Temporal Bestilling av Dynamic Expression data fra Detaljert Spatial Expression Maps

Introduction

Somites er de første segmentene dannet i forlengelse kroppens akse for å utvikle virveldyrarter og er forløperne av ryggraden, ribber, og dermis vev, så vel som av muskel og endotelceller. Under somitogenesen, epitelceller somites danne fra unsegmented presomitic mesoderm (PSM) (anmeldt i Referanse 1). Denne prosessen reguleres av "segmentering klokke", som består av et nettverk av oscillerende gener og proteiner, for det meste som tilhører den Notch signalveien. Den segmentering klokken består av ulike negative tilbakemeldinger looper, som gjør det pulserende produksjon av Notch aktivitet innenfor en enkelt celle ² (anmeldt i Referanser 3-6). Mens den intracellulære fremgangsmåte for oscillasjonen er godt karakterisert, er det likevel i stor grad ukjent hvordan disse oscillasjoner er koordinert på tvers av PSM vev. Det har nylig blitt vist, gjennom både eksperimentelle og teoretiske studier, at disse svingninger er essensielle ingredienserl til prosessen med somitogenesen og at Notch veien spiller en avgjørende rolle i prosessen med både segmentering og svinge genekspresjon ^{7, 8.} Men det har vært mye rapportert at Notch-reseptor 1 (Notch1) og Delta-lignende ligand (DLL) -1 har statiske gradienter i PSM ^{9, 10, 11.}

Vi antok at Notch-avhengige svingninger av PSM segmentering klokke avhengig av den periodiske aktivisering av hoved hakk sti-reseptor og ligand, Notch1 og Dll1, henholdsvis på tvers av mus PSM. Konklusjonene fra tidligere studier som rapporterte et statisk rostrokaudale gradient av disse proteiner var på grunn av, vi forutsi, til en mangel på sensitivitet i immunofarging teknikker. De var derfor ikke kunnet lavnivå svingninger Dll1 og Notch1 i hale PSM.

Vi hare utviklet en metode for nærmere å undersøke disse faktorene, som kombinerer eksperimentelle data med matematiske modeller for å forutsi en mekanisme ved hjelp av hvilken svingninger av proteinene i klokke komponenter er samordnet på tvers av PSM ^12.

Det overordnede målet med denne metoden er å oppdage og kvantifisere lavt nivå, dynamisk protein uttrykk i PSM og å kartlegge uttrykk profiler av proteiner av interesse i henhold til uttrykk av det kjente klokke genet, Lunatic frynser (Lfng). Siden en syklus av segmentering klokken i museembryo tar to timer å fullføre, er forskjellige prøver som kreves for å bygge en komplett spatiotemporal profil Dll1 og Notch1 protein uttrykk i løpet av en Lfng svingning i PSM. Vi har derfor utviklet denne protokollen for å tillate høy gjennomstrømming påvisning av lavt nivå protein uttrykk i hel-mount, kontralaterale PSM explants. Imidlertid kan denne teknikken også være nyttig for studier tlue tar sikte på å karakterisere lavnivå protein dynamikk innenfor enhver embryonale vev som kan deles inn i kontralaterale halvdeler.

Protocol

Alle forsøkene ble utført under prosjektet lisensnummer 6004219 i streng overholdelse av Dyr (vitenskapelige prosedyrer) loven av 1986 og de britiske hjemmekontoret Codes of Practice for bruk av dyr i vitenskapelige prosedyrer.

