया पर एक आवेगी और स्थानीय कतरनी तनाव और तनाव को ढाल के उत्पादन की इस प्रकार सक्षम है।

चित्रा 5 ब में दिखाया गया है एक और उदाहरण दिखाता है कोशिका झिल्ली विरूपण दिशात्मक और स्थानीय jetting मिलकर द्वारा उत्पादित प्रवाह से प्रेरित पर गतिरोध दूरी एस डी = 40 माइक्रोन बुलबुले। झिल्ली विरूपण और वसूली के एक क्रियाशील मनका (पीले बिंदीदार रेखा द्वारा इंगित) कोशिका झिल्ली के अग्रणी धार से जुड़ी के विस्थापन से डाला जाता है। स्थानीय क्षेत्र में तनाव आसन्न मोतियों की एक त्रय के समन्वय से गणना की जा सकती है। कोशिका की सतह पर विभिन्न स्थानों पर गणना की अधिकतम क्षेत्र परिवर्तन का एक योजनाबद्ध बीच में दिखाया गया है। अग्रणी धार मुख्य रूप से फैला है (हरी हलकों देखें), जबकि अनुगामी किनारे या अक्षांशसेल के आम पक्षों संकुचित कर रहे हैं (जैसा कि लाल हलकों द्वारा इंगित), मिलकर बुलबुला प्रेरित jetting प्रवाह द्वारा उत्पादित सेल विरूपण में विविधता का संकेत है। सेल अग्रणी धार पर क्षेत्र में तनाव का बदलाव अस्थायी सही पर सचित्र है। यह शुरुआत में कुछ तेजी दोलनों, के बारे में 100 μs (FWHM) और कई एमएस के एक समय के पैमाने पर बाद में एक क्रमिक वसूली के लिए एक बड़े और निरंतर खिंचाव के द्वारा पीछा के शामिल है।

इसके अलावा, बड़े क्षेत्र में तनाव और तनाव सेल में अभिन्न अग्रणी धार, कोशिका झिल्ली poration छोटी सी एस डी पर मनाया के लिए जिम्मेदार हो सकता है के रूप में दिखाया गया है चित्रा 5C। छोटी सी एस डी में (यानी, 10 माइक्रोन, या कुछ मामलों में, 20 माइक्रोन में) और मध्यवर्ती एस डी (यानी, 20 और 30 माइक्रोन के बहुमत), एक स्थानीय झिल्ली व्यवधान प्रेरित है, बाह्य पीआई के एक तुच्छ तेज करने के लिए अग्रणी मेंcytosol। सेल के अंदर पीआई तीव्रता संतृप्ति बिना बढ़ती रहती हैं, तो गल जाना होता है। इसकी तुलना में, अगर पीआई तीव्रता परिमाण के एक आदेश कम है और मिलकर बुलबुला इलाज के बाद 10 एस के भीतर एक पठार तक पहुँच जाता है, संभावना सेल अस्तित्व के साथ मरम्मत योग्य poration घटित होगा, जो आगे सेल आकृति विज्ञान में मामूली बदलाव के द्वारा समर्थित है। बड़ी एस डी (यानी, 40 माइक्रोन), पर नगण्य पीआई तेज मिलकर बुलबुला इलाज के बाद पाया जाता है, नगण्य या गैर poration का संकेत है। सेल नियमित रूप से विकास और प्रसार 22 के साथ जीवित रह सकते हैं। कुल मिलाकर, परिणाम एक स्पष्ट एस डी ≈ 20-40 माइक्रोन की रेंज में मरम्मत योग्य झिल्ली poration के माध्यम से नेक्रोसिस से सेल जवाब में संक्रमण, गैर poration करने के लिए, दिखाने के लिए।

