Summary
عوامل جينية يمكن أن تتفاعل مع البرامج الوراثية لتعدل التعبير الجيني وتنظيم وظيفة الخلية ب. من خلال الجمع بين التحفيز في المختبر ب-الخلايا وقرة-بكر، والفائق microRNA-تسلسل ونهجا مرناً-تسلسل، يمكننا تحليل جينية تحوير التعبير ميرنا والجينات في الخلايا باء.
Abstract
يتم إنجاز استجابات الأجسام المضادة من خلال العديد من العمليات الحرجة الخلية ب-الذاتية، بما في ذلك هايبرموتيشن جسدية (SHM)، وتبديل فئة جزئ الحمض النووي (CSR)، وتمايز خلية البلازما. تم في السنوات الأخيرة، أظهرت تعديلات جينية أو عوامل مثل هيستون ديسيتيليشن وميكرورناس (ميرناس)، للتفاعل مع البرامج ب-الخلايا الوراثية لتشكيل جسم الاستجابات، بينما تم العثور على اختلال وظيفي لعوامل جينية تؤدي إلى استجابات الأجسام. تحليل التعبير على نطاق الجينوم ميرنا ومرناً في الخلايا ب ردا على المغيرون جينية مهم لفهم تنظيم استجابة الدالة وجسم ب-خلية جينية. هنا، علينا أن نظهر بروتوكول لحفز الخلايا ب الخضوع للتمييز بين المسؤولية الاجتماعية للشركات، وخلايا البلازما، علاج هذه الخلايا ب مع مثبطات هيستون deacetylase (هداك) (دعم)، وتحليل التعبير مرناً وميكرورنا. في هذا البروتوكول، نحن نحلل مباشرة مكملة تسلسل الحمض النووي (كدنا) استخدام تكنولوجيات seq ميرنا، والجيل المقبل مرناً التسلسل (مرناً-seq) يقرأ تعيين تسلسل الجينوم، وكمية النسخ العكسي (قرة)-بكر. مع هذه النهج، حددنا في الخلايا ب الناجمين عن الخضوع للمسؤولية الاجتماعية للشركات، وتمايز خلايا البلازما، المبادرة، منظم جينية، بشكل انتقائي ينظم التعبير ميرنا ومرناً ويغير تمايز خلية البلازما والمسؤولية الاجتماعية للشركات.
Introduction
علامات جينية أو عوامل، مثل التعديلات هيستون بوستترانسلاشونال مثلايشن الحمض النووي والكشف غير الترميز (بما في ذلك ميكرورناس)، تعدل وظيفة الخلية بتغيير التعبير الجيني1. تعديلات جينية تنظيم وظيفة باللمفاويات، مثل جزئ الحمض النووي تبديل الطبقة الغلوبولين المناعي (CSR)، هايبرموتيشن جسدية (SHM) والتمايز إلى خلايا الذاكرة ب أو خلايا البلازما، وبالتالي تحوير بجسم والأجسام الردود2،3. المسؤولية الاجتماعية للشركات و SHM خطيرة تتطلب ديامينان سيتيديني التي يسببها التنشيط (المعونة، ترميز كأيكدا)، الذي هو الناجم عن درجة عالية في الخلايا ب استجابة لتعتمد على T والمستقلة T المستضدات4. الفئة-تحولت/هايبرموتاتيد ب خلايا أخرى تفرق في خلايا البلازما، التي تفرز كميات كبيرة من الأجسام المضادة بطريقة يتوقف بصورة حاسمة على البروتين نضوج المستحثة اللمفاويات ب 1 (Blimp1، ترميز ك Prdm1)5. قد يؤدي تغييرات جينية غير طبيعي في الخلايا ب استجابات جسم/الأجسام الشاذة، التي يمكن أن تؤدي إلى استجابة الحساسية أو المناعة الذاتية1،4. فهم عوامل جينية كيف، مثل ميرناس، تعدل الخلية ب-الذاتية التعبير الجيني ليس هاما لتطوير اللقاحات، ولكن ضروري أيضا للكشف عن آليات استجابات جسم طبيعي/الأجسام المحتملة.
هيستون acetylation وديسيتيلاتيون بتعديلات مخلفات يسين على البروتينات هستون عادة ما تحفزها acetyltransferase هستون (هات) و deacetylase هيستون (هداك). هذه التعديلات تؤدي إلى إمكانية الوصول إلى تزايد أو تناقص من الكروماتين وكذلك السماح أو منع ربط عوامل النسخ أو البروتينات للحمض النووي وتحوير الجينات التعبير5،6، 7 , 8-مثبطات هداك (المبادرة) هي فئة من المركبات التي تتداخل مع وظيفة هداكس. هنا، نحن تستخدم المبادرة (جيش فيتنام الشعبي) لمعالجة تنظيم هداك الشخصية التعبير الجيني الجوهرية من خلايا ب وآليتها.
ميرناس هي الصغيرة، غير الترميز الكشف ما يقرب من 18 إلى 22 النيوكليوتيدات في المدة التي يتم إنشاؤها من خلال عدة مراحل. ميرنا المضيفة جينات يتم نسخها وشكل دبوس ميكرورناس الأولية (pri-ميرناس). أنها تصدر إلى السيتوبلازم، حيث تتم معالجة pri-ميرناس كذلك إلى السلائف ميرناس (ما قبل-ميرناس). وأخيراً، تتشكل ميرناس ناضجة من خلال الانقسام من قبل--ميرناس. ميرناس الاعتراف بتسلسل التكميلية داخل المنطقة 3 ' غير مترجمة على6،مرناس الهدف7. من خلال إسكات بوستترانسكريبشونال، ميرناس تنظيم النشاط الخلوي، مثل انتشار، والتمايز، والمبرمج10،11. منذ ميرناس متعددة يمكنك استهداف نفس مرناً، وميرنا واحد واحد يمكن أن يحتمل أن تستهدف مرناس متعددة، من المهم أن يكون رأياً في سياق تعريف التعبير ميرنا لفهم قيمة الفرد والجماعية أثر ميرناس. ميرناس أظهرت أن تشارك في التنمية ب-الخلية والتمايز هامشية، فضلا عن ب-الخلية الخاصة بمرحلة التمايز واستجابة الأجسام المضادة والمناعة الذاتية1،،من49. في 3 ' UTR أيكدا و Prdm1، هناك عدة مواقع تقحم المصانة تم التحقق من صحتها أو المتوقعة التي يمكن أن تكون مستهدفة من قبل ميرناس8.
