Introduction
Somitlerin omurgalı türlerin geliştirilmesinde uzama vücut ekseni oluşturulan birinci segmentler ve omurga, kaburga öncüleri olan ve dermiş dokusu, hem de kas ve endotel hücrelerinin. somitogenesis sırasında, epitel Somitlerin (Referans 1 gözden) bölünmemiş presomitic mezoderm (PSM) den oluştururlar. Bu süreç çoğunlukla Notch sinyal yolunun ait, salınım genler ve proteinlerin bir ağ oluşur "segmentasyon saat," düzenlenir. Segmentasyon saat tek bir hücre 2 içinde Notch aktivitesinin pulsatil üretimini sağlayacak çeşitli negatif geri besleme döngüleri oluşur (Başvurular gözden 3-6). Salınım hücre içi yöntem iyi karakterize edilirken, bu salınımlar PSM doku boyunca koordine nasıl hala büyük ölçüde bilinmemektedir. Son zamanlarda bu salınımlar essentia olduğunu, hem deneysel ve teorik çalışmalar ile, gösterilmiştirÇentik yolunun somitogenesis sürecine ve l bölümleme ve salınımlı gen ekspresyonu 7, 8 her iki sürecinde önemli bir rol oynar. Ancak, yaygın olarak bu çentik reseptörü 1 (Notch1) ile rapor edilmiştir Delta benzeri ligandı (Dll) -1 PSM 9, 10, 11, statik gradyanlar sahiptir.
Biz PSM segmentasyon saatinin Notch bağımlı salınımlar fare PSM karşısında sırasıyla ana Notch yolu reseptörü ve ligand, Notch1 ve DLL1, periyodik aktivasyon bağlı olduğunu varsaydık. Bu proteinlerin statik rostral-kaudal degrade bildirdi önceki çalışmaların sonuçları biz immün teknikleri hassasiyet eksikliğinden dolayı, tahmin, bağlı idi. Onlar kuyruk PSM içinde DLL1 ve Notch1 düşük seviyeli dalgalanmaları tespit nedenle koyamadık.
Biz havE saat bileşenlerinin protein salınımlar PSM 12 arasında koordine edildiği bir mekanizma tahmin matematiksel modelleme ile deneysel verileri birleştirerek, daha yakından bu faktörleri incelemek için bir yöntem geliştirdi.
Bu yöntem genel amacı algılar ve PSM 'de düşük seviyede dinamik protein ekspresyonu miktarını ve bilinen saat genin ekspresyonuna göre ilgi konusu olan proteinlerin ekspresyon profillerini harita için, kanadını (Lfng). Fare embriyo içinde segmentasyon saatinin bir döngü tamamlamak için 2 saat sürer bu yana, çeşitli örnekleri PSM bir Lfng salınım sırasında DLL1 ve Notch1 protein ekspresyonu tam uzaysal profili oluşturmak için gereklidir. Böylece bütün montajlı düşük seviyeli protein ifadesi, kontralateral PSM eksplant yüksek verimlilik tespiti için izin vermek için bu protokolü geliştirdik. Bununla birlikte, bu teknik, aynı zamanda çalışma, sıcaklık için yararlı olabilirşapka kontralateral ikiye bölünebilir herhangi embriyonik doku içindeki düşük seviyeli protein dinamikleri karakterize hedefliyoruz.
Protocol
Bütün deneyler Hayvanlar (Bilimsel Prosedürler) 1986 Yasası ve bilimsel işlemlerde hayvanların kullanımı için Uygulama İngiltere Home Office Kodları sıkı sıkıya bağlı kalmanın proje lisans numarası 6004219 altında gerçekleştirildi.
1. PSM Eksplantasyon Diseksiyon
- Wild-tip (CD1) farelerin 13 zamanlı çiftleşme tarafından üretilen embriyolar kuyruk dokusu elde. Kısaca, embriyonik gün (D) 10,5, bir karbon diyoksit odasında hamile, verici bir fare euthanize. uterin boynuz hasat ve Home Office Lisans prosedürleri veya eşdeğer yerel kurallara uygun olarak 1x steril fosfat tamponlu salin (PBS) çözeltisi içine yerleştirin. Taze, steril PBS içeren bir doku kültürü çanak uterin boynuz aktarın. Bu çözümde sonraki tüm diseksiyon adımları uygulayın.
- Bir stereomikroskop altında, kavisli makas kullanarak uterin boynuz kalın kas zarı kesme ve dikkatle ince forseps kullanarak her bir embriyo ayıklayın. Kendine iyi bakkuyruk dokusu bu süreçte zarar görmediğinden emin olmak için. embriyoyu zarar vermemeye özen her embriyo amniyon kesesi uzak teşrih, kavisli makas ve ince forseps kullanarak.
- Arka bacak tomurcukları embriyo posterior keserek her embriyonun kuyruk dokusu hasat için bir cerrahi iğne veya kavisli makas kullanınız.
