Summary
후 성적인 요소는 유전자 발현을 조절 하 고 B 세포 기능을 조절 하는 유전자 프로그램으로 작용할 수 있습니다. 결합 하 여 체 외에서 B 세포 자극, qRT-PCR, 및 높은 처리량 예측에 관한 시퀀스 및 mRNA 순서 접근, 우리 B 세포에서 miRNA 및 유전자 표현의 epigenetic 변조를 분석할 수 있습니다.
Abstract
항 체 응답은 신체적인 hypermutation (SHM), 클래스-스위치 DNA 재결합 (CSR), 및 플라즈마 세포 분화를 포함 하 여 몇 가지 중요 한 B 세포-기본 프로세스를 통해 수행 됩니다. 최근 몇 년 동안, 후 성적인 수정 또는 히스톤 deacetylation 및 microRNAs (miRNAs) 같은 요인 보였다 epigenetic 요인의 부전으로 이어질 발견 되었습니다 동안 모양 항 체 반응, B-세포 유전 프로그램 상호 작용 autoantibody 응답입니다. Epigenetic 변조기에 B 세포에 게놈 넓은 miRNA 및 mRNA 표정 분석 하는 것이 B 세포 기능과 항 체 반응의 후 성적인 규정을 이해 하는 데 중요 합니다. CSR 및 플라스마 세포 감 별 법을 B 세포를 유도, 히스톤 deacetylase (HDAC) 억제제 (HDIs)와이 B 세포 치료 및 mRNA와 예측에 관한 식 분석 프로토콜을 설명 합니다. 이 프로토콜에 직접 보완 DNA (cDNA) 시퀀스를 사용 하 여 다음-세대 mRNA 시퀀싱 (mRNA-seq) 미르-seq 기술과 시퀀싱의 게놈, 그리고 양이 많은 반전 녹음 방송 (qRT)를 읽고 분석-PCR. 이러한 방법으로 우리는 정의 B 세포는 CSR 및 플라스마 세포 감 별 법을 유도, HDI, 후 레 귤 레이 터, 선택적으로 miRNA 및 mRNA 표정 변조 CSR 및 플라즈마 세포 분화를 변경.
Introduction
후 성적인 부호 또는 DNA 메 틸 화, 히스톤 posttranslational 수정, 및 비 코딩 RNAs (microRNAs 포함) 같은 요인 유전자 식1을 변경 하 여 세포 기능을 조절. 후 성적인 수정 B 림프 구 기능, 면역 글로불린 종류 스위치 DNA 재결합 (CSR), 신체적인 hypermutation (SHM), 및 메모리 B 세포 또는 플라스마 세포, 항 체 및 autoantibody 변조 함으로써 차별화 등 규제 응답2,3. CSR과 SHM 비판적으로 높은 T-종속 및 T-독립 항4B 세포에서 유도 된 활성화 유도 cytidine deaminase (원조, Aicda로 인코딩된), 필요 합니다. 클래스-전환/hypermutated B 셀 추가 1 (Blimp1, Prdm1로 인코딩된)5패션 비판적으로 유도 하는 B 림프 구 성숙 단백질에 의존에 항 체의 대량 분 비 플라즈마 세포로 분화. 탈 항 체/autoantibody 반응, 알레르기 반응 또는 면역1,4이어질 수 있는 B 세포에서 비정상적인 epigenetic 변화 될 수 있습니다. 어떻게 후 성적인 요소 이해, miRNAs, 같은 변조 B 세포 내장 유전자 발현은 백신 개발에 대 한 중요 한 뿐만 아니라 그러나 또한 잠재적인 비정상적인 항 체/autoantibody 응답의 메커니즘을 필수적 이다.