1. PSM Eksplantering Dissection

1. Skaff halen vev fra embryoer produsert av tidsbestemt parring av villtype (CD1) mus ^13. I korthet, ved embryodag (E) 10,5, avlive den gravide donor mus i en karbondioksyd kammer. Høste livmor horn og legg den inn 1x steril fosfatbufret saltvann (PBS) løsning i henhold til hjemmekontoret lisensrutiner eller tilsvarende lokale regler. Overfør livmorhornet til en vevskulturskål inneholdende friskt, sterilt PBS. Utfør alle etterfølgende disseksjon trinnene i denne løsningen.
2. Under en stereomikroskop, klippe den tykke muskuløse membran av livmorhorn bruker buede saks og pakke hver embryo forsiktig med fin pinsett. Ha det fintfor å sikre at halen vevet beskadiges ikke i denne prosess. Ved hjelp av buede saks og fin pinsett, dissekere bort fostersekken fra hvert embryo, tar seg ikke å skade fosteret.
3. Bruk enten en kirurgisk nål eller buet saks for å høste halen vev av hver embryo ved å skjære fosteret posterior til de bakre lem knopper.
4. Balanse halen vev ventral siden ned ved hjelp av både tang og en nål. Generere par av PSM explants fra hvert embryonale tail av dissekere halen vevet inn i to halvdeler langs midtlinjen; utføre en myk, vuggende bevegelse med en nål. Sørg for at nevralrøret, ryggstreng, og PSM vev er likt fordelt mellom de to explants.
5. Pipette hver kontralaterale PSM eksplantat på undersiden av en 35 mm-plastkulturskål lokk i et lite volum av forvarmet (37 ° C) kulturmedium (DMEM-F12 + 0,1% L-glutamin erstatning supplert med 10% føtalt kalveserum , 10 nM human bFGF, og 1% penicillin / streptomycin).
<li> Sett fatet på toppen av lokket og raskt å invertere det slik at PSM vev er opphengt i lokket i en "hengende dråpe" av medium. Culture PSM eksplantater i et fuktet kammer ved 37 ° C i 1 - 2 timer.
6. Overfør par av PSM eksplantater til individuelle brønner i en 24-brønners vevskulturplate. Inkuber i 4% paraformaldehyd i PBS i 1 time ved romtemperatur (RT) eller 4 ° C over natten (O / N). FORSIKTIG: Paraformaldehyde er giftig, og nødvendige sikkerhetstiltak må tas når du arbeider med denne løsningen.
   MERK: Utfør alle påfølgende vasking og inkubering trinnene i en 24-brønns vevskultur plate.
7. Vask prøvebrønnene i PBS ved romtemperatur på en gyngende plattform ved hjelp av en fin plastisk Pasteur pipette for å utveksle den PBS-oppløsning på prøvene i frisk PBS 3 - 4 ganger. Behandle en PSM eksplantat fra hvert par ved hjelp av immunhistokjemi (trinn 2) og den andre ved hjelp av fluorescerende in situ hybridisering for en kjent klokke gen (step 3).

2. Immunohistokjemi av PSM explants