تعديل جينية، بما في ذلك التعديل بعد انتهاء النسخ هيستون وميرناس، عرض نمط لائحة الخاصة بالمرحلة من نوع الخلية والخلية من التعبير الجيني9. هنا، يمكننا وصف أساليب لتحديد تعديل المبادرة بوساطة ميرنا والتعبير مرناً والمسؤولية الاجتماعية للشركات، وتمايز خلية البلازما. وتشمل هذه البروتوكولات لحفز خلايا ب الخضوع للمسؤولية الاجتماعية للشركات، وتمايز خلية البلازما؛ لعلاج الخلايا ب مع مبادرة التنمية البشرية؛ ومن أجل تحليل التعبير ميرنا ومرناً ببكر قرة وميرنا seq seq مرناً10،11،12،،من813.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
البروتوكول المبادئ التوجيهية الرعاية الحيوانية "مؤسسات الرعاية الحيوانية" و "استخدام اللجان التابعة" لجامعة تكساس مركز علوم الصحة في سان أنطونيو.
1. "تحفيز الخلايا ب الماوس" للمسؤولية الاجتماعية للشركات، والتمايز خلية البلازما، ومعاملة المبادرة
- إعداد تعليق خلية الطحال
ملاحظة: تنفيذ كافة الخطوات في غطاء الاندفاق الصفحي باستثناء الماوس القتل الرحيم والتشريح.- يوثانيزي محددة خالية من العوامل الممرضة C57BL/6J الماوس (8-12 أسبوعا عمر) باستنشاق أول أكسيد الكربون 2.
- تقع على عاتق الماوس على متنها تشريح البطن الأعلى. دبوس كل أربعة أقدام للماوس مع 18-قياس 1.5 في إبر الإبر.
- تعقيم الجلد باستخدام مناديل غارقة في الإيثانول 70%-
- استخدام مجموعة واحدة من الأدوات الجراحية يعقم (ملقط ومقص تشريح) لقطع طريق الجلد أسفل القفص الصدري تصور الطحال (في الجانب الأيسر من البطن أسفل الكبد)-
- استخدام ملقط معقم آخر والمقص المقص لاستخراج الطحال، التي تقع تحت انحناء أكبر من المعدة، لقط الطحال بلطف مع الملقط وقطع جميع أنسجة الربط مع تشريح. تأكد من إزالة جميع الأنسجة الاتصال-
- مكان الطحال في أنبوب 1.5 مل ميكروسينتريفوجي التي تحتوي على 1,000 ميليلتر الكامل RPMI1640 المتوسطة (المتوسط RPMI 1640 تستكمل مع مصل العجل الجنين إبطال الحرارة 10% (FBS)، 2 مم ل الجلوتامين، 100 ميكروغرام/مل البنسلين، 100 ميكروغرام/مل ستربتوميسين و 0.25 ميكروغرام/مل الامفوتريسين ب 50 ميكرومتر β-ميركابتوثانول)-
- وضع مصفاة خلية 70 ميكرومتر في أنبوب 50 مل البوليبروبيلين مخروطية أجهزة الطرد مركزي وصب الطحال من أنبوب ميكروسينتريفوجي على مصفاة الخلية. استخدام غيض من أنبوب الطرد المركزي المخروطية البوليبروبيلين 15 مل إلى الهريس بلطف الطحال من خلال المصفاة. شطف مصفاة الخلية مع 15 إلى 20 مل متوسطة كاملة-
- زيادة ونقصان لأسفل الخلايا في 350 غ س لمدة 5 دقائق وتجاهل المادة طافية.
- إزالة خلايا الدم الحمراء من تعليق خلية الطحال. ريسوسبيند بيليه الخلية في المخزن المؤقت لتحلل ACK (5 مل في الطحال). احتضان لمدة 4 دقيقة في درجة حرارة الغرفة مع الهز عرضية واخماد ثم مع 25 مل متوسطة كاملة-
- تدور أسفل الخلايا في 350 غ س لمدة 5 دقائق وتجاهل المادة طافية. ريسوسبيند بيليه الخلية في 1 أو 10 مل من المتوسطة كاملة. عد الخلايا قابلة للتطبيق باستخدام هيموسيتوميتير.
- العزلة ب-خلية
ملاحظة: "ب عزل" الخلايا بالانتقاء السلبي بعد الشركة المصنعة ' تعليمات s. وتستهدف الخلايا ب عدم لإزالة مع بيوتينيلاتيد الأجسام المضادة الموجهة ضد الخلايا غير ب (CD4، CD8، CD11b، CD43، CD49b، CD90.2، Ly-ج 6/غرام (غرام-1) و TER119) وجزيئات مغناطيسية المغلفة ستريبتافيدين.- تحضير تعليق خلية 0.25 إلى 2 مل 1 × 10 8 خلايا/مل في المتوسط كاملة في البوليسترين معقم 5 مل (12 × 75 مم) جولة لأسفل الأنبوبة. إضافة مصل الفئران العادية (50 ميليلتر/mL) للعينة.
- إضافة 50 ميليلتر/mL العزلة كوكتيل للعينة. مزج الخلايا بلطف بيبيتينج أعلى وأسفل 2-3 مرات واحتضان في درجة حرارة الغرفة للحد الأدنى 10 إضافة
- ميليلتر/مل 75 المغلفة ستريبتافيدين من الجزيئات المغناطيسية للعينة. مزج الخليط بلطف بيبيتينج صعودا وهبوطاً 2-3 مرات واحتضانها ل 2.5 دقيقة في درجة حرارة الغرفة- إضافة
- كاملة RPMI 1640 المتوسطة. مزج الخلايا بلطف بيبيتينج صعودا وهبوطاً 2-3 مرات-
- وضع الأنبوب (بدون الغطاء) في المغناطيس واحتضان في درجة حرارة الغرفة ل 2.5 كحد أدنى من أجل إيقاف المادة طافية تتضمن متأثر ب الخلايا في أنبوب 15 مل مخروطية الشكل جديد.
