Abstract
I detta manuskript, beskriver vi först tillverkningsprotokollet av en mikroflödessystem chip med guld prickar och fibronektinbelagda regioner på samma glassubstrat, som just styr generering av tandem bubblor och enskilda celler mönstrade närheten med väldefinierade platser och former. Vi visar då är alstrandet av tandembubblor genom användning av två pulsade lasrar belyser ett par guld prickar med några-mikrosekund tidsfördröjningen. Vi visualiserar bubblan-bubblan interaktion och jet bildning av höghastighetsavbildning och karakterisera den resulterande flödesfältet med hjälp av partikel bild Velocimetry (PIV). Slutligen presenterar vi några tillämpningar av denna teknik för enskild cell analys, inklusive cellmembran Abp med makromolekyl upptag, lokal membran deformation bestäms av förskjutningar av bifogade integrinbindande pärlor, och intracellulär kalcium svar från ratiometrisk avbildning. Våra resultat visar att en snabb och riktningsprutningsflödet är proproduceras vid tandem bubblan interaktion, som kan införa en mycket lokal skjuvspänning på ytan av en cell odlas i omedelbar närhet. Vidare kan olika bioeffekter induceras genom förändring av styrkan hos sprutan flödet genom att justera standoff avståndet från cellen till tandem bubblor.
Introduction
Det finns en växande insikt om att cellulär heterogenitet, som härrör från den stokastiska uttrycket av gener, proteiner och metaboliter, finns inom ett stort cellpopulation och fungerar som en grundläggande princip i biologi för att möjliggöra cell anpassning och evolution 1. Därför är det ofta felaktiga och otillförlitliga att använda populationsbaserade mätningar bulk att förstå funktionen hos individuella celler och deras interaktioner. Utveckla ny teknik för encelliga analys är därför av stort intresse inom biologisk och farmakologisk forskning, och kan användas, till exempel för att bättre förstå de viktigaste signalvägar och processer i stamcellsbiologi och cancerterapi 2-4. Under de senaste åren har framväxten av mikroflödes plattformar underlättas avsevärt encelliga analys, där positioneringen, behandling och observation av svaret från enskilda celler har utförts med nya analytiska strategier 5.
Kavitation spelar en viktig roll i en mängd olika biomedicinska tillämpningar, inklusive behandling av cancer genom hög intensitet fokuserat ultraljud (HIFU) 6, den icke-invasiv fragmentering av njursten efter stötvågen litotripsi (SWL) 7, läkemedel eller gentillförsel genom sonoporation 8, och den nyligen rapporterade förstörelse av celler eller vävnader av hydrodynamiskt bubbla kavitation 9,10. Trots detta, de dynamiska processer av kavitation bubblan (er) interaktioner med biologisk vävnad och celler har inte väl förstått. Detta beror på slumpmässig i kavitation initierings- och bubbla dynamik produceras av ultraljud, stötvågor, och lokal hydrauliska trycket; Dessutom finns det en brist på möjliggöra tekniker för att lösa de inneboende komplexa och snabba svar av biologiska celler, speciellt vid enkelcellnivån.
På grund av dessa utmaningar, är det inte förvånande att mycket få studier har been rapporterade att undersöka bubbel cell-interaktioner under väl kontrollerade experimentella förhållanden. Till exempel, membran Abp av enskilda celler fångade i suspension 11 och impulsiva stor deformation av humana röda blodkroppar 12 har visats med hjälp av lasergenererade enstaka bubblor i mikroflödessystem kanaler. Den senare tekniken kan emellertid bara producera mycket liten deformation i eukaryota celler på grund av närvaron av kärnan 13. Dessutom är det svårt att övervaka bioeffekter nedströms vid behandling av celler i suspension. I andra studier har ultraljudsexcitering av ett cellbundet mikrobubblor (eller ultraljudkontrastmedel) för framställning av membran porering och / eller intracellulära kalciumsvar i enskilda adherenta celler rapporterats 8. Membran porering av enskilda adherenta celler kan även framställas genom användning av lasergenererade tandem bubblor i ett tunt vätskeskikt innehållande Ijusabsorberande Trypan blå lösning 14, ellergenom en oscillerande gasbubbla som genereras av mikrolaserpulser bestrålar genom ett optiskt absorberande substrat i microchambers 15. Vid jämförelse, har den optiskt absorberande substratet en fördel framför laserabsorberande Trypan blå lösning eftersom de senare är giftig för celler. Ännu viktigare, lasergenererade bubblor är mer kontrollerbar när det gäller bubbel storlek och placering än akustiskt glada bubblor. Icke desto mindre, i alla dessa tidigare studier, cellformen, orientering och adhesionsförhållanden var inte kontrolleras, vilket väsentligen kan påverka cellsvaret och bioeffekter produceras av mekaniska spänningar 16.
För att övervinna dessa nackdelar i tidigare studier har vi nyligen utvecklat ett experimentellt system för bubbla generation, cell mönstring, bubbla-bubbla-cell-interaktioner, och realtids bioanalyser cellsvar i ett mikroflödessystem chip konstruerats med hjälp av en unik kombination av mikro Techniques. Tre huvuddrag som skiljer vårt experimentella system från andra i området är: 1) mönstring av mikrometerstorlek guld prickar på glassubstrat för att möjliggöra lokal laser absorption för bubbla generation 17; 2) den mönstring av mikrometerstorlek öar av extracellulär matris (ECM) för cellvidhäftning på samma substrat för att styra både läge och geometrin hos enskilda celler; och 3) komprimering av dimensionen av interaktionen bubble-bubble-cell domän från 3D till en kvasi-2D utrymme för att underlätta i planet visualisering av bubbel-bubbel-interaktioner, jetting flödesfält, cell deformation och bioeffekter, alla fångas i en strömlinjeformad avbildningssekvens (Figur 1d).
