Bu yazıda phagosomal pH ve alan olarak rasyometrik göstergesi seminaphthorhodafluor (SNARF) -1, ya da S-1 kullanılarak, insan ve fare nötrofillerin sitoplazmik pH'ını ölçmek için basit bir yöntem tarif etmektedir. Bu canlı hücre konfokal floresan mikroskop ve görüntü analizi kullanılarak elde edilir.
Nötrofiller doğuştan savunma barındırmak için çok önemlidir ve dolayısıyla tıbbi araştırma önemli bir alan oluşturmaktadır. fagosom, sardı parçacıkların öldürülmesi ve sindirim meydana hücre içi bölme, sıkı bir şekilde düzenlenmesini gerektirir nötrofil patojen öldürme için önemli alandır. Phagosomal pH dikkatli bir şekilde, antimikrobiyal bir proteaz aktivitesinin düzenlenmesinde da kontrol edilir bir yönüdür. Birçok flüoresan pH'a duyarlı boyalar phagosomal ortamı görselleştirmek için kullanılmıştır. S-1, çift emisyon spektrumları, foto-ağartma karşı direnç, ve yüksek pKa'sı dahil olmak üzere diğer pH'a duyarlı boyalar, üzerinde birçok avantajı vardır. Bu yöntemi kullanarak, nötrofil fagosom diğer fagositler göre alışılmışın dışında alkali olduğunu göstermiştir. fagozomun boyutu ve şeklindeki değişiklikler, tespit edilebilir, böylece boyanın farklı biyokimyasal çekimleri kullanarak, fagosom sitoplazmadan tarif edilebilir. Bu f veririyonik hareketi ya da daha fazla izlenmesi.
nötrofil Vücutta en bol bulunan doğuştan gelen immün hücredir. Temel işlevi kan dolaşımına devriye ve içine çeken ve fagositoz 1, 2 olarak bilinen bir süreç karşılaşabilecekleri yabancı madde sindirim oluşur. parçacıklar fagosom adı verilen bir hücre içi bölüm degradasyona uğrar. nötrofil NADPH oksidaz, izoform NoX2, aktivasyonu patojenin ölümü ile sonuçlanacak biyokimyasal reaksiyonların kaskadını başlatır. NoX2 protein alt-birimleri phagosomal membran 3 bir elektron taşıma zinciri kompleksi oluşturmak üzere devam eder. Bir kez süperoksit anyon ve diğer reaktif oksijen türleri üreten fagozomun içinde moleküler oksijene membran boyunca NADPH'den elektrota nakleder, aktive edildi. Bu solunum patlaması olarak bilinir ve verimli mikrobiyal öldürme ve sindirim 2 için gerekli olduğu düşünülmektedir </sup>. o pozitif yük tarafından hareket ve / veya negatif yükü fagozomun dışına hareket telafi olmasaydı Ancak, zar boyunca negatif yük bu özel hareketi yakında NoX2 inaktive edecek. İyi nötrofil şarj telafi çoğunluğu proton kanalı HVCN1 4, 5 ile gerçekleştirilir olduğu tespit edilmiştir. Bu kanal fagozomun sitosolda kendi elektro-kimyasal gradyana aşağı proton pasif hareket edebilmesini sağlar. Proton konsantrasyonunun pH tarafından yansıtılan, yani, oksidaz aktivitesinin, belirli bir seviyesi için, fagozomun pH derecesi ölçülerek şarj telafi protonik olmayan protonik yollarının nispi katılımı hakkında bilgi sağlayabilir.
İnsan nötrofil fagosom fagositozu 5 sonra yaklaşık 8.5 20-30 dakika süreyle bir alkalin pH'a sahiptir. Bu NOX ek olmayan proton iyon kanallarının varlığını imagözlenen aksine, asidik bir ortam sağlamak olur füzyon ve HVCN1 ile asidik granüller ve taban tazminat içeriklerini serbest bırakacak şekilde, yük dengeleme 2 ile indüklenen. iyon hareketi de ozmoz ile fagosom boyutunda değişiklik gösterebilirler, bu negatif bir yükü dengelemek için. Yüksek fizyolojik konsantrasyonlarda nötrofil mevcut Bu maddeler iyonları potasyum iyonları fagozomun 6 taşınmak gösterilmiştir ve klorür iyon hareketi nötrofil fonksiyonu 7 için önemli başka bir adaydır.