अंत में, हम intracellular कैल्शियम प्रतिक्रिया के ratiometric इमेजिंग अलग एस में व्यक्ति की कोशिकाओं में मिलकर बुलबुले द्वारा हासिल की परिणाम दिखानेडी, विशेष रूप से एस डी के sublethal रेंज में = 30-50 माइक्रोन (चित्रा 5 डी)। तीव्रता अनुपात intracellular कैल्शियम की मात्रा के अनुपात में होती है। छोटी सी एस डी में (यानी, 30 माइक्रोन या, कुछ मामलों में, 40 माइक्रोन में), अग्रणी धार से अनुगामी किनारे करने के लिए यात्रा एक कैल्शियम लहर स्पष्ट रूप से मिलकर बुलबुला इलाज के बाद कुछ ही सेकंड के भीतर मनाया जाता है। बाद intracellular कैल्शियम की एक चोटी एकाग्रता पहुंचता है, यह धीरे धीरे वापस कुछ ही मिनटों के भीतर आराम के स्तर को decays। इसके विपरीत, बड़ी एस डी में (यानी, 50 माइक्रोन के बहुमत, या कुछ मामलों में, 40 माइक्रोन), intracellular कैल्शियम की वृद्धि बहुत मामूली है, और कोई स्पष्ट रूप से दिखाई यात्रा कैल्शियम लहर पहचाना जा सकता है। ये दो अलग कैल्शियम की प्रतिक्रियाएं भी स्तर आराम कर चोटी से उनकी तीव्रता अनुपात बनाम समय प्रोफाइल से प्रतिष्ठित किया जा सकता तीव्रता अनुपात और वृद्धि समय के शिखर आयाम में महत्वपूर्ण अंतर के साथ,मूल्य। एक भी बड़ा एस डी (यानी, 60 माइक्रोन से ऊपर), कोई कैल्शियम प्रतिक्रिया मनाया जा सकता है। विभिन्न एस डी में कैल्शियम की प्रतिक्रियाएं प्रदर्शित हेला कोशिकाओं का प्रतिशत चित्रा 5 डी (दाएं) में संक्षेप।

सब सब में, हमारे परिणाम दिखा दिया है कि, jetting प्रवाह की ताकत में फेरबदल (या बदलने के एस डी) द्वारा, bioeffects की एक किस्म के समान संस्कृति की शर्तों के तहत अलग-अलग हेला कोशिकाओं है, जो की संभावना आयाम और अवधि के साथ जोड़ा जाता है में उत्पादन किया जा सकता है कोशिका झिल्ली 22 पर लगाया यांत्रिक विरूपण की।

चित्रा 5
चित्रा 5: मिलकर बुलबुला बातचीत, कोशिका झिल्ली विरूपण, झिल्ली poration, और कैल्शियम प्रतिक्रिया assays से परिणाम। क) द्रव गति और जेटमिलकर बुलबुला बातचीत के द्वारा प्रेरित किया। वाम: चयनित फ्रेम जेट गठन के साथ मिलकर बुलबुला बातचीत दिखा रहा है और प्रवाह PIV से पता चला क्षेत्र। दो बुलबुले की अधिकतम व्यास के बारे में 50 ± 2 माइक्रोन कर रहे हैं। मध्य: jetting मिलकर बुलबुले के योजनाबद्ध, पहले बुलबुला बी 1 के केंद्र अक्ष, निर्देशांक (ओ) का मूल है, और प्रॉक्सिमल और बाहर समाप्त होता है (या डंडे) को दर्शाता हुआ। अधिकार: मापा पोल पदों (त्रुटि के साथ = ± 1 माइक्रोन) समीपस्थ और बी 1 के बाहर अंत में। ख) कोशिका झिल्ली विरूपण। वाम: पीले बिंदीदार रेखा एक पी एस कोशिका झिल्ली के अग्रणी धार से जुड़ी मनका के विस्थापन लेबल, स्थानीय झिल्ली विरूपण और वसूली का संकेत है। मध्य: एक योजनाबद्ध शिखर क्षेत्र दिखा बाईं तरफ दिखाया कोशिका की सतह पर विभिन्न स्थानों पर तनाव। अधिकार: सेल अग्रणी धार के बीच में क्षेत्र स्ट्रेन के समय पाठ्यक्रमों। Δ ε क्षेत्र में तनाव गणना की बस हैप्रिंसिपल उपभेदों पर एड और Δ Δ क्षेत्र में तनाव त्रय ज्यामिति परिवर्तन के आधार पर गणना की है। क्षेत्र में तनाव गणना और त्रुटि विश्लेषण के बारे में अधिक जानकारी के संदर्भ 22. ग) कोशिका झिल्ली poration में दर्ज हैं। उज्ज्वल क्षेत्र छवियों से पहले और पीआई तेज (0 और 120 एस) के मिलकर बुलबुला उपचार और समय चूक प्रतिदीप्ति छवियों के बाद: वाम। सफेद तीर jetting प्रवाह की दिशा का संकेत मिलता है। मध्य: औसत पीआई तीव्रता बनाम कोशिकाओं के अंदर उस समय की विशेष परिवर्तन। अधिकार: अलग एस डी में नेक्रोसिस (लाल), मरम्मत योग्य poration (नीला), और गैर poration (हरा) के दौर से गुजर कोशिकाओं का प्रतिशत के सांख्यिकीय परिणाम है। कोशिकाओं की संख्या में इलाज: एन = 9, 14, 14, और एस डी = 10, 20, 30 के लिए 8, और 40, क्रमशः। आँकड़ों त्रुटि ± 1 / √ एन डी) intracellular कैल्शियम प्रतिक्रिया है। वाम: ratiometric छवियों के दृश्यों व्यक्ति सेल के intracellular कैल्शियम प्रतिक्रियाओं दिखा30 माइक्रोन और 50 माइक्रोन के एस डी पर है। लाल तीर जेट दिशा का संकेत मिलता है। मध्य: अलग एस डी पर ठेठ प्रतिक्रिया प्रोफाइल (अनुपात समय घटता)। अधिकार: अलग एस डी में एक कैल्शियम प्रतिक्रिया की संभावना है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