- forseps ve bir iğne her ikisini de kullanarak kuyruk dokusu ventral tarafı aşağı dengeleyin. orta hat boyunca ikiye kuyruk dokusu diseksiyon her embriyonik kuyruk PSM eksplant çiftleri oluşturmak; Bir iğne ile yumuşak sallanan hareketi gerçekleştirin. Nöral tüp, notokord ve PSM dokusu eşit olarak iki eksplant arasında bölünmüş emin olun.
- +% 0.1 L-glutamin yerine,% 10 fetal dana serumu ile takviye edilmiş, önceden ısıtılmış (37 ° C), kültür ortamı (DMEM-F12, küçük bir hacim içinde 35-mm plastik kültür kabı kapağının alt üzerine her karşı PSM eksplant Pipet 10 nM insan bFGF, ve% 1 penisilin / streptomisin). <li> kapağın üstüne çanak yerleştirin ve hızlı bir şekilde PSM doku ortamının bir "asılı damla" olarak kapağın askıya böylece onu çevirin. Kültür 1, 37 ° C'de nemlendirilmiş bir haznede lekelenmiştir PSM eksplantlar - 2 saat.
- 24 oyuklu doku kültür plakasının her bir gözeneğinden PSM eksplantlar devri çiftleri. gece boyunca, oda sıcaklığında (RT) ya da 4 ° C 'de 1 saat süreyle (O / N), PBS içinde% 4 paraformaldehid içinde inkübe edin. DİKKAT: Paraformaldehid toksiktir ve bu çözelti ile birlikte çalışan, uygun güvenlik önlemleri alınması gerekir.
Not: 24 oyuklu doku kültürü plakası sonraki tüm yıkama ve inkübasyon adımları. - 4 kez - Taze PBS 3 örnek üzerinde PBS çözeltisi alışverişi için iyi bir plastik pastör pipeti kullanılarak, sallanan bir platform üzerinde oda sıcaklığında PBS içinde numune kuyuları yıkayın. (Immünhistokimya (adım 2) ve bilinen bir saat geni için in situ hibridizasyon diğer kullanarak floresan kullanarak st her çiftten biri PSM eksplant SüreçEP 3).
PSM Eksplantlarından 2. İmmunohistokimya
- sallanan bir platform üzerinde oda sıcaklığında 1 saat boyunca PBS içinde% 2 Triton X-100, aşama 1 'de üretilen her embriyo çiftten bir PSM eksplant yıkayın ve daha sonra PBS içinde kısa bir süre örnekleri yıkayın. sallanan bir platform üzerinde 4 ° C de ve inkübe O bloke etme çözeltisi (PBS +% 0.1 Tween-20 içinde% 2 sığır serum albümini (BSA) ve% 10 normal keçi serumu (NGS)) / N numuneler PBS değiştirin.
NOT: Aksi belirtilmedikçe, bu bölüm içinde bulunan sonraki yıkama sıvıları ve inkübasyon adımları sallanan bir platform üzerinde oda sıcaklığında gerçekleştirilmelidir. Yıkama çözeltileri kolayca ince uçlu bir plastik ya da cam Pasteur pipet kullanılarak değiştirilebilir. - Çalışma tamponu içinde istenen birincil antikor / antikorlar seyreltilir (% 0.1 BSA,% 0.3 NGS ve PBS içinde% 0.2 Triton X-100). Bu örnekte, tampon çalışma DLL1 ve Notch1 antikorları 1:25 seyreltin.
NOT: Optimizasyon thi gerekli uygun seyreltme faktörünü belirlemek için gerekli olacaktırAlternatif antikorlar kullanılırsa s adımı. - sallanan bir platform üzerinde 4 ° C de 5 gün - 3 antikor çözeltisi içinde eksplantlar inkübe edin. Sekonder antikor kontrolleri olarak hareket etmek birincil antikor içeren tampon ile çalışan bazı örnekler şunlardır emin olun.
- bir pipet kullanılarak 1.5 mL depolama tüpünde birincil antikor çözeltisi elde etmek ve 4 ° C 'de muhafaza edin.
Not: Geri kazanılmış birincil antikor kullanılan antikora bağlı olarak, birçok kez kullanılabilir. - sallanan bir platform üzerinde oda sıcaklığında PBS içinde% 2 Triton X-100, 10 dakika her biri için 3 yıkama yapılmıştır PBS içinde 10 dakika her biri, - 5 Örneklerin 2 yıkama yapın.
- floresan etiketli ikincil antikor / antikorlar seyreltilir buferi (birincil antikora epitop eşleşen / antikorlar kullanılır). İsteğe bağlı olarak, çekirdek counterstain Bu çözeltiye 20 ug / ml Hoechst 33342 ekleyin.
Not: Optimizasyonu Bu aşamada gerekli uygun seyreltme faktörünü belirlemek için gerekli olabilir. Bu example, 1 bir seyreltme faktörü: 400, tipik olarak kullanılmıştır. - Antikor agregatların oluşumunu önlemek için 16 x g'de 10 dakika süre ile ikincil antikor çözeltisi santrifüjleyin. Antikor agregalar ihtiva edebilir çözeltisi son birkaç mikrolitre kullanmamaya dikkat ederek, her bir numune için ikincil antikor çözeltisinin 500 ul - 250 ekleyin.