1. Vask en PSM eksplantat fra hvert embryonisk par generert i trinn 1 i 2% Triton X-100 i PBS i 1 time ved romtemperatur på en gyngende plattform, og deretter skylle prøvene kort i PBS. Erstatte PBS på prøvene med blokkeringsløsning (2% bovint serumalbumin (BSA) og 10% normalt geiteserum (NGS) i PBS + 0,1% Tween-20) og inkuber O / N ved 4 ° C på en gyngende plattform.
   MERK: Alle etterfølgende vasker og ruge trinnene i denne delen må utføres ved romtemperatur på en gynge plattform, med mindre annet er oppgitt. Vask løsninger kan enkelt endres ved hjelp av en tynn plast eller glass Pasteur pipette.
2. Fortynn de ønskede primære antistoff / antistoffer i arbeids buffer (0,1% BSA, 0,3% NGS, og 0,2% Triton X-100 i PBS). I dette eksempelet fortynne Dll1 og Notch1 antistoffer 1:25 i arbeids buffer.
   MERK: Optimalisering vil være nødvendig for å finne riktig fortynningsfaktoren kreves i this trinnet hvis alternative antistoffer blir brukt.
3. Inkuber eksplantater i antistoffløsning i 3 - 5 dager ved 4 ° C på en gyngende plattform. Sørg for å inkludere noen prøver med arbeider buffer som inneholder ingen primær antistoff til å opptre som sekundære antistoffkontroll.
4. Gjenopprette den primære antistoffet løsningen i en 1,5 ml lagring røret ved hjelp av en pipette og lagre det ved 4 ° C.
   MERK: Gjen primære antistoff kan benyttes flere ganger, avhengig av antistoffet som brukes.
5. Utføre 2 vaskinger av prøvene i 5 - 10 minutter hver i PBS, etterfulgt av 3 vaskinger i 10 minutter hver i 2% Triton X-100 i PBS ved romtemperatur på en gyngende plattform.
6. Fortynn fluorescerende merkede sekundære antistoff / antistoffer (epitop avstemt til det primære antistoff / antistoffer brukt) i arbeids buffer. Eventuelt tilsettes 20 ug / ml Hoechst 33342 til denne løsningen for å counterstain kjernene.
   MERK: Optimalisering kan være nødvendig for å finne riktig fortynningsfaktoren nødvendig i dette trinnet. I denne example, en fortynningsfaktor på 1: 400 ble vanligvis brukt.
7. Sentrifuger det sekundære antistoffoppløsning i 10 minutter ved 16 x g for å forhindre dannelse av antistoff-aggregater. Tilsett 250 - 500 mL av det sekundære antistoff løsning til hver prøve godt, tar seg ikke å bruke de siste par mikroliter av løsningen, som kan inneholde antistoff aggregater.
8. Dekk prøven plate med aluminiumsfolie for å minimalisere lyseksponering og prøvene inkuberes i den sekundære antistoffoppløsning i 3 - 5 dager ved 4 ° C i mørket.
9. Før prøvemonterings, vaskes prøvene to ganger i 10 minutter hver i 0,1% Tween-20 i PBS (PBST), og en gang i 5 minutter i PBS ved romtemperatur på en gyngende plattform (se trinn 4).