गतिरोध दूरी (एस डी) (माइक्रोन) रेनॉल्ड्स संख्या (रे) yz विमान में कतरनी तनाव (पा) के औसत
20 206.96 618.64
30 354.8 709.69
40 378.78 657.22
50 163.85 323.61
60 105.08 42.21

तालिका 1: PIV परिणामों से भौतिकी के प्रवाह के लिए मानकों की एक सूची। अनुमानित रेनॉल्ड्स संख्या और विभिन्न गतिरोध दूरी (एस डी) के संबंध में कतरनी तनाव औसत। Yz विमान चैनल चौड़ाई x ऊँचाई विमान को दर्शाता है। औसतन कतरनी तनाव चैनल नीचे से 0 7.7 माइक्रोन की ऊंचाई से अनुमान लगाया गया है क्योंकि चैनल में सेल ऊंचाई के आसपास 6-7 माइक्रोन है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

एकल कोशिका विश्लेषण, लाइव सेल इमेजिंग के साथ संयोजन में, बहुत ऐसी phenotype के विकास और प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया 23 के रूप में व्यक्तिगत कोशिकाओं में गतिशील और अक्सर चर प्रक्रियाओं के बारे में हमारी समझ को बढ़ाया है। बर्तन या बोतल में पारंपरिक सेल संस्कृति के विपरीत, सिस्टम microfluidic वास्तविक समय में एकल कोशिका के स्तर तक नीचे microenvironment के सटीक नियंत्रण, सक्षम। नतीजतन, microfluidic प्रौद्योगिकी के क्षेत्र में प्रगति और तकनीक काफी हद तक throughput और एकल कोशिका विश्लेषण के reproducibility में सुधार हुआ है। नरम लिथोग्राफी और सतह patterning को एकीकृत करके, सिस्टम microfluidic आगे spatiotemporally चर उत्तेजनाओं की जटिल पैटर्न के लिए एक एकल कोशिका की प्रतिक्रिया का गहराई से विश्लेषण की सुविधा के लिए बनाया जा सकता है। उदाहरण के लिए, क्षणिक रासायनिक या यांत्रिक संकेतों सफलतापूर्वक एकल कक्षों के लिए दिया गया है, जबकि उनके जैविक या यांत्रिक प्रतिक्रियाओं स्वचालित रूप से दर्ज किया गया और 2 विश्लेषण किया4। यह सामान्य प्रवृत्ति के बावजूद, सेलुलर स्तर पर cavitation प्रेरित bioeffects का विश्लेषण करने के लिए microfluidics के आवेदन बहुत सीमित किया गया है। सबसे विशेष रूप से, यह केवल micropillars 11 से फंस निलंबन में व्यक्ति की कोशिकाओं का बुलबुला प्रेरित झिल्ली poration करने के लिए लागू किया गया है। पक्षपाती कोशिकाओं पर अध्ययन के बहुमत में, सेल आकृति विज्ञान को नियंत्रित गतिशील बुलबुला सेल बातचीत में निरंतरता बनाए रखने के लिए के लाभ के लिए या तो अनुपलब्ध या काफी हद तक उपेक्षित है।