- عد الخلايا قابلة للتطبيق باستخدام هيموسيتوميتير ووصمة عار تريبان الأزرق. تقييم نقاء الخلايا ب بالتدفق الخلوي تحليل الواسمات السطحية ب-الخلية، مثل B220 و CD19.
- ب-خلية التحفيز ومعاملة المبادرة
- ريسوسبيند الخلايا ب المنقاة في المتوسط RPMI 1640 كاملة بتركيز 0.3 × 10 6 خلايا/مل نهائي.
- استخدام لوح ثقافة 48-جيدا خلية للخلية والثقافة. لكل بئر، أضف 1 مل المنقي ب-خلية تعليق (0.3 × 10 6 خلايا/مل) أو لبس (3 ميكروغرام/مل تركيز النهائي) من الإشريكيّة القولونية، وايل-4 (5 نانوغرام/مليلتر تركيز النهائي)، و 0 أو 500 ميكرومتر المبادرة (حمض فالبرويك؛ جيش فيتنام الشعبي)-
- احتضان الخلايا في 37 درجة مئوية و 5% CO 2 ح 60 قرة-بكر وتحليل الفائق مرناً-وميرنا-التسلسل، أو 96 ساعة لتحليل التدفق الخلوي-
- تدفق التحليل الخلوي للمسؤولية الاجتماعية للشركات، وتمايز خلية البلازما
- بعد 96 ساعة ثقافة، فصل الخلايا من كل بئر من بيبيتينج الخلايا صعودا وهبوطاً عدة مرات. نقل تعليق خلية في أنبوب 1.5 مل ميكروسينتريفوجي. وتدور أسفل الخلايا في 350 غ س لمدة 5 دقائق مقاعد البدلاء-أعلى للطرد مركزي باستخدام تجاهل المادة طافية.
- ريسوسبيند في الخلايا التي تحتوي على 100 ميليلتر هبس المخزن المؤقت الذي يحتوي على جيش صرب البوسنة 1% و 0.5 نانوغرام/مل فلوريسسين (FITC)- الماعز مترافق المضادة للأجسام المضادة IgM – الماوس (Ab) ، اللوفيكوسيانين نانوغرام/مليلتر 0.2 (APC)-الماوس لمكافحة الفئران مترافق IgG1 [مونوكلونل] Ab (ماب)، 0.2 phycoerythrin نانوغرام/مليلتر (PE)-مترافق ماب B220 الماوس لمكافحة الجرذان والفئران PE-Cy7-مترافق نانوغرام/مليلتر 0.2 الماوس المضادة CD138 ماب 2 نانوغرام/مل 7-أمينواكتينوميسين د (7-عاد).
- احتضان الخلايا مع مترافق fluorescence الأجسام المضادة (الخطوة 1.4.2) في الظلام في درجة حرارة الغرفة عن 30 دقيقة
- تغسل الخلايا مع 1 مل حبس مع جيش صرب البوسنة 1%-
- زيادة ونقصان لأسفل الخلايا في 1,500 س ز لمدة 5 دقائق باستخدام أجهزة الطرد المركزي benchtop وتجاهل المادة طافية.
- ريسوسبيند الخلايا في 300 ميليلتر من حبس مع جيش صرب البوسنة 1% ونقل تعليق خلية إلى أنبوب البوليستيرين القاع المستديرة. تغطية الأنبوب مع إحباط لتجنب التعرض للضوء.
- تنفيذ التدفق الخلوي التحليل على تعليق خلية واحدة. جمع الأحداث 50,000 لكل عينة التعويض والأحداث 250,000 للعينات الأخرى. تحليل البيانات باستخدام برنامج المعدات.
- إزالة الحطام ودوبليتس باستخدام بوابة هندسة نبض (منتدى التعاون الأمني-ح س منتدى التعاون الأمني-أ وال SSC-ح س ال SSC-أ). على نحو مناسب من بوابة المؤامرة على 7-عاد استبعاد الخلايا الميتة.
2. الفائق مرناً-Seq
ح- بعد 60 من الثقافة، استخراج الجيش الملكي النيبالي إجمالي من 2-4 × 10 6 الخلايا باستخدام مجموعة عزل الحمض النووي الريبي مجموع يمكن استرداد رنا الصغيرة عقب الشركة المصنعة ' تعليمات s. وتشمل الدناز أنا خطوة العلاج.
- التحقق من سلامة الحمض النووي الريبي استخدام بيواناليزير، عقب الشركة المصنعة ' تعليمات s-
- استخدام 500 1,000 نانوغرام من مجموع الجيش الملكي النيبالي عالية الجودة (عدد سلامة الحمض النووي الريبي رين > 8.0) لتسلسل الحمض النووي الريبي عينة إعداد مكتبة مع الحمض النووي الريبي تجارية فطقم مندوب عقب الشركة المصنعة ' تعليمات s-
- تجمع المكتبات seq مرناً الفردية استناداً على أجزاء كل منها 6-bp مؤشر من المحولات وتسلسل المكتبات في 50 شركة بريتيش بتروليوم/تسلسل. استخدام نظام الفائق الحمض النووي وفقا للشركة المصنعة ' البروتوكولات s-
- بعد تشغيل التسلسل، ديمولتيبليكس مع كاسافا لإنشاء ملف فستق لكل عينة. القيام بما يلي: رسم الخرائط، وتحليل المعلوماتية الحيوية، كما هو مبين سابقا 11-
- محاذاة كل القراءات التسلسل مع على مرجع الجينوم (mm9 بناء جينوم الفأر التسخن) باستخدام الإعدادات الافتراضية TopHat2 14. معالجة الملفات أم من المحاذاة باستخدام العد هتسيق الحصول على التهم كل الجينات في جميع العينات-
3. ميرنا الفائق-Seq
- استخدام 100 نانوغرام-1 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي عالية الجودة الإجمالية، كما أعدت في الخطوة 2-1، لإعداد مكتبة تسلسل الحمض النووي الريبي الصغيرة باستخدام مجموعة تسلسل الحمض النووي الريبي صغيرة تجارية-
- ليجت 3 تحولت ' محول إلى 5 ′ ينتهي جزيئات الحمض النووي الريبي الصغيرة البدء مع مجموعة أدوات ربط تجارية. سد 5 تحولت ' محول إلى 3 ′ ينتهي جزيئات الحمض النووي الريبي الصغيرة البدء مع مجموعة أدوات ربط تجارية. تحويل الجيش الملكي النيبالي لكدنا بالنسخ العكسي وتضخيم المكتبة تسلسل الحمض النووي الريبي صغيرة من [بكر] تضخيم مع مجموعات تجارية-
- استخدم 6% TBE هلام صفحة أصلية لعزل المكتبة تسلسل الحمض النووي الريبي الصغيرة النهائي. تشغيل الهلام مع المخزن المؤقت X TBE 1 في 200 الخامس حتى تقترب الفرقة بروموفينول الأزرق تتبع صبغ الجزء السفلي من الهلام (0.5-1 سم)-
- إزالة الجل من ألواح الزجاج ووصمة عار مع اثيديوم بروميد (0.5 ميكروغرام/مل في المياه) في حاوية نظيفة لتصور الجل الفرق في ترانسيلوميناتور الأشعة فوق البنفسجية أو صك آخر من الوثائق جل كحد أدنى 2-3-
- قطع من الفرقة ~ 150-بي بي باستخدام الشفرة نظيفة ووضعه في أنبوب 1.7 مل.