- Karanlıkta 4 ° C'de 5 gün - ışığa maruz kalma en aza indirmek ve 3 ikincil antikor çözeltisinin örnekleri inkübe kalay folyo ile örnek plaka örtün.
- Montaj örnek PBS içinde% 0.1 Tween-20 içinde 10 dakika her biri (PBST) ile sallanan bir platform üzerinde oda sıcaklığında PBS içinde bir kez 5 dakika boyunca iki kez numune yıkama öncesinde (adım 4).
PSM Eksplantlarından Yerinde Hibridizasyon (FISH) 3. Floresan
- Alternatif bir kap içinde saklanması durumunda, 24 oyuklu doku kültür plakasının her bir gözeneğinden kalan karşı PSM eksplantlar aktarın.
- için numune yıkayın10 PBST içinde% 50 etanol içinde dakika, ve daha sonra doku kurutmak için oda sıcaklığında sallanan bir platform üzerinde 10 dakika boyunca% 100 etanol içinde her biri 2 yıkama yapar.
NOT: Aksi belirtilmedikçe, bu bölüm içinde bulunan sonraki yıkama sıvıları ve inkübasyon adımları sallanan bir platform üzerinde oda sıcaklığında gerçekleştirilmelidir. - PBST içinde her biri 5 dakika iki kez yıkanır, PBST içinde% 50 etanol içinde 10 dakika boyunca yıkama doku rehidrate.
NOT: 3.2 ve 3.3 bu protokol için gerekli sabitleme adımlardır ve ihmal edilemez adımları. - çalkalama olmaksızın 5 dakika boyunca PBS (PBST),% 0.1 Tween-20, 10 ug / ml proteinaz K ile inkübe edin. Hızla proteinaz K kaldırmak ve PBST% 4 formaldehit +% 0.1 gluteraldehit 30 dakika süreyle doku post-sabitleme kısa bir süre önce PBST ile örnekleri durulayın. DİKKAT: formaldehit ve glutaraldehit Hem toksik ve bu çözümler ile çalışırken uygun güvenlik önlemleri alınmalıdır.
NOT: Aşağıdaki yıkamave% 50 ve% 100 melezleştirme karışımları (3.6 adım - 3.9) içeren bekletme işlemleri çalkalama olmaksızın gerçekleştirilmelidir. - PBST içinde 10 dakika her biri için iki numune yıkandıktan sonra, intronik problar için (% 50 hibridizasyon karışımı bir kez uygun bir örneği yıkama:% 50 formamid, 5x salin sodyum sitrat (SSC), 5 mM EDTA, 50 ug / ml tRNA, % 0.2 Tween-20,% 0.1 SDS ve PBST içinde 100 ug / ml heparin) oda sıcaklığında hazırlandı. çalkalama olmaksızın 65 ° C de, 10 dakika boyunca bu çözelti içinde inkübe edin.
- 65 ° C'de (48 saat kadar) ≥ 2 saat boyunca melezleştirme karışımı örnekleri inkübe edildi önceden ısıtılmış (65 ° C) hibridizasyon karışımı ile iki kez numune durulayın (daha uzun inkübasyon süreleri, elde edilen sinyal-gürültü kontrastı arttırmak) . Önceki aşamadan elde edilmiş hibridizasyon karışımı çıkarın ve 0.25 ile değiştirin - önceden ısıtılmış 0.5 mL (65 ° C) digoksigenin (DIG) bilinen bir segmentasyon saat bileşenine karşı anti-sens RNA probu -etiketli ihtiva eden hibridizasyon karışımı.
DEĞİLE: Örneğin, bir intronik kanadını (Lfng (I) ') probu olgunlaşmamış Lfng mRNA tespit etmek için 20 ul / ml'lik bir konsantrasyonda kullanıldı. Bu basamakta kullanılan seyreltme prob bağlıdır ve optimizasyon gerektirir. - buharlaşmasını önlemek ve 65 ° C 'de iki gece prob çözeltisi örnekleri inkübe yapışkan bandı kullanarak plakayı kapatın.
- ince uçlu plastik Pasteur pipeti kullanarak, yeniden kullanım için prob kurtarmak ve 20 ° C'de saklayın. Ön 65 ° C de 20 dakika her biri için numuneler iki kez yıkanmasından önce, önceden ısıtılmış (65 ° C) olarak hibridizasyon sonrası karışımı (% 50 formamid,% 0.2 Tween-20 ve 1 x SSC) ile iki kez numune durulayın post-hibridizasyon karışımı ısındı.
- Tris-tamponlu tuzlu su çözeltisi (TBST) içinde% 0.1 Tween-20 içinde önceden ısıtılmış% 50 hibridizasyon karışımı içinde 65 ° C'de 15 dakika boyunca numune yıkanır. sallanan bir platform üzerinde TBST içinde oda sıcaklığında 30 dakika boyunca yıkanmasından önce TBST ile iki kez numune durulayın.