3. Fluorescent In Situ Hybridisering (FISH) av PSM explants

1. Hvis den lagres i en annen beholder, å overføre de gjenværende kontralaterale PSM eksplantater til de individuelle brønner i en 24-brønners vevkulturplate.
2. Vask prøvene etter10 min i 50% etanol i PBST, og deretter utføre 2 vasker i 10 minutter hver i 100% etanol på en gyngende plattform ved RT for å dehydratisere vev.
   MERK: Alle etterfølgende vasker og ruge trinnene i denne delen må utføres ved romtemperatur på en gynge plattform, med mindre annet er oppgitt.
3. Rehydrere vevet ved vasking i 10 minutter i 50% etanol i PBST, fulgt av vasking to ganger i 5 minutter hver i PBST.
   MERK: Trinn 3,2 og 3,3 er nødvendige feste skritt som kreves for denne protokollen og kan ikke utelates.
4. Inkuber prøvene med 10 ug / ml proteinase K i 0,1% Tween-20 i PBS (PBST) i 5 minutter uten omrøring. Raskt fjerne den proteinase K og skyll prøvene kort med PBST før post-feste vevet i 30 min i 4% formaldehyd + 0,1% glutaraldehyd i PBST. FORSIKTIG: Både formaldehyd og glutaraldehyd er giftige, og nødvendige sikkerhetstiltak må tas når du arbeider med disse løsningene.
   MERK: Følgende vaskog inkubasjons-trinn som involverer 50% og 100% hybridiserings-blandinger (trinn 3.6 til 3.9) skal utføres uten omrøring.
5. Etter vasking av prøvene to ganger i 10 minutter hver i PBST, vaskes prøvene en gang i 50% hybridisering blanding (egnet for intronic prober: 50% formamid, 5x saltvann-natriumcitrat (SSC), 5 mM EDTA, 50 ug / ml tRNA, 0,2% Tween-20, 0,1% SDS og 100 ug / ml heparin) i PBST fremstilt ved RT. Inkuber prøvene i denne løsningen i 10 minutter ved 65 ° C uten omrøring.
6. Skyll prøvene to ganger med forvarmet (65 ° C) hybridiseringsblandingen før inkubering av prøvene i hybridiseringsblandingen i ≥ 2 timer (inntil 48 timer) ved 65 ° C (lengre inkubasjonstider forbedre det resulterende signal-til-støy-kontrast) . Fjern hybridisering mix fra forrige trinn, og erstatte den med 0,25 til 0,5 ml forvarmet (65 ° C) hybridisering blanding som inneholder en digoxigenin (DIG) -merket anti-sense RNA probe mot en kjent segmentering klokke komponent.
   IKKEE: For eksempel ble en intronic ekstreme ytterkantene (Lfng (i)) probe som ble brukt ved en konsentrasjon på 20 pl / ml for å detektere begynnende Lfng mRNA. Den fortynning som brukes i dette trinnet er probe-avhengig og vil kreve optimalisering.
7. Tett plate ved hjelp av tape for å hindre fordamping og inkuber prøvene i sonden løsning for to netter på 65 ° C.
8. Ved hjelp av en tynn plast Pasteur pipette, gjenopprette sonden for gjenbruk og lagre det ved 20 ° C. Skyll prøvene to ganger med forvarmet (65 ° C) Etter hybridisering blanding (50% formamid, 0,2% Tween-20, og 1x SSC) før vasking av prøvene to ganger i 20 minutter hver ved 65 ° C i pre- varmet post-hybridisering mix.
9. Vask prøvene i 15 minutter ved 65 ° C i forvarmet 50% hybridisering blanding i 0,1% Tween-20 i Tris-bufret saltoppløsning (TBST). Skyll prøvene to ganger med TBST før vasking i 30 minutter ved RT i TBST på en gyngende plattform.
10. Pre-inkuber explants i blocking oppløsning (TBST + 2% blokkeringsbuffer reagens (BBR) + 20% varme-behandlede geiteserum) i minst 2 timer. Erstatte denne oppløsning med frisk blokkeringsløsning inneholdende en 1: 200 fortynning av pepperrot peroksidase (HRP) -konjugert anti-digoksigenin antistoff. Prøvene inkuberes i O / N ved 4 ° C.
11. Etter inkubering av antistoffet, skyll prøvene 3 ganger med TBST ved romtemperatur og overføre dem til individuelle brønner i en ny 24-brønners vevkulturplate. Vask eksplantater med TBST 3 ganger i 1 time hver.
12. På dette punktet, å overføre prøvene til 0,5 ml lagring rør eller de individuelle brønner i en 48-brønners vevskulturplate for å redusere det nødvendige volum av tyramide signalforsterkning (TSA) påvisningsreagenser i de følgende trinn.
13. Inkuber prøver i TSA amplifikasjon buffer (se reagenser liste) ved RT i 1 min uten omrøring å bruke så lite volum som mulig, slik at prøvene er fullstendig nedsenket i løsningen.
14. Legg TSA-reagens (sereagenser liste) til prøven forsterkning buffer ved en fortynning på 1:50. Raskt blande løsningen inntil TSA reagenset er jevnt fordelt, dekker platen eller rørene i aluminiumsfolie, og prøvene inkuberes i 60 - 90 min i mørket.
15. Fjern TSA forsterkning løsningen og vask prøvene i TBST 3 ganger i 5 minutter hver. Overfør explants tilbake til en 24-brønners vevskulturplate for å øke vaskevolumet og prøvene inkuberes i 1% hydrogenperoksyd i TBST i 1 time. Vask prøvene med TBST 3 ganger i 5 minutter hver, og deretter to ganger i 5 minutter hver med PBST før prøvemonterings (se trinn 4).