Figur 1: Den mikroflödessystem chip och scheman för olika analyser. a) En sammansatt mikroflödessystem chip med kanaler fyllda med blått bläck för visualisering. b) En region inuti mikroflödeschip med mönstrade celler och guld punkter (avståndet mellan de två guld prickar i närhet är 40 | j, m). Många par av arbetsenheter kan arrangeras i en kanal. c) Närbild bilden av en enda arbetsenhet bestående av ett par guld prickar och en HeLa cell fäst vid cell mönstring region. d) Skiss över enhetens funktion. En enda cell vidhäftar och sprider på "H" -formad ö belagd med fibronektin. Ett par kavitationsbubblor (tandem bubbla) med motfas oscillation produceras genom att belysa pulsade laserstrålar på guld prickar (se figur 4a), vilket leder till generering av en snabb och lokaliserad stråle rör sig mot målcellen i närheten. Cellen kan deformeras, dats för makromolekylärt upptag, och / eller stimuleras med ett kalciumsvar, beroende på den standoff avståndet (S d) i cellen till den tandem bubblan.f = "http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55106/55106fig1large.jpg" target = "_ blank"> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Denna plattform kan kombineras ytterligare med fluorescensanalyser och funktionaliserade pärlorna bundna till cellytan för kavitations-inducerad bioeffekter. I synnerhet, öppnar denna plattform vägen för tillförlitliga och kvantifierbara analyser vid encelliga nivå. Hittills har vi använt enheten för analys av tandem bubbla-inducerad cellmembranet deformation, cell Abp och intracellulär upptagning, livskraft, apoptos, och intracellulär kalciumsvar. I följande protokoll, beskriver vi processen för chiptillverkning och förfarandet för att analysera de olika bioeffekter nämns ovan. Dessutom är verksamheten i chipet också beskrivits.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Mikro
OBS: Alla mikrotillverkningsförfaranden sker i ett renrum. En krommask är utformad före mikro, se figur 2.
Figur 2: Schematisk bild av kanaldesign i mikroflödessystem chip och dimensionerna hos de arbetsenheter. a) Mask utformning av de inriktade PDMS mikro (grön) och mönster på glassubstrat (blå och röd). b) Förstorad bild av maskdesign i en representativ del av arbetsenheten matriser. c) Schematisk bild av en arbetsenhet som visar en cellmönster (blå) och ett par guld punkter (röd). Alla längdskalor visas längst ner till höger. Klicka här för att se en larGER version av denna siffra.
- Guld dot mönstring
OBS: Arean för varje gula punkten är avsedd att vara inom 25 till 30 | j, m 2, så att den är tillräckligt stor för att absorbera laserenergi för bubbelalstring, men tillräckligt liten för att undvika individuella celler som vidhäftar till den. Ett schematiskt diagram för den gula punkten tillverkning visas i figur 3a.- Glasskiva rengöring (i en kemisk huv)
- Spola glasskiva med aceton följt av isopropylalkohol (IPA), och sedan torka med N2-flöde.
- Blöt sliden i Piranha-lösning (H 2 SO 4: H2O 2 = 4: 1) under 10 min.
- Ta ut bilden, skölj den med avjoniserat vatten och sedan torka med N2-flöde.
- Baka objektglaset på en värmeplatta vid 120 ° C under 10 min.
- Behandla bilden i en plasma Asher på 100 W under 90 s.
- Spinnbeläggning (spinnbeläggning huva)
- Slå på en värmeplatta och vänta tills temperaturen är stabil vid 95 ° C.
- Följ beläggningsproceduren:
1000 rpm under 5 s med en 500 rpm / s ramp;
sedan 3000 rpm under 30 s med 1000 rpm / s ramp. - Fixera den rengjorda glasskivan på spinnbeläggare genom att applicera ett vakuum.
- Täck glidyta med P-20 och starta beläggningsrecept.
- Upprepa beläggningsprocessen för NFR-negativ fotoresist.
- Grädda bilden vid 95 ° C under 60 sekunder och vänta tills den har svalnat till rumstemperatur.
- fotolitografi
- Montera krommasken på mask Aligner och se till att mönstret är vänd nedåt mot bilden.
- Ställ in fotolitografi receptet till exponeringsläge hårt med 9 s av UV-exponering och snabbt anpassa glassubstrat med masken.
- Efter att ha genomfört den UV-exponering, baka bilden vid 956; C under 1 minut, och sedan låta det svalna till rumstemperatur.
- Utveckling
- Utveckla mönstret på objektglaset i framkallningslösningen under 60 s.
- Ta bilden från utvecklaren, spola det med avjoniserat vatten och torka den med N2-flöde.
- Kontrollera mönstergeometrin under ett mikroskop, och mäta och registrera dimensionen.
- Guld nedfall (elektronstråle avdunstning) och lyft-off
- Grädda bilden vid 120 ° C under 5 minuter, och låt den svalna till rumstemperatur.
- Rengör bilden med plasma i reaktiv jonetsning (RIE) maskin för 90 s vid 500 Torr och 100 W.
- Deposition 5 nm Ti och 15 nm Au på bilden med hjälp av en elektronstråle förångare 17.
- Blöt sliden över natten i en glasbägare innehållande fotoresist borttagnings lösningsmedel för att avlägsna guldet som vilar på toppen av NFR motstå.
- Hämta bilden, spola it med aceton följt av IPA, och torka den med N2-flöde.
- Torka bilden på en varm platta vid 115 ° C innan du rengör den i syreplasma Asher på 100 W under 90 s.
- Glasskiva rengöring (i en kemisk huv)
- Molekyl montering mönstring av lift-off (MAPL)
Obs: Området för varje fibronektin-belagda ön är inställd på att vara inom 700-900 pm 2 för att underlätta tillräcklig HeLa cellspridning i en fyrkantig region samtidigt minimera risken för flera celler aggregerar på ön. Ett schematiskt diagram för framställningen av cellmönstrings öar visas i figur 3b.- spinnbeläggning
- Upprepa steg 1.1.2, men använder S1813-positiv fotoresist och en temperatur av 115 ° C.
- inriktade fotolitografi
- Montera krommasken på mask Aligner och se till att sidan med mönstret nedåt mot bilden medguld prickar.
- Ställ in fotolitografi receptet till exponeringsläge hårt med 9 s UV-exponering.
- Rikta den övre masken med botten bilden med hjälp av inriktningsmärken, som ligger runt kanten på masken, såsom en rumslig referens.
- Kontrollera den centrala delen av masken och kontrollera att mönster funktioner hamnar rätt.
- Slutföra UV-exponering utan en post-baka.
- Utveckling
- Upprepa steg 1.1.3 men med 45 s utvecklings före torkning på en värmeplatta och bevara i N2 lagring.
- spinnbeläggning
- kemisk behandling
- Förbereda det passiverande lösning: 0,5 mg / ml PLL-g-PEG i 10 mM HEPES-buffert.