हम एक microfluidic प्रणाली ठीक दीक्षा, बाद में विस्तार, और cavitation बुलबुले के पतन की गतिशीलता को नियंत्रित करने के लिए विकसित किया है; जेट गठन के साथ बुलबुला बुलबुला बातचीत; और सेल आकार, अभिविन्यास, आसंजन पैटर्न, और बुलबुले से गतिरोध दूरी, इस प्रकार प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य jetting प्रवाह के लिए अनुमति अच्छी तरह से नियंत्रित प्रयोगात्मक परिस्थितियों में व्यक्ति की कोशिकाओं के लिए लागू किया जाएगा। इस उपन्यास microfluidic प्रणाली मौलिक सेंट बाहर ले जाने के लिए आदर्श हैcavitation बुलबुला (ओं) पर udies बातचीत है कि इस तरह के SWL, HIFU, और sonoporation के रूप में चिकित्सीय अल्ट्रासाउंड अनुप्रयोगों की एक विविध रेंज के लिए प्रासंगिक हैं कोशिका है। हमने दिखा दिया है कि हमारे microfluidic प्रणाली कोशिका झिल्ली विरूपण, झिल्ली poration, व्यवहार्यता और कैल्शियम प्रतिक्रिया सहित विभिन्न cavitation प्रेरित bioeffects, जांच करने के लिए एक अधिक नियंत्रणीय और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य तरीके से इस्तेमाल किया जा सकता है। सबसे विशेष रूप से, दिशात्मक jetting प्रवाह मिलकर बुलबुले द्वारा उत्पादित उच्च तनाव दरों के तहत अलग-अलग कोशिकाओं है कि अच्छी तरह से होती नहीं किया गया है में यांत्रिक संपत्ति और कैल्शियम प्रतिक्रिया की जांच करने के लिए हमें की अनुमति देता है। स्थानीय, आवेगी यांत्रिक तनाव इस तरह के एक jetting प्रवाह द्वारा उत्पादित ऐसे micropipette आकांक्षा 25 के रूप में पारंपरिक तरीकों खींच, और ऑप्टिकल 26 के उपयोग और चुंबकीय चिमटी 27 से हासिल नहीं किया जा सकता है। इसके अलावा, पिछले अध्ययनों अल्ट्रासाउंड विपरीत एजेंटों 8,28-30 या का उपयोग करने के लिए इसके विपरीत में लेजर प्रेरित एकल बूbbles 31,32, हमारे microfluidic प्रणाली सेल ज्यामिति और आसंजन की स्थिति के बेहतर नियंत्रण है, इस प्रकार सेलुलर प्रतिक्रिया और bioeffects 16 पर उनकी काफी प्रभाव को कम करने प्रदान करता है।