4. Prøvepreparering for Imaging

1. Fremstille en belastet adhesjon objektglass for hvert par eksplantat ved tilsetning av 0,12 mm tykk avbildningsavstandsstykker, som hindrer prøvene fra å bli knust ved tilsetning av et dekkglass. Fjern limet rutefly fra en overflate av en spacer og plassere den selvklebende siden ned på en glassplate, trykke på firmly å forsegle spacer til raset.
   MERK: For de resterende trinnene, forsøke å holde prøvene i dårlig lys eller i mørket for å unngå fotobleking. Pipettes eksplantering parvis mot en forberedt lysbilde ved hjelp av et glass Pasteur pipette i sentrum av avstandsholderen, slik at den dissekert siden av eksplantatet vender mot sleiden. Ordne kontralaterale par explants side ved side.
2. Fjern så mye væske som mulig fra raset ved hjelp av et glass Pasteur pipette og transportere ut all fuktighet rundt prøvene ved hjelp av et stykke av brettet lav-lint silkepapir.
3. La prøvene å følge lysbildet i 45 - 60 s, inntil vevet begynner å vises klissete og gjennomskinnelig. I løpet av denne tiden, må du fjerne de resterende limet rutefly fra avstands bruker tang. Ikke la prøvene å tørke ut.
4. Legg til en stor dråpe dobbeltfunksjon mountant og clearing-løsning (0,5% p-fenylendiamin og 20 mM Tris, pH 8,8, i 90% glycerol) til prøvene i centerav avstandsstykket. MERK: Denne løsningen blir brun / svart når det er tillatt å oksidere.
5. Nøye en sirkulær dekkglass (nr. 1.5) på tvers av prøvene, slik at den mountant er jevnt fordelt, og at alle kanter av dekkglass i kontakt med avstandsstykket. Plasser dekk gled lysbilde opp ned på noen lav-lint silkepapir.
6. Trykk hardt ned for å sikre at dekkglass fullt ut fester seg til avstandsstykket, og at eventuelt overskudd av mountant er fjernet. Gjenta til det ikke mer mountant blotter på papir.
7. Rengjør og merke lysbildet (e) på riktig måte, og lagre dem i mørket til bildebehandling, kortsiktig ved -20 ° C eller lang sikt ved -80 ° C. Etter å ha fjernet lysbildene fra lagring, tillate dem å fullt tine før bildebehandling.
8. Bilde de monterte prøver ved hjelp av en konfokal mikroskop med flislagt oppkjøp og høy forstørrelse objektiv. Bilde eksplantering parene med en 40X oljeneddyppingsobjektivet på 4-mikrometer z-intervaller ved hjelp av 488-nm, 568 nm og 647 nm laser lines å opphisse de grønne, røde, og langt-røde fluoroforer, henholdsvis ansatt for protein og mRNA deteksjon i denne studien ^12.
   MERK: Flislagt bildene ble sydd etter oppkjøpet for å danne et enkelt bilde for analyse.

5. Post-oppkjøpet bildeanalyse

1. Bruk bildeanalyse programvare til å definere et område av interesse innenfor PSM av hver eksperimentell prøve.
   1. For å kvantifisere uttrykk nivåer, subtrahere bakgrunn og terskel bilder til nivået av en ikke-primære kontrollprøve før etterfølgende kvantifisering. Definere en opprinnelse, en akse, og en enhetslengde for hver prøve.
2. Beregn fluorescens intensitet som en funksjon av posisjon langs den normaliserte rostro-kaudal aksen for hver av de M-sampler ^12. Etter normalisering intensitetsplottene, plassere belastningsprofiler ved siden av hverandre og skaffe en intensitet matrise f (i, j) som beskriver intensitet på I j ^th prøven.

6. Temporal Bestilling av prøver

1. Å antyde temp bestilling av en kjent klokke komponent, definere sin intensitet matrise. Deretter ordne kolonnene i matrisen intensitet slik at det oppnås en tidsmessig periodisk mønster. For å gjøre dette, definere funksjonen
   
   hvor A (f _j, k) representerer autokorrelasjonsfunksjonen av den j ^te kolonne av f og A _T er en mål-autokorrelasjonsfunksjon, valgt for å håndheve den temporale periodisitet av mønsteret, gitt av
   
2. Bruk Metropolis-Hastings (eller en annen minimeringsalgoritme) ¹² for å identifisere rekkefølgen av prøvene som minimerer funksjonen g. Dermed bestemme rekkefølgen avM prøver som maksimerer den time periodisitet av en kjent klokke komponent.
3. Bruke antatt time bestilling av M prøver, konstruere en ordnet kymograph for uttrykket mønster i samarbeid kanal ^12.

Representative Results

Denne protokollen tillater visualisering av tid og rom profil av et protein av interesse sammen med klokke gentranskripsjon i mus PSM ^12. For eksempel er Dll1 (figur 1 A-C) og Notch1 (figur 1D-F) proteinekspresjon vist seg å svinge ut av synkront med begynnende transkripsjon av Notch-regulert segmentering klokke-genet Lfng. Kvantifisering av Dll1, Notch1, og Lfng (i) signalintensitet i forhold til antero-posterior (AP) aksen av PSM (figur 1G) avslører store svingnings uttrykk dynamikk for slike mål (figur 1 H-J). Den spatiotemporal profilen til Dll1 og Notch1 protein uttrykk gjennom klokkesyklus er tydelig visualisert og kvantifisert ved hjelp av denne protokollen gjennom etter oppkjøpet bildeanalyse av høyoppløselige faste vev bildedata.