- blo eksplantlar önceden inkübecking çözeltisi (TBST +% 2 tampon reaktifi (BBR) +% 20 ısı ile muamele edilmiş keçi serumu engelleme), 2 saat içinde en az. 1 ihtiva eden taze bloklama çözeltisi ile değiştirin Çözüm: yaban turbu peroksidazı (HRP), 200 seyreltme, anti-digoksigenin antikor ile konjüge edilmiş. 4 ° C'de numunelerin O / N inkübe edin.
- Antikor inkübe edildikten sonra oda sıcaklığında numuneleri TBST ile 3 kez yıkayın ve yeni bir 24 oyuklu doku kültür plakasının her bir gözeneğinden aktarın. 1 saat için her TBST ile 3 kez eksplantlar yıkayın.
- Bu noktada, aşağıdaki adımlarda Tyramide sinyal amplifikasyonu (TSA) saptama reaktifleri gerekli miktarını azaltmak için, 0.5 mL 'lik bir depolama tüpler ya da 48 oyuklu doku kültür plakasının her bir gözeneğinden numuneleri aktarın.
- ajitasyon, mümkün olduğu kadar küçük bir hacim kullanılarak numuneler tam çözeltisine daldırıldığı emin olmadan 1 dakika için oda sıcaklığında TSA amplifikasyon tamponu örnekleri (reaktif listesine bakınız) inkübe edin.
- (bkz TSA reaktif ekleyin1:50 seyreltmede Örnek amplifikasyon tamponu reaktiflerin listesi). Hızla TSA reaktif eşit dağıtılmış kadar çözüm karıştırmak kalay folyo levha veya tüpler kapak ve 60 için örnekler inkübe - karanlıkta 90 dakika.
- TSA amplifikasyon çözüm çıkarın ve 5 dakika her TBST 3 kez numune yıkayın. 1 saat boyunca TBST içinde% 1 hidrojen peroksit örnekleri yıkama hacmini artırmak ve inkübasyona 24 oyuklu doku kültürü plakası geri eksplantlar aktarın. Her biri 5 dakika süreyle TBST ile 3 kez numune yıkanır ve sonra da iki kez 5 dakika boyunca, her PBST ile önceden monte örnek (adım 4).
Görüntüleme 4. Numune Hazırlama
- Bir lamel eklenmesi ile ezilmiş kalmasını engellemek 0.12 mm kalınlığında görüntüleme ara parçalar ekleyerek her eksplant çifti için bir ücret yapışma cam slayt hazırlayın. f presleme bir ara parçanın bir yüzeyine yapışkan astarını çıkarın ve bir cam slayt üzerine aşağı yapışkanlı tarafı yerirmly slayt ayırıcı mühür.
NOT: Kalan adımlar için, photobleaching önlemek için düşük ışık koşullarında veya karanlıkta örnekleri tutmak için çaba. eksplant disseke yan slayt karşı karşıya sağlanması, ara parçasının merkezi içinde bir cam Pasteur pipeti kullanarak hazırlanmış bir slayt üzerine Pipet eksplant çiftleri. yan eksplantlar yan taraf çiftleri düzenleyin. - Bir cam Pasteur pipeti kullanarak slayt mümkün olduğunca fazla sıvıyı çıkarın ve katlanmış az tüylü doku kağıt parçası kullanarak örnekleri çevreleyen herhangi bir kalıntı nemi fitil.
- Doku yapışkan ve saydam görünmesini başlayana kadar, 60 s - numuneler 45 slayt uymak için izin verin. Bu süre boyunca, forseps kullanılarak aralama kalan yapışkan astar çıkarın. Numuneler kurumasına izin vermeyin.
- merkezi içinde örnekleri (% 90 gliserol içinde% 0.5 p-fenilendiamin ve 20 mM Tris, pH 8.8,) Çift fonksiyonlu mountant ve temizleme çözeltisinin büyük damla eklemeara parçasının. NOT: okside izin Bu çözüm siyah / kahverengi döner.
- Dikkatle mountant eşit dağıtılmış olduğunu ve lamel tüm kenarlarında ayırıcı ile temas sağlanması, numuneler üzerinde dairesel bir lamel (no. 1.5) yerleştirin. baş aşağı bazı düşük tüy bırakmayan doku kağıt üzerine kapak astarlı slayt yerleştirin.
- Lamel tam ayırıcı yapıştığı ve herhangi bir aşırı mountant kaldırılır emin olmak için sıkıca bastırın. artık mountant lekeleri kağıt kadar tekrarlayın.
- Temiz ve uygun slayt (ler) etiket ve görüntüleme -20 ° C'de, kısa süreli ya da -80 ° C'de uzun vadede kadar karanlıkta saklayın. Depolama slaytları çıkardıktan sonra, onları tamamen görüntüleme önce çözülme sağlar.
- Görüntü kiremitli edinimi ve yüksek büyütme amacı ile bir konfokal mikroskop kullanılarak monte örnekleri. Görüntü 488 nm, 568 nm ve 647 nm lazer li kullanılarak 4 mikron z-aralıklarla 40X immersiyon yağı hedefi kullanarak eksplant çiftlerines, yeşil, kırmızı ve uzak-kırmızı fluorophores, sırasıyla, bu çalışmada 12 protein ve mRNA tespiti için kullanılan heyecanlandırmak için.
