Detta manuskript beskriver en enkel metod för att mäta phagosomal pH och område samt den cytoplasmatiska pH hos människa och mus neutrofiler med användning av ratiometrisk indikatorn seminaphthorhodafluor (Snarf) -1, eller S-1. Detta uppnås med hjälp av live-cell konfokal fluorescensmikroskopi och bildanalys.
Neutrofiler är avgörande för att vara värd för medfödda försvaret och därmed utgör ett viktigt område för medicinsk forskning. Den fagosomen, den intracellulära utrymmet där dödandet och nedbrytning av uppslukas partiklar sker, är den viktigaste arenan för neutrofila patogen dödande som kräver stram reglering. Phagosomal pH är en aspekt som är noggrant styrd i sin tur reglerar antimikrobiell proteasaktivitet. Många fluorescerande pH-känsliga färgämnen har använts för att visualisera phagosomal miljön. S-1 har flera fördelar jämfört med andra pH-känsliga färgämnen, inklusive dess dubbla emissionsspektra, dess motståndskraft mot fotoblekning, och dess höga pKa. Med denna metod har vi visat att neutrofiler fagosomen är ovanligt alkalisk i jämförelse med andra fagocyter. Genom att använda olika biokemiska konjugationer av färgämnet kan fagosomen avgränsas från cytoplasman så att ändringar i storleken och formen på fagosomen kan bedömas. Detta tillåter feller vidare övervakning av jonisk rörelse.
Den neutrofila är den vanligast förekommande medfödda immunceller i kroppen. Dess huvudsakliga funktion består av patruller blodomloppet och uppsluka och smälta de främmande partiklarna att den kan stöta på i en process känd som fagocytos 1, 2. Partiklarna bryts ned i en intracellulär avdelning kallad fagosomen. Aktiveringen av neutrofila NADPH-oxidas, den isoform NOX2, initierar en kaskad av biokemiska reaktioner som kulminerar i döden av patogenen. NOX2 proteinsubenheter vidare för att bilda en elektrontransportkedja komplex i phagosomal membranet 3. En gång aktiverats, det transporterar elektroner från NADPH över membranet till molekylärt syre inne i fagosomen, producerande superoxidanjoner och ytterligare reaktiva syrespecies. Detta är känt som den respiratory burst, och det tros vara väsentlig för effektiv mikrobiell avdödning och matsmältning 2 </sup>. Detta skulle dock exklusiva förflyttning av negativ laddning över membranet snart inaktivera NOX2 om det inte kompenserades genom positiv laddning rör sig i och / eller negativ laddning rör sig ut ur fagosomen. Det har varit väl etablerat att majoriteten av laddningskompensation i den neutrofila utförs genom protonkanal HVCN1 4, 5. Denna kanal tillåter passiv förflyttning av protoner ner sin elektrokemiska gradient från cytosolen in i fagosomen. Protonkoncentration reflekteras av pH, så för en given nivå av oxidasaktivitet, kan mätning av pH i fagosomen ge information om den relativa deltagande protoniska och icke-protoniska vägar i laddningskompensation.
Den humana neutrofil fagosomen har ett alkaliskt pH av ca 8,5 under 20-30 min efter fagocytos 5. Detta innebär att det finns ytterligare icke-proton jonkanaler i NOX2-inducerad laddningskompensation, som fusions och frisättning av innehållet i de sura granuler och enda kompensation av HVCN1 skulle bibehålla en sur miljö, i motsats till vad som observerats. Rörelsen av joner för att kompensera denna negativa laddning kan också utöva förändringar i fagosomen storlek via osmos. Dessa kan vara joner närvarande i den neutrofila vid höga fysiologiska koncentrationer: kaliumjoner har visats att flytta in i fagosomen 6, och klorid jonisk rörelse är en annan kandidat viktigt för neutrofil funktion 7.
Regleringen av pH i fagosomen är avgörande för antimikrobiell proteasaktivitet 5. Myeloperoxidas (MPO) synes ha optimal aktivitet vid pH 6, medan det för katepsin G och elastas, de optimala nivåer är pH 7-9 och pH 8-10, respektive 5. Därför kan övergående förändring i phagosomal pH ger aktivitets nischer för olika enzymer till funInsatser. Att förstå hur pH är involverad i neutrofila mikrobiell dödande kan ge användbar information för utformning av nya neutrofila-utöka mikrobiella medel.