Histone acetylation와 deacetylation는 히스톤 단백질 히스톤 acetyltransferase (모자) 및 히스톤 deacetylase (HDAC)에 의해 일반적으로 촉매에 리 진 잔류물의 수정. 이러한 수정 chromatin의 증가 또는 감소 접근으로 이어질 더 허용 또는 녹음 방송 요인 또는 단백질의 바인딩을 DNA와 유전자 식이5,6, 의 변경 방지 7 , 8. HDAC 저 해제 (HDI)는 HDACs의 기능을 방해 하는 화합물의 클래스. 여기, 우리는 B 세포의 본질적인 유전자 식 프로필에와 그것의 메커니즘에 HDAC의 규제를 해결 하기 위해 HDI (VPA)를 사용.
miRNAs는 작은, 비 코딩 RNAs 약 18 ~ 22 뉴클레오티드 길이에서 여러 단계를 통해 생성 되는. miRNA 호스트 유전자 변하게 되 고 머리 핀 기본 microRNAs (pri-miRNAs)를 형성 한다. 그들은 선구자 miRNAs (pre-miRNAs)에 pri miRNAs는 더 처리는 세포질에 수출 된다. 마지막으로, 성숙 miRNAs는 사전 miRNAs의 분열을 통해 형성 된다. miRNAs는 3' 번역된의 영역 내에 그들의 표적 mRNAs6,7보완 시퀀스를 인식합니다. Post-transcriptional 입을 통해 miRNAs 확산, 감 별 법, apoptosis10,11같은 세포 활동을 조절. 여러 miRNAs 동일한 mRNA를 타겟팅 할 수 있기 때문에 하나 하나의 miRNA 잠재적으로 여러 mRNAs를 타겟팅 할 수 있습니다, 개인의 가치와 miRNAs의 집단 효과 이해 하는 미르 식 프로필의 직접 보기 중요 하다. miRNAs B 세포 개발 및 주변 차별화로 B-세포 단계 특정 분화, 항 체 응답 및 면역1,,49에 포함 될 표시 되었습니다. 에 3' UTR Aicda 및 Prdm1의 여러 검증 또는 예측 진화론 보존된 사이트 miRNAs8여 대상이 될 수 있다.
히스톤 후 전사 수정 등 miRNAs, epigenetic 변조 유전자 식9의 셀 유형과 셀 단계-특정 규칙 패턴을 표시 합니다. 여기, miRNA 및 mRNA 표현, CSR, 그리고 플라즈마 세포 분화의 HDI 중재 변조를 정의 하는 방법을 설명 합니다. 이러한 CSR 및 플라즈마 세포 분화;을 B 세포를 유도 대 한 프로토콜을 포함 HDI;와 B 세포를 치료에 대 한 qRT-PCR, 미르-seq, 및 mRNA seq10,11,12,,813miRNA 및 mRNA 표정 분석을 위한.
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Protocol
프로토콜의 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 샌안토니오에서 건강 과학 센터 택 사스 대학 동물 보호 지침을 따릅니다.
1. 자극의 마우스 B 세포 CSR, 플라즈마 세포 분화 및 HDI 처리
- 비장 세포 현 탁 액의 준비
참고: 마우스를 제외 하 고 층 류 두건에 모든 단계를 수행 안락사와 해 부입니다.- 는 특정 병원 체 무료 C57BL/6J CO 2 흡입에 의해 (나이 8-12 주) 마우스 Euthanize.
- 위 복 부와 해 보드에 마우스를 하다. 피하 주사 바늘 1.5-18-게이지, 마우스의 모든 4 개 피트를 핀.
- 70% 에탄올에 젖은 잎사귀를 사용 하 여 피부를 소독.
- 압력가 수술 도구 (집게와 해가 위) 바로 시각화 (간 바로 아래 복 부의 왼쪽)에 비장 하 흉 곽 아래 피부를 통해 잘라의 1 세트를 사용 하 여.
- 다른 살 균 겸 자 사용 하 고 집게로 비장을 부드럽게 클램핑 및 해 부와 모든 연결 조직에서 절단 하 여 복 부의 더 큰 곡률 아래 거짓말 비장 추출 하가 위가 위. 모든 연결 조직을 제거 있는지 확인 하십시오.
- 1.5 mL microcentrifuge 튜브를 포함 하는 완전 한 RPMI1640 매체의 1000 µ L로 비장의 장소 (RPMI 1640 매체 보충 10% 열 비활성화 태아 종 아리 혈 청 (FBS), 2 mM L-글루타민, 100 µ g/mL 페니실린, 100 µ g/mL 스, 0.25 µ g/mL 암포 B, 및 50 µ M β-mercaptoethanol).
- 50 mL 폴 리 프로필 렌 원뿔 원심 분리기 튜브로 70 µ m 셀 스 트레이너를 배치 하 고 셀 여과기에 microcentrifuge 튜브에서 비장을 부 어. 15 mL 원뿔 폴 리 프로필 렌 원심 분리기 튜브의 끝을 사용 하 여 부드럽게 스 트 레 통해 비장을 매쉬. 완전 한 매체의 15 ~ 20 mL와 함께 셀 여과기 린스.