NOT: Çinili görüntüleri analiz için tek bir görüntü oluşturmak için alım sonrası dikişli bulundu.
5. Post-satın alma Görüntü Analizi
- Her deney numunesine ait PSM içinde ilgi bölgeyi tanımlamak için görüntü analiz yazılımı kullanın.
- sonraki ölçümü öncesinde no-birincil kontrol numunesinin seviyesine ifade seviyelerini, çıkarma arka plan ve eşik görüntüleri ölçmek için. bir kökeni, bir eksen, ve her bir numune için bir birim uzunluğu tanımlamak için kullanılır.
- M örnekleri 12 her biri için normalize Rostro-kaudal ekseni boyunca pozisyonun bir fonksiyonu olarak floresans yoğunluğunu hesaplar. Yoğunluk araziler normalize sonra, i de şiddetini tanımlayan bir yoğunluk matrisi f (i, j) yan yoğunluk profilleri yan yerleştirin ve elde
inci j mekansal pozisyon th> kadar.
Numunelerin 6. Geçici Sipariş
- Bilinen bir saat bileşeninin zamansal sipariş anlaması, onun yoğunluğu matrisi tanımlar. zamansal düzenli desen elde etmek üzere sonra, yoğunluk matris sütun yeniden. Bunu yapmak için, işlev tanımlayın
A (f j, k) burada f ve A T sütunun inci j otokorelasyon fonksiyonunu temsil tarafından verilen desen zamansal periyotlarını uygulamak için seçilen bir hedef otokorelasyon fonksiyonu, bir
- Fonksiyon g minimize örneklerin sırasını belirlemek için Metropolis-Hastings (veya başka bir minimizasyonu algoritması) 12 kullanın. Böylece, sırasını belirlemekBilinen bir saat bileşeninin zamansal periyotlarını maksimize M örnekleri.
- M örneklerinin olayla zamansal sıralaması kullanılarak, ortaklı kanalda 12 ifade deseni için bir sipariş kymograph inşa.
Representative Results
Bu protokol, fare PSM 12 saat, gen transkripsiyonu yanında ilgi bir proteinin Spatiotemporal profilinin görselleştirme izin verir. Örneğin, DLL1 (Şekil 1A-C) ve Notch1 (Şekil 1D-F) proteini sentezleme Çentik düzenlenir bölütleme saat gen Lfng olgunlaşmamış transkripsiyon ile eşzamanlı üzerinden salınım gösterilmiştir. DLL1, Notch1 ve Lfng (i) PSM (Şekil 1G) ve ön-arka (AP) eksenine göre sinyal yoğunluğu bu hedeflere (Şekil 1 H-J) için açık salınım ifade dinamiklerini ortaya miktarının belirlenmesi. Saat döngüsü boyunca DLL1 ve Notch1 protein ekspresyonu zamanmekansal profil açıkça görüntülenmiştir ve yüksek çözünürlüklü sabit doku görüntü veri alım sonrası görüntü analizi ile bu protokolü kullanarak ölçülür.
Şekil 1: uzay-zamansal Görselleştirme ve DLL1 Niceleme ve Notch1 Protein Ekspresyonu Dinamikleri. (AF) tespiti ile birlikte bir yarısında DLL1 proteini (AC) veya Notch1 proteini (DF) uzaysal dağılımını gösteren altı E10.5 embriyolar (AF) Lfng pre-mRNA (Lfng (I) ') için eksplant Çift her bir çiftin karşı yarı tekabül eder. Lfng (i) İfade mekansal profili tarafından belirlenen Paneller, Faz 1 (A ve D), Faz 2 (B ve E) ve segmentasyon saat döngüsü Faz 3 (C ve F) göre düzenlenir. PSM'nin anteroposterior ekseni boyunca DLL1 (yeşil), Notch1 (kırmızı) ve Lfng (I) 'in (gri) için ifade etki derecesi b sahiprenk kodlu çubuklarla çizilmiş een. Noktalı çizgiler, en son meydana hücre gruplarının (s), PSM dış kenarları ve bitişik sinir doku (C ve D) konumlarını ayırmak. Ölçek çubukları (alt, her panelin AF sol) 100 um temsil etmektedir. (G) PSM genelinde sinyal yoğunluğunda eksenel varyasyonu gösteren bir örnek yoğunluğu arsa. Veri karşı eksplant Notch1 protein (kırmızı) (embriyo 1), hem de Lfng ön-mRNA'nın (siyah bir katı çizgi) ile karşılaştırıldığında, bir eksplant Lfng ön-mRNA'nın (siyah kesikli çizgi) gösteren iki eksplant çiftlerinden çizilen başka bir eksplant kontralateral eksplant (Embriyo 2) 'de DLL1 proteini (yeşil) ile karşılaştırıldığında. Ölçülen sinyal yoğunluğu (y-ekseni) eksenel pozisyonu karşı çizilir (x-ekseni; [A] sola doğru ve posterior PSM [P] PSM anterior). Boyunca (H) DLL1, Notch1 ve Lfng (i) 'nin uzamsal dağılımını gösteren bir kymographÇok sayıda PSM. kymograph her bir satırı ayrı bir PSM eksplant sinyal yoğunluğu temsil eder. Sıralar Lfng ön-mRNA'nın (I) 'de gösterilen veri periyodik uzantısı