Den neutrofila fagosomen är en mycket reaktiv miljö. Detta gör det svårt att exakt bedöma pH, eftersom färgämnen kan lätt oxideras, vilket leder till tekniska artefakter. Historiskt har fluoresceinisotiocyanat (FITC) varit färgämnet med val för att mäta intracellulärt pH 8, 9. Det finns dock vissa nackdelar för dess användning för att mäta neutrofila phagosomal pH. Den har ett pKa av 6,4 10, vilket innebär att den kan endast noggrant användas för att bedöma pH-nivåer från 5 till 7,5 8, eftersom det mättar vid pH <8 11. Som neutrofila phagosomal pH kan bli mycket mer basisk 5, kan FITC inte fånga hela skalan av möjliga pH-förändringar. En ytterligare significant problem med FITC i samband med neutrofiler är att det är tänkt att vara photobleached av MPO 12. MPO-inhibitor, natriumazid, kan användas för att begränsa fotoblekning 13, men det har visat sig att natriumazid direkt sänker phagosomal pH i en MPO-oberoende sätt och är därför olämplig för användning i sådana analyser 5.
Jämfört med andra intracellulära färgämnen, S-1 har ett relativt högt pKa på 7,5 10. Under sura betingelser, är molekylen protonerad och alstrar ett emissionssignal mellan 560 och 600 nm, när den exciteras vid 488 nm eller högre. När molekylen deprotoneras i mer alkaliska förhållanden, är emissionsvåglängden över 600 nm. Ett förhållande av fluorescensintensiteterna vid dessa två våglängder indikerar emissionsskift, vilket är mer är tillförlitlig än enstaka fluorescensmätningar, eftersom det är opåverkad av fluorofor koncentration och cellstruktur. S-1 kan konjugeras till antigena material, såsom zymosan 14, även om värmedödade (HK) Candida albicans är att föredra, eftersom den större ytarean ger ett mer konsekvent fluorescensavläsning.
Vi har även använt en modifiering av denna metod för att studera tidsmässiga förändringar i pH (Figur 3) 5. Denna metod för mätning av cytosoliskt pH kan lätt tillämpas på andra celltyper, såsom beskrivits på annat ställe 15, 16, och celler med mer alkaliska fagosomer 14.
När väl de lämpliga reagens, mikroskopinställningar och kalibreringsexperiment sätts upp, är denna metod relativt enkel att utföra. De kritiska stegen inkluderar: märkning av Candida med S-1 för att säkerställa att det inte finns någon överbelastning av färg, kalibrering och analysera bilden.
S-1 är ett reagens lämpat för mera alkaliska pH-miljöer, vilket är särskilt viktigt för neutrofiler 21 men begränsar dess användning i vissa celltyper. För mer sura miljöer, såsom makrofag fagosomer, Snarf-4, eller S-4, är mer lämpliga på grund av dess lägre pKa 22. Dessutom, för mer noggranna cytoplasmatiska avläsningar, är det bättre att använda S-4, som standardkurvan för S-1 visar att fluorescensförhållanden börjar platå under pH 6 (figur 3). Andra färgämnen, såsom 2' , 7'-bis- (2-karboxietyl) -5- (och-6) -karboxifluorescein (BCECF) eller pHrodo Red kan också vara mer lämpliga i en fortsext som förväntas vara surt. Ändå cytoplasman färgningen är fortfarande nödvändigt för korrekt identifiering av fagosomer innehåller Candida.
En viktig egenskap hos en phagosomal pH-indikator är att den inte är irreversibelt förändras av den reaktiva phagosomal miljön. S-1 verkar vara resistenta mot neutrofila miljö. Detta visas av Levine et al. 5 (se Kompletterande Video 4 av referens 5), vilka demonstrerar fagocytos och efterföljande frisättning av en S-1-märkt Candida partikel genom en Hvcn1 – / – neutrofil. När fagocyteras, vänder partikeln från gul / orange till röd (neutralt till alkaliskt pH), men när partikeln frigörs av den neutrofila, återgår den till sin ursprungliga färg.