- Hämta bilden från N2 lagring och rengör den med RIE med parameterinställningen: 500 Torr tryck, 100 W effekt, och 90-s varaktighet.
- Pipettera en droppe av passive lösningen på en bit paraffinfilm. </ Li>
- Smörgås lösningen med filmen och bilden, och se till att sidan med mönstret funktioner är vänd nedåt mot filmen; undvika bildandet av bubblor.
- Vänta 45 minuter innan du tar bort bilden från filmen.
- Blötlägg bilden efter varandra i fotoresist borttagningsmedel, fotoresist borttagningsmedel och DI vatten (1: 1), och avjoniserat vatten, och skaka den i ett ultraljudsbad under 90 s för varje blöt.
- Torka objektglaset på en värmeplatta för att avlägsna fukten innan förslutning den i en exsickator och lagra den i ett kylskåp.
- chip~~POS=TRUNC
- Upprepa steg 1.1.1-1.1.4, men med SU8-2025-negativ fotoresist och inställningen parameter avses kallas MICROCHEM-protokollet 18, för att framställa en kiselform med en fotomask.
- Tillverka en PDMS mikro (40 mm x 25 mm x 5 mm, L x B x H) och en liten PDMS platta (800 um-brett spår struktur) med hjälp av mjuk litografi.
- Punch microchannel för vätskeaccessportar och rena den med tejp och sedan med IPA.
- Skärma det mönstrade området av glassubstratet med PDMS platta, och tillämpa RIE (100 W, 500 mTorr, 60 s) för att avlägsna PLL-g-PEG från det perifera området.
- Behandla mikro med en reducerad dos av RIE (25 W, 500 mTorr, 25 s), och sedan anpassa den till det mönstrade glassubstratet (med den lilla PDMS platta avlägsnade); föra mikro och mönstrade glassubstratet i konform kontakt under en stereoskop.
Figur 3: Schematisk diagram för mikro och chip montering. a) Mönster av guld prickar på glassubstratet. b) Framställning av glassubstrat för cell mönstring via MAPL. c) Montering av mikroflödessystem kanal med plasma bindning. Se Materiallista för definitionerna of förkortningarna. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
- cellvidhäftning
OBS: HeLa-celler rutinmässigt bibehålls i DMEM kompletterat med 10% FBS och 1% antibiotika / antimitotiska lösning i en cellodlingsinkubator. Ett schematiskt diagram för chipset montering och cellbindning visas i figur 3c.- Prime chipet med PBS under 30 min vid 1 ml / min, och sedan infundera fibronektin lösning (50 mikrogram / ml i PBS, 1 | il / min) under 45 min.
- Medan du väntar, trypsinize cellodling med 0,25% trypsin-EDTA, tvätta dem i odlingsmedium, centrifugera enskilda celler, och rekonstituera cellsuspensionen i förvärmda (37 ° C) odlingsmedium på 5x10 6 celler / ml.
- Ersätta fibronektinlösningen med PBS och spola chipet vid 10 | il / min under 5 min.
- Injiceraden framställda cellsuspensionen i chipet, stoppa flödet, klämma utloppet, och upprätthålla chipet i en cellkultur inkubator under 30 min.
- Frigöra utloppet och spola chip med cellodlingsmedium vid 10 | il / min under 5 min. Reducera perfusion flödeshastighet av odlingsmediet till 0,75 | il / min och underhålla cellodlingen i 2 h i inkubatorn.
2. Bubble Generation och Flow Visualisering
ANMÄRKNING: En schematisk bild av experimentuppställningen visas i fig 4a för tandem bubbelalstring och den resulterande flödes interaktion med en enda cell som odlas i närheten i ett mikroflödessystem kanal.
- Generering av tandem bubblor med två lasrar och tidsstyrning
- Placera mikroflödes chip på scenen av ett inverterat mikroskop och anpassa härdar av två pulsade Nd: YAG laser (λ = 532 nm, 5-ns puls varaktighet) på ett par mönstrade guld punkter separerade by 40 | j, m.
- Använd en digital fördröjningsgenerator för att utlösa två lasrar med en tidsfördröjning om 2,5 ps att producera två bubblor som inletts vid guld prickar.
- Justera laserns utgångsenergi (~ 10 μJ) för att producera en maximal diameter på bubblorna inom 50 ± 2 ^ m.
- Synkronisera en höghastighetskamera (200-ns exponering och 2 miljoner bilder per sekund (fps)) till lasrarna och fånga dynamiken i bubbelexpansion, kollaps, bubble-bubbla interaktion, och jet bildning.
- Kvantifiering av strålhastighet
- Registrera positionen för strålen spets (J 1) vid den proximala änden av den första bubblan (B 1) och den distala änden av B 1, med början vid genereringen av den andra bubblan (B 2) och slutar med touchdown av J en mot den distala änden av B 1; se den schematiska i figur 5a.
- Linjärt passa tidsförloppet position för both den proximala (jet tips) och de distala ändarna. Beräkna lutningen på spetspositionen mot tid-kurva för den proximala änden för att bestämma strålens hastighet. Skärningspunkten mellan de två linjerna indikerar jet touchdown tiden. Mer information kan hittas i referens 19.
- Visualisering av tandembubblan-inducerad flödesfält
- Förbereda en xm av polystyren (PS) pärlsuspension i Dl-vatten (2,6% vikt / volym) och injicera pärlorna in i mikroflödeschipet.
- Generera tandem bubblor som beskrivs i steg 2.1.1-2.1.3.
- Spela in tandem bubblan dynamik med hjälp av en höghastighetsvideokamera med en inramning hastighet på 5 M fps med en 100-ns exponeringstid.
- Ladda upp den förvärvade bildsekvensen till en kommersiell PIV programvara.
- Dela upp varje bild i mindre förhörs fönster 16 x 16 pixlar (px) med 75% överlappning.
- Applicera multi-pass iteration och regionala filter för att minska felen i hastighetsfältet beräkning, ochoutput resultaten i en hastighetsvektor karta.
Figur 4: Schematisk bild av experimentuppställning och bildinspelning. a) Experimentuppställning för tandem bubbla generation. b) tidssekvens som används för olika typer av avbildnings förvärv. FL: fluorescensmikroskopi, BF: ljusa fält, IFT: inter tid. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
3. Single-cellanalys och bioeffekter
OBS: tandem bubbla produceras bredvid målcellerna, och de resulterande bioeffekter studeras i ett dödläge avstånd beroende sätt. Tidsföljden för olika typer av bildförvärv avbildas i fig 4b.
- Membran porering och makromolekylär upptag
OBS: Upptaget av extracellulära makromolekyler in i målcellen kännetecknas av progressiv diffusion av membran impermeant propidiumjodid (PI) genom den poreringsstället på cellmembranet.- Efter steg 1,5, ersätta den normalt odlingsmedium (dvs DMEM) med PI-lösning (100 mikrogram / ml i DMEM) som löper vid en perfusion flödeshastighet av 0,5 mikroliter / min under hela försöket.
- Programmera mikroskop styrprogram för att automatiskt välja PI fluorescerande kuben på den roterande torn och synkronisera tidpunkten för CCD-kamera med PI fluorescens excitation att fånga fluorescens bilder med en exponeringstid på 200 ms.
- Efter de två laser fokus är anpassade till ett par guld prickar bredvid en målcell, spela in både ljusa fält (BF) och fluorescens (FL) bilder innan tandem bubblan behandling.
- Använd mikroskop styrprogram för att omedelbartstarta en tidsförlopp fluorescens bildinspelning av målcellen strax efter steg 2,1 för att fånga historia PI upptag.
- membran deformation
- Förbereda en-um pärlor (1% vikt / volym, aktiverade med vattenlöslig karbodiimid) och funktionalisera dem med peptid-2000 (100 | ig / ml i PBS).
- Efter steg 1,5, inkubera de bifogade cellerna med de funktionaliserade pärlorna i en täthet av 1x10 9 pärlor / ml vid 37 ° C under 30 min.
- Upprepa steg 2,1 för att producera tandem bubblor bredvid målcellen och registrera cell deformation med en ultra-höghastighetskamera körs med en inramning hastighet på 5 miljoner fps.
- Identifiera en triad av 3 pärlor som finns kvar på bildplanet genom hela experimentet och sammanställa sina positioner som (x 1, y 1) (x 2, y 2), och (x 3, y 3) i experimentet koordinater.
- Beräkna arean av triaden före och afTer tandem bubblan behandling med formeln:
- Beräkna area stam som:
- Baserat på koordinaterna för de tre hörn före och efter tandem bubblan behandling, beräkna den lokala huvudstam och området stam följande etablerade protokoll 20,21.
- Livskraft och apoptos
OBS: FITC Annexin V etiketter celler, inklusive apoptotiska sådana, genom utläggning av fosfatidylserin (grön fluorescens). PI etiketter kärnor av nekrotiska celler (röd fluorescens). Ljusa fält avbildning används för att dokumentera cellmorfologin och att hjälpa till med identifieringen av cellernas livskraft och apoptos.- Registrera positionen för varje behandlad cell i mikroflödeskanalen (underlättas av de adressetiketter i kanalen, se figur 2b
- Inkubera de behandlade cellerna i cellodlingsmediet för en annan 2 timmar före perfusion av chipet med FITC Annexin V lösningen under 15 min. Positiva celler visar grön fluorescens.
- Upprepa steg 3.3.2 24 timmar efter tandem bubblan behandling för att studera de långsiktiga bioeffekter i målcellerna.
- kalciumsvar
- Blanda 3 mikroliter av fura-2:00 stamlösning (1 mg / ml i DMSO) med 3 mikroliter av 10% vikt / vol Pluronic F-127 i 500 mikroliter av reducerat serummedium för att framställa den slutliga lösningen etikettering (6 iM).
- Efter steg 1,5, byt cellodlingsmediet med märkningen lösning och inkubera i rumstemperatur i mörker under 40 min (1 | il / min perfusionshastighet).
- Fyll kanalen med den reducerade serummedium (0,75 ml / min perfusionshastighet) innan cellexperiment.
- Börja ratiometrisk avbildning (våglängd: 340/380 nm, 50 ms exponering)av målcellen med hjälp av kommersiella PTI systemet.
- Efter 10 s från ratiometrisk avbildning av cellen vid vilonivån, producera tandem bubblor som i steg 2,1; första skiva med en inter tid (IFT) på 0,1 s för en minut, sedan öka IFT till 1 s för en annan minut, och ytterligare ökning till 5 sekunder efter 2 min.
- Använda PTI programvara för att beräkna förhållandet R = F340 / F380 i regionen av intresse (ROI), som är proportionell mot den intracellulära kalciumkoncentrationen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den mikroflödessystem plattformen beskrivs i detta arbete kan användas för att undersöka bubbel bubbla interaktioner och analysera en mängd kavitation-inducerad bioeffekter vid encelliga nivå. Här presenterar vi flera exempel för att visa en mängd olika experimentella studier och bioanalyser som kan utföras i vårt experimentella system. Vi kommer först att illustrera de transienta interaktioner av tandem bubblor med jet bildning, visualisering av den resulterande flödesfältet, och beräkningen av jet hastigheten (figur 5a). Vi kommer då att presentera exempel på tandembubbel inducerad lokaliserad cellmembranet deformation (figur 5b), pekade membran Abp med PI upptag (Figur 5c), och intracellulär kalciumsvar (Figur 5d). Andra exempel, såsom cellviabilitet och apoptos-analyser, kan hittas i referens 22.
Figur 5a visar ett exempel på tandem bubblan interaktion med jet bildning, fångas upp av höghastighets bildbehandling, och den resulterande flödesfältet avslöjas av PIV. Speciellt efter sin maximala expansion kollapsen av den första bubblan B 1 (som tillverkas i 0 ps) är förvrängt asymmetriskt av den snabba expansionen av den andra bubblan B2 (som tillverkas i 2,5 ps), vilket leder till bildandet av en "uppåt" strålen (J 1) vid 3,4 ^ s och den efterföljande prutningsflödes, visad vid 5,4 | is. Den genomsnittliga jet hastigheten bestäms av lutningen på en monterad linje för positionen av den proximala änden (eller polen) av B 1 före sättningen (dvs. kontakt med den distala änden av B 1) som funktion av tiden. Den genomsnittliga jet hastigheten visat sig öka från 20 till 58 m / s när den maximala diametern av B 2 ökar från 40 till 60 um. Baserat på resultaten från PIV analys, riktningsprutnings Flödet runt tandem bubblan är i storleksordningen 10 m / s och begränsas inom en bredd av storleksordningen 10 ^ m. Det är sålunda i stånd att producera en impulsiv och lokaliserad skjuvspänning och stress gradient på en målcell odlas i närheten.
Ett annat exempel visas i figur 5b illustrerar cellmembranet deformationen som induceras av den riktnings- och lokaliserad prutningsflödes produceras av tandem bubblor på standoff avstånd S d = 40 ^ m. Membranet deformation och återhämtning är markerade genom förskjutning av en funktionaliserad vulst (anges av den gula streckade linjen) fäst vid den främre kanten av cellmembranet. Det lokala området stammen kan beräknas från koordinatema för en triad av angränsande kulor. En schematisk bild av den beräknade maximala förändringen området vid olika ställen på cellytan visas i mitten. Framkanten främst sträcks (se de gröna cirklarna), medan bakkanten eller latrala sidor av cellen komprimeras (såsom indikeras av de röda cirklar), vilket indikerar heterogenitet i cell deformation produceras av tandem bubblan inducerad prutningsflödet. Den temporala variation av området stammen vid cell framkanten illustreras till höger. Den består av några snabba svängningar i början, följt av en stor och ihållande stretch för cirka 100 ps (FWHM) och en efterföljande gradvis återhämtning på en tidsskala av flera ms.
Vidare stort område stammen och stam integrerad vid cell framkant kan vara ansvarig för cellmembranet porerobserverades vid små S d, såsom visas i Figur 5c. Vid små S d (dvs., 10 | j, m, eller i vissa fall, 20 | j, m) och mellanliggande S D (dvs de flesta av 20 och 30 ^ m), en lokaliserad störning membran induceras, vilket leder till ett pinpoint upptag av extracellulär PI incytosolen. Om PI intensitet inuti cellen fortsätter att öka utan mättnad inträffar nekros. I jämförelse, om PI intensiteten är en storleksordning lägre och når en platå inom 10 s efter det att tandem bubblan behandling kommer reparerbar porering med sannolikt cellöverlevnad uppträder, vilket ytterligare stöds av minimal förändring av cellmorfologin. Vid stora S d (dvs 40 pm), försumbar PI upptag hittas efter tandem bubbla behandling, vilket indikerar försumbar eller icke-Abp. Cellen kan överleva med regelbunden tillväxt och spridning 22. Sammantaget visar resultaten en tydlig övergång i cellsvar från nekros, genom reparerbar membran porering, till icke-porering i intervallet S d ≈ 20-40 | j, m.
Slutligen visar vi resultaten av ratiometrisk avbildning av intracellulärt kalcium som förvärvas vid tandem bubblor i individuella celler vid olika Sd, särskilt i subletala området S d = 30-50 m (Figur 5d). Intensitetskvoten är proportionell mot mängden av intracellulärt kalcium. Vid små S d (dvs 30 pm eller, i vissa fall, 40 pm), en kalcium våg reser från framkanten till bakkanten tydligt observeras inom några sekunder efter tandem bubblan behandling. Efter den intracellulära kalcium når en toppkoncentration, avklingar det långsamt tillbaka till vilonivån inom några minuter. Däremot i stort S d (dvs, eller i vissa fall, en majoritet av 50 pm 40 pm), är ökningen av intracellulär kalcium mycket mildare, och några klart synliga reser kalcium våg kan identifieras. Dessa två olika kalciumsvar kan också skiljas från sina intensitetsförhållande mot tidsprofiler, med betydande skillnader i toppamplituden av intensitetsförhållandet och stigtid från vila nivå till toppvärde. Vid en ännu större S d (dvs över 60 um), kan observeras ingen kalciumsvaret. Den procentuella andelen av HeLa-celler som uppvisar kalciumsvar vid olika S d sammanfattas i fig 5d (höger).
Allt som allt har våra resultat visat att, genom att ändra styrkan hos sprutanflödet (eller ändra S d), kan framställas ett flertal bioeffekter i enskilda HeLa-celler under liknande odlingsbetingelser, vilket sannolikt är korrelerade med amplituden och varaktigheten av den mekaniska deformationen som införts på cellmembranet 22.
Figur 5: Resultat från tandem bubbla interaktion, cellmembranet deformation, membran Abp, och kalcium svarsanalyser. a) flytande rörelse och jetinducerad av tandem bubbla interaktion. Vänster: Utvalda bilder visar tandem bubbla interaktioner med jet bildning och flödesfält avslöjas av PIV. De maximala diametrarna hos de två bubblor är ungefär 50 ± 2 ^ m. USA: Schematisk av de prutningstandem bubblor, som illustrerar centrumaxeln, beskärning av koordinaterna (o), och proximala och distala ändar (eller stolpar) av den första bubblan B 1. Höger: Uppmätt pole position (med fel = ± 1 mm) vid den proximala och distala änden av B 1. b) Cellmembran deformation. Vänster: Den gula streckade linjen etiketter förskjutningen av en PS vulst fäst vid främre kanten av cellmembranet, vilket indikerar den lokala membranet deformation och återhämtning. Mitten: en schematisk visar topparean stammar på olika ställen på cellytan som visas till vänster. Höger: De tidsförloppen för stammarna i området i mitten av cellen framkant. Δ ε är området stam beräknade based på huvudstammar och Δ Δ är området stammen beräknas på triaden geometri förändring. Mer information om beräkningen området stammen och felanalys dokumenteras i referens 22. c) Cellmembran Abp. Vänster: ljusa fält bilder före och efter tandem bubbla behandling och tidsförlopp fluorescens bilder av PI upptag (0 och 120 s). De vita pilarna indikerar prutningsflödesriktningen. Mitten: den typiska förändringen av genomsnittliga PI intensitet mot tid inuti cellerna. Höger: Statistiska resultat av andelen celler som genomgår nekros (röd), repareras Abp (blå), och icke-Abp (grön) vid olika Sd. Antal celler behandlade: N = 9, 14, 14, och 8 för S d = 10, 20, 30, och 40, respektive. Den statistiska felet är ± 1 / √ N. d) Intracellulär kalciumsvar. Vänster: sekvenser av ratiometriska bilder som visar de intracellulära kalciumsvar av enskilda cellens vid S d av 30 | j, m och 50 | j, m. De röda pilarna indikerar jet riktning. USA: typiska svarsprofiler (förhållande tidskurvor) vid olika Sd. Höger: sannolikheten för en kalciumsvar på olika Sd. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| standoff avstånd (S d) (^ m) | Reynolds tal (Re) | genomsnitt skjuvspänning (Pa) i YZ-planet |
| 20 | 206,96 | 618,64 |
| 30 | 354,8 | 709,69 |
| 40 | 378,78 | 657,22 |
| 50 | 163,85 | 323,61 |
| 60 | 105,08 | 42,21 |
Tabell 1: En lista med parametrar för flödes fysik från PIV resultat. Uppskattad Reynoldstal och medelvärdes skjuvspänning med avseende på olika distansdon avstånd (S d). YZ-planet avser den kanalbredd x höjd planet. Den medelvärdes skjuvspänningen uppskattas från en höjd av 0-7,7 | im från kanalbotten eftersom cellen höjd i kanalen är ca 6-7 | j, m.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Encelliga analys, i kombination med levande cell imaging, har förbättrats avsevärt vår förståelse av de dynamiska och ofta varierande processer i enskilda celler, såsom fenotyp utveckling och immunsvar 23. I motsats till den konventionella cellkultur i skålar eller kolvar, mikrofluidiksystem möjliggöra exakt kontroll av mikromiljön, ner till den encelliga nivå, i realtid. Följaktligen framsteg inom mikroflödesteknik och tekniker har i hög grad förbättrat genomströmning och reproducerbarhet av encelliga analys. Genom att integrera mjuk litografi och yta mönstring, kan mikroflödessystem ytterligare för att underlätta den fördjupade analys av en enda cell svar på komplexa mönster av spatiotemporally variabla stimuli. Till exempel, har övergående kemiska eller mekaniska signaler har levererats till enstaka celler medan deras biologiska eller mekaniska svar registreras automatiskt och analyseras två4. Trots denna allmänna trend, har tillämpningen av mikrofluidik för att analysera kavitation-inducerade bioeffekter på cellnivå varit mycket begränsad. Framförallt har den endast tillämpats på bubble-inducerad membran porering av individuella celler i suspension fångad av mikropelare 11. I de flesta studier på fastsittande celler, är fördelen med att styra cellmorfologin att upprätthålla konsekvens i dynamiska bubbelcellinteraktioner antingen tillgänglig eller försummat.
Vi har utvecklat en mikroflödessystem för att exakt kontrollera initieringen, efterföljande expansion och kollaps dynamik kavitationsbubblor; bubbel bubbla interaktioner med jet bildning; och cell form, orientering, vidhäftning mönster, och dödläge avstånd från bubblorna, vilket möjliggör reproducerbar bestyckning flöde som skall tillämpas på enskilda celler under väl kontrollerade experimentella förhållanden. Detta nya mikroflödessystem är idealisk för att utföra grundläggande studies på kavitation bubbla (s) -cell interaktioner som är relevanta för ett varierat utbud av terapeutiska ultraljuds applikationer, såsom SWL, HIFU, och sonoporation. Vi har visat att vår mikroflödessystem kan användas för att undersöka olika kavitation-inducerad bioeffekter, inklusive cellmembran deformation, membran porering, viabilitet och kalciumsvar, på ett mer kontrollerbart och reproducerbart sätt. Framför allt, riktningsprutningsflödet produceras av tandembubblor tillåter oss att sondera mekaniska egenskaper och kalciumsvar i enskilda celler under höga belastningshastigheter som inte har väl karakteriserade. Den lokaliserade, impulsiv mekanisk påfrestning producerad av en sådan sprutanflöde kan inte åstadkommas genom konventionella stretching metoder, såsom mikropipett aspiration 25 och användningen av optiska 26 och magnetiska pincett 27. Dessutom, till skillnad från tidigare studier med användning av ultraljudskontrastmedel 8,28-30 eller laserinducerad enda bubbles 31,32, erbjuder vårt mikroflödessystem bättre kontroll av cellgeometri och adhesionsförhållanden, vilket minskar deras väsentlig effekt på cellulärt svar och bioeffekter 16.
Medan vår teknik är tillförlitlig och reproducerbar, måste man följa det protokoll som försiktigt för att säkerställa att det experimentella systemet är naturtroget. Kvaliteten på ytan mönstring i mikro är primärt ansvarig för reproducerbarhet bubbla-bubbla-cellinteraktioner och kaskad av bioeffekter nedströms. Till exempel, för HeLa-celler, måste området av varje gula punkten vara runt 25-30 | j, m 2 för att säkerställa stabil bubbelalstring samtidigt förhindra cellerna från att fästa. Å andra sidan, har området av varje fibronektin-belagda ö att vara omkring 700 till 900 ^ m 2 för att underlätta adekvat spridning av en enda cell i en fyrkant och samtidigt minska risken för flera celler som bildar aggregat på ön. Inriktningmellan guld prickar och fibronektinbelagda öar måste vara exakt utföras med hjälp av maskriktaren att hålla vinkelfelet inom en ° och axiella fel inom 0,5 pm. Dessutom ger detta experimentella mångsidighet i att övervaka en serie av händelser, med sin tid skala varierade med storleksordningar (t.ex. bubbla dynamik: xs, cell deformation: ms, membran Abp: s, apoptos: h). Därför är det viktigt att noggrant styra tidpunkten för bilden förvärvet och registrering av varje sekvens genom att finjustera de utlösarsignaler (som kontrolleras av en digital fördröjningsgenerator). Den encelliga kultur måste vara väl underhållna i mikrokanalen för att minimera cell-till-cell-variation i fenotyp (mestadels kallad morfologi). Därför är minst 2 h inkubation krävs för cellbindning och spridning på öarna innan du fortsätter med efterföljande cellbehandling. Det rekommenderas att alltid hålla flödet i microchannel enligt 3 mikroliter / min, så att flödet skjuvspänningen producerad av det cirkulerande odlingsmediet på cellen är inom det fysiologiska området.