जबकि हमारी तकनीक विश्वसनीय और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य है, एक सुनिश्चित करने के लिए कि प्रायोगिक प्रणाली ईमानदारी से reproduced है सावधानी प्रोटोकॉल का पालन करना चाहिए। microchannel में सतह patterning की गुणवत्ता बुलबुला बुलबुला सेल बातचीत के reproducibility और नीचे की ओर bioeffects का झरना के लिए मुख्य रूप से जिम्मेदार है। उदाहरण के लिए, हेला कोशिकाओं के लिए, प्रत्येक सोने डॉट के क्षेत्र के आसपास 25-30 माइक्रोन 2 स्थिर बुलबुला पीढ़ी सुनिश्चित करने के लिए है, जबकि पालन करने से कोशिकाओं को रोकने होना चाहिए। दूसरी ओर, प्रत्येक fibronectin लेपित द्वीप के क्षेत्र पर्याप्त एक वर्ग में एक एकल कोशिका के प्रसार करते हुए द्वीप पर समुच्चय के गठन एकाधिक कोशिकाओं की संभावना को कम करने की सुविधा के लिए चारों ओर 700-900 मीटर 2 हो गया है। संरेखणसोने डॉट्स और fibronectin लेपित द्वीपों के बीच ठीक मुखौटा aligner की सहायता से किया जाना चाहिए 1 डिग्री और 0.5 माइक्रोन के भीतर अक्षीय त्रुटि के भीतर कोणीय त्रुटि को रखने के लिए। (: Μs, सेल विरूपण: एमएस, झिल्ली poration: एस, apoptosis: एच जैसे, बुलबुला गतिशीलता) इसके अलावा, इस प्रायोगिक प्रणाली बहुमुखी प्रतिभा घटनाओं की एक श्रृंखला की निगरानी में, परिमाण के आदेश से अलग अपने समय के पैमाने के साथ प्रदान करता है। इसलिए, यह सही ठीक ट्यूनिंग ट्रिगर संकेतों (एक डिजिटल देरी जनरेटर द्वारा नियंत्रित) द्वारा छवि अधिग्रहण और प्रत्येक दृश्य की रिकॉर्डिंग के समय को नियंत्रित करने के लिए महत्वपूर्ण है। एकल कोशिका संस्कृति में अच्छी तरह से microchannel phenotype में सेल करने वाली सेल भिन्नता को कम करने में बनाए रखा जाना चाहिए (ज्यादातर आकृति विज्ञान के रूप में)। इसलिए, एक कम से कम 2-एच ऊष्मायन सेल लगाव के लिए आवश्यक और नीचे की ओर सेल उपचार के साथ आगे बढ़ने से पहले द्वीपों पर फैल रहा है। यह हमेशा microchann में प्रवाह की दर रखने की सिफारिश की है3 μL / मिनट के तहत ईएल, इतना है कि प्रवाह कतरनी तनाव सेल पर घूम संस्कृति के माध्यम से उत्पादित शारीरिक सीमा के भीतर है।

हमारी तकनीक से एक वर्तमान सीमा यह है कि मिलकर बुलबुला बातचीत और उसके एवज में jetting प्रवाह केवल एक बार एक लक्ष्य सेल के लिए लागू किया जा सकता है, क्योंकि सोने डॉट्स लेजर विकिरण से ablated हो जाएगा। इस खामी चिकित्सीय अल्ट्रासाउंड, जहां कोशिकाओं अक्सर cavitation घटनाओं को उजागर कर रहे द्वारा उत्पादित bioeffects नकल करने के लिए हमारे प्रायोगिक प्रणाली की क्षमता की सीमा। हालांकि, इस अस्थायी सीमा तरल 15 में प्रत्यक्ष निवेश से सोने डॉट्स की रक्षा के लिए सिलिकॉन डाइऑक्साइड का एक और पतली परत को लागू करने से क्रमशः समाप्त किया जा सकता है। कुल मिलाकर, हमारे microfluidic प्रणाली cavitation बुलबुला (s) सेल बातचीत से उत्पादित bioeffects जांच करने के लिए अच्छी तरह से नियंत्रित प्रयोगात्मक शर्तों प्रदान करता है और कई अनूठी विशेषताएं है। सबसे पहले, दोनों के आकार और cavitation के स्थान हमारे ई में बुलबुलेxperimental प्रणाली ठीक घटना लेजर ऊर्जा सोने डॉट्स द्वारा अवशोषित समायोजन करके नियंत्रित किया जा सकता है। दूसरा, ज्यामिति और व्यक्ति की कोशिकाओं के आसंजन सेल patterning द्वारा मानकीकृत कर रहे हैं, सेल प्रतिक्रिया और bioeffects पर उनके प्रभाव को कम करने के लिए अधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य परिणामों के लिए अग्रणी। तीसरा, microfluidic चिप डिजाइन में समानांतर काम इकाइयों यह संभव ऐसे सेल के विकास, प्रसार, और संभावित जीन अभिव्यक्ति, cavitation प्रदर्शन के बाद के रूप में नीचे की ओर bioeffects, अध्ययन करने के लिए, के बाद से प्रत्येक कोशिका को संबोधित किया जा सकता है और व्यक्तिगत रूप से नजर रखी हैं। सारांश में, हमारे microfluidic प्रणाली और कार्यप्रणाली में सुधार परिशुद्धता के साथ व्यक्ति की कोशिकाओं के bioeffects अध्ययन करने के लिए विश्वसनीय बुलबुला बुलबुला बातचीत पैदा करते हैं।

