Abstract
In dit manuscript beschrijven we eerst de vervaardiging protocol van een microfluïdische chip met goud dots en fibronectine gecoate gebieden op hetzelfde glassubstraat, dat het genereren van tandem bellen en individuele cellen buurt patroon met goed gedefinieerde locaties en vormen nauwkeurig regelt. Vervolgens tonen de vorming van luchtbellen tandem door twee lasers verlichten van een paar gouden stippen met enkele microseconde vertraging. We visualiseren de bubble-bubble interactie en de vorming van jet door high-speed imaging en karakteriseren van de resulterende stroom veld met behulp van particle image velocimetry (PIV). Tenslotte geven we een aantal toepassingen van deze techniek voor enkele cel analyse, inclusief celmembraan poratie met macromolecuul opname gelokaliseerde deformatie membraan bepaald door de verplaatsingen van de bijgevoegde integrine-bindende kralen en intracellulair calcium reactie van ratiometrische beeldvorming. Onze resultaten tonen aan dat een snelle en gerichte jetting stroming progeproduceerd door de tandem bubble interactie, die een sterk gelokaliseerde schuifspanning kunnen opleggen aan het oppervlak van een cel gekweekt in de nabijheid. Bovendien kunnen er verschillende bioeffects worden geïnduceerd door het veranderen van de sterkte van de stroming jetting door instelling van de afstandsmeting van de cel tandem bubbels.
Introduction
Er is een groeiend besef dat de cellulaire heterogeniteit, die voortvloeien uit de stochastische expressie van genen, eiwitten en metabolieten, bestaat binnen een grote cel populatie en dient als een fundamenteel principe in de biologie mogelijk te maken voor mobiele aanpassing en evolutie 1. Daarom is het vaak onnauwkeurig en onbetrouwbaar populatie gebaseerde bulk metingen gebruiken om de functie van individuele cellen en hun interacties te begrijpen. Ontwikkeling van nieuwe technologieën eencellige analyse is daarom van groot belang in biologisch en farmacologisch onderzoek en kan worden gebruikt, bijvoorbeeld om beter de sleutel signaalwegen en processen stamcel biologie en kankertherapie 2-4. De laatste jaren heeft de opkomst van microfluïdische platforms aanzienlijk vergemakkelijkt single-cell analyse, waarbij de positionering, behandeling en observatie van de reactie van individuele cellen uitgevoerd met nieuwe analysestrategieën 5.
Cavitatie speelt een belangrijke rol in een brede waaier van biomedische toepassingen, met inbegrip van de behandeling van kankers door high-intensity focused ultrasound (HIFU) 6, de non-invasieve versnippering van nierstenen door schokgolf lithotripsy (SWL) 7, geneesmiddel of gentherapie door sonoporatie 8, en de onlangs gerapporteerde vernietiging van cellen of weefsels door hydrodynamische cavitatie zeepbel 9,10. Desondanks hebben de dynamische processen van cavitatiebel (s) interactie met biologisch weefsel en cellen niet goed begrepen. Dit komt door de willekeur cavitatie initiatie en beldynamica door ultrageluid, schokgolven en plaatselijke hydraulische druk; bovendien is er een gebrek aan technieken waarmee de inherent complexe en snelle reacties van biologische cellen te lossen, vooral bij de enkele-celniveau.
Vanwege deze problemen, is het niet verwonderlijk dat heel weinig studies hebben been gemeld aan bubble-cel interacties onder goed gecontroleerde experimentele omstandigheden te onderzoeken. Bijvoorbeeld membraan perforeren van afzonderlijke cellen in suspensie gevangen 11 en de impulsieve grote deformatie van rode bloedcellen humane 12 aangetoond met behulp van laser opgewekte interne bellen in microkanalen. Deze laatste techniek is echter, kan slechts zeer geringe vervorming in eukaryotische cellen door de aanwezigheid van de kern 13. Bovendien is het moeilijk om downstream bioeffects controleren bij de behandeling van cellen in suspensie. In andere studies is ultrasone excitatie van een celgebonden microbelletjes (of ultrageluid contrastmiddel) voor het membraan poratie en / of intracellulair calcium reacties in één hechtende cellen gerapporteerd 8. Membraan perforeren van één hechtende cellen kunnen ook worden geproduceerd door laser gegenereerde tandem bellen in een dunne vloeistoflaag die lichtabsorberende trypan blauwe oplossing 14 ofdoor een oscillerende gasbel gegenereerd door microseconde laserpulsen bestralen door middel van een optisch absorberende substraat in 'counter 15. In vergelijking, de optisch absorberende substraat heeft een voordeel ten opzichte van de laser-absorberende trypan blauwe oplossing omdat deze is giftig voor cellen. Wat nog belangrijker is, laser-gegenereerde bubbels zijn beter controleerbaar in termen van de zeepbel van de grootte en locatie dan akoestisch opgewonden bubbels. Niettemin, in al deze eerdere studies, de cel vorm, oriëntatie en adhesie omstandigheden werden niet gecontroleerd, die in hoofdzaak de cel respons en bioeffects geproduceerd door mechanische spanningen 16 kan beïnvloeden.
Deze nadelen in eerdere studies overwinnen, hebben we onlangs ontwikkelde een experimenteel systeem voor vorming van belletjes, cel patronen, bel-bel-cel interacties en real-time bioassays van celrespons in een microfluïdische chip geconstrueerd door een unieke combinatie van microfabricage techniques. Drie belangrijke kenmerken die ons experimenteel systeem te onderscheiden van anderen in het gebied zijn: 1) de patroonvorming van microscopisch kleine gouden stippen op het glassubstraat gelokaliseerde laser absorbeert, vorming van belletjes 17 mogelijk te maken; 2) de patroonvorming van microscopisch kleine eilanden extracellulaire matrix (ECM) voor celhechting op hetzelfde substraat aan zowel de locatie en de vorm van individuele cellen te controleren; en 3) het samenpersen van de afmeting van de bel-bel-celinteractie domein van 3D naar een quasi-2D speelt in het vlak visualisatie van bubble-bubble interacties te vergemakkelijken, spuiten stroomvelden, celvervorming en bioeffects, alle meegenomen in een gestroomlijnde beeldvorming sequentie (figuur 1d).
