Abstract
本稿では、まず、正確にタンデム気泡と明確に定義された位置及び形状に近いパターニング個々の細胞の発生を制御する同一のガラス基板上の金のドットとフィブロネクチンで被覆された領域と、マイクロ流体チップの製造手順を説明します。我々は、数マイクロ秒の時間遅延を有する金のドットの組を照射する2つのパルスレーザを使用して、タンデム気泡の発生を示します。我々は、高速撮像により気泡バブル相互作用とジェットの形成を視覚化し、粒子画像速度測定（PIV）を用いて得られた流れ場を特徴付けます。最後に、我々は、巨大分子の取り込み、添付のインテグリン結合ビーズの変位によって決まる局所的な膜の変形、及びレシオメトリックイメージングからの細胞内カルシウム応答を有する細胞膜の穿孔を含む、単一細胞分析のために、この技術のいくつかのアプリケーションを提示します。我々の結果は、高速かつ指向吐出流量がプロであることを示し近接して増殖させた細胞の表面上に高度に局在化せん断応力を課すことができるタンデムバブル相互作用によって生さ。また、別の生体効果タンデム気泡セルからスタンドオフ距離を調整することにより、吐出流の強さを変化させることにより誘導することができます。
Introduction
細胞異質は、遺伝子、タンパク質、および代謝物の確率論的表現から生じる、大きな細胞集団内に存在し、細胞の適応と進化の1を可能にするために、生物学において基本的な原理として機能することを認識が高まっています。したがって、個々の細胞との相互作用の機能を理解するために集団ベースのバルク測定を使用することは、しばしば不正確で信頼できません。単一細胞分析のための新しい技術を開発することは、したがって、生物学的および薬理学的研究に高い関心のある、より良い幹細胞生物学および癌療法2-4の主要なシグナル伝達経路およびプロセスを理解するために、例えば、使用することができます。近年では、マイクロ流体プラットフォームの出現は大幅に位置付け、処理、および個々の細胞からの応答の観測は、新規の分析戦略5を用いて行われてきた単一細胞分析を、容易にしました。
キャビテーションは、高強度で癌の治療を含む生物医学的用途の多様な範囲の中で重要な役割は、衝撃波砕石術（SWL）7、薬物または遺伝子送達によって、腎臓結石の非侵襲的なフラグメンテーションを超音波（HIFU）6を集中果たしていますソノポレーション8、および流体力学的バブルキャビテーション9,10によって、細胞または組織の最近報告された破壊によって。それにもかかわらず、キャビテーション気泡（複数可）の動的プロセスは、生体組織および細胞との相互作用が十分に理解されていません。これは、超音波、衝撃波、およびローカル油圧によって生成されるキャビテーションの開始とバブル動力学におけるランダム性に起因しています。さらに、特に、単一細胞レベルで、生体細胞の本質的に複雑かつ高速応答を解決するための技術を可能にするが不足しています。
これらの課題のために、それは驚くべきことではないので、非常に少数の研究は、蜂を持っていることnが十分に制御された実験条件下で気泡 - 細胞相互作用を調査するために報告されています。例えば、膜懸濁液11に捕捉された個々の細胞の穿孔およびヒト赤血球のインパルス大きな変形12は、マイクロ流体チャネル内のレーザで生成単一の気泡を用いて実証されています。後者の技術は、しかし、唯一のための核13の存在により、真核細胞中で非常に小さな変形を生成することができます。また、懸濁液中の細胞を治療する場合、下流生体効果を監視することは困難です。他の研究では、単一の接着細胞における膜の穿孔および/または細胞内カルシウム応答を産生するための細胞に結合したマイクロバブル（または超音波造影剤）の超音波励起は8に報告されています。単一接着細胞の膜の穿孔は、レーザーで生成タンデムを用いて製造することができる光吸収トリパンブルー溶液14を含有する薄い液体層中に気泡、またはマイクロチャンバー15内に光学吸収性基板を介して照射するマイクロ秒のレーザーパルスによって生成された振動する気泡によって。比較すると、後者は、細胞に対して毒性であるため、光学的に吸収性基材は、レーザ光吸収トリパンブルー溶液を超える利点を有します。さらに重要なのは、レーザー発生した気泡は、音響的に励起された泡よりも気泡サイズと位置の点でより制御可能です。それにもかかわらず、すべてのこれらの以前の研究で、細胞の形状、向き、及び接着条件は、実質的に細胞応答および機械的応力16によって生成される生体効果に影響を与える可能性がある、制御しませんでした。
以前の研究で、これらの欠点を克服するために、我々は最近、気泡発生、細胞パターニング、バブルバブル - 細胞相互作用、およびリアルタイム微細TECHNのユニークな組み合わせを使用して構築されたマイクロ流体チップにおける細胞応答のバイオアッセイのための実験系を開発しましたiques。フィールドに他の人から私たちの実験システムを区別三つの主な機能は次のとおりです：1）ガラス基板上にミクロンサイズの金ドットのパターニングは、気泡発生17用のローカライズされたレーザ吸収を可能にするために、 2）個々の細胞の位置および形状の両方を制御するために、同一基板上の細胞接着のための細胞外マトリックス（ECM）のミクロンサイズの島のパターン。 3）準2次元空間に3次元の気泡の気泡 - 細胞相互作用ドメインの大きさの圧縮は、全てで捕捉、流れ場、細胞変形、及び生体効果を噴射、バブルバブル相互作用の面内の可視化を容易にします1合理化された撮像シーケンス（ 図1D）。
図1：マイクロ流体チップと異なるアッセイの概略図。 a）は、チャンネルの組み立てられたマイクロ流体チップは、青色のインクが充填します可視化のため。 b）はパターン化された細胞と金ドットとマイクロ流体チップの内側の領域は、（近接する2金のドット間の距離）は40μmです。作業単位の多数の対がチャネル内に配置することができます。金ドットのペアおよび細胞パターニング領域に付着したHeLa細胞からなる単一の作業単位のc）のクローズアップ画像。デバイス動作のd）の概略。単一の細胞はに付着し、フィブロネクチンでコーティングされた「H」字型の島に広がります。逆位相振動でキャビテーション気泡（タンデムバブル）の組は、近くの標的細胞に向かって移動し、高速かつ局所的なジェットの生成につながる（ 図4aを参照）、金ドットのパルスレーザ光を照射することによって生成されます。セルは、変形高分子取り込みのためporated、および/またはタンデムバブルに対する細胞のスタンドオフ距離（S d）が依存し、カルシウム応答を用いて刺激することができます。F = "http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55106/55106fig1large.jpg"ターゲット= "_空白">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
このプラットフォームは、さらに、キャビテーション誘発性の生体効果のために細胞表面に付着した蛍光アッセイおよび官能化ビーズと組み合わせることができます。具体的には、このプラットフォームは、単一細胞レベルで信頼性の高い定量化アッセイのための道を開きます。これまで、我々は、タンデムバブル誘導細胞膜変形、細胞のポレーション及び細胞内取り込み、生存率、アポトーシス、および細胞内カルシウム応答の分析のための装置を使用しています。以下のプロトコルでは、我々はチップ製造の過程と、上記の各種の生体効果を分析するための手順を説明します。また、チップの動作も記載されています。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.微細加工
注：すべての微細加工の手順は、クリーンルーム内で行われています。クロムマスクは、前の微細加工に設計図2を参照します。
図2：マイクロ流体チップ内のチャネル設計と作業単位の寸法の概略図。 a）は、マスク整列PDMSマイクロチャネル（緑）のデザインとガラス基板（青と赤）上のパターン。作業ユニット・アレイの代表セクションのマスクデザインのb）の拡大画像。セルパターン（青）及び金のドットの組（赤）を示すつの作業単位のc）の概略。すべての長さスケールは、右下に表示されます。 LARを表示するには、こちらをクリックしてください。この図のGERバージョン。
- 金ドットパターニング
注：気泡発生用のレーザエネルギーを吸収するのに十分に大きいが、それに付着した個々の細胞を避けるために十分に小さくなるように、各金ドットの面積は、25〜30マイクロメートル2の範囲内になるように設計されています。金ドット製造するための模式図は、 図3aに示されています。- （化学フード内）スライドガラスクリーニング
- イソプロピルアルコール（IPA）、続いてアセトンでスライドガラスをフラッシュし、その後N 2流で乾燥させました。
- ピラニア溶液中にスライドを浸す（H 2 SO 4：H 2 O 2 = 4：1）で10分間。
- 、スライドを取り出し、DI水でそれを洗い流し、その後、N 2流で乾燥させました。
- 10分間120℃でホットプレート上でスライドガラスを焼きます。
- 90秒間、100Wでプラズマアッシャーでスライドを扱います。
- スピンコーティング（スピンコートのフード）
- ホットプレートの電源をオンにし、温度が95℃で安定するまで待ちます。
- コーティング手順に従ってください：
500回転/ sのランプで5秒間1,000rpmで。
その後、1000回転数/ sのランプで30秒間3,000rpmで。 - 真空を適用することにより、スピンコーター上に洗浄したガラススライドを修正しました。
- P-20との摺動面を覆い、コーティングレシピを開始します。
- NFR-ネガ型フォトレジストのためのコーティングプロセスを繰り返します。
- 60秒、95℃でスライドを焼くと、それが室温に冷えるまで待ちます。
- フォトリソグラフィー
- マスクアライナ上にクロムマスクをマウントし、パターン側がスライドに向かって下を向いていることを確認してください。
- UV露光の9秒でハード露出モードにフォトリソグラフィレシピを設定し、すぐにマスクを用いてガラス基板を整列させます。
- UV露光を行った後、95でスライドを焼きます6、次に1分間C、及びそれを室温まで冷却させ。
- 開発
- 60秒間現像液中でスライド上にパターンを開発します。
- 、開発者からスライドを削除し、DI水でそれをフラッシュし、そしてN 2流で乾燥させました。
- 顕微鏡下でパターン形状を確認し、特徴サイズを測定し、記録します。
- 金蒸着（電子ビーム蒸着）およびリフトオフ
- 5分間、120℃でスライドを焼いて、それを室温まで冷却させ。
- 500トルと100 W.で90秒間反応性イオンエッチング（RIE）マシンでのプラズマでスライドをきれいにしてください
- 堆積物5のTi nmおよび電子ビーム蒸発器17を用いてスライド上にAuを15nmの。
- レジストのNFRの上に金の休息を除去するために溶剤のフォトレジスト除去を含むガラスビーカー中で一晩スライドを浸します。
- スライドを取得し、フラッシュIアセトンでtはIPAが続き、N 2流で乾燥させました。
- 90秒間100 Wで酸素プラズマアッシャーでそれをクリーニングする前に115℃のホットプレート上でスライドを乾燥させます。
- （化学フード内）スライドガラスクリーニング
- リフトオフによる分子アセンブリのパターニング（MAPL）
注：各フィブロネクチンでコーティングされた島の面積は島に集約複数のセルの可能性を最小限に抑えながら正方形領域に広がる十分なHeLa細胞を容易にするために、700〜900マイクロメートル2の範囲内に設定されています。細胞パターニングアイランドを製造するための模式図は、 図3bに示されています。- スピンコーティング
- 繰り返し手順1.1.2が、S1813-ポジ型フォトレジスト及び115℃の温度を使用します。
- 整列フォトリソグラフィ
- マスクアライナ上にクロムマスクをマウントし、パターンのある側が持つスライドに向かって下を向いていることを確認してください金ドット。
- UV露光の9秒でハード露出モードにフォトリソグラフィレシピを設定します。
- 空間参照として、マスクのエッジの周りに位置するアライメントマークを使用して、下のスライドでトップマスクを合わせます。
- マスクの中央部分をチェックして、パターンの機能が正しく整列されていることを確認します。
- ポストベークすることなく、UV露光を完了します。
- 開発
- 1.1.3しかし、開発の45 sのホットプレート上で乾燥させ、N 2ストレージに保存する前に手順を繰り返し。
- スピンコーティング
- 化学的処理
- 10mMのHEPES緩衝液中の0.5mg / mLのPLL-G-PEG：不動態化溶液を準備します。
- N 2ストレージからスライドを取得し、パラメータ設定でRIEを使用してそれをきれい：500トルの圧力、100-W電源、および90-sの持続時間。
- パラフィンフィルム片の上に不動態化溶液をピペットで1滴。</李>
- パターンのある側がフィルムに向かって下向きになっていますことを確認して、フィルムを含む溶液とスライドを挟みます。気泡の形成を避けます。
- フィルムからスライドを削除する前に、45分間待ちます。
- フォトレジスト除去、フォトレジスト除去、および脱イオン水（1：1）で連続的にスライドを浸漬し、脱イオン水、および各浸漬のために90秒間超音波浴中に攪拌します。
- デシケーター中でそれを密封し、冷蔵庫に格納する前に水分を除去するためにホットプレート上でスライドを乾燥させます。
- チップアセンブリ
- 繰り返しは、1.1.1-1.1.4ステップが、SU8-2025ネガティブフォトレジストおよびパラメータ設定でフォトマスクとシリコン型を準備するために、Microchem社プロトコル18と呼ばれる呼ばれます。
- ソフトリソグラフィを用いて、PDMSマイクロチャネル（40ミリメートル×25ミリメートル×5ミリメートル、L×幅×H）と小さなPDMSスラブ（800ミクロン幅の溝構造）を作製。
- microchanneパンチ流体アクセスポート用リットルときれいにテープで、次いでIPAで。
- PDMSスラブ付きガラス基板のパターン領域を遮蔽し、周辺領域からPLL-G-PEGを除去するために、RIE（100 W、500ミリトール、60秒）を適用します。
- RIE（25 W、500ミリトール、25秒）の低減された用量でマイクロチャネルを扱い、その後、（削除小さなPDMSスラブで）パターン化されたガラス基板上に位置に合わせます。ステレオスコープの下に共形接触におけるマイクロチャネルとパターン化ガラス基板をもたらします。
図3：微細化とチップ組立するための模式図。ガラス基板上の金のドットのa）のパターン。 MAPLを介した細胞パターニング用ガラス基板B）の調製。 c）のプラズマボンディングとマイクロ流体チャネルのアセンブリ。 O定義については、物質一覧を参照してください。略語F。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
- 細胞接着
注：HeLa細胞を日常的に、細胞培養インキュベーター中で、10％FBSおよび1％抗生物質/抗有糸分裂溶液を補充したDMEM中で維持されています。チップアセンブリと細胞接着するための模式図を図3cに示されています。- プライム1μL/分で30分間、PBSでチップ、およびその後45分間フィブロネクチン溶液（PBS中の50μg/ mLの、1μL/分）を注入します。
- 0.25％トリプシン-EDTAでトリプシン処理細胞培養物を待っている間、培地、遠心個々の細胞内でそれらを洗浄し、5×10 6細胞/ mLで予め温めた（37℃）培地中の細胞懸濁液を再構成します。
- PBSでフィブロネクチン液を交換し、5分間10μL/ minでチップをフラッシュします。
- 注射しますチップに調製した細胞懸濁液を、流れを止める出口をクランプし、30分間、細胞培養インキュベーター中にチップを維持します。
- コンセントをリリースし、5分間10μL/分で細胞培養培地でチップを洗浄します。 0.75μL/ minに培養液の灌流流量を減らして、インキュベーター中で2時間、細胞培養を維持します。
2.バブルの生成と流れの可視化
注：実験の概略をタンデムバブルの生成とマイクロ流体チャネルに近く成長した単セルで生じたフローの相互作用については、 図4aに示されています。
- タンデムの生成は2つのレーザタイミング制御と気泡
- 倒立顕微鏡のステージ上にマイクロ流体チップを配置し、2つのパルスのNdの焦点を合わせます：B分離パターン化された金ドットのペアにYAGレーザー（λ= 532nmの、5ナノ秒のパルス持続時間）Yは40μm。
- 金ドットで開始2泡を生成するために2.5マイクロ秒程度の時間遅れを持つ2つのレーザーをトリガするために、デジタル遅延発生器を使用してください。
- 50±2μmの範囲内の気泡の最大直径を生成するためにレーザ出力エネルギー（〜10μJ）を調整します。
- レーザに高速度カメラ（200-nsの露光と毎秒200万フレーム（FPS））を同期すると、バブルの膨張、崩壊、バブルバブルの相互作用、およびジェット形成のダイナミクスをキャプチャします。
- ジェット速度の定量化
- 最初のバブル（B 1）及びB 1の遠位端部の近位端にジェットチップ（J 1）の位置を記録し、第二の気泡（B 2）の生成で始まり、Jのタッチダウンで終わりますB 1の遠位端に向かって1。 図5aの概略図を参照してください。
- 直線ボットのための位置の時間経過に合わせて時間近位（ジェットチップ）および遠位端。ジェット速度を決定するために、近位端のための時間曲線に対する先端位置の傾きを算出します。 2つのラインの交点は、ジェットタッチダウン時間を示します。詳細は文献19に記載されています。
- タンデムバブルに誘発される流れ場の可視化
- DI水中のポリスチレン（PS）ビーズ懸濁液（w / vの2.6％）の1ミクロンを準備し、マイクロ流体チップにビーズを注入します。
- ステップ2.1.1-2.1.3で説明したようにタンデム気泡を生成します。
- 100ナノ秒の露光時間で5 M FPSのフレーミング速度の高速ビデオカメラを使用して、タンデムバブル動態を記録します。
- 商用PIVソフトウェアに取得された画像シーケンスをアップロードします。
- 75％のオーバーラップで16×16ピクセル（px）の小さい呼び掛けウィンドウに各画像を分割します。
- 速度場の計算の誤差を低減するために、マルチパスの繰り返しや地域フィルタを適用し、そして出力速度ベクトルマップをもたらします。
図4：実験と画像記録の概略。タンデムバブル発生のためのa）の実験装置。 b）の時系列は、画像取得の異なる種類のために使用されます。 FL：蛍光顕微鏡、BF：明視野、IFT：インター時間。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
3.シングルセル解析と生体効果
注：タンデム気泡が次のターゲット細胞に生産され、得られた生体効果は、スタンドオフ距離依存的に研究されています。画像収集の異なるタイプの時系列は、 図4bに示されています。
- 膜ポレーションおよび高分子の取り込み
注：標的細胞への細胞外巨大分子の取り込みは、細胞膜上のポレーションサイトを介して膜不透過性のヨウ化プロピジウム（PI）の進行性の拡散によって特徴付けられます。- ステップ1.5に続いて、実験を通して0.5μL/ minの灌流流量で実行されているPI溶液（DMEM中を100μg/ mL）で、通常の培地（ すなわち、DMEM）に交換してください。
- プログラム自動的に回転タレットのPI蛍光キューブを選択し、200ミリ秒の露光時間で蛍光画像を捕捉するためにPIの蛍光励起とCCDカメラのタイミングを同期させる顕微鏡制御ソフトウェア。
- 二つのレーザの焦点を次のタンデムバブル処理の前に、標的細胞、レコード明視野（BF）の両方の蛍光（FL）画像に金のドットの組に位置合わせされた後。
- すぐに顕微鏡制御ソフトウェアを使用しますPI取り込みの歴史をキャプチャするためにすぐにステップ2.1の後、標的細胞のタイムラプス蛍光画像の記録を開始します。
- 膜変形
- 1-μmのビーズ（w / vの1％、水溶性カルボジイミドで活性化）を準備し、ペプチド-2000（PBS中100μg/ mLの）とそれらを官能。
- ステップ1.5の後、30分間、37℃で1×10 9ビーズ/ mlの密度で官能化ビーズを付着した細胞をインキュベートします。
- 繰り返しステップ2.1は、標的細胞の隣タンデム泡を生成し、超高速カメラが500万FPSのフレーミングレートで動作してセル変形を記録します。
- 実験を通して撮像面上に残る3ビーズのトライアドを識別し、それらの位置（X 1、Y 1）（X 2、Y 2）をコンパイルし、（X 3、Y 3）実験における座標。
- 前のトライアドの面積を計算し、AF式を用いてタンデムバブル処理TER。
- 地域のひずみを計算します。
- 前とタンデムバブル処理後の3つの頂点の座標に基づいて、確立されたプロトコル20,21次のローカル主ひずみと面積歪みを計算します。
- 生存率およびアポトーシス
注：FITCアネキシンVは、ホスファチジルセリン（緑色蛍光）の外部化を通じて、アポトーシスのものを含む細胞を、ラベルを付けます。 PIは、壊死細胞（赤色蛍光）の核にラベルを付けます。明視野イメージングは、細胞の形態を文書化し、細胞の生存およびアポトーシスの同定を支援するために使用されます。- 図2bを参照して 、チャネル内のアドレス・ラベルによって容易にマイクロ流体チャネル（各処理された細胞の位置を記録
- 15分間、FITCアネキシンV溶液でチップを灌流する前に、別の2時間の細胞培養培地中で処理した細胞をインキュベートします。陽性細胞は緑色の蛍光を表示します。
- 24時間タンデムバブル処理後の手順を繰り返し3.3.2は、標的細胞の長期的な生体効果を研究します。
- カルシウム応答
- wは3μLの10％でフラ-2 AM原液の3μL（DMSO中1mg / ml）をミックス/プルロニックF-127最終標識溶液（6μM）を調製するための低血清培地500μLでvです。
- ステップ1.5の後、標識溶液で細胞培養培地を交換し、40分間（1μL/分の灌流速度）暗所で室温下にインキュベートします。
- 細胞実験を開始する前に、低血清培地（0.75μL/分灌流速度）でチャンネルを補充します。
- レシオメトリックイメージングを起動します（波長：340/380 nmで、50ミリ秒の露光）標的細胞の商用PTIシステムを使用して。
- 静止レベルでのセルのレシオメトリックイメージング、ステップ2.1のようにタンデム泡を作り出すの10秒後。 1分間の0.1秒のフレーム間時間（IFT）との最初のレコードは、その後、別の分1秒にIFTを増加させ、そして2分後に5秒に更なる増加。
- 細胞内カルシウム濃度に比例した関心領域（ROI）に比R = F340 / F380を計算するために、PTIソフトウェアを使用してください。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
この作業に記載のマイクロ流体プラットフォームは、バブルバブルの相互作用を調査すると、単一細胞レベルでのキャビテーションによって誘発される生体効果の多様を分析するために使用することができます。ここで、我々は我々の実験システムで実行することができる実験研究とバイオアッセイの多様性を実証するためにいくつかの例を提示します。まずジェット形成、得られた流れ場の可視化、およびジェット速度（ 図5a）の計算と並行気泡の一時的な相互作用を例示します。私たちは、タンデムバブルによって誘発される局所的な細胞膜の変形（ 図5b）、PI取り込み（ 図5c）とのピンポイントの膜ポレーション、および細胞内カルシウム応答（ 図5d）の後、現在の例ではなります。このような細胞の生存及びアポトーシスアッセイなどの他の例は、文献22に見出すことができます。
図5aは、高速撮像により撮像さジェットの形成、およびPIVによって明らかにされた、得られた流れ場を有するタンデムバブル相互作用の一例を示す図です。具体的には、その最大膨張以下、（0マイクロ秒で生成された）最初のバブルB 1の崩壊は「上向き」の形成をもたらす、（2.5マイクロ秒で生成）は、第2のバブルB 2の急速な拡大により非対称に歪んでいます5.4マイクロ秒で示さ3.4μsで、その後の吐出流量でジェット（J 1）、。平均ジェット速度は、時間に対する（ 即ち、B 1の遠位端と接触）、タッチダウンの前にB 1の近位端（または極）の位置に対する近似直線の傾きによって決定されます。平均ジェット速度は時40から60ミクロンのB 2増加の最大直径が20〜58メートル/秒から増加することが見出されています。 PIV解析、TAND周り方向噴出流の結果に基づいてEMバブルが10m / sのオーダーであり、10ミクロンのオーダーの幅内に閉じ込められます。これは、近く成長し、標的細胞に衝動およびローカライズせん断応力及び応力勾配を生成できるようになっています。
図5Bに示す別の例は、タンデムによって生成さ方向とローカライズ噴射流により誘導される細胞膜の変形はスタンドオフ距離S D = 40ミクロンで気泡示します。膜の変形と回復は、細胞膜の先端に取り付けられた（黄色の点線で示す）の官能化ビードの変位によって強調されています。ローカルエリア株は、隣接するビーズの三つ組の座標から算出することができます。細胞表面上の異なる位置で計算された最大面積変化の概略中央に示されています。トレーリングエッジまたは緯度ながら、リーディングエッジは、主に、（緑の円を参照）延伸されます（赤い丸で示されているように）セルのERAL側面は、タンデム気泡誘導さ噴出流によって生成される細胞の変形において不均一性を示し、圧縮されます。セル先端の面積歪みの時間的変化は、右側に示されています。これは、約100マイクロ秒（FWHM）のための大規模かつ持続的なストレッチと数msの時間スケールで、その後の緩やかな回復が続く最初のいくつかの急速な振動、から構成されています。
に示されるようにまた、細胞先端に一体大面積株と株は、小さなS dで観察された細胞膜の穿孔の原因となり得ます 図5c。小S dの（ すなわち、10ミクロン、またはいくつかのケースでは、20ミクロン）と中間のS D（ すなわち、20〜30ミクロンの大部分）では、ローカライズされた膜破壊が誘導され、中に細胞外PIのピンポイントの取り込みにつながります細胞質ゾル。細胞内のPI強度が飽和することなく、増加し続ける場合は、壊死が発生します。 PI強度が一桁低く、タンデムバブル処理後10秒以内にプラトーに達した場合に比較して、可能性の高い細胞生存と修理ポレーションは、細胞の形態における最小の変化によって支持され、発生します。大S Dの（ すなわち、40ミクロン）では、ごくわずかなPI取り込みは無視できる、または非穿孔を示す、タンデム泡処理後見出されます。細胞は、通常の成長および増殖22で生き残ることができます。全体的に、結果は壊死から、修復可能な膜ポレーションを介して、S dの≈20-40ミクロンの範囲内の非穿孔に対する細胞応答の明確な推移を示しています。
最後に、我々は、異なるSで個々の細胞タンデム気泡によって誘発される細胞内カルシウム応答のレシオメトリックイメージングの結果を示しますD、特にS dの致死量以下の範囲で= 30-50ミクロン（ 図5d）。強度比は、細胞内カルシウムの量に比例します。小SのD（ すなわち、30μm以下、場合によっては、40ミクロン）で、前縁から後縁まで進行カルシウム波が明らかにタンデムバブル処理後数秒以内に観察されています。細胞内カルシウムのピーク濃度に達した後、それは、ゆっくり戻って数分以内に静止レベルに減衰します。対照的に、大S dで（ すなわち、50μmの大部分は、場合によっては、40μm）は、細胞内カルシウムの増加は非常に穏やかな、そして全くはっきり見える進行カルシウム波を識別することができないです。これらの二つの異なるカルシウム応答はまた、ピークにレベル静止から強度比と立ち上がり時間のピーク振幅に有意差と、時間プロフィルに対するそれらの強度比と区別することができます値。より大きなSのD（ すなわち、60ミクロンを超える）では、何カルシウム応答は観察されないことができます。様々なS dでカルシウム応答を表示するHeLa細胞の割合は、図5D（右）に要約されています。
全体として、我々の結果は、噴射流の強さを変化させる（またはS dを変更する）ことによって、生体効果の様々な可能性の振幅および持続期間と相関する類似の培養条件下で、個々のHeLa細胞において産生することができる、ということを実証しました細胞膜22に課される機械的変形の。
図5： タンデムバブル相互作用、細胞膜の変形、膜の穿孔、及びカルシウム応答アッセイの結果。 a）は、流体運動とジェットタンデムバブルの相互作用によって誘導されます。左：PIVによって明らかにされたジェットの形成と流れ場とのタンデムバブルの相互作用を示す選択されたフレームを。 2気泡の最大直径は約50±2μmです。中央：噴射タンデム気泡の回路図、第気泡B 1の中心軸を、座標（O）を原点と、近位端および遠位端（または極）を示します。右：B 1の近位端及び遠位端でのポールポジション（エラーと=±1μm）を測定しました。 b）細胞膜変形。左：黄色の点線は、地元の膜変形と回復を示す、細胞膜の先端に取り付けられたPSビーズの変位にラベルを付けます。中央左に示され、細胞表面上の異なる位置でのピーク面積系統を模式的に示します。右：セルリーディングエッジの中央にある面積株の時間のコース。 Δεは面積歪み算出し浅です主ひずみにエドと ΔΔはトライアドジオメトリ変化に基づいて算出した面積株です。面積歪み計算と誤差解析についての詳細は、リファレンス22 c）の細胞膜の穿孔に記載されています。左：明視野画像をタンデムバブル処理とPI取り込み（0と120秒）のタイムラプス蛍光画像の前と後。白い矢印は、噴射の流れ方向を示しています。ミドル：細胞内部の平均のPI強度対時間の典型的な変化。右：異なるS dで壊死（赤）、修復可能なポレーション（青）、および非ポレーション（緑）を受けている細胞の割合の統計結果。細胞数は、治療：N = 9、14、14、及びS D = 10、20、30、8、及び40は、それぞれ。統計誤差は±1 /√N. d）は細胞内カルシウム応答です。左：個々の細胞の細胞内カルシウム応答を示すレシオメトリック画像シーケンス30ミクロンと50ミクロンのS dの秒。赤い矢印は、ジェット方向を示しています。ミドル：異なるS dにおける典型的な応答プロフィール（比-時間曲線）。右：異なるS dにおけるカルシウム応答の確率。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
| スタンドオフ距離（S d）は（ミクロン） | レイノルズ数（Re） | YZ平面内でせん断応力（PA）を平均化 |
| 20 | 206.96 | 618.64 |
| 30 | 354.8 | 709.69 |
| 40 | 378.78 | 657.22 |
| 50 | 163.85 | 323.61 |
| 60 | 105.08 | 42.21 |
表1：PIV結果から流れ物理学のためのパラメータのリスト。レイノルズ数を推定し、別のスタンドオフ距離（S dの）に対するせん断応力を平均しました。 YZ平面は、チャネル幅×高さ面を指します。チャンネル内のセルの高さは約6-7μmであるため、平均せん断応力は、チャネル底から7.7μmと0の高さから推定されます。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
単一細胞分析は、生細胞イメージングとの組み合わせで、非常にこのような表現型の発達、免疫応答23のような個々の細胞でしばしば動的変数プロセスの我々の理解を高めています。皿またはフラスコ中で通常の細胞培養とは対照的に、マイクロ流体システムは、リアルタイムで、ダウン単一細胞レベルに、微小環境の正確な制御を可能にします。したがって、マイクロ流体技術の進歩及び技術は、主に、単一細胞分析のスループットおよび再現性を改善しています。ソフトリソグラフィ及び表面パターンを統合することにより、マイクロ流体システムは、さらに、時空間的に可変の刺激の複雑なパターンへの単一の細胞の応答の詳細な分析を容易にするように設計することができます。例えば、一過性の化学的または機械的な手がかりが正常にそれらの生物学的または機械的な応答が自動的に記録しながら、単一の細胞に送達し、2を分析されています4。この一般的な傾向にもかかわらず、細胞レベルでのキャビテーションによって誘発される生体効果を分析するマイクロ流体の適用は非常に限られていました。最も顕著なのは、それだけマイクロピラー11に捕捉された懸濁液中の個々の細胞の気泡誘発性膜穿孔に適用されています。接着細胞の研究の大部分では、動的な気泡 - 細胞相互作用の一貫性を維持するために、細胞の形態を制御することの利点は、いずれか利用できない、または大部分が無視されます。
我々は正確に開始、その後の拡張、およびキャビテーション気泡の崩壊のダイナミクスを制御するためのマイクロ流体システムを開発しました。ジェット形成を伴うバブルバブルの相互作用;従って、細胞の形状、配向、接着パターン、気泡からのスタンドオフ距離、再現可能な吐出流量が十分に制御された実験条件下での個々の細胞に適用することを可能にします。この新規なマイクロ流体システムは、基本的な目を実施するための理想的ですキャビテーション気泡（複数可）にudiesは、SWL、HIFU、およびソノポレーションなどの治療超音波アプリケーションの多様な範囲に関連する相互作用を-cell。私たちは、マイクロ流体システムは、より制御可能かつ再現可能な方法で、細胞膜の変形、膜穿孔、生存率およびカルシウム応答を含む様々なキャビテーション誘発性の生体効果を調査するために使用することができることを実証しました。最も顕著なのは、タンデム泡によって生成さ方向の吐出流量は、十分に特徴付けられていない高歪速度下で個々の細胞内での機械的特性やカルシウム応答を精査することを可能にします。このような吐出流量によって生成ローカライズ、衝動的機械的ストレスは、マイクロピペット吸引25と光26の使用および磁気ピンセット27などの従来の延伸方法によって達成することができません。さらに、以前の研究とは対照的に、超音波造影剤8,28-30又はレーザ誘起単一BUを使用bbles 31,32、当社のマイクロ流体システムは、このように細胞応答や生体効果16上での実質的な影響を低減し、セルの形状と接着条件のより良好な制御を提供しています。
私たちの技術は、信頼性と再現性がある一方で、1は、実験系が忠実に再現されることを保証するために慎重プロトコルに従わなければなりません。マイクロチャネル内の表面パターニングの品質はバブルバブル - 細胞相互作用の再現性と下流生体効果のカスケードの主な原因です。例えば、HeLa細胞のために、各金ドットの面積が付着する細胞を防止しながら、安定した気泡発生を確実にするために周り25-30μm2である必要があります。一方、各フィブロネクチンでコーティングされた島の面積は島の凝集体を形成する複数のセルの可能性を低減しながら広場に単一細胞の広がり十分なを促進するために周りに700〜900μm2でなければなりません。アラインメント金ドットとフィブロネクチンでコーティングされた島々の間に正確に1°と0.5μmの内の軸誤差の範囲内で角度誤差を維持するために、マスクアライナの助けを借りて行われなければなりません。また、この実験系は、大きさ（：マイクロ秒、細胞変形：ミリ、膜ポレーション：秒、アポトーシス：H 例えば、気泡ダイナミクス）の注文によって変化し、その時間スケールで、一連のイベントを監視する際に汎用性を提供します。したがって、正確に（デジタル遅延発生器によって制御される）トリガ信号を微調整することにより、各シーケンスの画像取得および記録のタイミングを制御することが重要です。単一細胞培養物は、十分に（ほとんど形態と称する）の表現型における細胞から細胞への変化を最小限にするために、マイクロチャネル内に維持されなければなりません。したがって、最小2時間のインキュベーションは、細胞接着のために必要と下流の細胞処理を続行する前に島に広がっています。常にmicrochannで流量を維持することが推奨されていますμL/分3下EL、細胞に循環する培地によって生産流剪断応力が生理学的範囲内にあるようにします。
我々の技術の一つの電流制限は、金ドットがレーザ照射によりアブレーションされるため、タンデムバブル相互作用および結果として得られる噴射流だけ、一度標的細胞に適用することが可能です。この欠点は、細胞がしばしばキャビテーションイベントにさらされている治療用超音波によって生成生体効果を模倣するために我々の実験システムの能力を制限します。しかし、この時間的制約は、液体15に直接暴露から金ドットを保護するために、二酸化ケイ素の別の薄い層を適用することによって軽減することができます。全体的に、私たちのマイクロ流体システムは、キャビテーション気泡（複数可）-cellの相互作用から生成された生体効果を調査するために十分に制御された実験条件を提供し、いくつかのユニークな特徴を持っています。まず、大きさやキャビテーションの位置の両方は、私たちの電子内の気泡xperimentalシステムは正確金ドットによって吸収された入射レーザーエネルギーを調整することによって制御することができます。第二に、個々の細胞の形状と密着性がより再現性のある結果をもたらす、細胞応答と生体効果に及ぼす影響を最小限にするために、細胞パターニングによって標準化されています。各セルがアドレス指定され、個別に監視することができるので、第三に、マイクロ流体チップ設計の並列作動装置は、キャビテーション露光後、それが実現可能なそのような細胞の成長、増殖、および潜在的に遺伝子発現のような下流の生体効果を研究することを可能にします。要約すると、我々のマイクロ流体システムおよび方法論は、改善された精度で個々の細胞の生体効果を研究するために信頼性の高いバブルバブルの相互作用を作成します。
私たちの現在のチップは、個々のHeLa細胞の分析のために設計されています。しかし、他の哺乳動物細胞株のためのパターン島の変更も可能です。いくつかの改良は、さらにアプリケーション情報を拡大させることができますチップのナノ秒。例えば、PLL-G-PEG分子の代用にも24時間後の移行から個々のパターン化された細胞を停止するために探求することができました。このような蛍光マーカーまたは毒性試薬などの化学物質のみが、チップの他の領域中の細胞に影響を与えることなく、特定の場所に適用されるように、また、マイクロ流体バルブを有する新しいチップ設計は、細胞の局所微小環境を制御するために探索することができます。これらの改良により、ここに提示マイクロ流体システムは、キャビテーション露光や衝動的な流れによって生成される機械的刺激以下、このような代謝、分離、分化、および遺伝子発現などの単一細胞の長期的な生体効果を研究する機会を提供することができます。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent/Materials | |||
| 75 mm x 38 mm Plain Microscope Slides | Corning | 2947-75X38 | |
| Acetone | Sigma Aldrich, Co. | 320110 | ACS reagent, ≥99.5% |
| Isopropyl alcohol | Sigma Aldrich, Co. | W292907 | ≥99.7%, FCC, FG |
| Sulfuric acid | Sigma Aldrich, Co. | 320501 | ACS reagent, 95.0-98.0% |
| Hydrogen peroxide | Sigma Aldrich, Co. | 216763 | 30 wt.% in H2O |
| Primer P-20 | Microchem | MCC Primer 80/20 | |
| NFR photoresist | JSR | NFR016D2 | |
| Photomask | Photoplotstore | N/A | 4x4 Direct write mask |
| MF-319 Developer | Shipley (Rohm and Haas) | Microposit MF-319 | |
| 1165 Photoresist Remover | Dow Chemical, Co. | DEM-10018073 | 1-methyl-2-pyrrolidinone based |
| S1813 photoresist | Shipley (Rohm and Haas) | S1813 | |
| PLL-g-PEG | SuSoS | PLL(20)-g[3.5]- PEG(2) | |
| HEPES | ThermoFisher Scientific | 15630080 | |
| Paraffin film | HACH | 251764 | |
| SU-2025 photoresist | Microchem | SU-2025 | |
| PDMS | Dow Corning | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | |
| Microbore Tubing | Saint-Gobain PPL Corp. | S-54-HL | |
| Metal pins | New England Small Tube | NE-1300-01 | Cut Tube (straight), 0.025” OD x 0.017” ID x 0.50” Long |
| HeLa cells | Duke Cell Culture Facility | (307-CCL-2) HeLa, p.148 | |
| DPBS (1x) buffer | ThermoFisher Scientific | 14190144 | |
| DMEM culture medium | ThermoFisher Scientific | 11995065 | |
| Fibronectin Bovine Protein, Plasma | ThermoFisher Scientific | 33010018 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA (1x) | ThermoFisher Scientific | 25200056 | |
| Propidium Iodide | ThermoFisher Scientific | P21493 | |
| Carboxylate Microspheres 1.00 μm | Polysciences, Inc | 08226-15 | |
| Carboxylate Microspheres 2.00 μm | Polysciences, Inc | 18327-10 | |
| EDC (1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride) | ThermoFisher Scientific | 22980 | |
| Sulfo-NHS | Sulfo-NHS (N-hydroxysulfosuccinimide) | 24510 | |
| Peptite-2000 | Advanced BioMatrix | 5020-5MG | |
| FITC Annexin V | ThermoFisher Scientific | A13199 | |
| Fura-2, AM | ThermoFisher Scientific | F1221 | |
| DMSO | Sigma Aldrich, Co. | D2650 | |
| F-127 | invitrogen | P6866 | 0.2 µm filtered (10% Solution in Water) |
| Reduced serum media | ThermoFisher Scientific | 11058021 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Plasma asher | Emitech | K-1050X | O2 / Ar plasma ashing of photoresist and other organic materials |
| Mask aligner | SUSS MicroTec | Karl Suss MA6/BA6 | |
| E-beam evaporator | CHA Industries | CHA Industries Solution E-Beam | |
| RIE | Trion Technology | Trion Technology Phantom II | (oxide/ nitride/ polymer) etching |
| Stereoscope | AmScope | American Scope SM-4TZ-FRL | Stereo Microscope |
| Syringe pump | Chemyx Inc | NanoJet | |
| Cell culture incubator | NuAire | AutoFlow NU-8500 Water Jacket CO2 Incubator | |
| Biological Safety Cabinets | NuAire | NU-425-400 | |
| Water bath | VWR | 1122s | |
| Centrifuge | IEC | Centra CL2 | |
| Microscope | Zeiss | Axio Observer Z1 | |
| Nd:YAG laser (laser 1) | New Wave Research | Tempest | |
| Nd:YAG laser (laser 2) | New Wave Research | Orion | |
| Delay generator | Berkeley Nucleonics | BNC 565-8c | |
| Flash lamp | Dyna-Lite | ML1000 fiber-coupled flashtube | |
| high speed camera | DRS Hadland | Imacon 200 | |
| high speed camera | Shimadzu | HPV-X | |
| high speed camera | Vision Research | Phantom V7.3 | |
| PIV software | LaVision | DaVis 7.2 | |
| camera | Zeiss | AxioCam MRc 5 | |
| software | Zeiss | AxioVision | |
| PTI system | Horiba | S/N: 1705 RAM-X | |
| EasyRatio software | Horiba | Easy Ratio Pro 2 | version 2.3.125.86 |
| 63× objective | Zeiss | LD Plan Neofluar |
References
- Wang, D., Bodovitz, S. Single cell analysis: the new frontier in 'omics. Trends Biotechnol. 28 (6), 281-290 (2010).
- Weaver, W. M., et al. Advances in high-throughput single-cell microtechnologies. Curr Opin Biotechnol. 25, 114-123 (2014).
- Gossett, D. R., et al. Hydrodynamic stretching of single cells for large population mechanical phenotyping. Proc Natl Acad Sci USA. 109 (20), 7630-7635 (2012).
- Spiller, D. G., Wood, C. D., Rand, D. A., White, M. R. H. Measurement of single-cell dynamics. Nature. 465 (7299), 736-745 (2010).
- Lecault, V., White, A. K., Singhal, A., Hansen, C. L. Microfluidic single cell analysis: from promise to practice. Curr Opin Chem Biol. 16 (3-4), 381-390 (2012).
- Kennedy, J. E. High-intensity focused ultrasound in the treatment of solid tumours. Nat Rev Cancer. 5 (4), 321-327 (2005).
- Zhu, S., Cocks, F. H., Preminger, G. M., Zhong, P. The role of stress waves and cavitation in stone comminution in shock wave lithotripsy. Ultrasound Med Biol. 28 (5), 661-671 (2002).
- Fan, Z., Liu, H., Mayer, M., Deng, C. X. Spatiotemporally controlled single cell sonoporation. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (41), 16486-16491 (2012).
- Itah, Z., et al. Hydrodynamic cavitation kills prostate cells and ablates benign prostatic hyperplasia tissue. Exp Biol Med. 238 (11), 1242-1250 (2013).
- Kosar, A., Sesen, M., Oral, O., Itah, Z., Gozuacik, D. Bubbly cavitating flow generation and investigation of its erosional nature for biomedical applications. IEEE Trans Biomed Eng. 58 (5), 1337-1346 (2011).
- Li, Z. G., Liu, A. Q., Klaseboer, E., Zhang, J. B., Ohl, C. D. Single cell membrane poration by bubble-induced microjets in a microfluidic chip. Lab Chip. 13 (6), 1144-1150 (2013).
- Li, F. F., Chan, C. U., Ohl, C. D. Yield Strength of Human Erythrocyte Membranes to Impulsive Stretching. Biophys J. 105 (4), 872-879 (2013).
- Li, F., M, M., Ohl, C. .D. . Shear stress induced stretching of red blood cells by oscillating bubbles within a narrow gap. Bull Am Phys Soc. 58, (2013).
- Sankin, G. N., Yuan, F., Zhong, P. Pulsating tandem microbubble for localized and directional single-cell membrane poration. Phys. Rev. Lett. 105 (7), 078101 (2010).
- Fan, Q., Hu, W., Ohta, A. T. Laser-induced microbubble poration of localized single cells. Lab Chip. 14 (9), 1572-1578 (2014).
- Chen, C. S., Mrksich, M., Huang, S., Whitesides, G. M., Ingber, D. E. Geometric control of cell life and death. Science. 276 (5317), 1425-1428 (1997).
- Yuan, F., Sankin, G., Zhong, P. Dynamics of tandem bubble interaction in a microfluidic channel. J Acoust Soc Am. 130 (5), 3339-3346 (2011).
- Microchem, SU-8 2000 Processing Guidelines. , Available from: http://www.microchem.com/pdf/SU-82000DataSheet2000_5thru2015Ver4.pdf (2000).
- Yang, C. Analysis of Tandem Bubble Interaction and Jet Formation in a Microfluidic Channel. , Duke University. (2013).
- Simon, S. I., Schmid-Schonbein, G. W. Cytoplasmic strains and strain rates in motile polymorphonuclear leukocytes. Biophys J. 58 (2), 319-332 (1990).
- Barbee, K. A., Macarak, E. J., Thibault, L. E. Strain measurements in cultured vascular smooth muscle cells subjected to mechanical deformation. Ann Biomed Eng. 22 (1), 14-22 (1994).
- Yuan, F., Yang, C., Zhong, P. Cell membrane deformation and bioeffects produced by tandem bubble-induced jetting flow. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 112 (51), E7039-E7047 (2015).
- Yin, H., Marshall, D. Microfluidics for single cell analysis. Curr Opin Biotechnol. 23 (1), 110-119 (2012).
- Tay, S., et al. Single-cell NF-kappa B dynamics reveal digital activation and analogue information processing. Nature. 466 (7303), 267-271 (2010).
- Rand, R. P., Burton, A. C. Mechanical Properties of the Red Cell Membrane: I. Membrane Stiffness and Intracellular Pressure. Biophys J. 4 (2), 115-135 (1964).
- Lim, C. T., Dao, M., Suresh, S., Sow, C. H., Chew, K. T. Large deformation of living cells using laser traps. Acta Mater. 52 (7), 1837-1845 (2004).
- Puig-de-Morales-Marinkovic, M., Turner, K. T., Butler, J. P., Fredberg, J. J., Suresh, S. Viscoelasticity of the human red blood cell. Am J Physiol Cell Physiol. 293 (2), C597-C605 (2007).
- Kudo, N., Okada, K., Yamamoto, K. Sonoporation by single-shot pulsed ultrasound with microbubbles adjacent to cells. Biophys J. 96 (12), 4866-4876 (2009).
- van Wamel, A., et al. Vibrating microbubbles poking individual cells: Drug transfer into cells via sonoporation. J Control Release. 112 (2), 149-155 (2006).
- Hu, Y., Wan, J. M., Yu, A. C. Membrane perforation and recovery dynamics in microbubble-mediated sonoporation. Ultrasound Med Biol. 39 (12), 2393-2405 (2013).
- Dijkink, R., et al. Controlled cavitation-cell interaction: trans-membrane transport and viability studies. Phys Med Biol. 53 (2), 375-390 (2008).
- Rau, K. R., Quinto-Su, P. A., Hellman, A. N., Venugopalan, V. Pulsed laser microbeam-induced cell lysis: Time-resolved imaging and analysis of hydrodynamic effects. Biophys J. 91 (1), 317-329 (2006).