simüle birden çok saat osilasyonları DLL1, Notch1 ve Lfng (I)' uzaysal dağılımının uzaysal dağılımına göre zamansal sırasında düzenlenir (H) , DLL1 ve Notch1 ifade dinamikleri salınım doğasını vurgulayarak. Kaudal PSM içinde (J) Pulsatil Notch1 protein ekspresyonu (I) 'de gösterildiği sanal kymograph demarcated bölgenin büyütme ile vurgulanır. Referans 12. modifiye bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 2: DLL1 ve Notch1 Protein Ekspresyonu uzay-zamansal Dynamics miktarının belirlenmesi. (A), bir örneği, yoğunluk haritası PSM boyunca sinyal yoğunluğundaki eksenel varyasyonunu göstermektedir. Veriler bir yarım eksplant kontralateral eksplant devre Notch1 protein (kırmızı), hem de Lfng ön-mRNA'nın (siyah bir katı çizgi) ile karşılaştırıldığında, bir eksplant Lfng ön-mRNA'nın (siyah kesikli çizgi) gösteren iki eksplant çiftlerinden çizilen ikinci kuyruk kontralateral eksplant yarısında DLL1 protein (yeşil) ile karşılaştırıldığında ikinci kuyruk. Ölçülen şiddetleri (y-ekseni) eksenel pozisyonu karşı çizilen (x-ekseni, rostral [A] sola sağa ve kaudal [P]). (BH) Kymographs sayıda PSM boyunca Notch1, DLL1, NiCd ve Lfng (i) 'nin uzamsal dağılımını göstermektedir. (B ve C) NICD (B) ve DLL1 (C) PSM bölümlerinde sentezleme; (D ve E) Lfng (I) 'in (D) ile DLL1 (<kontralateral eksplant yarıya strong> E); (F ve G) karşı eksplant yarıya Lfng (I) 'in (F) ve Notch1 (G). Referans 12. itibaren bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Discussion
Protokol çerçevesinde kritik adımlar
Mevcut protokol E10.5 fare PSM eksplantlarda düşük seviyeli protein ekspresyonu ve osilatör dinamikleri nicel analizini gerçekleştirmek için hassas bir yöntem açıklanır. In situ hibridizasyon (FISH) hem immünhistokimya ve floresan için sağlam bir protokol konfokal görüntüleme tüm montaj yüksek çözünürlüklü takip eder, ve ardından görüntü analizi ve kymographs zamansal segmentasyonu ile PSM genelinde protein ifadesi bir uzaysal haritası oluşturmak için. Protein ve mRNA tespitinde yüksek bir sinyal-gürültü oranı, bu tekniğin başarısı için çok önemlidir. Bakım 3. adımda ilgili aşamalarında 65 ° C yıkama sıcaklığı iyice yıkama adımları sırasında etkin bir şekilde tüm çözümler alışverişinde bulunmak ve korumak için alınması gereken karşı etkili antikorlar ve RNA probları kaynak için zaman ayırın en avantajlı ve ilgi hedefleri bu reaktif test etmekiyice bu protokolü başlamadan önce tüm montaj örnekleri üzerinde.
Değişiklikler ve Sorun Giderme
Bu protokolü yaparken karşılaşılabilecek ana konular zayıf sinyal algılama gücüne ve kalitesine kaynaklanmaktadır. Bu sırasıyla protokolde immünhistokimya veya FISH adımları için kullanılan antikorların veya RNA probların etkinliği üzerine büyük ölçüde bağımlı. Yeterli sinyal algılama sağlanır önce farklı adımlar bir dizi optimizasyonu gerekebilir. zayıf sinyal tespiti için yaygın bir nedeni yanlış fiksasyondur; taze PFA ya da PFA ya örnekleri sabitlemek için kullanılan bu süre bir hafta daha 4 ° C 'de muhafaza zorunludur. Sabitleme uzunluğu, aynı zamanda kullanılan antikor ya da RNA probu bağlı olarak, optimizasyon gerektirebilir. antikorlar için, mümkünse RNA probları için, biz yayınlanan literatür istişare tavsiye ederken, üreticinin talimatlarına uyun tavsiye edilir.
Lfng ön-mRNA'nın tespit bir RNA probu kullanılır. Nedeniyle bolluğu göreceli eksikliği, Lfng ön-mRNA'nın tespiti iyi bir sinyal tespiti için 5x salin sodyum sitrat (SSC) ihtiva eden hibridizasyon karışımı probu ile inkübe uzun bir süre gerektirir. Aynı koşullar zayıf ifade mRNA tespit diğer problar için geçerli olabilir, ama bizim deneyim, daha istikrarlı mRNA hedeflerin tespiti hibridizasyon karışımı kısa bir prob hibridizasyon adımı ve alt SSC konsantrasyonları (örneğin, 1,3x SSC) gerektirebilir. immünohistokimya ve FISH her ikisi için, protokol ilk bütün embriyolar optimize edilmesi gerekir, ve antikorun veya prob optimum konsantrasyon ampirik olarak tespit edilmelidir.