हमारे वर्तमान चिप व्यक्ति हेला कोशिकाओं के विश्लेषण के लिए बनाया गया है। हालांकि, अन्य स्तनधारी सेल लाइनों के लिए पैटर्न द्वीपों में से एक संशोधन भी संभव है। कई सुधारों को आगे आवेदन व्यापक बनाने के लिए किया जा सकता हैचिप के एनएस। उदाहरण के लिए, पीएलएल-G-खूंटी अणुओं के विकल्प के 24 के बाद भी ज पलायन से अलग-अलग नमूनों की कोशिकाओं को रोकने के लिए पता लगाया जा सकता है। इसके अलावा, microfluidic वाल्व के साथ नई चिप डिजाइन, कोशिकाओं की स्थानीय microenvironment को नियंत्रित करने का पता लगाया जा सकता है कि इस तरह के प्रतिदीप्ति मार्करों या विषाक्त अभिकर्मकों के रूप में रसायनों केवल चिप के अन्य क्षेत्रों में कोशिकाओं को प्रभावित किए बिना, एक विशिष्ट स्थान के लिए लागू किया जाएगा । इन सुधारों के साथ, microfluidic यहाँ प्रस्तुत प्रणाली ऐसी चयापचय, अलगाव, भेदभाव, और जीन अभिव्यक्ति के रूप में एकल कक्षों, cavitation जोखिम या यांत्रिक एक आवेगी प्रवाह द्वारा उत्पादित उत्तेजनाओं के बाद, के दीर्घकालिक bioeffects का अध्ययन करने के अवसर प्रदान कर सकता है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagent/Materials
75 mm x 38 mm Plain Microscope Slides Corning 2947-75X38
Acetone Sigma Aldrich, Co. 320110 ACS reagent, ≥99.5%
Isopropyl alcohol Sigma Aldrich, Co. W292907 ≥99.7%, FCC, FG
Sulfuric acid Sigma Aldrich, Co. 320501 ACS reagent, 95.0-98.0%
Hydrogen peroxide Sigma Aldrich, Co. 216763 30 wt.% in H2O
Primer P-20 Microchem MCC Primer 80/20
NFR photoresist JSR NFR016D2
Photomask Photoplotstore N/A 4x4 Direct write mask
MF-319 Developer Shipley (Rohm and Haas) Microposit MF-319
1165 Photoresist Remover Dow Chemical, Co. DEM-10018073 1-methyl-2-pyrrolidinone based
S1813 photoresist Shipley (Rohm and Haas) S1813
PLL-g-PEG SuSoS PLL(20)-g[3.5]- PEG(2)
HEPES ThermoFisher Scientific 15630080
Paraffin film HACH 251764
SU-2025 photoresist Microchem SU-2025
PDMS Dow Corning 184 SIL ELAST KIT 0.5KG
Microbore Tubing Saint-Gobain PPL Corp. S-54-HL
Metal pins New England Small Tube NE-1300-01 Cut Tube (straight), 0.025” OD x 0.017” ID x 0.50” Long
HeLa cells Duke Cell Culture Facility (307-CCL-2) HeLa, p.148
DPBS (1x) buffer ThermoFisher Scientific 14190144
DMEM culture medium ThermoFisher Scientific 11995065
Fibronectin Bovine Protein, Plasma ThermoFisher Scientific 33010018
0.25% Trypsin-EDTA (1x) ThermoFisher Scientific 25200056
Propidium Iodide ThermoFisher Scientific P21493
Carboxylate Microspheres 1.00 μm Polysciences, Inc 08226-15
Carboxylate Microspheres 2.00 μm Polysciences, Inc 18327-10
EDC (1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride) ThermoFisher Scientific 22980
Sulfo-NHS Sulfo-NHS (N-hydroxysulfosuccinimide) 24510
Peptite-2000 Advanced BioMatrix 5020-5MG
FITC Annexin V ThermoFisher Scientific A13199
Fura-2, AM ThermoFisher Scientific F1221
DMSO Sigma Aldrich, Co. D2650
F-127 invitrogen P6866 0.2 µm filtered (10% Solution in Water)
Reduced serum media  ThermoFisher Scientific 11058021
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
Plasma asher Emitech K-1050X O2 / Ar plasma ashing of photoresist and other organic materials
Mask aligner SUSS MicroTec  Karl Suss MA6/BA6
E-beam evaporator CHA Industries CHA Industries Solution E-Beam
RIE Trion Technology  Trion Technology Phantom II (oxide/ nitride/ polymer) etching
Stereoscope AmScope American Scope SM-4TZ-FRL Stereo Microscope
Syringe pump Chemyx Inc NanoJet
Cell culture incubator NuAire AutoFlow NU-8500 Water Jacket CO2 Incubator
Biological Safety Cabinets NuAire NU-425-400
Water bath VWR 1122s
Centrifuge IEC Centra CL2
Microscope Zeiss Axio Observer Z1
Nd:YAG laser  (laser 1) New Wave Research Tempest
Nd:YAG laser  (laser 2) New Wave Research Orion
Delay generator Berkeley Nucleonics  BNC 565-8c
Flash lamp Dyna-Lite ML1000 fiber-coupled flashtube
high speed camera DRS Hadland  Imacon 200
high speed  camera Shimadzu HPV-X
high speed camera Vision Research Phantom V7.3
PIV software LaVision DaVis 7.2
camera Zeiss AxioCam MRc 5
software Zeiss AxioVision
PTI system Horiba S/N: 1705 RAM-X
EasyRatio software Horiba Easy Ratio Pro 2 version 2.3.125.86
63× objective Zeiss LD Plan Neofluar