- استخراج الحمض النووي استخدام مجموعة أدوات استخراج هلام لإرشادات الشركة المصنعة.
- التحقق من توزيع حجم المكتبة النهائي مع فحص الحمض النووي حساسية عالية تجارية والتركيز مع الإنزيم دسدنا تجارية كل المصنعين ' الإرشادات.
- تجمع المكتبات للتضخيم وتسلسله لاحقة تشغيل مع نظام تسلسل الحمض النووي الفائق تجارية للشركة المصنعة ' البروتوكولات s-
- ديمولتيبليكس مع كاسافا لإنشاء ملف فاستق لكل عينة الواحدة والشركة المصنعة ' البروتوكولات s-
- لتحليل الحمض النووي الريبي seq الصغيرة كل عينة، استخدام وميض لمحاذاة رنا الصغيرة الواحدة والشركة المصنعة ' s البروتوكولات.
- إزالة ما يلي: أن يتم محاذاة للملوثات، مثل الميتوكوندريا، الرنا الريباسي، كبسولة تفجير، وهلم جرا.
- محاذاة البيانات إلى أن تنضج متواليات ميرنا.
- محاذاة البيانات إلى تسلسل حلقة دبوس (ميرنا السلائف).
- محاذاة البيانات إلى أخرى صغيرة الحمض النووي الريبي متواليات (باستخدام قاعدة بيانات فرنا) 15-
- بعد جميع العينات كمياً، تعريف ميرناس أعرب التفاضلية بين المجموعات/عينات مختلفة. التنبؤ ميرناس التي تستهدف مرناس المحدد أو مرناس التي يمكن أن تكون مستهدفة من قبل انتقائية ميرنا استخدام أدوات التنبؤ الهدف ميرنا عبر الإنترنت، مثل تارجيتسكان 16 ومصغرا 17 بيكتار 18 .
- إذا كان هناك حاجة إلى تحليل الشرح أو مسار وظيفي، يقدم الجينات المتوقعة لتحليل "مسار الإبداع" (IPA) أو ديفيد-
4. الكمية RT-PCR (قرة-PCR) مرناس وميرناس
- قرة-PCR تحليل مرناً
- "استخراج الحمض النووي الريبي" من 0.2-5 × 10 6 الخلايا باستخدام عزل الحمض النووي الريبي إجمالي تجاري كيت التي يمكن استرداد رنا الصغيرة، بعد الشركة المصنعة ' تعليمات s. وتشمل الدناز أنا خطوة العلاج.
- توليف كدنا من مجموع الجيش الملكي النيبالي مع نظام توليف كدنا حبلا أول استخدام التمهيدي اليغو-dT.
- قياس كدنا قبل بكر qRT مع الإشعال المناسبة، باستخدام 2 x ميكس سيد بكر في الوقت الحقيقي مع البروتوكول التالي: 95 درجة مئوية لمدة 15 ثانية، دورات 40 94 درجة مئوية لمدة 10 s، 60 درجة مئوية لمدة 30 s، و 72 درجة مئوية لمدة 30 س.
- القيام باقتناء البيانات أثناء الخطوة ملحق 72 درجة مئوية، وإجراء تحليل منحنى ذوبان من 72 إلى 95 ° C.
- تحليل PCR قرة ميرنا
- "الكوة الجيش الملكي النيبالي" من العينات التي تم إعدادها في الخطوة 4.1.1.
- عكس نسخ الجيش الملكي النيبالي في كدنا. استخدام أدوات نسخ عكسي microRNA تجارية، عقب الشركة المصنعة ' تعليمات s-
- إجراء PCR الوقت الحقيقي ميكرورنا باستخدام مزيج "الأخضر سيبر" سيد بكر في الوقت الحقيقي مع 250 نانومتر ميرنا ناضجة إلى الأمام الإشعال بالاقتران مع تمهيدي عكس عالمية.
- ذوبان الجليد 2 x ميكس سيد بكر، ميرنا محددة التمهيدي إلى الأمام، وعكس العالمي التمهيدي في درجة حرارة الغرفة. مزيج الحلول الفردية-
- إعداد مزيج رد فعل على النحو التالي لوحدة تخزين 25 ميليلتر الواحدة وكذلك فعل (المستخدمة في لوحات بكر 96-جيدا):
2 × 12.5 ميكس ماجستير بكر ميليلتر
ميرنا الأمام الإشعال (2.5 ميكرومتر) ميليلتر 2.5
عالمية عكس التمهيدي (2.5 ميكرومتر) ميليلتر 2.5
RN ميليلتر خالية من بورصة عمان water5 - ميكروليتر 22.5 إضافة رد فعل مزيج لصفيحة بكر 96-جيدا. إضافة 2.5 ميليلتر من قالب كدنا (50 نانوغرام pg-3) إلى الآبار لوحة الفردية- أحكام ختم
- الفيلم لوحة. الطرد المركزي في اللوحة لمدة 1 دقيقة ب 000 1 × ز ودرجة حرارة الغرفة.