Det är viktigt att nämna några av de begränsningar som är förknippade med att använda S-1. Det faktum att detta färgämne har två emissionsspektra medger ratiometrisk measurement är en fördel, men det krävs specialutrustning för att förvärva bilder; mikroskop som används för experimenten måste kunna spela in två bilder samtidigt eller med en obetydlig tidsfördröjning. Författarna antar att forskaren försöker detta protokoll har erfarenhet av att använda konfokalmikroskopi, eller har tillgång till en utbildad professionell. Vi kan inte räkna upp alla specifika mikroskop parametrar som de kommer att skilja sig för varje mikroskop och måste optimeras av forskaren. Den acetoximetylester konjugerad till S-1 som medger färgämnet att diffundera in i cellcytoplasman bryts ned av icke-specifika esteraser i cellcytoplasman att bilda den fluorescerande molekylen. Esteraser, såsom alkaliskt fosfatas, är närvarande i humant serum och fetalt bovint serum, vilka används för att komplettera cellkulturmedia. Följaktligen måste det medium i vilket cellerna är laddade med S-1-AM (avsnitt 4,5) inte innehålla serum. Detta kan vara svårt om användning av celler som kräver en mer närings Rich-medium för att upprätthålla dem än den balanserade saltlösningen används i hela detta protokoll. På liknande sätt, andra fluorescerande mediumkomponenter, såsom fenolrött, kan störa S-1-mätningar.
De felstaplar i figur 3 indikerar att det finns viss variation i förhållandemätningar vid varje pH. Ett lämpligt antal upprepningar av varje experiment (minst n = 3) och så många enskilda mätningarna i varje enda experiment behövs för att övervinna den inter-vakuolär variation. Det är därför tillrådligt att mäta pH av minst 100 fagosomer för varje tillstånd och lika många phagosomal områden som ser ut att innehålla endast en Candida. De fagosomer skall mätas för kvantifiering bör vara de som helt har engulfed en Candida partikel (dvs de helt omgiven av cytoplasman). För att mildra effekterna av oavsiktliga fördomar i valet av celler / fagosomer för kvantifiering bör alla analyser utföras medanblind för försöksbetingelserna.
Här beskriver vi isoleringen av neutrofiler genom dextransedimentering av helblod följt av centrifugering av plasmaskiktet genom en densitetsgradient. Vi använder denna teknik, eftersom det snabbt och effektivt producerar en ren (> 95%) population av neutrofiler, även om det finns andra metoder tillgängliga, såsom helblod centrifugering genom andra densitetsgradient formler eller negativ selektion av neutrofiler med användning av specialiserade kit med antikroppar eller magnetisk pärlor. Däremot kan den senare vara oöverkomligt dyra för de flesta grupper som isolerar neutrofiler rutinmässigt. Dessutom använder vi antikoaguleringsmedlet heparin i bloduppsamlingsröret, medan andra forskare kan vara mer vana vid att använda etylendiamintetraättiksyra (EDTA) eller syracitrat natrium (ACD). Eftersom det finns många olika metoder att välja mellan, är det upp till den personliga preferenser forskaren.
Dessutom,när isolera och manipulera neutrofiler de bör hanteras med viss försiktighet för att undvika överdriven aktivering. Förebyggande åtgärder är: bara använder plastartiklar, inga glas; filtrera-sterilisera alla buffertar för att avlägsna eventuellt kontaminerande endotoxin; när snurra neutrofiler se till att centrifugen är väl balanserad för att undvika alltför stora vibrationer; begränsa så mycket som möjligt den tid neutrofiler kvar i en pellet efter centrifugering; upprätthåller inte neutrofiler i lösning av mer än 5 x 10 6 / ml; och utför experimentet så snart som möjligt efter isolering.
Denna metod kan anpassas för att mäta ändringar i pH och phagosomal område över tiden genom att använda en uppvärmd skede uppsättning till 37 ° C på mikroskop och ta ögonblicksbilder gång varje 30-60 s från samma position, såsom beskrivits för kalibreringsstegen. Det kan också teoretiskt kunna anpassas för högre genomströmning experiment, såsom vid 96-brunnsplattor, och för flödescytometri experiment, där S-1 kananvändas som en pH-indikator 23. Men i dessa inställningar är betoningen på individuell cellsaktivitet ersätts av en mer global effekt på cellpopulationen.
Denna metod syftar till att ge en relativt enkel experimentuppställning på vilken enskilda forskare kan anpassa för att passa deras intresseområde. Forskare kan vill utforska neutrofil phagosomal pH och område och samtidigt även mäta förflyttning av andra joner, till exempel, intracellulär kalciumkoncentration. Det finns flera fluorescerande Ca2 + indikatorer lätt tillgängliga för konfokal mikroskopi, såsom Indo-1, som också har dubbla emissionsspektra vid 400 och 475 nm 24. Dessa emissionsvåglängder inte överlappar med S-1 emissionsspektra, men excitationsvåglängden är i ultraviolett (UV) änden av spektrumet, som kan skada till celler, och en UV-laser är inte vanligt på alla mikroskop. En omfattande genomgång av de olika indikatorer för attmäta intracellulärt kalciumflöde är täckt av Takahashi et al. 25 och Hillson et al. 26.