- 5 분 및 삭제는 상쾌한 350 x g에서 셀 아래로 회전.
- 비장 세포 정지에서 붉은 혈액 세포를 제거합니다. ACK 세포의 용 해 버퍼 (5 mL 당 비장)에 셀 펠 릿을 resuspend. 가끔 떨고와 실 온에서 4 분 동안 품 어 고 다음 완전 한 매체의 25 mL와 끄다.
- 스핀 5 분 350 x g에서 셀 고는 상쾌한 삭제. 완전 한 매체의 1 또는 10 mL에 셀 펠 릿을 resuspend. hemocytometer를 사용 하 여 가능한 셀.
- B-세포 격리
참고: 부정적인 선택 다음 제조 업체에 의해 격리 B 셀 ' s 지시. 비-B 세포는 비 B 세포 (CD4, CD8, CD11b, CD43, CD49b, CD90.2, Ly-6 C/G (Gr-1), 및 TER119)와 streptavidin 입히는 자석 입자에 대하여 지시 하는 biotinylated 항 체와 제거에 대 한 대상. - 준비 1 x 10 8 셀/mL 살 균 5 mL (12 x 75 mm) 폴리스 티 렌에 완전 한 매체에서의 0.25 ~ 2 mL 세포 현 탁 액
- 라운드-하단 튜브. 샘플을 정상적인 쥐 혈 청 (50 µ L/mL)을 추가.
- 추가 50 µ L/mL 격리 샘플을 칵테일. 부드럽게 pipetting으로 셀을 혼합 최대 아래로 2-3 시간 및 10 분에 대 한 실 온에서 품 어
- 샘플에 75 µ L/mL streptavidin 입히는 자석 입자를 추가합니다. 부드럽게 위아래로 pipetting으로 혼합물을 섞어 2-3 시간 실 온에서 2.5 분 동안 품 어와.
- 완료 RPMI 1640 매체를 추가합니다. 부드럽게 위아래로 2-3 번 pipetting으로 세포를 혼합.
- 자석에 (뚜껑) 없이 튜브를 놓고 새로운 15 mL 원뿔 튜브에 손길이 닿지 않은 B 세포를 포함 하는 상쾌한에서 2.5 분 부에 대 한 실 온에서 품 어.
- 는 Hemocytometer 고 Trypan 푸른 얼룩을 사용 하 여 가능한 셀을 계산 합니다. B220 등 CD19 B 세포 표면 마커 흐름 cytometry 분석에 의해 B 세포의 순도 평가.
- 10 6 셀/mL x 0.3의 최종 농도에 완전 한 RPMI 1640 매체에 순화 B 셀 Resuspend.
- 48-잘 셀 문화 접시를 사용 하 여 세포 배양에 대 한. 각 잘 순화 된 B-세포 현 탁 액 (0.3 x 10 6 셀/mL), 대장균, IL-4 (마지막 5 ng/mL 농도), 그리고 0에서 LPS (최종 농도 3 µ g/mL) 또는 500 µ M HDI (valproic 산; 1 mL을 추가 VPA).
- QRT-PCR 및 높은 처리량 mRNA와 미르 시퀀싱 분석을 위한 60 h 또는 흐름 cytometry 분석을 위한 96 h 37 ° C, 5% CO 2에서 셀을 품 어.
- 문화의 96 h 후 여러 번 위아래 세포를 pipetting으로 각 우물에서 셀 분리. Microcentrifuge 1.5 mL 튜브에 세포 현 탁 액을 전송 합니다. 벤치 가기 원심 분리기를 사용 하 여 5 분 동안 350 x g에서 셀 아래로 회전 하 고는 상쾌한 삭제.
- HBSS 버퍼 1 %BSA 및 0.5 ng/mL fluorescein (FITC)-100 µ L 셀 resuspend - 마우스 IgM 항 체 (Ab) , 0.2 ng/mL allophycocyanin (APC) 안티 염소를 활용된-활용된 쥐 반대로 마우스 IgG1 단일 클로 널 Ab (mAb), 0.2 ng/mL phycoerythrin (PE)-쥐 반대로 마우스 B220 mAb, 0.2 ng/mL PE Cy7 활용 된 쥐 반대로 마우스 CD138 mAb, 및 2 ng/mL 7-aminoactinomycin 활용 된 D (7-AAD).