Figur 1: rom-tid-visualisering og Kvantifisering av Dll1 og Notch1 protein uttrykk Dynamics. (AF) Par av eksplantater fra seks embryoer E10.5 (AF) som viser den romlige fordelingen av Dll1 protein (AC) eller Notch1 protein (DF) i en halv sammen med påvisning av Lfng pre-mRNA (Lfng (i)) i tilsvarende motsatt halvdel av hvert par. Paneler er ordnet etter fase 1 (A og D), Fase 2 (B og E), og Fase 3 (C og F) av segmenterklokkesyklus, som bestemmes av den romlige profil Lfng (i) ekspresjon. Omfanget av uttrykket domener for Dll1 (grønn), Notch1 (rød), og Lfng (i) (grå) langs Antero-posterior aksen av PSM har been avgrensa av fargekodede barer. De stiplede linjene avgrense posisjonene av de sist dannede somitt (s), de ytre kantene av PSM, og den tilstøtende nervevev (C og E). Skala barer (nederst til venstre i hvert panel, AF) representerer 100 mikrometer. (G) Et eksempel intensitet plott som viser den aksiale variasjon i signalintensitet på tvers av PSM. Dataene er plottet fra to eksplantering par som viser Lfng pre-mRNA (sort kryptert linje) i en eksplantat sammenlignet med Notch1 protein (rød) i den kontralaterale eksplantatet (Embryo 1), så vel som Lfng pre-mRNA (sort heltrukket linje) i en annen eksplantering forhold til Dll1 protein (grønn) i kontralaterale eksplantering (Embryo 2). Målte signalintensitet (y-aksen) er plottet mot aksial posisjon (x-aksen; anterior PSM [A] til høyre og bakre PSM [P] til venstre). (H) A kymograph som viser den romlige fordelingen av Dll1, Notch1, og Lfng (i) på tversmange PSMS. Hver rad i kymograph representerer signalstyrken for et individ PSM eksplantering. Rader er anordnet i tidssekvens i henhold til den tid og rom fordeling av Lfng pre-mRNA (I) Den tid og rom fordeling av Dll1, Notch1, og Lfng (i) gjennom flere klokke oscillasjoner blir simulert ved periodisk utvidelse av dataene som er vist i (H) , fremhever svinge natur Dll1 og Notch1 uttrykk dynamikk. (J) Pulsatile Notch1 protein uttrykk i hale PSM er markert med forstørrelse av regionen avgrenset i den virtuelle kymograph vist i (I). Modifisert fra Reference 12. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2: Kvantifisering av rom-tid-Dynamics of Dll1 og Notch1 Protein Expression. (A) Et eksempel intensitet plott viser aksiale variasjon i signalintensitet på tvers av PSM. Data plottet fra to eksplantering par som viser Lfng pre-mRNA (sort kryptert linje) i en eksplantat sammenlignet med Notch1 protein (rød) i den kontralaterale eksplantatet halvdel, samt Lfng pre-mRNA (sort heltrukket linje) i en halv eksplantat fra en andre hale sammenlignet med Dll1 protein (grønn) i den kontralaterale eksplantatet halvdel av den andre halen. Målte intensiteter (y-aksen) er plottet mot aksial posisjon (x-aksen; rostralt [A] til høyre og kaudale [P] til venstre). (BH) Kymographs viser den romlige fordelingen av Notch1, Dll1, NICD, og Lfng (i) over mange PSMS. (B og C) NICD (B) og Dll1 (C) ekspresjon i PSM seksjoner; (D og E) Lfng (i) (D) og Dll1 (<strong> E) i kontralaterale eksplantering halvdeler; (F og G) Lfng (i) (F) og Notch1 (G) i kontralaterale eksplantering halvdeler. Fra Reference 12. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Discussion

Kritiske trinn i protokollen

Den nåværende protokollen beskriver en sensitiv metode for å utføre kvantitativ analyse av lavnivå protein expression og oscillasjon dynamikk i E10.5 mus PSM explants. En robust protokoll for både immunhistokjemi og fluorescerende in situ hybridisering (FISH) etterfølges av høyoppløselig hel-mount konfokal avbildning, og deretter ved bildeanalyse og tidsmessig segmentering av kymographs for å generere et kart over tid og rom protein ekspresjon på tvers av PSM. Et høyt signal-til-støy-forhold i protein og mRNA deteksjon er viktig for å sikre suksess for denne teknikken. Forsiktighet må utvises for å grundig utveksle alle løsninger effektivt under vasketrinnet og for å opprettholde temperaturen på 65 ° C vaskinger i de aktuelle trinn for trinn 3. Det er mest fordelaktig å ta seg tid til kilde effektive antistoffer og RNA-prober mot mål av interesse og for å teste disse reagensergrundig på hel-mount prøver før du starter denne protokollen.