- وضع اللوحة في cycler في الوقت الحقيقي، وبدء برنامج ركوب التالية: 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق، دورات 40 94 درجة مئوية لمدة 15 ثانية، 55 درجة مئوية لمدة 30 s، و 72 درجة مئوية لمدة 30 س.
- استخدم الأسلوب ΔΔCt لتحليل البيانات قرة-PCR مع جدول بيانات. تطبيع التعبير عن ميرناس ذات الصلة إلى التعبير عن الصغيرة النووية/النوية Rnu6 الكشف/RNU61/2، Snord61/SNORD61، Snord68/SNORD68، و Snord70/SNORD70-
- التحليل الإحصائي
- إجراء تحليل إحصائي لتحديد قيم p إقران ومزاوج الطالب ' s t- اختبار باستخدام جدول بيانات والنظر في القيم ف < 0.05 كما كبير-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
استخدام لدينا بروتوكول، تنقية الخلايا ب وضعها مع لبس (3 ميكروغرام/مل)، وايل-4 (5 نانوغرام/مل) ليمكن أن يستحث ح 96 30-40 ٪ من المسؤولية الاجتماعية للشركات إلى IgG1 و ~ 10% من تمايز خلية بلازما. بعد العلاج مع المبادرة (500µM جيش فيتنام الشعبي)، المسؤولية الاجتماعية للشركات إلى IgG1 انخفض إلى 10-20 في المائة، بينما انخفضت تمايز خلية البلازما ~ 2% (الرقم 1). وأكد انخفاض أرقام جزئ بعد Iμ-Cγ1 وناضج الخامسحدي جيحزيادة تثبيط المبادرة بوساطة للمسؤولية الاجتماعية للشركات-النصوص Cγ1، وهي السمات المميزة للمسؤولية الاجتماعية للشركات المنجزة. كما تقاس qRT-بكر، عرضت التعبير عن أيكدا، الذي حاسم بالنسبة للمسؤولية الاجتماعية للشركات/SHM، و Prdm1 و Xbp1، وهامة لتمييز خلايا البلازما، تكون أعاقت بجيش فيتنام الشعبي (الشكل 2).
وكان تحوير التعبير مرناً بالمبادرة في الخلايا ب انتقائية للغاية. كما تقاس seq مرناً في الخلايا ب حفز مع لبس وايل-4، 0.3 في المائة فقط من هذه الغاية المعلنة مرناس كانت upregulated من المبادرة أكثر من شقين، ونسبة 0.36 في المائة فقط من الغاية المعلنة (> 20 نسخ/الخلية في الخلايا ب دون علاج المبادرة) مرناس، بما في ذلك أيكدا، Prdm1، وتم خفض Xbp1، بالمبادرة أكثر من 50 ٪ (الشكل 3).
يحتمل أن يكون توسط دوونريجوليشن أيكدا، Prdm1، والتعبير Xbp1 ميرناس، وهي سلبية المنظمين للتعبير الجيني. وقد حددنا باستخدام ميرنا استهداف أدوات التنبؤ (TargetScan.org و miRNA.org و miRbase.org)، ميرناس متعددة يمكن أن يحتمل أن تستهدف أيكدا أو Prdm1. تحليل seq ميرنا ميرنا التنميط في الخلايا باء تعامل مع المبادرة أو النيل أظهر أن دعم بشكل انتقائي أوبريجولاتي أيكدا-- و Prdm1-استهداف ميرناس (الأرقام 4-6).
رقم 1- التعبير السطحي من علامة B220 والأجسام المضادة السطحية IgG1 علامة البلازمية-خلية CD138 ب-خلية تم تحليلها بواسطة التدفق الخلوي-
B220+ IgG1+ الخلايا هي الخلايا ب تحولت إلى IgG1. B220منخفضCD138+ الخلايا من خلايا البلازما. يتم الإشارة إلى النسبة المئوية للخلايا تحولت IgG1 ب وخلايا البلازما من الخلايا ب حفز مع لبس وايل-4 حضور النيل أو مبادرة التنمية البشرية (جيش فيتنام الشعبي، 500 متر) عن 96 ساعة كالأرقام داخل البوابات. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الرقم 2. التعبير عن السمات المميزة للمسؤولية الاجتماعية للشركات المنجزة؛ ناضج الخامسحدي جيح-Cγ1 النصوص والنصوص جزئ بعد Iμ-Cγ1؛ و أيكدا، و Prdm1، و Xbp1 تم تحليلها بواسطة qRT-بكر، تطبيع للنصوص Cd79b ، وهو مبين في الرسم بياني.