- 셀 형광 활용 된 항 체 (단계 1.4.2) 30 분에 대 한 실 온에서 어둠에서을 품 어
- 1 %BSA HBSS의 1 mL로 세포 세척.
- 벤치탑 원심 분리기 및 삭제는 상쾌한 사용 하 여 5 분 동안 1500 x g에서 셀 아래로 회전.
- 1 %BSA HBSS의 300 µ L 셀 resuspend 고 라운드-하단 폴리스 티 렌 튜브에 세포 현 탁 액을 전송. 빛에 노출을 피하기 위해 호 튜브 커버.
- 수행 흐름 cytometry 분석 단일 셀 서 스 펜 션에. 각 보상 샘플 50000 이벤트와 다른 샘플에 대 한 250000 이벤트를 수집 합니다. 장비 소프트웨어를 사용 하 여 데이터를 분석.
- 펄스 형상 게이트 (FSC-H FSC-A와 SSC-H SSC A x x)를 사용 하 여 파편과 남자를 제거 합니다. 적절 하 게 죽은 세포를 제외 하려면 7-AAD에 작 게이트.
2. 높은 처리량 mRNA-Seq
작은 RNA는 제조 업체에 따라 복구할 수 있는 총 RNA 격리 키트를 사용 하 여 2-4 × 10 6 셀에서 총 RNA를 추출 하는 문화의- 후 60 h ' s 지시. DNase를 포함 나 치료 단계.
- 는 bioanalyzer, 다음 제조 업체를 사용 하 여 RNA 무결성 확인 ' s 지침.
- 사용 높은-품질 총 RNA의 500-1000 ng (RNA 무결성 번호 린 > 8.0) RNA-seq에 대 한 상업적인 RNA와 라이브러리 준비 샘플 p다음 제조업체 담당자 키트 ' s 지침.
- 는 어댑터의 그들의 각각 6-혈압 인덱스 부분에 따라 개별 mRNA-seq 라이브러리 수영장 및 50 bp/시퀀스에서 라이브러리 순서. 제조 업체에 따라 높은 처리량 DNA 시스템을 사용 하 여 ' s 프로토콜.
- 시퀀싱 실행 후에 각 샘플의 fastq 파일을 생성 하는 CASAVA와 demultiplex. 읽기 매핑 및 이전 개요 11로 생물 정보학 분석 수행.
- 는 TopHat2 기본 설정 14를 사용 하 여 그들의 참조 게놈 (UCSC 마우스 게놈 빌드 mm9)와 모든 시퀀싱 읽기 맞춥니다. 모든 샘플에서 유전자 당 수를 HTSeq-카운트를 사용 하 여 정렬에서 bam 파일을 처리.
3. 높은 처리량 미르-Seq
- 사용 100 ng-1 µ g의 높은-품질 총 RNA에서 준비 단계 상업 작은 RNA-seq 키트를 사용 하 여 작은 RNA-seq 라이브러리 준비를 위한 2.1.
- Ligate 퇴 화 3 ' 5에 어댑터 ′ 상업 결 찰 키트와 함께 시작 작은 RNA 분자의 끝. 선 퇴 화 5 ' 3에 어댑터 ′ 상업 결 찰 키트와 함께 시작 작은 RNA 분자의 끝. 반전 녹음 방송으로 cDNA에 RNA를 변환 하 고 상업 키트와 PCR 증폭에 의해 작은 RNA-seq 라이브러리를 증폭.
- 마지막 작은 RNA-seq 라이브러리를 분리 하는 6 %TBE 네이티브 페이지 젤을 사용 합니다. Bromophenol 염료 추적 블루 밴드 젤 (0.5-1 ㎝)의 하단에 가까워질 때까지 200 V에서 1 X TBE 버퍼와 젤을 실행.
- 유리 접시에서 젤을 제거 하 고 2-3 분 젤 UV transilluminator 또는 다른 젤 문서 악기에 밴드 하는 시각화에 대 한 깨끗 한 용기에 ethidium 평범한 사람 (물에 0.5 µ g/mL)와 얼룩.