Fagozomun pH düzenlenmesi antimikrobiyal proteaz aktivitesi 5 için hayati önem taşımaktadır. Miyeloperoksidaz (MPO), katepsin G ve elastas için, optimal seviyeler 5, sırasıyla, pH 7-9 ve pH 8-10 iken, pH 6'da en iyi aktiviteye sahip gibi görünmektedir. Bu nedenle, phagosomal pH geçici değişim eğlence farklı enzimler için etkinlik niş sağlayabilirction. pH, nötrofil mikrobiyal öldürmede rol ne anlama yeni nötrofil artırmada mikrobik maddelerin tasarımı için yararlı bilgiler sağlayabilir.
nötrofil fagosom oldukça reaktif bir ortamdır. boyalar kolayca okside edilebilir, çünkü bu teknik yapay yol açan, tam olarak pH değerlendirmek zor hale getirir. Tarihsel olarak, flöresin izotiyosiyanat (FITC), hücre içi pH 8, 9 ölçmek için tercih edilen bir boya olmuştur. Bununla birlikte, nötrofil phagosomal pH ölçümü olarak kullanımı için bazı dezavantajları da vardır. O, pH <8 11, doyurur olarak sadece doğru, 5 ila 7,5 ila 8 pH seviyelerini değerlendirmek için de kullanılabilir, yani 6.4 10 bir pKa değerine sahiptir. Nötrofil phagosomal pH daha bazik 5 olmak üzere, FITC potansiyel pH değişiklikleri dizi yakalayamaz. Bir başka özellikleri önemlinötrofillerin bağlamında FITC ile can sorun MPO 12 tarafından photobleached düşünülmektedir olmasıdır. MPO inhibitörü, sodyum azid, 13 ışıkla ağartma sınırlamak için kullanılabilir, fakat sodyum azid ile doğrudan bir MPO bağımsız bir şekilde phagosomal pH'ı düşürür ve bu tür deneylerde 5 kullanılmak için bu şekilde uygunsuz olduğu gösterilmiştir.
Diğer hücre içi boyalar ile karşılaştırıldığında, S-1 7.5 10, nispeten yüksek bir pKa değerine sahiptir. asidik koşullarda, molekül protonlanır ve 488 nm veya daha uyarıldığı zaman 560 ve 600 nm arasında bir emisyon sinyali üretir. molekül daha alkalin koşullarında deprotone edildiğinde, emisyon dalga boyu 600 nm üzerindedir. Bu fluorofor konsantrasyonu ve hücre yapısı etkilenmez, bu iki dalga boyunda floresan yoğunlukları bir oran, daha fazla tek fluoresans ölçümleri daha güvenilir olduğu emisyon kayması gösterir. Isı-ölümlü (HK), Candida albicans, tercih edilmesine rağmen, daha büyük bir yüzey alanı daha tutarlı bir floresans okuma verir S-1, örneğin zimosan 14 olarak, bir antijene konjuge edilebilir.
Ayrıca (Şekil 3) 5 pH geçici değişiklikler incelemek için bu metodun bir modifikasyonu kullandık. Daha alkali fagozomların 14 başka bir yerde 15, 16, ve hücreleri için anlatılan şekilde sitosolik pH ölçümü için bu yöntem kolayca diğer hücre tipleri de uygulanabilir.
Uygun reaktifler, mikroskop ayarları ve kalibrasyon deneyleri ayarlandıktan sonra, bu yöntem gerçekleştirmek için oldukça basittir. Kritik adımlar şunlardır: S-1 Candida etiketleme kalibre ve görüntü analiz, boyanın herhangi bir aşırı yükleme olduğundan emin olmak için.