التعبير الجيني في الخلايا ب حفز مع لبس وايل-4 حضور 500 ميكرومتر جيش فيتنام الشعبي وذات الصلة بالتعبير الجيني في ب الخلايا مع المحفزات نفس حضور النيل كانت تصور على أنها 1. والبيانات من ثلاث تجارب مستقلة. قيم p ، إقران تي-اختبار. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3. خلايا ب قد حفزت مع لبس وايل-4، وتعامل مع المبادرة (جيش فيتنام الشعبي، 500 ميكرومتر) أو النيل للتعبير مرناً 60 h. تم تحليلها بواسطة ما يليها مرناً
(أ) متوسط مستويات التعبير مرناً في ثلاث تجارب مستقلة (قراءة كل كيلوبس الواحدة على ما يلي: تم تعيينه مليون ربكمس) قد صورت في التبعثر مؤامرات. يناظر كل قطعة واحدة المستوى الفردي في التعبير مرناً. خطوط متقطعة اثنين خطوط مزدوجة. مبعثر مؤامرات الموجود أعلاه خط متقطع أعلى أو أسفل الجزء السفلي تبين خط متقطع مرناس التي تعبر عن أكثر من مرتين أو أقل من النصف عند الناجم عن جيش فيتنام الشعبي والنيل، على التوالي. (ب) الرسوم البيانية بار تصوير متوسط التغير في مستويات التعبير مرناً (متوسط ربكمس من ثلاث تجارب مستقلة) في لبس وب إيل-4-حفز الخلايا تعامل مع مبادرة التنمية البشرية، بالمقارنة مع تلك الموجودة في الخلايا باء تعامل مع النيل. إلا مرناس في ربكم متوسط > 20 مدرجة في لبس وب إيل-4-حفز الخلايا تعامل مع النيل. ويرد التعبير مرناً في كل تجربة فردية، كما هو موضح بمؤامرة مبعثر (ج) أو رسم بياني شريطي (د)، بنفس الطريقة كما في (أ) و (ب). قيم p ، إقران تي-اختبار. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4. خلايا ب قد حفزت مع لبس وايل-4، وتعامل مع المبادرة (جيش فيتنام الشعبي، 500 ميكرومتر) أو النيل للتعبير ميرنا 60 h. تم تحليلها بواسطة ميرنا-ما يليها
(أ) التغيير في مستويات التعبير ميرنا متوسط في خلايا ب تعامل مع المبادرة ومقارنة بأنه تعامل مع النيل في الخلايا ب كانت وصفت بشريط الرسوم البيانية. (ب) التغيير في مستويات التعبير ميرنا في ب الخلايا تعامل مع المبادرة ومقارنة بأن تعامل مع النيل في ثلاث تجارب مستقلة في الخلايا ب كانت وصفت بشريط الرسوم البيانية. إلا ميرناس في المتوسط دورة في الدقيقة > 0.5 في لبس وب إيل-4-حفز يتم تضمين الخلايا تعامل مع النيل. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 5. المبادرة زيادة التعبير عن أيكدا-استهداف ميرناس، كما هو مبين بما يليها ميرنا
(أ) تسلسل المحاذاة في ميرناس والمواقع المستهدفة في 3 ' UTR من مرناس أيكدا . (ب) كانت مثقف خلايا ب مع لبس وايل-4 في وجود أو عدم وجود مبادرة التنمية البشرية (جيش فيتنام الشعبي، 500 متر) ح 60. التعبير عن ميرناس التي تم التنبؤ بها لاستهداف أيكدا 3 ' UTR تم تحليلها بواسطة seq ميرنا ووصفت لفة في الدقيقة. قيم p ، إقران تي-اختبار. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 6. المبادرة زيادة التعبير عن Prdm1-استهداف ميرناس، كما هو مبين بما يليها ميرنا
(أ) تسلسل المحاذاة في ميرناس والمواقع المستهدفة في 3 ' UTR من مرناس Prdm1 . (ب) كانت مثقف خلايا ب مع لبس وايل-4 في وجود أو عدم وجود مبادرة التنمية البشرية (جيش فيتنام الشعبي، 500 متر) عن 60 h. التعبير عن ميرناس التي تم التنبؤ بها لاستهداف Prdm1 3 ' UTR تم تحليلها بواسطة seq ميرنا ووصفت لفة في الدقيقة. قيم p ، إقران تي-اختبار. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يوفر هذا البروتوكول نهج شاملة للحث على تبديل فئة بالخليه وتمايز خلية البلازما؛ لتحليل تأثيرها بجينيه المغيرون، إلا وهي مبادرة التنمية البشرية؛ والكشف عن أثر المبادرة على التعبير مرناً وميرنا في هذه الخلايا. معظم هذه النهج يمكن استخدامها أيضا لتحليل تأثير عوامل جينية في التعبير الدالة ومرناً/ميرنا ب-الخلايا البشرية. يمكن أيضا استخدام قرة-بكر ونهجا مرناً-seq/ميرنا-seq لتحليل الخلايا ب المعزولة من الفئران تعامل مع المغيرون جينية، مثل دعم.
مودولاتي جينية قد تؤثر على العديد من وظائف الخلية المختلفة، مثل تكاثر الخلايا وقدرتها على البقاء، مما قد يؤثر على تمايز خلية البلازما والمسؤولية الاجتماعية للشركات. ولذلك، ينبغي تحليل انتشار الخلايا والجدوى ودورات خلية من الخلايا باء، مع أو بدون علاج مبادرة التنمية البشرية،. أحد التحديات التي تواجه تحليل تحوير التعبير مرناً وميرنا بالمبادرة أو غيرها المنظمين جينية ببكر qRT هو اختيار التدبير المنزلي مناسبة الجينات أو الرنا الصغيرة. ويمكن تغيير العديد من الجينات المشتركة في التدبير المنزلي بدرجات متفاوتة حسب المغيرون جينية. ينبغي قياس مستويات التعبير من جينات مختلفة التدبير المنزلي كثيرة ويستخدمها qRT-بكر لتطبيع تعبير الجينات المحددة. ويمكن أيضا تناول هذه المسألة seq مرناً وميرنا-seq، حيث يمكن تطبيعها التعبير عن مرناس الفردية أو ميرناس بمستويات مرناً أو ميرنا المجين على نطاق المنظومة.
seq مرناً يمكن أن لا تعرف سوى الشخصية التعبير مرناً مع أنبوب المعلوماتية الحيوية مناسبة، ولكن هذا النهج أيضا تعريف الشخصية الحمض النووي الريبي (لنكرنا) فضله منذ وقت طويل. عادة ما ينطوي seq مرناً في إثراء poly(A) + الكشف بالتحديد oligo(dT). كما هي معروفة في عدد من لنكرنا إلى الافتقار إلى ذيول poly(A)، لا يمكن تحديد نهجاً مرناً seq تشمل التحديد اليغو (dT) الحصول على معلومات كاملة من التعبير لنكرنا. من أجل تحقيق التغطية الكاملة لملامح التعبير مرناً ولنكرنا على حد سواء، ينبغي استخدام نهج تسلسل الحمض النووي الريبي التي تنطوي على استنفاد الرنا الريباسي. في معظم تجاربنا، نستخدم مجموعة تجارية لاستخراج مجموع الجيش الملكي النيبالي، بما في ذلك ميرنا, ميرنا seq ومرناً seq qRT-PCR. قبل بناء مكتبة تسلسل الفائق، يتم التحقق من نوعية الجيش الملكي النيبالي إجمالي عن طريق تشغيل قاسمة على نظام مراقبة الجودة عينة الجيش الملكي النيبالي، والحمض النووي والبروتين مؤتمت. من المستحسن أن عينات الحمض النووي الريبي قد رين رقم 7.0 أو أعلى إذا كانت ستستخدم لإعداد مكتبة صغيرة في الجيش الملكي النيبالي. عينات مع انخفاض رين الأرقام بنسبة أعلى من منتجات رنا المتدهورة في حجم مجموعة من الأنواع الصغيرة من الحمض النووي الريبي (النيوكليوتيدات 15-30). عندما يكون عدد رين أدناه 7.0، لن تكون التغطية جيدة. خيار آخر لعينات الحمض النووي الريبي أقل من مثالية لتنفيذ نهج استنفاد الرنا الريباسي بدلاً من نهج عزلة مرناً، ولكن هذا يتطلب أن تكون العينات على الأقل 10 نانوغرام/مل.