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wang, D., Bodovitz, S. Single cell analysis: the new frontier in 'omics. Trends Biotechnol. 28 (6), 281-290 (2010).
  2. Weaver, W. M., et al. Advances in high-throughput single-cell microtechnologies. Curr Opin Biotechnol. 25, 114-123 (2014).
  3. Gossett, D. R., et al. Hydrodynamic stretching of single cells for large population mechanical phenotyping. Proc Natl Acad Sci USA. 109 (20), 7630-7635 (2012).
  4. Spiller, D. G., Wood, C. D., Rand, D. A., White, M. R. H. Measurement of single-cell dynamics. Nature. 465 (7299), 736-745 (2010).
  5. Lecault, V., White, A. K., Singhal, A., Hansen, C. L. Microfluidic single cell analysis: from promise to practice. Curr Opin Chem Biol. 16 (3-4), 381-390 (2012).
  6. Kennedy, J. E. High-intensity focused ultrasound in the treatment of solid tumours. Nat Rev Cancer. 5 (4), 321-327 (2005).
  7. Zhu, S., Cocks, F. H., Preminger, G. M., Zhong, P. The role of stress waves and cavitation in stone comminution in shock wave lithotripsy. Ultrasound Med Biol. 28 (5), 661-671 (2002).
  8. Fan, Z., Liu, H., Mayer, M., Deng, C. X. Spatiotemporally controlled single cell sonoporation. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (41), 16486-16491 (2012).
  9. Itah, Z., et al. Hydrodynamic cavitation kills prostate cells and ablates benign prostatic hyperplasia tissue. Exp Biol Med. 238 (11), 1242-1250 (2013).
  10. Kosar, A., Sesen, M., Oral, O., Itah, Z., Gozuacik, D. Bubbly cavitating flow generation and investigation of its erosional nature for biomedical applications. IEEE Trans Biomed Eng. 58 (5), 1337-1346 (2011).
  11. Li, Z. G., Liu, A. Q., Klaseboer, E., Zhang, J. B., Ohl, C. D. Single cell membrane poration by bubble-induced microjets in a microfluidic chip. Lab Chip. 13 (6), 1144-1150 (2013).
  12. Li, F. F., Chan, C. U., Ohl, C. D. Yield Strength of Human Erythrocyte Membranes to Impulsive Stretching. Biophys J. 105 (4), 872-879 (2013).
  13. Li, F., M, M., Ohl, C. .D. . Shear stress induced stretching of red blood cells by oscillating bubbles within a narrow gap. Bull Am Phys Soc. 58, (2013).
  14. Sankin, G. N., Yuan, F., Zhong, P. Pulsating tandem microbubble for localized and directional single-cell membrane poration. Phys. Rev. Lett. 105 (7), 078101 (2010).
  15. Fan, Q., Hu, W., Ohta, A. T. Laser-induced microbubble poration of localized single cells. Lab Chip. 14 (9), 1572-1578 (2014).
  16. Chen, C. S., Mrksich, M., Huang, S., Whitesides, G. M., Ingber, D. E. Geometric control of cell life and death. Science. 276 (5317), 1425-1428 (1997).
  17. Yuan, F., Sankin, G., Zhong, P. Dynamics of tandem bubble interaction in a microfluidic channel. J Acoust Soc Am. 130 (5), 3339-3346 (2011).
  18. Microchem, SU-8 2000 Processing Guidelines. , Available from: http://www.microchem.com/pdf/SU-82000DataSheet2000_5thru2015Ver4.pdf (2000).
  19. Yang, C. Analysis of Tandem Bubble Interaction and Jet Formation in a Microfluidic Channel. , Duke University. (2013).