S-1, nötrofilin 21 için özellikle önemlidir, fakat belirli hücre tipleri kullanılmasını kısıtlar daha alkalik pH ortamlarında uygun bir reaktif,. Makrofaj fagozomların, SNARF-4, ya da S-4 daha fazla asidik ortamlarda, için, çünkü bunun düşük pKa değeri 22 daha uygundur. Ayrıca, daha doğru bir sitoplazmik okumaları için, floresans oranları pH 6'nın altında platoya (Şekil 3) başlaması gösteren S-1 için bir standart eğri olarak, S-4 kullanımı daha iyidir. Diğer boyalar, örneğin, 2' , 7'-bis- (2-karboksietil) -5- (ve-6) -Carboxyfluorescein (BCECF) ya da pHrodo Kırmızı da cont daha uygun olabilirasidik olması beklenen dahili. Yine sitoplazma boyama hala Candida içeren fagozomların doğru tanımlanması için gereklidir.
Bir phagosomal pH göstergesi önemli bir özelliği geri dönüşü olmayan reaktif phagosomal ortamı tarafından değişmez olmasıdır. S-1 nötrofil ortamda dayanıklı olduğu görülmektedir. Bu Levine ve diğerleri tarafından gösterilmiştir. – / – nötrofil 5, bir Hvcn1 fagositozunu ve bir S-1-işaretli Candida parçacık daha sonra tahliye edilmesini göstermektedir (referans 5 Ek video 4). fagosite zaman, partikül (alkali pH nötr) kırmızı, sarı / turuncu döner, fakat partikül nötrofil tarafından serbest bırakılır, bunun orijinal rengine geri döner.
S-1 kullanımıyla ilgili sınırlamalar bazı bahsetmek önemlidir. Bu boya rasyometrik ÖLÇÜMÜ sağlayan iki emisyon spektrumunu sahip olmasıkullanan akan bir avantajdır, ancak uzman ekipman görüntüleri elde etmek için gerekli olan; Deneylerde kullanılan mikroskop iki resim aynı anda ya da önemsiz bir zaman gecikmesiyle kayıt gerekir. Yazarlar, bu protokol çalışırken araştırmacı konfokal mikroskopi kullanılarak tecrübeye sahip ya da eğitimli profesyonel erişimi olduğunu varsayalım. onlar her mikroskop için farklıdır ve araştırmacı tarafından optimize edilmesi gerekecektir gibi tüm spesifik mikroskop parametreleri listeler olamaz. boya hücre sitoplazmasına yayılmasını sağlayan S-1 konjüge asetoksimetil ester, flüoresan molekül oluşturmak üzere hücre sitoplazmasında spesifik olmayan esterazlarla parçalanır. Alkali fosfataz gibi esterazlar, hücre kültürü ortamı olarak desteklenmesi için kullanılır insan serumu ve fetal sığır serumu içinde mevcut bulunmaktadır. Bu duruma göre, hücreler, G-1-AM (bakınız bölüm 4.5) ile yüklü olan orta serum içermemelidir. Daha besin Ric gerektiren hücreleri kullanılarak, bu da zor olabilirh ortamı bu protokol boyunca kullanılan dengelenmiş tuz çözeltisi daha onları sürdürmek için. Benzer bir şekilde, örneğin fenol kırmızı gibi diğer floresan ortam bileşenleri, S-1 ölçümlerine müdahale edebilir.
Şekil 3 'de hata çubukları, her pH değerinde oranı ölçümleri bazı değişiklikler olduğunu göstermektedir. Her bir deney tekrarları bir uygun sayıda (en az n = 3) ve her biri tek bir deneyde çok sayıda bireysel ölçüm arası koful varyasyonunu yenmek için ihtiyaç vardır. En az 100 her bir durum için fagozomların ve sadece bir Candida içeren görünen kadar phagosomal alanlarında pH ölçümü böylece tavsiye edilir. Fagozomların tamamen (yani, bu tamamen sitoplazma ile çevrili) bir Candida parçacık sardı sahip olanlar olmalıdır miktar tayini için ölçülecek. kantitatif için hücreler / fagozomların seçiminde kasıtsız önyargılara karşı azaltmak için, tüm analizler sırasında yapılmalıdırdeneysel koşullara kör.
Burada, bir yoğunluk gradyanı yoluyla plazma tabakanın ardından santrifüj tam kan dekstran sedimantasyonu ile nötrofillerin izolasyonunu tarif eder. hızlı ve verimli bir şekilde nötrofil saf (>% 95) populasyonunu gibi diğer yoğunluk gradyan formüller ya da antikor ya da manyetik ile uzman kitleri kullanılarak nötrofiller negatif seçim yoluyla tam kan merkezkaç olarak kullanılabilen diğer yöntemler vardır, ancak biz, bu tekniği kullanmak boncuklar. Ancak, ikinci rutin nötrofiller izole çoğu grup için pahalı olabilir. Diğer araştırmacılar, etilendiamintetraasetik asit (EDTA) ya da asit sitrat, sodyum (ACD) ile daha alışkın oysa Ayrıca, kan toplama tüpü içinde pıhtılaşma önleyici heparin kullanılır. Seçim için pek çok farklı yöntem vardır gibi, araştırmacının kişisel tercihinize kalmış.
Ayrıca,nötrofilleri izole edilmesi ve manipüle zaman aşırı aktivasyonu engellemek için bir dikkatle ele alınmalıdır. Önlem adımlar şunları içerir: tek bir plastik ürünleri kullanılarak, bir cam; filtre-sterilize kontamine endotoksin ayırma tüm tamponları; ne zaman iplik nötrofiller santrifüj aşırı titreşimi önlemek dengeli olduğundan emin olun; Zaman nötrofil santrifüj işleminden sonra topak kalır mümkün olduğu kadar azaltmak; Birden fazla, 5 x 10 6 / mL çözelti nötrofilleri muhafaza etmez; ve tecrit sonra mümkün olan en kısa sürede denemeyi gerçekleştirmek.
Kalibrasyon adımları için tarif edildiği gibi bu yöntem, mikroskop, 37 ° C'ye kadar ısıtılmış bir sahne seti kullanılarak ve aynı pozisyonda bir kez, her 30-60 s anlık alınarak zamanla pH'ı ve phagosomal alanı değişiklikleri ölçmek için adapte edilebilir. Aynı zamanda, teorik olarak, 96 gözlü plakalar içinde daha yüksek verimli deneyler için uyarlanabilir ve Akış sistometri deneyleri için, burada S-1 canpH indikatörü 23 olarak kullanılabilir. Ancak bu ortamlarda, bireysel hücre aktivitesi üzerine vurgu hücre popülasyonu üzerinde daha global bir etkisi ile değiştirilir.
Bu yöntem, bireysel araştırmacılar kendi ilgi alanı uyacak şekilde adapte edebileceğiniz bunun üzerine nispeten basit bir deney düzeneği sağlamayı amaçlamaktadır. Araştırmacılar, aynı zamanda, örneğin, hücre içi kalsiyum konsantrasyonu için, diğer iyonlar hareketinin ölçülmesine iken nötrofil phagosomal pH ve keşfetmek isteyebilir. Örneğin Indo-1, aynı zamanda, 400 ve 475 nm 24 ° C'da iki emisyon spektrumunu olduğu gibi konfokal mikroskopi için hazır çok sayıda floresan Ca2 + göstergeler vardır. Bu emisyon dalga boylarında, S-1 emisyon spektrumu ile üst üste, ama eksitasyon dalga boyu hücrelere zarar olabilir spektrumu, bir ultraviyole (UV) ucunda, bir UV lazer tüm mikroskoplar olağan değildir. Farklı göstergelerin kapsamlı bir incelemesiölçmek hücre içi kalsiyum akısı Takahashi ve arkadaşları tarafından kaplanır. 25 ve Hillson ve diğ. 26.
Sonuç olarak, Nunes ve diğerleri gibi farklı floresan boyalar kullanarak phagosomal pH ölçmek için uygun başka yöntemler de vardır. 13 gibi diğer gruplar 27, 28 gösterilmiştir. Diğer araştırmacılar da sitosolik pH 29 veya phagosomal pH 14 ölçmek için S-1 kullanılmıştır. – / – Bununla birlikte, bu protokol, aynı zamanda phagosomal kesit alanı değişiklikleri gözlemlemek ve vahşi tipte ve Hvcn1 ayırt fırsat sağlar sitozol ve fagozomun hem de pH, ölçme benzersizdir fare nötrofiller ile ve olmadan insan nötrofil NADPH oksidaz çalışma.
The authors have nothing to disclose.
Bu çalışma nazik Wellcome Trust, Biyoteknoloji ve Biyolojik Bilimler Araştırma Konseyi ve Irwin Joffe Memorial Kardeşliği tarafından finanse edildi.
Candida albicans ATCC 10231 Vitroids 80 CFU | Sigma-Aldrich | RQC14003-10EA | Place directly on a spread agar plate according to the manufacturer's instructions |
YPD broth | Sigma-Aldrich | Y1375 | Follow manufacturer's instructions, various providers exist |
Dextran Clinical grade MW = 200,000-300,000 | MP Biomedicals | 2101514 | Use gloves |
Heparin Sodium solution for infusion (preservative free), 1,000IU/ml | Fannin, Wockhardt UK Ltd | FP1077 | We purchased from UCH inpatient pharmacy |
SNARF-1 Carboxylic Acid, Acetate, Succinimidyl Ester – Special Packaging | Thermo Scientific/Invitrogen | SS22801 | Use gloves |
5-(and-6)-Carboxy SNARF-1, Acetoxymethyl Ester, Acetate | Thermo Scientific/Invitrogen | C1272 | Use gloves |
Vivaglobin human IgG 160mg/ml solution | CSL Behring | received as a gift | Various providers exist |
Normal mouse serum | Abcam | ab7486 | Various providers exist |
Lymphoprep (density gradient medium) | Alere Ltd | 1114547 | Keep sterile and away from direct sunlight, can be substituted by Ficoll-Paque |
Nigericin | Sigma-Aldrich | N7143 | Toxic, use gloves, various providers exist |
Saponin | Sigma-Aldrich | 47036 | Toxic, use gloves, various providers exist |
Dimethyl sulphoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | Toxic, use gloves, various providers exist |
4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid (HEPES) | Sigma-Aldrich | H3375 | Various providers exist |
Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris) | Sigma-Aldrich | T1503 | Various providers exist |
Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9333 | Various providers exist |
Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S7653 | Various providers exist |
Magnesium chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | M8266 | Various providers exist |
Magnesium sulphate (MgSO4) | Sigma-Aldrich | M7506 | Various providers exist |
Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P9791 | Various providers exist |
Calcium chloride (CaCl2) | Sigma-Aldrich | C1016 | Various providers exist |
Glucose | Sigma-Aldrich | D9434 | Various providers exist |
Absolute Ethanol | Sigma-Aldrich | 2860 | Various providers exist |
Diphenylene iodonium (DPI) | Sigma-Aldrich | D2926 | Various providers exist |
Zinc chloride | Sigma-Aldrich | 208086 | Various providers exist, do not dilute in phosphate based buffers as it will precipitate |
Poly L lysine | Sigma | P4707 | Various providers exist |
Laser scanning confocal microscope (Zeiss LSM 700) | Carl Zeiss | The microscope must be able to excite at 555nm and measure emission at two channels simultaneously (560-600nm, >610nm) | |
Ibidi µ slide 8 well ibiTreat | Thistle Scientific | IB-80826 | Other appropriate imaging dishes can be substituted |
Fluorodish Cell Culture Dish-35mm, 23mm well | World Precision Instruments | FD35-100 | Other appropriate imaging dishes can be substituted, different sizes are available |
Soniprep 150 | MSE | Any appropriate sonicator will suffice | |
TC20 Automated Cell Counter | BioRad | Various providers exist | |
1.5ml Protein LoBind Tubes | Sigma-Aldrich | Z666505-100EA | Specially used as Candida can stick to normal eppendorfs |