بروتوكولات مرناً-seq المستخدمة هنا هي الأمثل ل 100 1,000 نانوغرام من مجموع الجيش الملكي النيبالي. لميرنا-seq استخدام أقل من 100 نانوغرام من مجموع الجيش الملكي النيبالي، إعداد مكتبة تسلسل الحمض النووي الريبي الصغيرة ينبغي أن يتبع بروتوكول إعداد تسلسل الحمض النووي الريبي صغيرة أكثر حساسية، الذي يستفيد من الهيكل الطبيعي المشترك لمعظم الجزيئات المعروفة ميكرورنا. وقد ميرناس الأكثر نضجاً 5 '-فوسفات ومجموعة 3'-هيدروكسيل نتيجة على مسار نشوء حيوي. وبسبب هذا، هي المحولات 3 'و 5' في هذه المجموعة متصلة مباشرة إلى ميرناس.
لتحليل تأثير المبادرة على الخلية ب مرناً وميرنا التعبير في فيفو، يمكن علاج الفئران مع جيش فيتنام الشعبي أو دعم أخرى بإضافة هذه المبادرة إلى مياه الشرب، والحقن داخل هذه الفئران مع تي-تعتمد على مستضد NP-وظفته أو تي-المستقلة مستضد NP-لبس يمكن أن يؤديها. يمكن تنقية الخلايا ب من الطحال 10 أيام بعد التطعيم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب يعلن أن لديهم لا تضارب المصالح المالية.
Acknowledgments
بتأييد هذا العمل بالمعاهد الوطنية للصحة منح 105813 منظمة العفو الدولية ومنظمة العفو الدولية 079705 (على الكمبيوتر)، التحالف من أجل "تحديد الهدف البحث الذئبة" في الذئبة 295955 ALR المنح (للكمبيوتر)، والبحوث "مؤسسة أبحاث التهاب المفاصل الوطنية" منح (هرتز). وأيد المركز الطبي لطب الأطفال، مستشفى إكسيانجيا الثانية، وجامعة جنوب وسط مدينة تشانغشا، الصين، في سياق برنامج الزيارة طالب طب إكسيانجيا-يوتا "مدرسة طب سان أنطونيو" TS.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL/6 mice | Jackson Labs | 664 | |
| Corning cellgro RPMI 1640 Medium (Mod.) 1X with L-Glutamine (Size: 6 x 500mL; With L-Glutamine) | Fisher Scientific | MT 10-040-CV | |
| FBS | Hyclone | SH300 | |
| HyClone Antibiotic Antimycotic Solution 100 mL | Fisher Scientific - Hyclone | SV3007901 | |
| β-Mercaptoethanol | Fisher Scientific | 44-420-3250ML | |
| Falcon Cell Strainers | Fisher Scientific | 21008-952 | |
| Trypan Blue Stain 0.04% | GIBCO/Life Technologies/Inv | 15250 | |
| ACK Lysis Buffer | Fisher Scientific | BW10-548E | |
| Hausser Scientific Bright-Line Counting Chamber | Fisher Scientific | 02-671-51B | |
| EasySep Magnet | Stem Cell Technologies | 18000 | |
| Falcon Round-Bottom Polystyrene Tubes with Cap | Fisher Scientific | 14-959-1A | |
| EasySep Mouse B cell Isolation Kit | Stem Cell Tech | 19854 | |
| BD Needle Only 18 Gauge 1.5 inch SHORT BEVEL 100/box | BD Biosciences | 305199 | |
| PE/Cy7 anti-mouse CD138 (Syndecan-1) Antibody | BioLegend | 142513 (25 ug) | |
| PE-Cy7 B220 antibody | BioLegend | 103222 | |
| 7-AAD (1 mg) | Sigma Aldrich | A9400-1MG | |
| APC anti-mouse/human CD45R/B220 antibody | Biolegend | 103212 | |
| Mouse APC-IgG1 200 µg | Biolegend | 406610 | |
| FITC anti-mouse IgM Antibody | Biolegend | 406506 | |
| FITC anti-mouse/human CD45R/B220 Antibody | Biolegend | 103206 | |
| PE Anti-Human/Mouse CD45R (B220) (RA3-6B2) | Biolegend | 103208 | |
| HBSS 1X | Fisher Scientific | MT-21-022-CM | |
| Bovine Serum Albumin, Fraction V, Heat Shock Treated | Fisher Scientific | BP1600-100 | |
| LPS 25mg (Lipopolysaccharides from Escherichia coli 055:B5) | Sigma Aldrich | L2880-25MG | |
| Recombinant mouse IL-4 (carrier-free) | BioLegend | 574302 (size: 10 ug) | |
| Valproic acid sodium salt | Sigma Aldrich | P4543 | |
| SterilGARD e3 Class II Type A2 Biosafety Cabinet | The Baker Company | SG404 | |
| Large-Capacity Reach-In CO2 Incubator | Thermo Scientific | 3950 | |
| Isotemp Digital-Control Water Baths: Model 205 | Fisher Scientific | 15-462-5Q | |
| 5mL Round Bottom Polystyrene Test Tube | Fisher Scientific | 14-959-5 | |
| Corning CentriStar 15ml Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 05-538-59A | |
| 1.7 mL Microtube, clear | Genesee | 22-282 | |
| Higher-Speed Easy Reader Plastic Centrifuge Tubes 50ml | Fisher Scientific | 06-443-18 | |
| ELMI SkySpin CM-6MT | ELMI | CM-6MT | |
| Rotor 6M | ELMI | 6M | |
| Rotor 6M.06 | ELMI | 6M.06 | |
| Drummond Portable Pipet-Aid XP Pipet Controller | Drummond Scientific | 4-000-101 | |
| 25 mL serological pipette tips | Fisher Scientific | 89130-900 | |
| 10 mL serological pipette tips | Fisher Scientific | 89130-898 | |
| 5 mL serological pipette tips | Fisher Scientific | 898130-896 | |
| 48-well plates | Fisher Scientific | 07-200-86 | |
| Allegra 6 Benchtop Centrifuge, Non-Refrigerated | Beckman Coulter | 366802 | |
| GH-3.8A Rotor, Horizontal, ARIES Smart Balance | Beckman Coulter | 366650 | |