Sammanfattningsvis finns det andra metoder som finns tillgängliga för att mäta phagosomal pH med användning av olika fluorescerande färgämnen som Nunes et al. har visat 13 liksom andra grupper 27, 28. Andra forskare har också använt S-1 för att mäta cytosoliska pH 29 eller phagosomal pH 14. Emellertid är detta protokoll unik i att mäta samtidigt pH i både cytosol och fagosomen, vilket ger möjlighet att observera förändringar i phagosomal tvärsnittsarea och för att skilja mellan vildtyp och Hvcn1 – / – mus neutrofiler och humana neutrofiler med och utan en arbets NADPH-oxidas.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete har vänligt finansieras av Wellcome Trust, bioteknik och Biological Sciences Research Council, och Irwin Joffe Memorial Fellowship.
Candida albicans ATCC 10231 Vitroids 80 CFU | Sigma-Aldrich | RQC14003-10EA | Place directly on a spread agar plate according to the manufacturer's instructions |
YPD broth | Sigma-Aldrich | Y1375 | Follow manufacturer's instructions, various providers exist |
Dextran Clinical grade MW = 200,000-300,000 | MP Biomedicals | 2101514 | Use gloves |
Heparin Sodium solution for infusion (preservative free), 1,000IU/ml | Fannin, Wockhardt UK Ltd | FP1077 | We purchased from UCH inpatient pharmacy |
SNARF-1 Carboxylic Acid, Acetate, Succinimidyl Ester – Special Packaging | Thermo Scientific/Invitrogen | SS22801 | Use gloves |
5-(and-6)-Carboxy SNARF-1, Acetoxymethyl Ester, Acetate | Thermo Scientific/Invitrogen | C1272 | Use gloves |
Vivaglobin human IgG 160mg/ml solution | CSL Behring | received as a gift | Various providers exist |
Normal mouse serum | Abcam | ab7486 | Various providers exist |
Lymphoprep (density gradient medium) | Alere Ltd | 1114547 | Keep sterile and away from direct sunlight, can be substituted by Ficoll-Paque |
Nigericin | Sigma-Aldrich | N7143 | Toxic, use gloves, various providers exist |
Saponin | Sigma-Aldrich | 47036 | Toxic, use gloves, various providers exist |
Dimethyl sulphoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | Toxic, use gloves, various providers exist |
4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid (HEPES) | Sigma-Aldrich | H3375 | Various providers exist |
Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris) | Sigma-Aldrich | T1503 | Various providers exist |
Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9333 | Various providers exist |
Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S7653 | Various providers exist |
Magnesium chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | M8266 | Various providers exist |
Magnesium sulphate (MgSO4) | Sigma-Aldrich | M7506 | Various providers exist |
Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P9791 | Various providers exist |
Calcium chloride (CaCl2) | Sigma-Aldrich | C1016 | Various providers exist |
Glucose | Sigma-Aldrich | D9434 | Various providers exist |
Absolute Ethanol | Sigma-Aldrich | 2860 | Various providers exist |
Diphenylene iodonium (DPI) | Sigma-Aldrich | D2926 | Various providers exist |
Zinc chloride | Sigma-Aldrich | 208086 | Various providers exist, do not dilute in phosphate based buffers as it will precipitate |
Poly L lysine | Sigma | P4707 | Various providers exist |
Laser scanning confocal microscope (Zeiss LSM 700) | Carl Zeiss | The microscope must be able to excite at 555nm and measure emission at two channels simultaneously (560-600nm, >610nm) | |
Ibidi µ slide 8 well ibiTreat | Thistle Scientific | IB-80826 | Other appropriate imaging dishes can be substituted |
Fluorodish Cell Culture Dish-35mm, 23mm well | World Precision Instruments | FD35-100 | Other appropriate imaging dishes can be substituted, different sizes are available |
Soniprep 150 | MSE | Any appropriate sonicator will suffice | |
TC20 Automated Cell Counter | BioRad | Various providers exist | |
1.5ml Protein LoBind Tubes | Sigma-Aldrich | Z666505-100EA | Specially used as Candida can stick to normal eppendorfs |