- 잘라 깨끗 한 면도기를 사용 하 여 150 ~ bp 밴드 고 1.7 mL 튜브에 배치.
- 제조업체 지침 당 젤 추출 키트를 사용 하 여 DNA를 추출.
- 상업 고감도 DNA 분석 결과와 최종 도서관과 제조 업체 당 상업 dsDNA 분석 결과와 농도의 크기 분포를 확인 ' 지침.
- 증폭 및 후속 시퀀싱 실행 제조 업체 당 상업 높 처리량 DNA 시퀀싱 시스템 라이브러리를 풀 ' s 프로토콜.
- 제조 업체 당 각 샘플에 대 한 fastq 파일을 생성 하는 CASAVA와 Demultiplex ' s 프로토콜.
- 각 샘플의 작은 RNA-seq 분석을 사용 하 여 깜박임 제조 업체 당 작은 RNA 정렬에 대 한 ' s 프로토콜.
- RRNA, 뇌관, 미토 콘 드리 아, 같은 오염 물질에 정렬 되 고 읽기 제거.
- 성숙 미르 시퀀스를 데이터 정렬.
- 머리 핀 루프 시퀀스 (전조 미르)에 데이터를 정렬.
- 맞춤 데이터를 다른 작은 RNA (fRNA 데이터베이스를 사용 하 여) 시퀀스 15.
- 모든 샘플은 계량 후 다른 그룹/샘플 사이 차동 표현된 miRNAs 정의. 예측 대상으로 선택 된 mRNAs 또는 선택적 미르 TargetScan 16, 소 17, PicTar 등 온라인 miRNA 표적 예측 도구를 사용 하 여 대상이 될 수 있는 mRNAs miRNAs 18 .
- 기능 주석 또는 통로 분석, 필요한 경우 제출 독창성 통로 분석 (IPA) 예측된 유전자 또는 데이비드.
4. MRNAs와 miRNAs의 양적 RT-PCR (qRT-PCR)
- mRNA의 qRT-PCR 분석
- RNA 추출에서 0.2-5 × 10 6 셀 다음 작은 RNA를 복구할 수 있는 상업 총 RNA 격리 키트를 사용 하는 제조 업체 ' s 지시. DNase를 포함 나 치료 단계.
- 올리고 dT 프라이 머를 사용 하 여 첫번째 물가 cDNA 합성 시스템 총 RNA 로부터 cDNA를 합성.
- 다음 프로토콜 실시간 PCR 마스터 믹스 x 2를 사용 하 여 적절 한 뇌관으로 qRT-PCR에 의해 cDNA를 계량: 95 ° C 15에 대 한 s, 10 94 ° C의 40 주기 s, 60 ° C 30에 대 한 s, 및 72 ° C 30에 대 한 s.
- 72 ° C 확장 단계 동안 데이터 수집을 수행 하 고 95 72에서 녹는 곡선 분석을 수행 ° c.
- miRNA의 qRT-PCR 분석
- 단계 4.1.1에서에서 준비 하는 샘플에서 Aliquot RNA.
- CDNA로 RNA 반전 녹음입니다. 제조 업체에 따라 상업 예측에 관한 반전 녹음 방송 키트를 사용 ' s 지침.
- 250 nM 성숙한 미르 앞으로 뇌관으로 함께에서 범용 역 뇌관 SYBR 녹색 실시간 PCR 마스터 믹스를 사용 하 여 예측에 관한 실시간 PCR를 수행 합니다.
실 온에서
- 재개 2 x PCR 주인 혼합, 미르 관련 앞으로 뇌관, 및 보편적인 반전 뇌관. 개별 솔루션을 혼합.
- 준비 25 µ L 당 잘 반응 볼륨 (96-잘 PCR 번호판에 사용)에 대 한 반응 혼합으로 다음과 같습니다:
PCR 마스터 믹스 12.5 µ L x 2
미르 전달 뇌관 (2.5 μ M) 2.5 µ L
유니버설 반전 뇌관 (2.5 μ M) 2.5 µ L
RN ase 무료 water5 µ L - 96 잘 PCR 플레이트에 반응 혼합의 추가 22.5 μ. 개별 판 우물에 추가할 템플릿 cDNA (50 세-3 ng)의 2.5 µ L.
- 단단히 접시 영화 인감. 1000 x g 및 실내 온도에서 1 분 동안 접시를 원심.