| Allegra 25R Benchtop Centrifuge, Refrigerated | Beckman Coulter | 369434 | |
| TA-15-1.5 Rotor, Fixed Angle | Beckman Coulter | 368298 | |
| Fisher Scientific AccuSpin Micro 17 | Fisher Scientific | 13-100-675 | |
| Fisher Scientific Analog Vortex Mixer | Fisher Scientific | 02-215-365 | |
| miRNeasy Mini Kit (50) | Qiagen | 217004 | |
| Direct-zol RNA MiniPrep kit | Zymo Research | R2050 | |
| Chloroform (Approx. 0.75% Ethanol as Preservative/Molecular Biology) | Fisher Scientific | BP1145-1 | |
| Rnase-Free Dnase set (50) | QIAGEN | 79254 | |
| NanoDrop 2000 Spectrophotometers | Thermo Scientific | ND-2000 | |
| Superscript III First-strand Synthesis System RT-PCR | Invitrogen | 175013897 | |
| iTaq Universal SYBR Green Supermix | Bio-rad | 172-5121 | |
| Fisherbrand 96-Well Semi-Skirted PCR Plates, case of 25 | Fisher | 14-230-244 | |
| Microseal 'B' Adhesive Seals | Bio-Rad | MSB-1001 | |
| MyiQ Optics Module | Bio-Rad | 170-9744 | |
| iCycler Chassis | Bio-Rad | 170-8701 | |
| Optical Kit | Bio-Rad | 170-9752 | |
| BD LSR II Flow Cytometry Analyzer | BD Biosciences | ||
| FACSDiva software | BD Biosciences | ||
| FlowJo 10 | BD Biosciences | ||
| 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2943CA | |
| S200 Focused-ultrasonicator | Covaris | S200 | |
| SPRIworks Fragment Library System I for Illumina | Beckman Coulter | A288267 | |
| cBot Cluster Generation Station | illumina | SY-312-2001 | |
| HiSeq 2000 Genome Sequencer | Illumina | SY-401-1001 | |
| TruSeq RNA Library Prep Kit v2 | Illumina | RS-122-2001 | |
| TruSeq Small RNA Library Prep Kit | Illumina | RS-200-0012 | |
| NEXTflex Illumina Small RNA Sequencing Kit v3 | Bioo Scientific | 5132-05 | |
| 2200 TapeStation | Agilent | G2964AA |
References
- Allis, C. D., Jenuwein, T. The molecular hallmarks of epigenetic control. Nat Rev Genet. 17, 487-500 (2016).
- Li, G., Zan, H., Xu, Z., Casali, P. Epigenetics of the antibody response. Trends Immunol. 34, 460-470 (2013).
- Zan, H., Casali, P. Epigenetics of Peripheral B-Cell Differentiation and the Antibody Response. Front Immunol. 6, 631 (2015).
- Xu, Z., Zan, H., Pone, E. J., Mai, T., Casali, P. Immunoglobulin class-switch DNA recombination: induction, targeting and beyond. Nat. Rev. Immunol. 12, 517-531 (2012).
- Nutt, S. L., Hodgkin, P. D., Tarlinton, D. M., Corcoran, L. M. The generation of antibody-secreting plasma cells. Nat. Rev. Immunol. 15, 160-171 (2015).
- Bartel, D. P. MicroRNAs: target recognition and regulatory functions. Cell. 136, 215-233 (2009).
- Fabian, M. R., Sonenberg, N., Filipowicz, W. Regulation of mRNA translation and stability by microRNAs. Annu. Rev. Biochem. 79, 351-379 (2010).
- White, C. A., et al. Histone deacetylase inhibitors upregulate B cell microRNAs that silence AID and Blimp-1 expression for epigenetic modulation of antibody and autoantibody responses. J Immunol. 193, 5933-5950 (2014).
- Farh, K. K., et al. Genetic and epigenetic fine mapping of causal autoimmune disease variants. Nature. 518, 337-343 (2015).
- Nagalakshmi, U., Waern, K., Snyder, M. RNA-Seq: a method for comprehensive transcriptome analysis. Curr Protoc Mol Biol. , 11-13 (2010).
- Martin, J. A., Wang, Z.
- Luo, S. MicroRNA expression analysis using the Illumina microRNA-Seq Platform. Methods Mol. Biol. 822, 183-188 (2012).
- Shen, T., Sanchez, H. N., Zan, H., Casali, P. Genome-wide analysis reveals selective modulation of microRNAs and mRNAs by histone deacetylase inhibitor in B cells induced to uUndergo class-switch DNA recombination and plasma cell differentiation. Front. Immunol. 6, 627 (2015).
- Trapnell, C., et al. Differential gene and transcript expression analysis of RNA-seq experiments with TopHat and Cufflinks. Nat Protoc. 7, 562-578 (2012).
- Kin, T., et al. fRNAdb: a platform for mining/annotating functional RNA candidates from non-coding RNA sequences. Nucleic Acids Res. 35, D145-D148 (2007).
- Agarwal, V., Bell, G. W., Nam, J. W., Bartel, D. P. Predicting effective microRNA target sites in mammalian mRNAs. Elife. 4, (2015).
- Griffiths-Jones, S., Saini, H. K., van Dongen, S., Enright, A. J. miRBase: tools for microRNA genomics. Nucleic Acids Res. 36, D154-D158 (2008).
- Anders, G., et al. doRiNA: a database of RNA interactions in post-transcriptional regulation. Nucleic Acids Res. 40, D180-D186 (2012).