Figuur 1: De microfluïdische chip en schema's van verschillende assays. a) een samengestelde microfluïdische chip met kanalen gevuld met blauwe inkt voor visualisatie. b) Een regio binnen de microfluïdische chip met gevormde cellen en gouden stippen (de afstand tussen de twee gouden stippen in de nabijheid is 40 pm). Vele paren werkeenheden kunnen worden aangebracht in een kanaal. c) Close-up beeld van een enkele werkeenheid die bestaat uit een paar gouden stippen en een HeLa cel gehecht aan het cel-patronen regio. d) Schema van de bedieningsinrichting. Een enkele cel hecht aan en zich in het "H" -vormige eiland bedekt met fibronectine. Een paar cavitatiebubbels (tandem bubble) met tegenfase trilling worden geproduceerd door verlichten gepulste laserstralen op de gouden stippen (zie figuur 4a), wat leidt tot de vorming van een snelle en gelokaliseerde jet naar de beoogde cel buurt. De cel kan worden vervormd nomen voor macromoleculaire opname en / of gestimuleerd met calcium respons, afhankelijk van de afstandsmeting (Sd) van de cel om de tandem bubble.f = "http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55106/55106fig1large.jpg" target = "_ blank"> Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Dit platform kan verder gecombineerd worden met fluorescentie- assays en gefunctionaliseerde kralen bevestigd aan het celoppervlak voor cavitatie geïnduceerde bioeffects. Vooral dit platform schept voor betrouwbare en kwantificeerbare assays bij de enkele-celniveau. Tot nu toe hebben we de inrichting voor de analyse van tandem bubble-geïnduceerde celmembraan vervorming cel poratie en intracellulaire opname, levensvatbaarheid, apoptose en intracellulair calcium respons. In de onderstaande voorschriften beschrijven we het proces-chips en de procedure voor het analyseren van verschillende bioeffects bovengenoemde. Bovendien worden de bewerkingen van de chip ook beschreven.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Microfabricage
LET OP: Alle microfabrication procedures worden uitgevoerd in een cleanroom. Een chromen masker is ontworpen voor de microfabrication, zie figuur 2.
Figuur 2: Schematische voorstelling van het kanaal ontwerp in de microfluïdische chip en de afmetingen van de werkeenheden. a) Masker ontwerp van de uitgelijnde PDMS microkanalen (groen) en de patronen op het glassubstraat (blauw en rood). b) vergrote afbeelding van het masker ontwerp in een representatief deel van de werkende unit arrays. c) Schematische voorstelling van een werkeenheid die een cel patroon (blauw) en een paar gouden stippen (rood). Alle lengteschalen worden getoond op de rechts onderaan. Klik hier om een LAR bekijkenger versie van deze figuur.
- Gold dot patroonvorming
Opmerking: Het gebied van elk punt goud is ontworpen om binnen 25-30 urn 2, zodat deze groot genoeg is om laserenergie absorberen vorming van belletjes, maar klein genoeg om individuele cellen hechten te vermijden. Een schema voor het goud dot fabricage is getoond in figuur 3a.- Glasplaatje schoonmaak (in een chemische kap)
- Spoel het glaasje met aceton gevolgd door isopropylalcohol (IPA), en droog hem vervolgens met een stroom N2.
- Week de dia in piranha-oplossing (H 2 SO 4: H 2 O 2 = 4: 1) gedurende 10 min.
- Haal de dia, spoelen met DI water en droog hem vervolgens met een stroom N2.
- Bak het glaasje op een verwarmingsplaat bij 120 ° C gedurende 10 minuten.
- Behandel de dia in een plasma Asher bij 100 W gedurende 90 s.
- Spin-coating (spin-bekledingskap)
- Zet op een kookplaat en wacht tot de temperatuur stabiel is bij 95 ° C.
- Volg de coating procedure:
1000 rpm gedurende 5 s met 500 rpm / s ramp;
dan 3000 rpm gedurende 30 s met een 1000-rpm / s helling. - Bevestig de gereinigde glasplaatje op de spin coater door een vacuüm.
- Bedek het glijoppervlak met P-20 en start de coating recept.
- Herhaal de coating proces voor het NFR-negatieve fotoresist.
- Bak de schuif bij 95 ° C gedurende 60 s en wacht tot hij is afgekoeld tot kamertemperatuur.
- fotolithografie
- Monteer de chromen masker op het masker aligner en zorg ervoor dat het patroon kant naar beneden in de richting van de dia.
- Stel de fotolithografie recept om belichtingsstand hard met 9 s van UV-blootstelling en snel uitlijnen van de glazen substraat met het masker.
- Na het uitvoeren van de blootstelling aan UV, bak de dia bij 956; C gedurende 1 minuut, en laat het afkoelen tot kamertemperatuur.
- Ontwikkeling
- Ontwikkelen van de patroon op de dia in de ontwikkelaar oplossing voor 60 s.
- Verwijder de schuif van de ontwikkelaar, spoelen met DI water en droog het met N2 flow.
- Controleer het patroon geometrie onder een microscoop, en meten en de feature size opnemen.
- Gold depositie (E-beam verdamping) en lift-off
- Bak de glijbaan bij 120 ° C gedurende 5 minuten, en laat het afkoelen tot kamertemperatuur.
- Maak de dia met plasma in de reactieve ionen etsen (RIE) machine gedurende 90 s bij 500 Torr en 100 W.
- Borg 5 nm van Ti en 15 nm van Au op de dia met behulp van een e-beam verdamper 17.
- Week de dia overnacht in een glazen bekerglas met fotoresist remover oplosmiddel goud rust bovenop de NFR verwijderen weerstaan.
- Haal de glijbaan, flush it met aceton, gevolgd door IPA, en droog het met N2 flow.
- Droog de dia een hete plaat bij 115 ° C voordat het zuurstofplasma asher reinigen bij 100 W gedurende 90 s.
- Glasplaatje schoonmaak (in een chemische kap)
- Moleculair-assemblage patroonvorming door lift-off (MAPL)
Opmerking: Het gebied van iedere fibronectine gecoate eiland is ingesteld op binnen 700-900 pm 2 voldoende HeLa cel verspreiding in een vierkant gebied terwijl het minimaliseren van de kans op meerdere cellen aggregeren op het eiland vergemakkelijken. Een schema voor de bereiding van cel-patroonvorming eilanden is weergegeven in figuur 3b.- spincoating
- Herhaal stap 1.1.2, maar gebruik S1813-positieve fotoresist en een temperatuur van 115 ° C.
- Aligned fotolithografie
- Monteer de chromen masker op het masker aligner en zorg ervoor dat de kant met het patroon wordt naar beneden in de richting van de dia met degouden stippen.
- Stel de fotolithografie recept om belichtingsstand hard met 9 s van blootstelling aan UV.
- Lijn de bovenkant masker met het bodemobjectglaasje behulp uitrichtkenmerken, gelegen rond de rand van het masker, als ruimtelijke referentie.
- Controleer het centrale gedeelte van het masker en controleer of het patroon functies correct zijn uitgelijnd.
- Voltooiing van de blootstelling aan UV zonder een post-bakken.
- Ontwikkeling
- Herhaal stap 1.1.3, maar met 45 jaren van ontwikkeling voor het drogen op een kookplaat en het behoud in N 2 -opslag.
- spincoating
- chemische behandeling
- Bereid de passiverende oplossing: 0,5 mg / mL PLL-g-PEG in 10 mM HEPES buffer.
- Haal de dia uit N2 opslag en reinig het met behulp van RIE met de parameter-instelling: 500-Torr druk van 100 W vermogen, en 90-s duur.
- Pipetteer één druppel passiveren oplossing op een stuk film paraffine. </ Li>
- Sandwich de oplossing met de film en de glijbaan, zorg ervoor dat de kant met het patroon kenmerken is naar beneden in de richting van de film; voorkomen blaasvorming.
- Wacht 45 minuten alvorens de schuif uit de film.
- Geniet van de dia achtereenvolgens in fotoresist remover, fotolak remover en DI-water (1: 1), en DI-water, en schud het in een ultrasoon bad gedurende 90 s voor elke weken.
- Droog de dia op een verwarmingsplaat om het vocht te verwijderen alvorens af te dichten in een exsiccator en opgeslagen in een koelkast.
- chip assemblage
- Herhaal de stappen 1.1.1-1.1.4, maar met SU8-2025-negatieve fotoresist en de parametrering bedoelde genaamd de Microchem protocol 18, een siliconen mal te bereiden met een fotomasker.
- Vervaardig een PDMS microkanaal (40 mm x 25 mm x 5 mm, L x B x H) en een kleine PDMS plaat (800 urn brede ril) met behulp van zachte lithografie.
- Pons de microchannel voor vloeibare toegangspoorten en schoon te maken met tape en vervolgens met IPA.
- Schild met patronen van de glassubstraat met de PDMS plaat en toepassen RIE (100 W, 500 mTorr, 60 s) PLL-g-PEG te verwijderen uit het randgebied.
- Behandel de microkanaal met een lagere dosis van RIE (25 W, 500 mTorr, 25 s), en lijn naar de patroon glazen substraat (met de kleine PDMS plaat verwijderd); breng de microkanaal en het patroon glassubstraat in conform contact onder een stereoscoop.
Figuur 3: Schema's voor microfabrication en chip montage. a) patroon van goud punten op het glassubstraat. b) Bereiding van het glazen substraat voor cellulaire patroonvorming via MAPL. c) Montage van de microfluïdische kanaal met plasma-bonding. Zie de Materialen List voor de definities of de afkortingen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
- celhechting
OPMERKING: HeLa-cellen worden routinematig aangehouden in DMEM aangevuld met 10% FBS en 1% antibioticum / antimitotische oplossing in een celkweek incubator. Een schematisch diagram van de chipeenheid en celhechting is weergegeven in figuur 3c.- Prime de chip met PBS gedurende 30 min bij 1 ul / min en vervolgens giet fibronectine-oplossing (50 ug / ml in PBS, 1 pl / min) gedurende 45 min.
- Afwachting, trypsinize celkweek met 0,25% trypsine-EDTA, was ze in kweekmedium centrifuge individuele cellen en reconstitueren de celsuspensie in voorverwarmde (37 ° C) kweekmedium 5x10 6 cellen / ml.
- Vervang de fibronectine-oplossing met PBS en spoel de chip aan 10 ul / min gedurende 5 min.
- Injecterende bereide celsuspensie in de chip, stop de stroom, klem de uitlaat, en onderhouden van de chip in een celkweek incubator gedurende 30 minuten.
- Laat de uitlaat en spoel de chip met celkweekmedium bij 10 ul / min gedurende 5 min. Verminder de perfusie debiet van het kweekmedium 0,75 pl / min en handhaven van de celkweek voor 2 uur in de incubator.
2. Bubble Generation en Flow Visualisatie
OPMERKING: Een schematische weergave van de experimentele opstelling wordt getoond in figuur 4a tandem vorming van belletjes en het resulterende stroom interactie met een enkele cel nabij gekweekt in een microfluïde kanaal.
- Genereren van tandem bellen met twee lasers en timingscontrole
- Plaats de microfluïdische chip op het podium van een omgekeerde microscoop en lijn de brandpunten van twee gepulste Nd: YAG lasers (λ = 532 nm, 5-ns pulsduur) op een paar gevormde gouden stippen gescheiden by 40 urn.
- Gebruik een digitale vertragingsgenerator de twee lasers activeren tijdvertraagd ongeveer 2,5 microseconden twee bellen ingeleid op gouden dots produceren.
- Stel de laser uitgangsenergie (~ 10 uJ) met een maximum diameter van de belletjes binnen 50 ± 2 urn.
- Synchroniseer een high-speed camera (belichting 200 ns en 2 miljoen frames per seconde (fps)) naar de lasers en vastleggen van de dynamiek van de zeepbel van de uitbreiding, instorten, bubble-bubble interactie, en de vorming jet.
- Kwantificering van jet snelheid
- Noteer de positie van het spuitmondje (J 1) aan het proximale uiteinde van de eerste bel (B 1) en het distale uiteinde van B 1, beginnend bij het genereren van de tweede bubble (B 2) en eindigend met het neerkomen van J 1 naar het distale uiteinde van B 1; zie het schema in figuur 5a.
- Lineair past het tijdsverloop van de positie voor both de proximale (jet tip) en de distale einden. Bereken de helling van de punt is ten opzichte tijdscurve voor het proximale uiteinde naar het jet snelheid te bepalen. Het snijpunt van de twee lijnen geeft de straal touchdown tijd. Meer details zijn te vinden in referentie 19.
- Visualisatie van de bubble-geïnduceerde stroom veld tandem
- Bereid 1 urn polystyreen (PS) kralensuspensie in DI-water (2,6% w / v) en injecteer de kralen in de microfluïdische chip.
- Genereer tandem bellen zoals beschreven in stap 2.1.1-2.1.3.
- Noteer de tandem bubble dynamiek met behulp van een high-speed video camera op een opnamesnelheid van 5 fps M met een 100-ns belichtingstijd.
- Upload de verworven afbeelding sequentie in een commercieel PIV software.
- Verdeel elk beeld in kleinere ondervraging ramen van 16 x 16 pixels (px) met een overlap van 75%.
- Toepassen meerdere doorlopen iteratie en regionale filters om de fouten in snelheidsveld berekening verminderen, ende resultaten af van een snelheidsvector kaart.
Figuur 4: Schematische weergave van de experimentele opstelling en beeldopname. a) Experimentele opstelling voor tandem bubble generatie. b) De tijd die wordt gebruikt voor verschillende soorten beeldvorming acquisities. FL: fluorescentie microscopie, BF: helder veld, IFT: interframe tijd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
3. Single-cell Analyse en Bioeffects
OPMERKING: De tandem bel wordt geproduceerd naast de doelcellen en de resulterende bioeffects bestudeerd in een afstandsmeting-afhankelijke wijze. De tijdsvolgorde voor verschillende typen beelden worden afgebeeld in figuur 4b.
- Membraan perforeren en macromoleculaire opname
OPMERKING: De opname van extracellulaire macromoleculen in de doelcel wordt gekenmerkt door de geleidelijke diffusie membraan impermeant propidiumjodide (PI) door de poratie plaats op het celmembraan.- Na stap 1,5, vervangt het vaste kweekmedium (dwz DMEM) met PI oplossing (100 ug / ml in DMEM), dat op een perfusie stroomsnelheid van 0,5 ul / min gedurende het experiment.
- Programmeer de microscoop control software om automatisch de PI fluorescerende kubus op de draaiende carrousel en synchroniseren van de timing van de CCD-camera met de PI-fluorescentie excitatie om de fluorescentie beelden vast te leggen met een belichtingstijd van 200 ms.
- Nadat de twee brandpunten laser wordt afgestemd op een paar gouden stippen naast een doelcel, staat zowel helderveld (BF) en fluorescentie (FL) beelden voordat de tandem bubble behandeling.
- Gebruik microscoop besturingssoftware onmiddellijkstart een time-lapse fluorescentie beeld opnemen van de doelcel kort na stap 2.1 de geschiedenis van PI opname vastleggen.
- membraan vervorming
- Bereid 1-um korrels (1% w / v, geactiveerd met wateroplosbaar carbodiimide) en functionaliseren ze met Peptide-2000 (100 ug / ml in PBS).
- Na stap 1,5, incubeer de aangehechte cellen met het gefunctionaliseerde korrels met een dichtheid van 1x10 9 kralen / ml bij 37 ° C gedurende 30 minuten.
- Herhaal stap 2.1 tot tandem bellen produceren naast het doel cel en noteer de cel vervorming met een ultra-high-speed camera draait op een opnamesnelheid van 5.000.000 fps.
- Identificeren van een triade van 3 kralen die gedurende het experiment blijft de beeldvlak en hun positie als (x 1, y 1) (2 x, y 2) compileren en (3 x, y 3) in het experiment coördinaten.
- Bereken de oppervlakte van de triade voor en afTER de tandem bubble behandeling met behulp van de formule:
- Bereken de oppervlakte stam als:
- Op basis van de coördinaten van de hoekpunten voor en na de behandeling tandem bubble Bereken het lokale hoofdrek Plaatselijke stam volgende vastgestelde protocollen 20,21.
- Levensvatbaarheid en apoptose
LET OP: FITC Annexine V etiketten cellen, met inbegrip van apoptotische degenen, via de externalisering van fosfatidylserine (groene fluorescentie). PI labelt de kernen van necrotische cellen (rode fluorescentie). Helderveld beeldvorming wordt gebruikt om celmorfologie te documenteren en te helpen bij de identificatie van cellevensvatbaarheid en apoptose.- Noteer de positie van elke behandelde cel in de microfluïdische kanaal (vergemakkelijkt door de adresetiketten in het kanaal, zie Figuur 2b
- Incubeer de behandelde cellen in het celkweekmedium nog 2 uur voordat perfuseren de chip met FITC- Annexine V oplossing gedurende 15 min. Positieve cellen weer groene fluorescentie.
- Herhaal stap 3.3.2 24 uur na de tandem bubble behandeling langdurig bioeffects in de doelcellen te bestuderen.
- calcium reactie
- Meng 3 gl Fura-2:00 voorraadoplossing (1 mg / ml in DMSO) met 3 pl van 10% w / v Pluronic F-127 in 500 ui gereduceerd serum medium tot de uiteindelijke labelingoplossing (6 uM) te bereiden.
- Na stap 1.5, vervang de celkweek medium met de etikettering oplossing en incubeer bij kamertemperatuur in het donker gedurende 40 minuten (1 pl / min perfusie tarief).
- Vullen van het kanaal met de verminderde serum medium (0,75 ul / min perfusiesnelheid) voordat de cel experiment.
- Start ratiometrische imaging (golflengte: 340/380 nm, 50-ms blootstelling)van de doelcel met het commerciële PTI systeem.
- Na 10 s van ratiometrische beeldvorming van de cel rust komt, produceren tandem bellen zoals in stap 2.1; eerste record met een interframe tijd (IFT) van 0,1 s gedurende 1 minuut, dan stijgen de IFT op 1 s voor een andere min, en de verdere stijging tot 5 s na 2 min.
- Met de PTI software om de verhouding R = F340 / F380 berekenen in het gebied van belang (ROI), dat evenredig is met de intracellulaire calciumconcentratie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De microfluïdische platform in dit werk beschreven kan worden gebruikt voor bubble bubble-interacties te onderzoeken en een verscheidenheid aan cavitatie geïnduceerde bioeffects analyseren bij de enkele-celniveau. Hier presenteren we een aantal voorbeelden van verschillende experimentele studies en bioassays die kunnen worden uitgevoerd in ons experimenteel systeem te demonstreren. We zullen eerst illustreren de voorbijgaande interacties van tandem bubbels met de straalvorming, de visualisatie van het resulterende stromingsveld, en de berekening van de snelheid straal (figuur 5a). Wij zullen dan aanwezig zijn voorbeelden van tandem bubble-geïnduceerde gelokaliseerde celmembraan vervorming (figuur 5b), gelokaliseerd membraan perforeren met PI-opname (Figuur 5c), en intracellulaire calcium respons (Figuur 5d). Andere voorbeelden, zoals cellevensvatbaarheid en apoptose-assays, is beschikbaar in referentie 22.
Figuur 5a toont een voorbeeld van de tandem bubble interactie met de straalvorming, gevangen door snelle beeldvorming, en het resulterende stromingsveld onthuld door PIV. Specifiek, na de maximale expansie, de instorting van de eerste luchtbel B 1 (geproduceerd 0 us) asymmetrisch vertekend door de snelle expansie van de tweede bel B 2 (geproduceerd 2,5 ps), leidt tot de vorming van een "opwaartse" straal (J 1) en 3,4 ps en de daaropvolgende jetting stroom, getoond bij 5,4 microseconden. De gemiddelde jet snelheid wordt bepaald door de helling van een ingerichte lijn voor de positie van het proximale einde (of paal) van B 1 vóór touchdown (dat wil zeggen, het contact met het distale einde van B 1) tegen de tijd. De gemiddelde straal snelheid toe te nemen 20-58 m / s wanneer de maximale diameter van 2 B stijgt 40 tot 60 urn. Op basis van de resultaten van PIV analyse de directionele jetting luchtstroom rond de tandem bubble in de orde van 10 m / s en is ingesloten in een breedte in de orde van 10 urn. Het is dus in staat is een impulsieve en gelokaliseerde afschuifspanning en spanningsgradiënt op een doelcel buurt gekweekt.
Andere figuur 5b voorbeeld illustreert de celmembraan deformatie geïnduceerd door de gerichte en gelokaliseerde jetting stroming door de tandem bubbels op afstandsmeting S d = 40 urn. Het membraan vervorming en herstel worden benadrukt door de verplaatsing van een gefunctionaliseerde kralen (aangegeven door de gele stippellijn) bevestigd aan de voorrand van het celmembraan. De omgeving stam kan worden berekend uit de coördinaten van een drietal aangrenzende kralen. Een schema van de berekende maximale gebied verandering op verschillende locaties op het celoppervlak wordt weergegeven in het midden. De voorrand is vooral gerekt (zie de groene cirkels), terwijl de achterrand of latrale zijden van de cel worden gecomprimeerd (zoals aangegeven door de rode cirkels) waarin heterogeniteit in celvervorming door de tandem bubble jetting geïnduceerde stroom. De temporele variatie van de oppervlakte spanning bij de cel voorrand rechts afgebeeld. Het bestaat uit een enkele snelle oscillaties in het begin, gevolgd door een sterke en aanhoudende rek ongeveer 100 microseconden (FWHM) waarna geleidelijk herstel op een tijdschaal van enkele ms.
Bovendien is de grote oppervlakte spanning en rek integraal aan de cel voorrand kan verantwoordelijk zijn voor het celmembraan poratie waargenomen bij kleine S d zijn, zoals in Figuur 5c. Bij kleine S d (bijvoorbeeld 10 urn, of in sommige gevallen 20 urn) en tussenproduct Sd (dwz de meeste 20 en 30 pm), een gelokaliseerde membraan verstoring wordt veroorzaakt, leidt tot een pinpoint opname van extracellulaire PI inhet cytosol. Als de PI intensiteit in de cel blijft toenemen zonder verzadiging necrose optreedt. Ter vergelijking, als de PI intensiteit een orde van grootte lager en een plateau binnen 10 s na tandem bubble behandeling bereikt, herstelbaar poratie met mogelijke celoverleving ontstaat, die verder wordt ondersteund door de minimale verandering in celmorfologie. Bij grote S d (dat wil zeggen 40 pm), verwaarloosbaar PI opname wordt gevonden na tandem bubble behandeling, wat aangeeft verwaarloosbaar of niet-perforeren. De cel kan overleven met regelmatige groei en proliferatie 22. Kortom, de resultaten tonen een duidelijke overgang celrespons necrose, door eenvoudig membraan perforeren, op niet-poratie in het gebied Sd ≈ 20-40 urn.
Tenslotte tonen we de resultaten van ratiometrische beeldvorming van de intracellulaire calcium respons opgewekt door tandem bellen in individuele cellen bij verschillende Sd, vooral in de subletale van S d = 30-50 pm (Figuur 5d). De intensiteitverhouding is evenredig met de hoeveelheid intracellulair calcium. Bij kleine S d (bijvoorbeeld 30 urn of, in sommige gevallen 40 urn), een calcium golf die vanaf de voorrand naar de achterrand wordt duidelijk waargenomen binnen enkele seconden na tandem bubble behandeling. Na de intracellulaire calcium een piek concentratie bereikt, vervalt langzaam terug naar de rust niveau binnen een paar minuten. Daarentegen grote S d (dwz een meerderheid van 50 urn, of in sommige gevallen 40 urn), de toename van intracellulair calcium veel milder en geen duidelijk zichtbare reizen calcium golf kan worden geïdentificeerd. Deze twee verschillende calcium reacties kunnen ook worden onderscheiden van de intensiteitverhouding versus tijdprofielen, met aanzienlijke verschillen in de piekamplitude van de intensiteitverhouding en de stijgtijd van rustende niveau piekwaarde. Op nog grotere Sd (dwz boven 60 um), geen calciumrespons te nemen. Het percentage HeLa cellen die calcium responsen op verschillende Sd wordt samengevat in figuur 5d (rechts).
Al met al, onze resultaten tonen aan dat, door het veranderen van de sterkte van de jetting stroom (of wijzigen S d), diverse bioeffects kunnen in afzonderlijke HeLa-cellen onder dezelfde kweekomstandigheden, die waarschijnlijk samenhangt met de amplitude en duur van de mechanische vervorming opgelegd aan de celmembraan 22.
Figuur 5: Resultaten van tandem bel interactie celmembraan vervorming, membraan poratie en calciumrespons assays. a) Fluid beweging en de jetgeïnduceerd door tandem bubble interactie. Links: Geselecteerde frames tonen tandem bubble interacties met de formatie jet en de stroom veld onthuld door PIV. De maximale diameter van de twee belletjes ongeveer 50 ± 2 urn. Midden: Schema van de jetting tandem bellen, illustreert de hartlijn, oorsprong van de coördinaten (o), en proximale en distale uiteinden (of polen) van de eerste luchtbel B 1. Rechts: Gemeten poles (met fout = ± 1 pm) en het proximale en distale uiteinde van B1. b) Celmembraan vervorming. Links: De gele gestippelde lijn labelt de verplaatsing van een PS kraal bevestigd aan de voorste rand van het celmembraan, met vermelding van de lokale membraan vervorming en herstel. Midden: een schematische weergave van het piekoppervlak stammen op verschillende plaatsen op het celoppervlak links getoond. Rechts: De tijdsverloop van het gebied stammen in het midden van de cel leading edge. Δ ε is het gebied stam berekende based op hoofdrekken en Δ Δ is het gebied druk berekend op basis van de triade geometrie verandering. Meer details over het gebied stam berekening en foutenanalyse zijn gedocumenteerd in Reference 22. c) Celmembraan perforeren. Links: helderveld beelden voor en na de tandem bubble behandeling en time-lapse fluorescentie beelden van de PI-opname (0 en 120 s). De witte pijlen geven de jetting stroomrichting. Midden: de typische verandering van de gemiddelde PI intensiteit tegen de tijd in de cellen. Rechts: Statistische resultaten van het percentage cellen ondergaan necrose (rood), repareerbaar perforeren (blauw), en niet-perforeren (groen) op verschillende S d. Aantal cellen behandeld: N = 9, respectievelijk 14, 14 en 8 voor S d = 10, 20, 30 en 40,. De statistische fout is ± 1 / √ N. d) Intracellulaire calcium respons. Links: sequenties van ratiometrische beelden die de intracellulaire calcium reacties van individuele cels bij S d van 30 pm en 50 pm. De rode pijlen geven de jet richting. Midden: typische reactie profielen (verhouding-time curves) op verschillende S d. Rechts: de kans dat een calciumrespons op verschillende Sd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| impasse afstand (S d) (pm) | Getal van Reynolds (Re) | gemiddeld shear stress (Pa) in het YZ-vlak |
| 20 | 206,96 | 618,64 |
| 30 | 354,8 | 709,69 |
| 40 | 378,78 | 657,22 |
| 50 | 163,85 | 323,61 |
| 60 | 105,08 | 42.21 |
Tabel 1: Een lijst van parameters voor stroming natuurkunde aan de PIV resultaten. Geschat getal van Reynolds en gemiddeld shear stress met betrekking tot de verschillende impasse afstanden (S d). Het YZ-vlak betreft de kanaalbreedte x hoogte vlak. De gemiddelde schuifspanning wordt geschat uit een hoogte van 0-7,7 urn uit het kanaal bodem omdat de cel hoogte in het kanaal is ongeveer 6-7 urn.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Eencellige analyse, in combinatie met live-cell imaging, is sterk verbeterd ons begrip van de dynamische en vaak variabele processen in afzonderlijke vakken, zoals fenotype ontwikkeling en immuunrespons 23. In tegenstelling tot de conventionele celkweek in schotels of flacons, microfluïdische systemen maken nauwkeurige regeling van de micro-omgeving naar de enkelvoudige-celniveau, in real time. Bijgevolg, de vooruitgang in microfluïdische technologie en technieken zijn grotendeels de doorvoer en reproduceerbaarheid van single-cell analyse verbeterd. Door de integratie van zachte lithografie en het oppervlak patronen, kan microfluïdische systemen verder worden ontwikkeld om de diepgaande analyse van de reactie van een enkele cel om complexe patronen van spatiotemporeel variabele stimuli te vergemakkelijken. Zo voorbijgaande chemische of mechanische signalen succes verzonden aan enkele cellen terwijl hun biologische of mechanische reacties automatisch werden geregistreerd en geanalyseerd 24. Ondanks deze algemene trend is de toepassing van microfluidics het analyseren cavitatie-geïnduceerde bioeffects op celniveau zeer beperkt. Het meest opvallend is het alleen toegepast op bubble-geïnduceerde membraan perforeren van afzonderlijke cellen in suspensie gevangen door micropillars 11. In de meeste studies op hechtende cellen, het voordeel van het controleren celmorfologie consistentie in dynamische bubble-cel interacties te handhaven is niet beschikbaar of grotendeels genegeerd.
We hebben een microfluïdische systeem om de inleiding, daaropvolgende expansie en instorting dynamiek van cavitatiebelletjes nauwkeurig te regelen ontwikkeld; bubble-bubble interacties met de vorming van jet; en mobiele vorm, oriëntatie, hechting patroon, en standoff afstand van de bubbels, waardoor voor reproduceerbare jetting stroming onder goed gecontroleerde experimentele condities worden toegepast op individuele cellen. Deze roman microfluïdische systeem is ideaal voor het uitvoeren van fundamentele studies op cavitatiebel (s)-cel interacties die tot een brede waaier van therapeutische ultrasound toepassingen, zoals SWL, HIFU, en sonoporatie relevant zijn. We hebben aangetoond dat onze microfluïdische systeem kan worden gebruikt om verschillende cavitatie-geïnduceerde bioeffects, waaronder celmembraan vervorming membraan perforeren, levensvatbaarheid en calcium responding, in een meer beheersbare en reproduceerbare wijze. Het meest opvallend is de directionele jetting stroom geproduceerd door tandem bellen laat ons toe om de mechanische eigenschappen en calcium respons in individuele cellen onder hoge druk-tarieven die niet goed gekarakteriseerd sonde. De gelokaliseerde, impulsieve spanning levert zo'n jetting stroom kan niet worden bereikt door conventionele werkwijzen strekken, zoals micropipet aspiratie 25 en het gebruik van optische en magnetische pincet 26 27. Bovendien in tegenstelling tot eerdere studies met ultrageluid contrastmiddelen 8,28-30 of laser-geïnduceerde één bubbles 31,32, onze microfluïdische systeem biedt een betere controle van de cel geometrie en adhesie, waardoor hun substantieel effect op cellulaire respons en bioeffects 16 verminderen.
Terwijl onze techniek betrouwbaar en reproduceerbaar is, moet men voorzichtig het protocol te volgen dat de experimenteel systeem getrouw wordt weergegeven. De kwaliteit van het oppervlak patronen in het microkanaal is primair verantwoordelijk voor de reproduceerbaarheid van de bubble-bubble-cel interacties en de cascade van downstream bioeffects. Bijvoorbeeld, voor HeLa-cellen, het oppervlak van elke goud punt moet ongeveer 25-30 urn 2 om te zorgen voor stabiele vorming van belletjes en voorkomt de cellen hechten. Anderzijds, het oppervlak van elke met fibronectine gecoate eiland heeft ongeveer 700-900 urn 2 te vergemakkelijken geschikte spreiding van een enkele cel in een vierkant en tegelijkertijd de kans op meerdere cellen vormen aggregaten op het eiland. opstellingtussen het goud en de stippen met fibronectine gecoate eilanden moet exact worden uitgevoerd met behulp van het masker aligner om de hoekverdraaiing binnen 1 ° en de axiale fout binnen 0,5 urn te houden. Bovendien is dit experimenteel systeem biedt flexibiliteit in het monitoren van een reeks van gebeurtenissen, met hun tijdschaal gevarieerd door ordes van grootte (bijvoorbeeld, bel dynamiek: ps, cell vervorming: ms, membraan perforeren: s, apoptosis: h). Daarom is het belangrijk om nauwkeurig regelen van de timing van de beeldacquisitie en registratie van elke sequentie van het verfijnen van de trekkersignalen (geregeld door een digitale vertragingsgenerator). De eencellige kweek moet goed worden gehandhaafd in de microkanaal naar cel tot cel verschillen in fenotype minimaliseren (meestal aangeduid als morfologie). Daarom is een minimum 2-uur incubatie vereist voor celhechting en spreiding op de eilanden alvorens benedenstroomse cel behandeling. Het is raadzaam om altijd het debiet in de microchannel tot 3 ul / min, zodat de stroom schuifspanning door het circulerende kweekmedium op de cel binnen het fysiologische bereik.
Een stroombegrenzing onze techniek is dat tandem bubble interactie en de resulterende stroom spuiten slechts eenmaal kan worden toegepast op een doelcel, omdat de gouden stippen wordt geablateerd door de laser bestraling. Dit nadeel beperkt de mogelijkheden van ons experimenteel systeem om de bioeffects door therapeutische ultrasound, waarbij cellen vaak blootgesteld aan cavitatie gebeurtenissen bootsen. Echter kan deze beperking worden ondervangen door het aanbrengen van een dunne laag silicium dioxide om het goud stippen beschermen tegen aanraking met de vloeistof 15. Algemeen, ons microfluïdische systeem biedt goed gecontroleerde experimentele omstandigheden aan de bioeffects geproduceerd uit cavitatiebel (s)-cel interacties te onderzoeken en heeft een aantal unieke eigenschappen. Eerst, zowel de grootte en de locatie van de cavitatiebellen in onze eXperimental systeem kan nauwkeurig worden geregeld door de invallende laserenergie geabsorbeerd door de gouden stippen. Ten tweede, de geometrie en de hechting van individuele cellen worden gestandaardiseerd door cellen patroonvorming hun effecten celresponsen en bioeffects minimaliseren, wat leidt tot meer reproduceerbare resultaten. Ten derde, de parallelle bewerkingseenheden in de microfluïdische chip ontwerp maakt het mogelijk om stroomafwaarts bioeffects, zoals celgroei, proliferatie en mogelijk genexpressie na blootstelling cavitatie bestuderen, omdat elke cel kan worden aangepakt en afzonderlijk bewaakt. Kortom, onze microfluïdische systeem en de methode te creëren betrouwbare bubble-bubble interacties aan de bioeffects van individuele cellen met verbeterde precisie te bestuderen.
Onze huidige chip is ontworpen voor de analyse van afzonderlijke HeLa cellen. Echter, een wijziging van de patroon eilanden andere zoogdiercellijnen zijn ook mogelijk. Verschillende verbeteringen kunnen worden aangebracht in de applicatio verder uit te breidenns van de chip. Zo zou plaatsvervangers van de PLL-g-PEG-moleculen worden onderzocht om afzonderlijke gevormde cellen stoppen migreren zelfs na 24 uur. Bovendien kunnen nieuwe chip ontwerpen met microfluïdische kleppen worden onderzocht om de lokale micro-omgeving van de cellen te controleren, waardoor chemicaliën zoals fluorescentie merktekens of toxische reagentia alleen worden toegepast op een specifieke locatie, zonder dat de cellen in andere gebieden van de chip . Met deze verbeteringen kunnen de microfluïdische systeem hier gepresenteerde mogelijkheden om op lange termijn bioeffects van afzonderlijke cellen, zoals metabolisme, scheiding, differentiatie en genexpressie na blootstelling cavitatie of mechanische stimuli door een impulsieve stroming onderzoek te verrichten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent/Materials | |||
| 75 mm x 38 mm Plain Microscope Slides | Corning | 2947-75X38 | |
| Acetone | Sigma Aldrich, Co. | 320110 | ACS reagent, ≥99.5% |
| Isopropyl alcohol | Sigma Aldrich, Co. | W292907 | ≥99.7%, FCC, FG |
| Sulfuric acid | Sigma Aldrich, Co. | 320501 | ACS reagent, 95.0-98.0% |
| Hydrogen peroxide | Sigma Aldrich, Co. | 216763 | 30 wt.% in H2O |
| Primer P-20 | Microchem | MCC Primer 80/20 | |
| NFR photoresist | JSR | NFR016D2 | |
| Photomask | Photoplotstore | N/A | 4x4 Direct write mask |
| MF-319 Developer | Shipley (Rohm and Haas) | Microposit MF-319 | |
| 1165 Photoresist Remover | Dow Chemical, Co. | DEM-10018073 | 1-methyl-2-pyrrolidinone based |
| S1813 photoresist | Shipley (Rohm and Haas) | S1813 | |
| PLL-g-PEG | SuSoS | PLL(20)-g[3.5]- PEG(2) | |
| HEPES | ThermoFisher Scientific | 15630080 | |
| Paraffin film | HACH | 251764 | |
| SU-2025 photoresist | Microchem | SU-2025 | |
| PDMS | Dow Corning | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | |
| Microbore Tubing | Saint-Gobain PPL Corp. | S-54-HL | |
| Metal pins | New England Small Tube | NE-1300-01 | Cut Tube (straight), 0.025” OD x 0.017” ID x 0.50” Long |
| HeLa cells | Duke Cell Culture Facility | (307-CCL-2) HeLa, p.148 | |
| DPBS (1x) buffer | ThermoFisher Scientific | 14190144 | |
| DMEM culture medium | ThermoFisher Scientific | 11995065 | |
| Fibronectin Bovine Protein, Plasma | ThermoFisher Scientific | 33010018 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA (1x) | ThermoFisher Scientific | 25200056 | |
| Propidium Iodide | ThermoFisher Scientific | P21493 | |
| Carboxylate Microspheres 1.00 μm | Polysciences, Inc | 08226-15 | |
| Carboxylate Microspheres 2.00 μm | Polysciences, Inc | 18327-10 | |
| EDC (1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride) | ThermoFisher Scientific | 22980 | |
| Sulfo-NHS | Sulfo-NHS (N-hydroxysulfosuccinimide) | 24510 | |
| Peptite-2000 | Advanced BioMatrix | 5020-5MG | |
| FITC Annexin V | ThermoFisher Scientific | A13199 | |
| Fura-2, AM | ThermoFisher Scientific | F1221 | |
| DMSO | Sigma Aldrich, Co. | D2650 | |
| F-127 | invitrogen | P6866 | 0.2 µm filtered (10% Solution in Water) |
| Reduced serum media | ThermoFisher Scientific | 11058021 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Plasma asher | Emitech | K-1050X | O2 / Ar plasma ashing of photoresist and other organic materials |
| Mask aligner | SUSS MicroTec | Karl Suss MA6/BA6 | |
| E-beam evaporator | CHA Industries | CHA Industries Solution E-Beam | |
| RIE | Trion Technology | Trion Technology Phantom II | (oxide/ nitride/ polymer) etching |
| Stereoscope | AmScope | American Scope SM-4TZ-FRL | Stereo Microscope |
| Syringe pump | Chemyx Inc | NanoJet | |
| Cell culture incubator | NuAire | AutoFlow NU-8500 Water Jacket CO2 Incubator | |
| Biological Safety Cabinets | NuAire | NU-425-400 | |
| Water bath | VWR | 1122s | |
| Centrifuge | IEC | Centra CL2 | |
| Microscope | Zeiss | Axio Observer Z1 | |
| Nd:YAG laser (laser 1) | New Wave Research | Tempest | |
| Nd:YAG laser (laser 2) | New Wave Research | Orion | |
| Delay generator | Berkeley Nucleonics | BNC 565-8c | |
| Flash lamp | Dyna-Lite | ML1000 fiber-coupled flashtube | |
| high speed camera | DRS Hadland | Imacon 200 | |
| high speed camera | Shimadzu | HPV-X | |
| high speed camera | Vision Research | Phantom V7.3 | |
| PIV software | LaVision | DaVis 7.2 | |
| camera | Zeiss | AxioCam MRc 5 | |
| software | Zeiss | AxioVision | |
| PTI system | Horiba | S/N: 1705 RAM-X | |
| EasyRatio software | Horiba | Easy Ratio Pro 2 | version 2.3.125.86 |
| 63× objective | Zeiss | LD Plan Neofluar |
References
- Wang, D., Bodovitz, S. Single cell analysis: the new frontier in 'omics. Trends Biotechnol. 28 (6), 281-290 (2010).
- Weaver, W. M., et al.
- Gossett, D. R., et al. Hydrodynamic stretching of single cells for large population mechanical phenotyping. Proc Natl Acad Sci USA. 109 (20), 7630-7635 (2012).
- Spiller, D. G., Wood, C. D., Rand, D. A., White, M. R. H.
- Lecault, V., White, A. K., Singhal, A., Hansen, C. L. Microfluidic single cell analysis: from promise to practice. Curr Opin Chem Biol. 16 (3-4), 381-390 (2012).
- Kennedy, J. E. High-intensity focused ultrasound in the treatment of solid tumours. Nat Rev Cancer. 5 (4), 321-327 (2005).
- Zhu, S., Cocks, F. H., Preminger, G. M., Zhong, P. The role of stress waves and cavitation in stone comminution in shock wave lithotripsy. Ultrasound Med Biol. 28 (5), 661-671 (2002).
- Fan, Z., Liu, H., Mayer, M., Deng, C. X. Spatiotemporally controlled single cell sonoporation. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (41), 16486-16491 (2012).
- Itah, Z., et al. Hydrodynamic cavitation kills prostate cells and ablates benign prostatic hyperplasia tissue. Exp Biol Med. 238 (11), 1242-1250 (2013).
- Kosar, A., Sesen, M., Oral, O., Itah, Z., Gozuacik, D. Bubbly cavitating flow generation and investigation of its erosional nature for biomedical applications. IEEE Trans Biomed Eng. 58 (5), 1337-1346 (2011).
- Li, Z. G., Liu, A. Q., Klaseboer, E., Zhang, J. B., Ohl, C. D. Single cell membrane poration by bubble-induced microjets in a microfluidic chip. Lab Chip. 13 (6), 1144-1150 (2013).
- Li, F. F., Chan, C. U., Ohl, C. D. Yield Strength of Human Erythrocyte Membranes to Impulsive Stretching. Biophys J. 105 (4), 872-879 (2013).
- Li, F., M, M., Ohl, C. .D. . Shear stress induced stretching of red blood cells by oscillating bubbles within a narrow gap. Bull Am Phys Soc. 58, (2013).
- Sankin, G. N., Yuan, F., Zhong, P. Pulsating tandem microbubble for localized and directional single-cell membrane poration. Phys. Rev. Lett. 105 (7), 078101 (2010).
- Fan, Q., Hu, W., Ohta, A. T. Laser-induced microbubble poration of localized single cells. Lab Chip. 14 (9), 1572-1578 (2014).
- Chen, C. S., Mrksich, M., Huang, S., Whitesides, G. M., Ingber, D. E. Geometric control of cell life and death. Science. 276 (5317), 1425-1428 (1997).
- Yuan, F., Sankin, G., Zhong, P. Dynamics of tandem bubble interaction in a microfluidic channel. J Acoust Soc Am. 130 (5), 3339-3346 (2011).
- Microchem, SU-8 2000 Processing Guidelines. , Available from: http://www.microchem.com/pdf/SU-82000DataSheet2000_5thru2015Ver4.pdf (2000).
- Yang, C. Analysis of Tandem Bubble Interaction and Jet Formation in a Microfluidic Channel. , Duke University. (2013).
- Simon, S. I., Schmid-Schonbein, G. W. Cytoplasmic strains and strain rates in motile polymorphonuclear leukocytes. Biophys J. 58 (2), 319-332 (1990).
- Barbee, K. A., Macarak, E. J., Thibault, L. E. Strain measurements in cultured vascular smooth muscle cells subjected to mechanical deformation. Ann Biomed Eng. 22 (1), 14-22 (1994).
- Yuan, F., Yang, C., Zhong, P. Cell membrane deformation and bioeffects produced by tandem bubble-induced jetting flow. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 112 (51), E7039-E7047 (2015).
- Yin, H., Marshall, D. Microfluidics for single cell analysis. Curr Opin Biotechnol. 23 (1), 110-119 (2012).
- Tay, S., et al. Single-cell NF-kappa B dynamics reveal digital activation and analogue information processing. Nature. 466 (7303), 267-271 (2010).
- Rand, R. P., Burton, A. C. Mechanical Properties of the Red Cell Membrane: I. Membrane Stiffness and Intracellular Pressure. Biophys J. 4 (2), 115-135 (1964).
- Lim, C. T., Dao, M., Suresh, S., Sow, C. H., Chew, K. T. Large deformation of living cells using laser traps. Acta Mater. 52 (7), 1837-1845 (2004).
- Puig-de-Morales-Marinkovic, M., Turner, K. T., Butler, J. P., Fredberg, J. J., Suresh, S. Viscoelasticity of the human red blood cell. Am J Physiol Cell Physiol. 293 (2), C597-C605 (2007).
- Kudo, N., Okada, K., Yamamoto, K. Sonoporation by single-shot pulsed ultrasound with microbubbles adjacent to cells. Biophys J. 96 (12), 4866-4876 (2009).
- van Wamel, A., et al. Vibrating microbubbles poking individual cells: Drug transfer into cells via sonoporation. J Control Release. 112 (2), 149-155 (2006).
- Hu, Y., Wan, J. M., Yu, A. C. Membrane perforation and recovery dynamics in microbubble-mediated sonoporation. Ultrasound Med Biol. 39 (12), 2393-2405 (2013).
- Dijkink, R., et al. Controlled cavitation-cell interaction: trans-membrane transport and viability studies. Phys Med Biol. 53 (2), 375-390 (2008).
- Rau, K. R., Quinto-Su, P. A., Hellman, A. N., Venugopalan, V. Pulsed laser microbeam-induced cell lysis: Time-resolved imaging and analysis of hydrodynamic effects. Biophys J. 91 (1), 317-329 (2006).