Tekniğin Sınırlamalar
Yukarıda zikredildiği gibi, bu teknik başarısının proteini ve mRNA tespit kalitesi son derece bağlıdır. We protein ve mRNA tespiti nasıl geliştirilebileceği konusunda birkaç öneri ana hatlarıyla, ancak yüksek kaliteli floresan sinyal tespiti yokluğunda, deneme devam edebilirsiniz yolu yoktur var. Her bir doku numunesinde analiz edilebilir protein hedeflerinin sayısı konfokal mikroskop spektral çözünürlüğe göre ve ikinci antikor epitopları ile sınırlıdır. Bu çalışmada, her numune 12 DNA leke yanında protein tespiti için üç epitoplara kadar kullanmak için başardık. Mevcut alternatif yöntemler olarak üçe kadar hedef 14 bu geliştirmek için kullanılabilir rağmen bu protokol, tek bir mRNA hedef tespit edilmesine izin verir.
Mevcut / Alternatif Yöntemler Göre Tekniği Önemi
Burada anlatılan yöntemi tüm montaj PSM eksplantlarda düşük seviyeli protein dalgalanmaları tespit etmek için hassas bir teknik sağlar. Bu dinamiklerin miktar olankontralateral eksplantlar gelen bilinen bir saat geni için FISH gerçekleştirerek mümkün. kymographs bir kütüphane bu süre içinde ilgi hedefin uzaysal ifade dinamiklerini vurgulayarak, bir segmentasyon saat döngüsü boyunca organize edilebilir oluşturulur. diğerleri üzerinde bu tekniğin bir önemli fark geçici tarafsız bir şekilde analiz edilecek yeni saat bileşenlerinin zamanmekansal ifade dinamiklerini izin büyük veri setleri, sipariş hesaplama otomasyon kullanılmasıdır. Örneğin, bu tekniğin DLL1 ve Notch1 proteinleri ve bunların salınımlar ortak düzenlenen tüm PSM karşısında nasıl görmemizi sağladı. Bu bağlamda alternatif yöntemler de immün güvenerek, ama onlar bu yöntemi kullanarak belirgindi kaudal PSM 'DLL1 ve Notch1 protein seviyelerinde küçük dalgalanmalara tespit edemedik. Bunun yerine, rostral bölge 9 güçlü olduğu ifade sürekli bir gradyan rapor
Tekniği Mastering sonra gelecek Uygulamalar veya Tarifi
Bu protokol, hakim sonra, yüksek verimli bir ifade analizi, PSM 'de ilgi herhangi bir protein için gerçekleştirilebilir.Birkaç fare yavrularına üretilen PSM eksplantlar analizi için gerekli olan yüksek örnek sayı üretmek için bir kerede işlenebilir. yalnızca bu çalışmalarda, vahşi tip embriyolar kullanmış olmasına rağmen, protein sentezleme dinamikleri üzerinde bir ya da daha fazla faktörün önemi değerlendirmek için genetik olarak modifiye edilmiş embriyolar kullanarak bu analizi gerçekleştirmek mümkündür. PSM ötesinde, bu protokol, iki karşı taraf yarısı oluşan ve hassas bir alt düzey protein ekspresyonu ve salınım dinamikleri tespit etmek için kullanılabilen diğer sistemlere adapte edilebilir. Kontralateral yarıları oluşturulur ve kültürlendi ve Çentik aktivitesi 15 desenlendirme mevcut hem de önemli olduğu gösterilmiştir olabilir çünkü bu protokol adapte edilebileceği için bir örnek, fare nöral tüpte dinamik protein ifade çalışmadır. Biz diğer sistemlere bu protokolü adapte ve gelecekteki gelişimi için geribildirim sağlamak için diğer grupları teşvik ediyoruz.