Modifikasjoner og feilsøking

De viktigste spørsmålene som kan oppstå når du utfører denne protokollen oppstår fra dårlig signaldeteksjon styrke og kvalitet. Dette er i stor grad avhengig av effektiviteten av antistoffene eller RNA-prober anvendt for immunhistokjemi eller fisk trinnene i protokollen, respektivt. Et antall forskjellige trinn kan kreve optimalisering før tilstrekkelig signaldeteksjon er oppnådd. En vanlig årsak til dårlig signal deteksjon er feil fiksering; er det viktig at enten fersk PFA eller PFA lagret ved 4 ° C ikke lenger enn en uke blir brukt til å fikse prøvene. Lengden av fiksering kan også kreve optimalisering, avhengig av antistoffet eller RNA-sonde som ble brukt. For antistoffer, er det anbefalt å følge produsentens instruksjoner der det er mulig, mens for RNA-prober, anbefaler vi konsultasjon av publisert litteratur.

Lfng. På grunn av sin relative mangel på overflod, påvisning av Lfng pre-mRNA krever en lang periode med inkubering med sonden i hybridiseringen blanding inneholdende 5 x saltvann-natriumcitrat (SSC) for god signaldeteksjon. De samme forhold kan gjelde for andre sonder som gjenkjenner svakt uttrykt mRNA, men vår erfaring, kan påvisning av mer stabile mRNA mål krever en kortere probe hybridisering trinn og lavere SSC konsentrasjoner i hybridisering blanding (f.eks 1,3x SSC). For både immunhistokjemi og FISH, må protokollen først optimaliseres på hele embryoer, og den optimale konsentrasjon av antistoff eller sonde må bestemmes empirisk.

Begrensninger av teknikken

Som nevnt ovenfor, suksessen med denne teknikken er svært avhengig av kvaliteten på protein og mRNA deteksjon. We har skissert flere forslag til hvordan protein og mRNA deteksjon kan bli bedre, men i fravær av høy kvalitet fluorescerende signal deteksjon, er det ingen måte eksperimentet kan fortsette. Antallet av protein mål som kan analyseres i hver vevsprøve er begrenset av spektral oppløsning av det konfokale mikroskop og ved epitopene av antistoffene anvendt. I denne studien, var vi i stand til å bruke opp til tre epitoper for protein deteksjon sammen med en DNA flekk på hver prøve ^12. Denne protokollen tillater at kun påvisning av en mRNA-mål, selv om det aktuelle alternative metoder kan benyttes for å øke denne til opp til tre mål ^14.

Betydningen av Technique For eksisterende / alternative metoder

Metoden er beskrevet her gir en sensitiv metode for å påvise lavt nivå protein svingninger i hele montering PSM explants. Kvantifisering av disse dynamikkene ermulig ved å utføre FISH for en kjent klokke gen i tilsvarende kontralaterale explants. Et bibliotek av kymographs genereres som kan organiseres i løpet av en segmentering klokkesyklus, fremhever tid og rom uttrykk dynamikken i et mål av interesse innenfor denne tidsrammen. En viktig forskjell i denne teknikken over andre er bruken av beregnings automatisering til timelig bestille store datasett, som tillater tid og rom uttrykk dynamikken i nye klokke komponenter som skal analyseres på en objektiv måte. For eksempel, denne teknikken gitt innsikt i hvordan Dll1 og Notch1 proteiner og deres svingninger er co-regulert over hele PSM. Alternative metoder i denne sammenheng har også grunnlag farging, men de gjorde ikke oppdage de små svingninger i Dll1 og Notch1 proteinnivåer i hale PSM som var tydelig ved hjelp av denne metoden. I stedet, rapporterte de en jevn stigning av uttrykk som er sterkest i rostral regionen ^{9 10, 11.} Dette kan være på grunn av det faktum at denne protokollen er en omstendelig primært antistoff inkubasjonsperioden (3 - 5 dager, i motsetning til over natten), som kan være nødvendig for å påvise lave nivåer av protein. Som nivåer av Dll1 og Notch1 uttrykk er relativt høy i rostral PSM, kan dette ha påvirket forfatterne til bilde prøvene ved en lavere eksponering innstilling enn det som ville være nødvendig for å oppdage hale protein uttrykk. En ytterligere potensiell avvik oppstår fra bruken av ufiksert vev i studien av Chapman et al. , Der den forbigående uttrykk for Dll1 og Notch1 i hale PSM kan ha vært mindre godt bevarte ^9.

Fremtidige søknader eller Veibeskrivelse Etter å mestre teknikken

Når denne protokollen har blitt mestret, kan utføres med høy gjennomstrømming uttrykk analyse for noen protein av interesse i PSM.PSM eksplantater generert fra flere muse kull kan behandles samtidig for å generere den høye prøvenummer nødvendig for analyse. Selv om vi har bare brukt villtype-embryoer i disse studiene, er det mulig å utføre denne analyse ved anvendelse av genetisk modifiserte embryoer for å vurdere betydningen av en eller flere faktorer på protein expression dynamikk. Utover det PSM, kan denne protokollen tilpasses andre systemer som er sammensatt av to halvdeler kontralaterale og kan brukes til å detektere følsomt lavnivå proteinekspresjon og oscillerende dynamikk. Et eksempel hvor denne protokollen kan tilpasses er studiet av dynamiske proteinekspresjon i mus neural rør, ettersom kontralaterale halvdeler kan genereres og dyrket, og Notch-aktivitet har blitt vist å være både til stede og viktig for mønstring ^15. Vi oppfordrer andre grupper for å tilpasse denne protokollen til andre systemer, og å gi tilbakemeldinger for fremtidige forbedringer.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM-F12	Gibco (ThermoFisher Scientific)	11320033
GlutaMAX™-1 (100x)	Gibco (ThermoFisher Scientific)	35050
Fetal Bovine Serum, qualified, E.U.-approved, South America origin	Gibco (ThermoFisher Scientific)	10270106
Recombinant Human FGF-basic (154 a.a.)	Peprotech	100-18B
Penicillin/Streptomycin	Gibco (ThermoFisher Scientific)	15140122
anti-mouse monoclonal Notch1 antibody^	BD Pharmingen	552466
anti-rat polyclonal Dll1 antibody^*	N/A	N/A
Lfng intronic anti-sense RNA probe^*	N/A	N/A
16% paraformaldehyde	Pierce (ThermoFischer Scientific)	PI28908
Proteinase K, recombinant, PCR grade	Roche (Sigma-Aldrich)	31158
Phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4	Made in house	N/A
Triton-X 100	Sigma-Aldrich	T8787
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	5470
Normal goat serum (NGS) (heat-treated)	Gibco (ThermoFisher Scientific)	16210072
Hoechst 33342	ThermoFischer Scientific	H3570
Tween-20	Sigma-Aldrich	P9416
Ethanol	Sigma-Aldrich	46139
Glutaraldehyde	Sigma-Aldrich	340855
Formamide	Sigma-Aldrich	F9037
Saline-sodium citrate (SSC)	Sigma-Aldrich	93017
EDTA	Sigma-Aldrich	798681
tRNA	Roche (Sigma-Aldrich)	101095
Heparin	Sigma-Aldrich	H3149
Tris-buffered saline (TBS)	Made in house	N/A
Blocking Buffer Reagent	Roche (Sigma-Aldrich)	11096176001
anti-DIG horseradish peroxidase (HRP) conjugated antibody	Roche (Sigma-Aldrich)	11207733910
Tyramide signal amplification (TSA) kit	Perkin Elmer	NEL744001KT
*The Dll1 antibody and RNA probe used in this study are not commercially available. Please see acknowledgements for sources.
^Antibodies/RNA probes should be sourced which are applicable to the research interests of the reader.