- 실시간 cycler에 접시를 놓고 다음과 같은 순환 프로그램 시작: 5 분, 15 94 ° C의 40 주기 동안 95 ° C s, 55 ° C 30에 대 한 s, 및 72 ° C 30에 대 한 s.
- ΔΔCt 메서드를 사용 하 여 스프레드시트와 qRT-PCR 데이터 분석을 위해. 정상화 표현의 작은 핵/nucleolar RNAs Rnu6/RNU61/2, Snord61/SNORD61, Snord68/SNORD68, 및 Snord70/SNORD70 관련 miRNAs의 표정.
- 통계 분석
- 통계 분석 p 값으로 결합 하 고 학생 홀을 수행 ' s t- 스프레드시트를 사용 하 여 테스트 및 p 값 고려 <로 0.05 상당한.
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Representative Results
LPS와 함께 배치 하는 B 세포를 정화 우리의 프로토콜을 사용 하 여 (3 µ g/mL) 및 IL-4 (5 ng/mL)에 96 h IgG1에 CSR의 30-40% 및 플라즈마 세포 분화의 ~ 10%를 일으킬 수 있다. HDI (500µM VPA) 치료, 후에 IgG1 CSR 감소 10-20%, 플라스마 세포 감 별 법 ~ 2%로 감소 하는 동안 (그림 1). CSR의 HDI 중재 금지 추가 후 재결합 Iμ Cγ1 및 성숙한 VHDJH의 감소 수에 의해 확인 되었다-완료 된 CSR의 Cγ1 증명서. QRT-PCR로 측정 된, CSR/SHM, Prdm1 및 Xbp1, 플라즈마 세포 차별화에 대 한 중요 한 중요 Aicda, 표현의 VPA (그림 2)에 의해 저해를 표시 했다.
HDI B 세포에 의해 mRNA 식의 변조는 매우 선택적 이었다. 이러한 높은 표현된 mRNAs의 0.3%만 HDI 두 배 이상으로 upregulated 되었고 높은 표현의 0.36%만 mRNA-seq B 세포 자극된 LPS와 IL-4에에서 의해 측정 된 (> 20 복사본/HDI 치료 없이 B 셀에 셀) mRNAs, 를 포함 하 여 Aicda, Prdm1, 및 Xbp1, HDI (그림 3) 50% 이상 감소 했다.
Aicda, Prdm1, 및 Xbp1 식 downregulation 잠재적으로 유전자 발현의 부정적인 레 귤 레이 터는 miRNAs에 의해 중재 될 수 있습니다. 미르 (TargetScan.org, miRNA.org, 및 miRbase.org) 예측 도구를 타겟팅을 사용 하 여 여러 miRNAs Aicda 또는 Prdm1잠재적으로 대상 수 있는 파악. B 세포에서 프로 파일링 미르 미르-seq 분석 치료 HDI 또는 전무 HDIs 보여주었다 선택적으로 upregulate Aicda- 및 Prdm1-miRNAs (그림 4-6)를 대상으로.
그림 1. B 셀 표식 B220, 표면 항 체 IgG1, 및 플라즈마 세포 마커 CD138의 표면 표현 cytometry에 의해 분석 되었다.
B220+ IgG1+ 세포 B 세포 IgG1 전환 했다. B220낮은CD138+ 세포 플라스마 세포를 했다. IgG1 전환 B 세포와 B 세포 자극된 96 h LPS 및 IL-4 대 0의 존재 또는 HDI (VPA, 500 M)에서 플라즈마 세포의 백분율 문 내 수로 표시 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2입니다. 완성 된 CSR;의 표현 성숙한 VHd JH-Cγ1 성적 및 후 재결합 Iμ Cγ1 증명서; 그리고 Aicda, Prdm1, Xbp1 qRT-PCR에 의해 분석, Cd79b 성적으로 정규화 그리고 히스토그램에 표시 된.
B 세포 자극된 500 µ M VPA의 LPS와 IL-4에에서 유전자 발현 유전자 발현에 관련 된 B 전무의 존재 같은 자극으로 셀 1로 묘사 했다. 데이터는 3 개의 독립적인 실험에서. p 값, 쌍체 t-테스트. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3입니다. B 세포 LPS와 IL-4 자극 했다 HDI (VPA, 500 µ M)으로 치료 또는 60 h. mRNA 표현에 대 한 없음이 mRNA에 의해 분석
(3 개의 독립적인 실험 (백만 매핑된 읽기, RPKMs 당 kilobase 당 읽기) A) 평균 mRNA 식 레벨 분산형 플롯에 묘사 했다. 각 플롯 한 개별 mRNA 식 수준에 해당합니다. 두 개의 점선된 라인은 두 배 선. 최고 파선 위에 있는 플롯을 흩어 또는 하단 아래 파선 두 배 이상 많은 표현 mRNAs 또는 절반 때 각각 VPA 및 없음에 의해 유도 된 나타냅니다. (B) 막대 그래프 묘사 LPS에 mRNA 식 수준 (평균 RPKMs 3 개의 독립적인 실험에서)에서 평균 변화 및 IL 4 자극 하는 B 세포 B 세포에 비해 HDI, 치료 치료 없음. 평균 RPKM에만 mRNAs > 20 LPS와 IL 4 자극 하는 B 세포 없음 치료 포함 됩니다. 각 개별 실험에 mRNA 식 점도 (C) 또는 막대 그래프 (D)와 같이에서 마찬가지로 같은 방식으로 (A) 및 (B) 묘사 된다. p 값, 쌍체 t-테스트. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4입니다. B 세포 LPS와 IL-4 자극 했다 HDI (VPA, 500 µ M)으로 치료 또는 60 헤 미르 식 전무가 miRNA에 의해 분석
(A)는 변화에 비유 된 as HDI로 치료 하는 B 세포에 평균 미르 식 수준에서 B 세포에서 전무로 치료 막대 그래프에 의해 묘사 했다. (B) B에 미르 식 수준에서 변경 셀에 비유 된 as HDI로 치료 B 셀에 없음에 3 개의 독립적인 실험 치료 막대 그래프에 의해 묘사 했다. 평균 rpm만 miRNAs > 0.5 LPS와 IL 4 자극 하는 B 세포 없음 치료 포함 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5입니다. 미르가 여 같이 HDI Aicda-miRNAs, 타겟팅의 식을 증가합니다
(A) 시퀀스는 miRNAs와의 그들의 대상에는 3' UTR Aicda mRNAs의 맞춤입니다. (B) B 세포는 60 h에 대 한 HDI (VPA, 500 M)의 유무에 LPS와 IL-4 경작 했다. 대상 Aicda 3' UTR에 예측 했다 miRNAs의 표정 미르-seq에 의해 분석 하 고 RPM으로 묘사 했다. p 값, 쌍체 t-테스트. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 6입니다. 미르가 여 HDI의 Prdm1-miRNAs, 타겟팅 식 증가
(A) 시퀀스는 miRNAs와의 그들의 대상에는 3' UTR Prdm1 mRNAs의 맞춤입니다. (B) B 세포는 LPS와 IL-4 60 h. Prdm1 대상 3' UTR 미르-seq 분석 되었고 RPM으로 묘사 예측 했다 miRNAs의 표정에 대 한 HDI (VPA, 500 M)의 유무에 경작 했다. p 값, 쌍체 t-테스트. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
이 프로토콜 B 셀 클래스 스위칭 및 플라즈마 세포 분화; 유도에 포괄적인 접근을 제공 합니다. epigenetic 변조기, 즉 HDI;에 의해 그들의 영향을 분석 하 그리고이 세포에서 mRNA와 미르 식에 HDI의 효과 검색 합니다. 이러한 방법의 대부분은 또한 인간 B 세포 기능 및 mRNA/miRNA 표정에 epigenetic 요인의 영향을 분석 하 사용할 수 있습니다. QRT-PCR 및 mRNA-seq/미르-seq 접근 또한 HDIs 같은 후 변조기로 치료 하는 쥐에서 분리 하는 B 세포를 분석을 사용할 수 있습니다.