Acknowledgments
Bu çalışma RAB bir MRC öğrencilik, CSLB bir MRC öğrencilik ve JKD (WT089357MA) bir WT proje hibe ile desteklenmiştir. çalışmaları da bir hoş geldiniz Güven Stratejik ödülü (097.945 / Z / 11 / Z) tarafından desteklenmiştir. Biz Lfng RNA probu DLL1 antikor ve Dr. O. Pourquie tür hediye Dr. E. Kremmer teşekkür ederim.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM-F12 | Gibco (ThermoFisher Scientific) | 11320033 | |
| GlutaMAX™-1 (100x) | Gibco (ThermoFisher Scientific) | 35050 | |
| Fetal Bovine Serum, qualified, E.U.-approved, South America origin | Gibco (ThermoFisher Scientific) | 10270106 | |
| Recombinant Human FGF-basic (154 a.a.) | Peprotech | 100-18B | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco (ThermoFisher Scientific) | 15140122 | |
| anti-mouse monoclonal Notch1 antibody^ | BD Pharmingen | 552466 | |
| anti-rat polyclonal Dll1 antibody^* | N/A | N/A | |
| Lfng intronic anti-sense RNA probe^* | N/A | N/A | |
| 16% paraformaldehyde | Pierce (ThermoFischer Scientific) | PI28908 | |
| Proteinase K, recombinant, PCR grade | Roche (Sigma-Aldrich) | 31158 | |
| Phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4 | Made in house | N/A | |
| Triton-X 100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | 5470 | |
| Normal goat serum (NGS) (heat-treated) | Gibco (ThermoFisher Scientific) | 16210072 | |
| Hoechst 33342 | ThermoFischer Scientific | H3570 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 46139 | |
| Glutaraldehyde | Sigma-Aldrich | 340855 | |
| Formamide | Sigma-Aldrich | F9037 | |
| Saline-sodium citrate (SSC) | Sigma-Aldrich | 93017 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | 798681 | |
| tRNA | Roche (Sigma-Aldrich) | 101095 | |
| Heparin | Sigma-Aldrich | H3149 | |
| Tris-buffered saline (TBS) | Made in house | N/A | |
| Blocking Buffer Reagent | Roche (Sigma-Aldrich) | 11096176001 | |
| anti-DIG horseradish peroxidase (HRP) conjugated antibody | Roche (Sigma-Aldrich) | 11207733910 | |
| Tyramide signal amplification (TSA) kit | Perkin Elmer | NEL744001KT | |
| *The Dll1 antibody and RNA probe used in this study are not commercially available. Please see acknowledgements for sources. | |||
| ^Antibodies/RNA probes should be sourced which are applicable to the research interests of the reader. | |||
References
- Oates, A. C., Morelli, L. G., Ares, S. Patterning embryos with oscillations: structure, function and dynamics of the vertebrate segmentation clock. Development. 139 (4), Cambridge, England. 625-639 (2012).
- Krol, A. J., Roellig, D., et al. Evolutionary plasticity of segmentation clock networks. Development. 138 (13), Cambridge, England. 2783-2792 (2011).
- Dequéant, M. -L., Ahnert, S., et al. Comparison of Pattern Detection Methods in Microarray Time Series of the Segmentation Clock. PLoS ONE. 3 (8), 2856 (2008).
- Bailey, C., Dale, K. Somitogenesis in Vertebrate Development. , John Wiley & Sons, Ltd. Chichester, UK. 1-15 (2015).
- Maroto, M., Bone, R. A., Somitogenesis Dale, J. K. Somitogenesis. Development. 139 (14), Cambridge, England. 2453-2456 (2012).
- Kageyama, R., Masamizu, Y., Niwa, Y. Oscillator mechanism of notch pathway in the segmentation clock. Developmental Dynamics. 236 (6), 1403-1409 (2007).
- Ferjentsik, Z., Hayashi, S., et al. Notch Is a Critical Component of the Mouse Somitogenesis Oscillator and Is Essential for the Formation of the Somites. PLoS Genetics. 5 (9), 1000662 (2009).
- Wiedermann, G., Bone, R. A., Silva, J. C., Bjorklund, M., Murray, P. J., Dale, J. K. A balance of positive and negative regulators determines the pace of the segmentation clock. eLife. 4, 05842 (2015).
- Chapman, G., Sparrow, D. B., Kremmer, E., Dunwoodie, S. L. Notch inhibition by the ligand DELTA-LIKE 3 defines the mechanism of abnormal vertebral segmentation in spondylocostal dysostosis. Human Molecular Genetics. 20 (5), 905-916 (2011).
- Sparrow, D. B., Chapman, G., et al. A Mechanism for Gene-Environment Interaction in the Etiology of Congenital Scoliosis. Cell. 149 (2), 295-306 (2012).
- Okubo, Y., Sugawara, T., Abe-Koduka, N., Kanno, J., Kimura, A., Saga, Y. Lfng regulates the synchronized oscillation of the mouse segmentation clock via trans-repression of Notch signalling. Nature communications. 3, 1141 (2012).
- Bone, R. A., Bailey, C. S. L., et al. Spatiotemporal oscillations of Notch1, Dll1 and NICD are coordinated across the mouse PSM. Development. 141 (24), Cambridge, England. 4806-4816 (2014).
- Shea, K., Geijsen, N. Dissection of 6.5 dpc mouse embryos. Journal of Visualized Experiments. (2), 160 (2007).
- Denkers, N., García-Villalba, P., Rodesch, C. K., Nielson, K. R., Mauch, T. J. FISHing for chick genes: Triple-label whole-mount fluorescence in situ hybridization detects simultaneous and overlapping gene expression in avian embryos. Developmental Dynamics. 229 (3), 651-657 (2004).
- Stasiulewicz, M., Gray, S. D., et al. A conserved role for Notch signaling in priming the cellular response to Shh through ciliary localisation of the key Shh transducer Smo. Development. 142 (13), Cambridge, England. 2291-2303 (2015).