En strömbegränsning av vår teknik är att tandem bubbla interaktion och den resulterande bestyckningen flödet endast kan tillämpas på en målcell en gång, eftersom guld prickar kommer att ablateras genom laserbestrålning. Denna nackdel begränsar möjligheterna för vårt experimentsystem för att efterlikna de bioeffekter produceras av terapeutiskt ultraljud, där celler är ofta utsatta för kavitation händelser. Emellertid kan detta tidsmässig begränsning lindras genom att applicera ett annat tunt skikt av kiseldioxid för att skydda guld prickar från direkt exponering i vätskan 15. Sammantaget erbjuder vårt mikroflödessystem välkontrollerade experimentella betingelser för att undersöka bioeffekter framställts av kavitation bubblan (s) -cell interaktioner och har flera unika egenskaper. Först, både storleken och placeringen av kavitationsbubblor i vår experimental systemet kan kontrolleras noggrant genom att justera den infallande laserenergin absorberas av guld prickar. För det andra, geometri och vidhäftning av enskilda celler är standardiserade av cell mönstring för att minimera deras effekter på cellsvar och bioeffekter, vilket leder till mer reproducerbara resultat. För det tredje, de parallella arbetsenheterna i mikroflödessystem chip design gör det möjligt att studera nedströms bioeffekter, såsom celltillväxt, proliferation och potentiellt genuttryck efter kavitation exponering, eftersom varje cell kan adresseras och övervakas individuellt. Sammanfattningsvis vårt mikroflödessystem och metodik skapa pålitliga bubbel bubbla interaktioner att studera bioeffekter enskilda celler med förbättrad precision.
Vår nuvarande chip är utformad för analys av individuella HeLa-celler. Emellertid en modifiering av mönster öarna för andra däggdjurscellinjer är också möjliga. Flera förbättringar kan göras för att ytterligare bredda TILLÄMPNINns av chipet. Till exempel kan substitut för PLL-g-PEG-molekyler undersökas för att stoppa enskilda mönstrade celler från att migrera även efter 24 timmar. Dessutom kan nya chipkonstruktioner med mikroflödesventiler undersökas för att kontrollera den lokala mikro av cellerna, så att kemikalier som fluorescensmarkörer eller giftiga reagenser endast kommer att tillämpas på en viss plats, utan att det påverkar cellerna i andra delar av chipet . Med dessa förbättringar kan mikroflödessystem som presenteras här ger möjligheter att studera de långsiktiga bioeffekter av enskilda celler, såsom metabolism, segregation, differentiering och genuttryck, efter kavitation exponering eller mekaniska stimuli som produceras av en impulsiv flöde.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent/Materials | |||
| 75 mm x 38 mm Plain Microscope Slides | Corning | 2947-75X38 | |
| Acetone | Sigma Aldrich, Co. | 320110 | ACS reagent, ≥99.5% |
| Isopropyl alcohol | Sigma Aldrich, Co. | W292907 | ≥99.7%, FCC, FG |
| Sulfuric acid | Sigma Aldrich, Co. | 320501 | ACS reagent, 95.0-98.0% |
| Hydrogen peroxide | Sigma Aldrich, Co. | 216763 | 30 wt.% in H2O |
| Primer P-20 | Microchem | MCC Primer 80/20 | |
| NFR photoresist | JSR | NFR016D2 | |
| Photomask | Photoplotstore | N/A | 4x4 Direct write mask |
| MF-319 Developer | Shipley (Rohm and Haas) | Microposit MF-319 | |
| 1165 Photoresist Remover | Dow Chemical, Co. | DEM-10018073 | 1-methyl-2-pyrrolidinone based |
| S1813 photoresist | Shipley (Rohm and Haas) | S1813 | |
| PLL-g-PEG | SuSoS | PLL(20)-g[3.5]- PEG(2) | |
| HEPES | ThermoFisher Scientific | 15630080 | |
| Paraffin film | HACH | 251764 | |
| SU-2025 photoresist | Microchem | SU-2025 | |
| PDMS | Dow Corning | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | |
| Microbore Tubing | Saint-Gobain PPL Corp. | S-54-HL | |
| Metal pins | New England Small Tube | NE-1300-01 | Cut Tube (straight), 0.025” OD x 0.017” ID x 0.50” Long |
| HeLa cells | Duke Cell Culture Facility | (307-CCL-2) HeLa, p.148 | |
| DPBS (1x) buffer | ThermoFisher Scientific | 14190144 | |
| DMEM culture medium | ThermoFisher Scientific | 11995065 | |
| Fibronectin Bovine Protein, Plasma | ThermoFisher Scientific | 33010018 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA (1x) | ThermoFisher Scientific | 25200056 | |
| Propidium Iodide | ThermoFisher Scientific | P21493 | |
| Carboxylate Microspheres 1.00 μm | Polysciences, Inc | 08226-15 | |
| Carboxylate Microspheres 2.00 μm | Polysciences, Inc | 18327-10 | |
| EDC (1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride) | ThermoFisher Scientific | 22980 | |
| Sulfo-NHS | Sulfo-NHS (N-hydroxysulfosuccinimide) | 24510 | |
| Peptite-2000 | Advanced BioMatrix | 5020-5MG | |
| FITC Annexin V | ThermoFisher Scientific | A13199 | |
| Fura-2, AM | ThermoFisher Scientific | F1221 | |
| DMSO | Sigma Aldrich, Co. | D2650 | |
| F-127 | invitrogen | P6866 | 0.2 µm filtered (10% Solution in Water) |
| Reduced serum media | ThermoFisher Scientific | 11058021 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Plasma asher | Emitech | K-1050X | O2 / Ar plasma ashing of photoresist and other organic materials |
| Mask aligner | SUSS MicroTec | Karl Suss MA6/BA6 | |
| E-beam evaporator | CHA Industries | CHA Industries Solution E-Beam | |
| RIE | Trion Technology | Trion Technology Phantom II | (oxide/ nitride/ polymer) etching |
| Stereoscope | AmScope | American Scope SM-4TZ-FRL | Stereo Microscope |
| Syringe pump | Chemyx Inc | NanoJet | |
| Cell culture incubator | NuAire | AutoFlow NU-8500 Water Jacket CO2 Incubator | |
| Biological Safety Cabinets | NuAire | NU-425-400 | |
| Water bath | VWR | 1122s | |
| Centrifuge | IEC | Centra CL2 | |
| Microscope | Zeiss | Axio Observer Z1 | |
| Nd:YAG laser (laser 1) | New Wave Research | Tempest | |
| Nd:YAG laser (laser 2) | New Wave Research | Orion | |
| Delay generator | Berkeley Nucleonics | BNC 565-8c | |
| Flash lamp | Dyna-Lite | ML1000 fiber-coupled flashtube | |
| high speed camera | DRS Hadland | Imacon 200 | |
| high speed camera | Shimadzu | HPV-X | |
| high speed camera | Vision Research | Phantom V7.3 | |
| PIV software | LaVision | DaVis 7.2 | |
| camera | Zeiss | AxioCam MRc 5 | |
| software | Zeiss | AxioVision | |
| PTI system | Horiba | S/N: 1705 RAM-X | |
| EasyRatio software | Horiba | Easy Ratio Pro 2 | version 2.3.125.86 |
| 63× objective | Zeiss | LD Plan Neofluar |
References
- Wang, D., Bodovitz, S. Single cell analysis: the new frontier in 'omics. Trends Biotechnol. 28 (6), 281-290 (2010).
- Weaver, W. M., et al. Advances in high-throughput single-cell microtechnologies. Curr Opin Biotechnol. 25, 114-123 (2014).
- Gossett, D. R., et al. Hydrodynamic stretching of single cells for large population mechanical phenotyping. Proc Natl Acad Sci USA. 109 (20), 7630-7635 (2012).
- Spiller, D. G., Wood, C. D., Rand, D. A., White, M. R. H. Measurement of single-cell dynamics. Nature. 465 (7299), 736-745 (2010).
- Lecault, V., White, A. K., Singhal, A., Hansen, C. L. Microfluidic single cell analysis: from promise to practice. Curr Opin Chem Biol. 16 (3-4), 381-390 (2012).
- Kennedy, J. E. High-intensity focused ultrasound in the treatment of solid tumours. Nat Rev Cancer. 5 (4), 321-327 (2005).
- Zhu, S., Cocks, F. H., Preminger, G. M., Zhong, P. The role of stress waves and cavitation in stone comminution in shock wave lithotripsy. Ultrasound Med Biol. 28 (5), 661-671 (2002).
- Fan, Z., Liu, H., Mayer, M., Deng, C. X. Spatiotemporally controlled single cell sonoporation. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (41), 16486-16491 (2012).
- Itah, Z., et al. Hydrodynamic cavitation kills prostate cells and ablates benign prostatic hyperplasia tissue. Exp Biol Med. 238 (11), 1242-1250 (2013).
- Kosar, A., Sesen, M., Oral, O., Itah, Z., Gozuacik, D. Bubbly cavitating flow generation and investigation of its erosional nature for biomedical applications. IEEE Trans Biomed Eng. 58 (5), 1337-1346 (2011).
- Li, Z. G., Liu, A. Q., Klaseboer, E., Zhang, J. B., Ohl, C. D. Single cell membrane poration by bubble-induced microjets in a microfluidic chip. Lab Chip. 13 (6), 1144-1150 (2013).
- Li, F. F., Chan, C. U., Ohl, C. D. Yield Strength of Human Erythrocyte Membranes to Impulsive Stretching. Biophys J. 105 (4), 872-879 (2013).
- Li, F., M, M., Ohl, C. .D. . Shear stress induced stretching of red blood cells by oscillating bubbles within a narrow gap. Bull Am Phys Soc. 58, (2013).
- Sankin, G. N., Yuan, F., Zhong, P. Pulsating tandem microbubble for localized and directional single-cell membrane poration. Phys. Rev. Lett. 105 (7), 078101 (2010).
- Fan, Q., Hu, W., Ohta, A. T. Laser-induced microbubble poration of localized single cells. Lab Chip. 14 (9), 1572-1578 (2014).
- Chen, C. S., Mrksich, M., Huang, S., Whitesides, G. M., Ingber, D. E. Geometric control of cell life and death. Science. 276 (5317), 1425-1428 (1997).
- Yuan, F., Sankin, G., Zhong, P. Dynamics of tandem bubble interaction in a microfluidic channel. J Acoust Soc Am. 130 (5), 3339-3346 (2011).
- Microchem, SU-8 2000 Processing Guidelines. , Available from: http://www.microchem.com/pdf/SU-82000DataSheet2000_5thru2015Ver4.pdf (2000).
- Yang, C. Analysis of Tandem Bubble Interaction and Jet Formation in a Microfluidic Channel. , Duke University. (2013).
- Simon, S. I., Schmid-Schonbein, G. W. Cytoplasmic strains and strain rates in motile polymorphonuclear leukocytes. Biophys J. 58 (2), 319-332 (1990).
- Barbee, K. A., Macarak, E. J., Thibault, L. E. Strain measurements in cultured vascular smooth muscle cells subjected to mechanical deformation. Ann Biomed Eng. 22 (1), 14-22 (1994).
- Yuan, F., Yang, C., Zhong, P. Cell membrane deformation and bioeffects produced by tandem bubble-induced jetting flow. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 112 (51), E7039-E7047 (2015).
- Yin, H., Marshall, D. Microfluidics for single cell analysis. Curr Opin Biotechnol. 23 (1), 110-119 (2012).
- Tay, S., et al. Single-cell NF-kappa B dynamics reveal digital activation and analogue information processing. Nature. 466 (7303), 267-271 (2010).
- Rand, R. P., Burton, A. C. Mechanical Properties of the Red Cell Membrane: I. Membrane Stiffness and Intracellular Pressure. Biophys J. 4 (2), 115-135 (1964).
- Lim, C. T., Dao, M., Suresh, S., Sow, C. H., Chew, K. T. Large deformation of living cells using laser traps. Acta Mater. 52 (7), 1837-1845 (2004).
- Puig-de-Morales-Marinkovic, M., Turner, K. T., Butler, J. P., Fredberg, J. J., Suresh, S. Viscoelasticity of the human red blood cell. Am J Physiol Cell Physiol. 293 (2), C597-C605 (2007).
- Kudo, N., Okada, K., Yamamoto, K. Sonoporation by single-shot pulsed ultrasound with microbubbles adjacent to cells. Biophys J. 96 (12), 4866-4876 (2009).
- van Wamel, A., et al. Vibrating microbubbles poking individual cells: Drug transfer into cells via sonoporation. J Control Release. 112 (2), 149-155 (2006).
- Hu, Y., Wan, J. M., Yu, A. C. Membrane perforation and recovery dynamics in microbubble-mediated sonoporation. Ultrasound Med Biol. 39 (12), 2393-2405 (2013).
- Dijkink, R., et al. Controlled cavitation-cell interaction: trans-membrane transport and viability studies. Phys Med Biol. 53 (2), 375-390 (2008).
- Rau, K. R., Quinto-Su, P. A., Hellman, A. N., Venugopalan, V. Pulsed laser microbeam-induced cell lysis: Time-resolved imaging and analysis of hydrodynamic effects. Biophys J. 91 (1), 317-329 (2006).