  20. Simon, S. I., Schmid-Schonbein, G. W. Cytoplasmic strains and strain rates in motile polymorphonuclear leukocytes. Biophys J. 58 (2), 319-332 (1990).
  21. Barbee, K. A., Macarak, E. J., Thibault, L. E. Strain measurements in cultured vascular smooth muscle cells subjected to mechanical deformation. Ann Biomed Eng. 22 (1), 14-22 (1994).
  22. Yuan, F., Yang, C., Zhong, P. Cell membrane deformation and bioeffects produced by tandem bubble-induced jetting flow. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 112 (51), E7039-E7047 (2015).
  23. Yin, H., Marshall, D. Microfluidics for single cell analysis. Curr Opin Biotechnol. 23 (1), 110-119 (2012).
  24. Tay, S., et al. Single-cell NF-kappa B dynamics reveal digital activation and analogue information processing. Nature. 466 (7303), 267-271 (2010).
  25. Rand, R. P., Burton, A. C. Mechanical Properties of the Red Cell Membrane: I. Membrane Stiffness and Intracellular Pressure. Biophys J. 4 (2), 115-135 (1964).
  26. Lim, C. T., Dao, M., Suresh, S., Sow, C. H., Chew, K. T. Large deformation of living cells using laser traps. Acta Mater. 52 (7), 1837-1845 (2004).
  27. Puig-de-Morales-Marinkovic, M., Turner, K. T., Butler, J. P., Fredberg, J. J., Suresh, S. Viscoelasticity of the human red blood cell. Am J Physiol Cell Physiol. 293 (2), C597-C605 (2007).
  28. Kudo, N., Okada, K., Yamamoto, K. Sonoporation by single-shot pulsed ultrasound with microbubbles adjacent to cells. Biophys J. 96 (12), 4866-4876 (2009).
  29. van Wamel, A., et al. Vibrating microbubbles poking individual cells: Drug transfer into cells via sonoporation. J Control Release. 112 (2), 149-155 (2006).
  30. Hu, Y., Wan, J. M., Yu, A. C. Membrane perforation and recovery dynamics in microbubble-mediated sonoporation. Ultrasound Med Biol. 39 (12), 2393-2405 (2013).
  31. Dijkink, R., et al. Controlled cavitation-cell interaction: trans-membrane transport and viability studies. Phys Med Biol. 53 (2), 375-390 (2008).
  32. Rau, K. R., Quinto-Su, P. A., Hellman, A. N., Venugopalan, V. Pulsed laser microbeam-induced cell lysis: Time-resolved imaging and analysis of hydrodynamic effects. Biophys J. 91 (1), 317-329 (2006).

Tags

जैव अभियांत्रिकी अंक 119 microfluidics एकल कोशिका विश्लेषण cavitation सेल pattering jetting प्रवाह झिल्ली poration झिल्ली विरूपण कैल्शियम प्रतिक्रिया
एकल कोशिका के स्तर पर cavitation बुलबुला (s) सेल इंटरेक्शन और उसके एवज में Bioeffects जांच के लिए सतह patterning के साथ एक microfluidic प्रणाली
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Li, F., Yuan, F., Sankin, G., Yang,… More

Li, F., Yuan, F., Sankin, G., Yang, C., Zhong, P. A Microfluidic System with Surface Patterning for Investigating Cavitation Bubble(s)–Cell Interaction and the Resultant Bioeffects at the Single-cell Level. J. Vis. Exp. (119), e55106, doi:10.3791/55106 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter