Dette manuskriptet beskriver en enkel metode for å måle phagosomal pH-verdi og området samt det cytoplasmatiske pH av humane og muse nøytrofiler ved hjelp av kvotient- målings indikatoren seminaphthorhodafluor (snarf) -1, eller S-1. Dette oppnås ved hjelp av levende celler konfokal fluorescens mikroskopi og bildeanalyse.
Nøytrofile er avgjørende for å være vert for medfødt forsvar og dermed utgjøre et viktig medisinsk forskning. Den fagosomet, i det intracellulære rommet hvor den dreping og fordøyelse av omsluttet partikler finner sted, er hoved arena for nøytrofil patogen dreping som krever tett regulering. Phagosomal pH er ett aspekt som er nøye kontrollert, på sin side å regulere antimikrobiell proteaseaktivitet. Mange fluorescerende pH-følsomme fargestoffer har blitt brukt til å visualisere phagosomal miljø. S-1 har flere fordeler i forhold til andre pH-følsomme fargestoffer, inkludert dens doble emisjonsspektra, dens motstand mot foto-bleking, og den høye pKa. Ved hjelp av denne metode, har man vist at de nøytrofile fagosomet er usedvanlig alkalisk i forhold til andre fagocytter. Ved å bruke forskjellige biokjemiske bøyning av fargestoff, kan det fagosomet være avgrenset fra cytoplasma, slik at forandringer i størrelsen og formen på fagosomet kan vurderes. Dette gjør at feller ytterligere overvåkning av ionisk bevegelse.
De nøytrofile celler er den mest tallrike medfødte immun celle i kroppen. Dens hovedfunksjon består i patruljer blodet og henger og bearbeider de fremmede partiklene at det kan støte på i en prosess kjent som fagocytose 1, 2. Partiklene blir nedbrutt i et intracellulære rommet kalles fagosomet. Aktiveringen av nøytrofil NADPH oksidase, isoformen NOX2, initierer en kaskade av biokjemiske reaksjoner som kulminerer i død av organismen. NOX2 proteinsubenheter fortsette å danne en elektrontransportkjeden kompleks i phagosomal membran 3. Når den er aktivert, den transporterer elektroner fra NADPH over membranen til molekylært oksygen inne i fagosomet, produserer superoksydanioner og ytterligere reaktive oksygenarter. Dette er kjent som luft sprakk, og det er tenkt å være avgjørende for effektiv mikrobiell drap og fordøyelse 2 </sup>. Imidlertid vil dette eksklusive bevegelsen av negativ ladning over membranen snart inaktivere NOX2 hvis det ikke ble kompensert av positiv ladning bevege seg i og / eller negativ ladning flytte ut av fagosomet. Det er vel etablert at flertallet av ladning kompensasjon i nøytrofil utføres ved proton kanal HVCN1 4, 5. Denne kanal gjør det mulig for den passive bevegelse av protoner ned deres elektrokjemisk gradient fra cytosol inn i fagosomet. Proton-konsentrasjonen blir reflektert ved hjelp av pH, slik at for et gitt nivå av oksidase aktivitet, kan måling av pH-verdien i den fagosomet gi informasjon om den relative deltakelse av proton og ikke-protoniske baner i charge kompensasjon.
Den human neutrofil fagosomet har en alkalisk pH på omtrent 8,5 i 20-30 minutter etter fagocytose 5. Dette innebærer eksistensen av ytterligere ikke-proton ionekanaler i NOX2-induserte ladning kompensasjon, som fusjon og frigivelse av innholdet av de sure granulene og såle erstatning av HVCN1 vil opprettholde et surt miljø, i motsetning til det som observeres. Bevegelsen av ioner for å kompensere denne negative ladning kan også utøve endringer i fagosomet størrelse via osmose. Disse kan være ioner som er tilstede i den nøytrofile ved høye fysiologiske konsentrasjoner: kalium-ioner har vist seg å bevege seg inn i det fagosomet 6, og klorid ionisk bevegelse er en annen kandidat viktig for nøytrofil-funksjons-7.
Reguleringen av pH-verdien i den fagosomet er avgjørende for antimikrobiell proteaseaktivitet 5. Myeloperoksidase (MPO) ser ut til å ha optimal aktivitet ved pH 6, mens for cathepsin G og elastase, de optimale nivåene er pH 7-9 og pH 8-10, henholdsvis 5. Derfor kan forbigående endring i phagosomal pH gi aktivitets nisjer for ulike enzymer til moroDette skjer. Å forstå hvordan pH er involvert i nøytrofil-mikrobielle dreping kan gi nyttig informasjon for utforming av nye nøytrofil-forsterknings mikrobielle midler.
Den nøytrofil fagosomet et meget reaktivt miljø. Dette gjør det vanskelig å nøyaktig vurdere pH, fordi farvestoffer kan lett oksyderes, noe som fører til tekniske gjenstander. Historisk har fluorescein-isothiocyanat (FITC) vært fargestoffet av valget for å måle intracellulær pH 8, 9. Det finnes imidlertid noen ulemper for dets bruk ved måling av nøytrofile phagosomal pH. Det har en pKa-verdi på 6,4 10, noe som betyr at det kan kun nøyaktig kan brukes til å vurdere pH-verdier 5-7,5 8, som det metter ved pH <8 11. Som det nøytrofile phagosomal pH kan bli mye mer basisk 5, kan FITC ikke fange opp hele omfanget av potensielle pH-endringer. En ytterligere signifiskrånende problem med FITC i sammenheng med nøytrofile er at det er tenkt å bli fotobleket av MPO 12. MPO-inhibitor, natriumazid, kan brukes til å begrense fotobleking 13, men det har vist seg at natriumazid direkte senker phagosomal pH-verdien i en MPO-uavhengig måte, og er derfor uegnet for bruk i slike analyser 5.
Sammenlignet med andre intracellulære fargestoffer, har S-1 en forholdsvis høy pKa-verdi på 7,5 10. I sure betingelser, er molekylet protonert og skaper en emisjon signal mellom 560 og 600 nm når eksitert ved 488 nm eller høyere. Når molekylet deprotoneres i mer alkaliske betingelser, er emisjonsbølgelengden over 600 nm. Et forhold på fluorescensstyrkene ved disse to bølgelengder viser emisjons skift, som er mer pålitelig enn enkelt er fluorescensmålinger, da den ikke påvirkes av fluoroforen konsentrasjon og cellestrukturen. S-1 kan konjugeres til antigent materiale, for eksempel zymosan 14, selv om varme-drepte (HK) Candida albicans er foretrukket, som det større overflateareal gir en mer ensartet fluorescens, lesing.
Vi har også anvendt en modifikasjon av denne fremgangsmåten for å studere tidsmessige forandringer i pH (figur 3) 5. Denne metode for måling av cytosolisk pH kan lett anvendes på andre celletyper, som beskrevet andre steder 15, 16, og celler med mer alkaliske phagosomes 14.
Når de passende reagenser, mikroskop innstillinger og kalibreringsforsøk er satt opp, er denne fremgangsmåte forholdsvis enkel å utføre. De kritiske trinnene omfatter: merking av Candida med S-1 for å sikre at det ikke er noen overbelastning av fargestoff, kalibrering, og analysere bildet.
S-1 er en reagens som er egnet til mer alkalisk pH-miljø, noe som er spesielt viktig for neutrofiler 21 men begrenser dens bruk i visse celletyper. For mer sure omgivelser, slik som makrofag phagosomes, snarf-4, eller S-4, er mer egnet på grunn av sin lavere pKa 22. Videre, for mer nøyaktige avlesninger cytoplasmiske, er det bedre å bruke S-4, som standard-kurve for S-1 viser at fluorescens-forhold begynne å flate ut under pH 6 (figur 3). Andre fargestoffer, så som 2' , 7'-bis (2-karboksyetyl) -5- (og-6) -Carboxyfluorescein (BCECF) eller pHrodo Red kan også være mer hensiktsmessig i et fortsext som forventes å være sur. Ennå cytoplasma farging er fortsatt nødvendig for korrekt identifisering av phagosomes som inneholdt Candida.
Et viktig trekk ved en phagosomal pH-indikator er at det ikke er irreversibelt forandret ved den reaktive phagosomal miljø. S-1 synes å være motstandsdyktige mot den nøytrofile miljø. Dette er vist ved Levine et al. 5 (se terende video 4 av referanse 5), som demonstrerer den fagocytose og etterfølgende frigjøring av en S-1-merket Candida partikkel ved en Hvcn1 – / -, nøytrofile celler. Når utsatt for fagocytose, slår partikkel fra gul / oransje til rød (nøytral til alkalisk pH-verdi), men når partikkelen er utgitt av neutrofile, går den tilbake til sin opprinnelige farge.
Det er viktig å nevne noen av de begrensninger knyttet til bruk av S-en. Det faktum at dette fargestoffet har to emisjonsspektra som tillater ratiometrisk measurement er en fordel, men spesialutstyr er nødvendig for å hente bilder; mikroskop brukes for forsøkene må være i stand til å ta opp to bilder samtidig eller med en ubetydelig tidsforsinkelse. Forfatterne antar at forskeren forsøker denne protokollen har erfaring med konfokalmikroskopi, eller har tilgang til en profesjonell. Vi kan ikke liste opp alle de spesifikke mikroskop parametere som de vil variere for hver mikroskop og må optimaliseres av forskeren. Den acetoksymetylester konjugert til S-en som gjør at fargestoffet diffunderer inn i cellecytoplasmaet forringes av ikke-spesifikke esteraser i cellecytoplasmaet for å danne fluorescerende molekyl. Esteraser, for eksempel alkalisk fosfatase, til stede i humant serum og føtalt bovint serum, som brukes til å supplere cellekulturmedier. Følgelig må mediet hvor cellene er lastet med S-1-AM (seksjon 4.5) ikke inneholder serum. Dette kan vise seg utfordrende hvis du bruker celler som krever en mer næringsrik rich medium for å opprettholde dem enn den balanserte saltløsning brukt i denne protokollen. Likeledes kan andre fluorescerende mediumkomponentene, slik som fenol-rødt, interferere med S-1-målinger.
Feilstolpene i figur 3 indikerer at det er en viss variasjon i forholdet målinger ved hver pH. Et passende antall gjentagelser av hvert eksperiment (minst n = 3) og like mange enkeltmålinger i hvert enkelt forsøk for å overvinne den inter vacuolar variasjon. Det er således tilrådelig å måle pH-verdien på minst 100 phagosomes for hver tilstand og så mange phagosomal områder som synes å inneholde bare ett Candida. De phagosomes som skal måles for kvantifisering bør være de som er fullstendig omsluttet en Candida partikkel (dvs. de som er fullstendig omgitt av cytoplasma). For å redusere mot utilsiktede skjevheter i utvelgelsen av celler / phagosomes for kvantifisering, bør alle analyser utføres mensblind til de eksperimentelle betingelser.
Her beskriver vi isolering av nøytrofiler ved dekstransedimentering av helt blod, etterfulgt av sentrifugering av plasmalaget gjennom en tetthetsgradient. Vi bruker denne teknikk som det raskt og effektivt frembringer en ren (> 95%) populasjonen av nøytrofile celler, selv om det finnes andre metoder som er tilgjengelige, slik som fullblod sentrifugering gjennom andre tetthetsgradient formler eller negativ seleksjon av nøytrofiler ved bruk av spesialiserte byggesett med antistoffer eller magnetisk perler. Imidlertid kan sistnevnte være uoverkommelig dyrt for de fleste grupper som isolerer nøytrofile rutinemessig. I tillegg bruker vi den antikoagulerende heparin i blodoppsamlingsrøret, mens andre forskere kan være mer vant til å bruke etylendiamintetraeddiksyre (EDTA) eller syrecitrat natrium (ACD). Ettersom det er mange forskjellige metoder å velge mellom, er det opp til personlig preferanse for forskeren.
Dessuten,ved isolering og manipulering av nøytrofiler de må håndteres med en viss forsiktighet for å unngå overdreven aktivering. Forsiktighets trinnene omfatter: bare ved hjelp av plast ware, ingen glass; filter-sterilisere alle buffere for å fjerne eventuelt forurensende endotoksin; når spinn neutrofiler sørge for at sentrifugen er godt balansert for å unngå for høye vibrasjoner; begrense så mye som mulig den tid neutrofiler forbli i en pellet etter sentrifugering; opprettholder ikke nøytrofiler i oppløsning på mer enn 5 x 10 6 / ml; og utføre forsøket så snart som mulig etter isolering.
Denne metoden kan være tilpasset for å måle endringer i pH-verdien og phagosomal område over tid ved anvendelse av et oppvarmet trinn satt til 37 ° C på mikroskopet og ta fotografier en gang hver 30 til 60 s fra den samme posisjon, som beskrevet for kalibreringstrinn. Det kan også teoretisk bli tilpasset for høyere gjennomstrømming eksperimenter, slik som i 96-brønners plater, og for flowcytometri eksperimenter, hvor S-1 boksbli anvendt som en pH-indikator 23. Men i disse innstillingene, er det lagt vekt på individuell celle aktivitet erstattet av en mer global effekt på cellepopulasjonen.
Denne metoden tar sikte på å gi en relativt enkel eksperimentelle oppsettet hvorpå enkeltforskere kan tilpasse til deres område av interesse. Forskere kan ønske å utforske nøytrofil phagosomal pH-verdi og området mens de også å måle bevegelsen av andre ioner, for eksempel, intracellulær kalsiumkonsentrasjon. Det er flere fluoriserende Ca2 + indikatorer er lett tilgjengelige for konfokal mikroskopi, for eksempel Indo-1, som også har to emisjonsspekter ved 400 og 475 nm 24. Disse emisjonsbølgelengder overlapper ikke med S-1 emisjonsspektra, men eksitasjonsbølgelengden er ved ultrafiolett (UV) ende av spekteret, noe som kan være skadelig for cellene, og en UV-laser ikke er vanlig på alle mikroskoper. En omfattende gjennomgang av de ulike indikatorene tilmåle intracellulær kalsium-fluks er dekket av Takahashi et al. 25 og Hillson et al. 26.
Som konklusjon, er det andre metoder er tilgjengelige for å måle phagosomal pH ved anvendelse av forskjellige fluorescerende fargestoffer som Nunes et al. har demonstrert 13, så vel som andre grupper 27, 28. Andre forskere har også benyttet S-1 for å måle cytosolisk pH 29 eller phagosomal pH 14. Imidlertid er denne protokollen unikt i å måle samtidig pH-verdien i både cytosol og fagosomet, som gir mulighet til å observere endringer i phagosomal tverrsnittsareal og for å skille mellom villtype og Hvcn1 – / – mus neutrofiler og humane neutrofiler med og uten arbeider NADPH oksidase.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble velvillig finansiert av Wellcome Trust, bioteknologi og Biological Sciences Research Council, og Irwin Joffe Memorial Fellowship.
Candida albicans ATCC 10231 Vitroids 80 CFU | Sigma-Aldrich | RQC14003-10EA | Place directly on a spread agar plate according to the manufacturer's instructions |
YPD broth | Sigma-Aldrich | Y1375 | Follow manufacturer's instructions, various providers exist |
Dextran Clinical grade MW = 200,000-300,000 | MP Biomedicals | 2101514 | Use gloves |
Heparin Sodium solution for infusion (preservative free), 1,000IU/ml | Fannin, Wockhardt UK Ltd | FP1077 | We purchased from UCH inpatient pharmacy |
SNARF-1 Carboxylic Acid, Acetate, Succinimidyl Ester – Special Packaging | Thermo Scientific/Invitrogen | SS22801 | Use gloves |
5-(and-6)-Carboxy SNARF-1, Acetoxymethyl Ester, Acetate | Thermo Scientific/Invitrogen | C1272 | Use gloves |
Vivaglobin human IgG 160mg/ml solution | CSL Behring | received as a gift | Various providers exist |
Normal mouse serum | Abcam | ab7486 | Various providers exist |
Lymphoprep (density gradient medium) | Alere Ltd | 1114547 | Keep sterile and away from direct sunlight, can be substituted by Ficoll-Paque |
Nigericin | Sigma-Aldrich | N7143 | Toxic, use gloves, various providers exist |
Saponin | Sigma-Aldrich | 47036 | Toxic, use gloves, various providers exist |
Dimethyl sulphoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | Toxic, use gloves, various providers exist |
4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid (HEPES) | Sigma-Aldrich | H3375 | Various providers exist |
Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris) | Sigma-Aldrich | T1503 | Various providers exist |
Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9333 | Various providers exist |
Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S7653 | Various providers exist |
Magnesium chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | M8266 | Various providers exist |
Magnesium sulphate (MgSO4) | Sigma-Aldrich | M7506 | Various providers exist |
Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P9791 | Various providers exist |
Calcium chloride (CaCl2) | Sigma-Aldrich | C1016 | Various providers exist |
Glucose | Sigma-Aldrich | D9434 | Various providers exist |
Absolute Ethanol | Sigma-Aldrich | 2860 | Various providers exist |
Diphenylene iodonium (DPI) | Sigma-Aldrich | D2926 | Various providers exist |
Zinc chloride | Sigma-Aldrich | 208086 | Various providers exist, do not dilute in phosphate based buffers as it will precipitate |
Poly L lysine | Sigma | P4707 | Various providers exist |
Laser scanning confocal microscope (Zeiss LSM 700) | Carl Zeiss | The microscope must be able to excite at 555nm and measure emission at two channels simultaneously (560-600nm, >610nm) | |
Ibidi µ slide 8 well ibiTreat | Thistle Scientific | IB-80826 | Other appropriate imaging dishes can be substituted |
Fluorodish Cell Culture Dish-35mm, 23mm well | World Precision Instruments | FD35-100 | Other appropriate imaging dishes can be substituted, different sizes are available |
Soniprep 150 | MSE | Any appropriate sonicator will suffice | |
TC20 Automated Cell Counter | BioRad | Various providers exist | |
1.5ml Protein LoBind Tubes | Sigma-Aldrich | Z666505-100EA | Specially used as Candida can stick to normal eppendorfs |