Epigenetic 조절 세포 증식, 생존, CSR 및 플라즈마 세포 분화에 영향을 미칠 수 있는 등 많은 다른 세포 기능에 영향을 줄 수 있습니다. 따라서, 세포 증식, 생존, 그리고 HDI 치료 없이 B 세포의 세포 주기를 분석 합니다. HDI에 의해 mRNA와 미르 식 또는 qRT-PCR에 의해 다른 후 레 귤 레이 터의 변조를 분석 하기 위한 과제 중 하나는 적당 한 내부 관리 유전자 또는 작은 RNA 선택 이다. 많은 일반적인 내부 관리 유전자 epigenetic 변조기에 의해 다양 한 각도를 변경할 수 있습니다. 많은 다른 내부 관리 유전자의 식 수준은 측정 하 고 qRT-PCR에 의해 특정 유전자 발현을 정상화 하는 데 사용 해야 합니다. 이 문제는 또한 mRNA-seq와 미르-seq, 어디 개별 mRNAs 또는 miRNAs의 표정 게놈 넓은 mRNA 또는 miRNA 수준으로 정규화 할 수 있습니다 해결할 수 있습니다.
mRNA-seq만 적절 한 생물 정보학 파이프라인 mRNA 식 프로필을 정의 하지 수 있지만이 이렇게 긴 noncoding RNA (lncRNA) 프로 파일을 정의할 수도 있습니다. mRNA-seq는 일반적으로 많은 + oligo(dT) 선택에 의해 RNAs의 풍부를 포함 한다. LncRNA의 수 많은 꼬리 부족 알려져 있습니다, 올리고 (dT) 선택과 관련 된 mRNA-seq 접근 lncRNA 식의 완전 한 정보를 확인할 수 없습니다. MRNA와 lncRNA 식 프로 파일의 완전 한 범위를 달성 하기 위해 rRNA 고갈 관련 된 RNA-seq 접근을 사용 한다. 우리의 실험의 대부분은, 미르, 미르-seq, mRNA-seq와 qRT-PCR을 포함 한 총 RNA 추출 하 상업 키트를 사용 합니다. 높은 처리량 시퀀싱 라이브러리 구축, 이전 총 RNA 품질 자동된 RNA, DNA와 단백질 샘플 품질 관리 시스템에는 약 수를 실행 하 여 확인 됩니다. RNA 샘플 7.0의 번호 또는 그들이 작은 RNA 라이브러리 준비를 위해 사용 하는 경우는 린은 것이 좋습니다. 더 낮은 린 숫자와 작은 RNA 종 (15-30 뉴클레오티드)의 크기 범위에서 저하 RNA 제품의 높은 %를 있다. 린 수 7.0이 하 있는 경우에, 보험은 잘 되지 않습니다. 덜-보다-이상적 RNA 샘플에 대 한 또 다른 옵션은 mRNA 격리 접근 보다는 rRNA 고갈 접근을 수행 하지만이 샘플 10 ng/mL 수 필요 합니다.
100-1000 ng 총 RNA의 mRNA-seq 여기에 사용 되는 프로토콜 최적화 되어 있다. 미르-seq 100을 사용 하 여에 대 한 ng 총 RNA, 작은 RNA-seq 라이브러리 준비의 더 민감한 작은 RNA-seq 준비 프로토콜, 대부분 알려진된 예측에 관한 분자에 일반적인 자연 구조의 활용을 따라야 한다. 가장 성숙한 miRNAs는 5'-인산 염 있고 그들의 속 통로 결과로 3'-수 산 기 그룹. 이 때문에,이 키트에서 3'와 5' 어댑터는 miRNAs에 직접 출혈 된다.
B-세포 mRNA와 미르 식에 vivo에서에 대 한 HDI의 영향 분석, 마우스 대우 될 수 있다 VPA 또는 다른 HDIs 식 수, 및 T-종속 항 NP CGG 또는 T-독립이이 마우스의 복 주입이이 HDI를 추가 하 여 항 NP LPS를 수행할 수 있습니다. B 세포는 면역 후 10 일 비장에서 정화 수 있습니다.
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Disclosures
저자 들은 아무 경쟁 금융 관심사 선언 합니다.
Acknowledgments
이 작품은 NIH 교부 금 AI 105813 및 인공 지능 079705 (PC)에 의해 지원 되었다, Lupus 연구 대상 식별 Lupus 그랜트 ALR 295955 (PC)에 대 한 얼라이언스와 관절염 국립 연구 재단 연구 부여 (HZ). TS는 의학 샌 안토니오 Xiangya UT 학교 학생 방문 프로그램의 맥락에서 소아과 의료 센터, 두 번째 Xiangya 병원, 중앙 남쪽 대학, 창사, 중국에 의해 지원 되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL/6 mice | Jackson Labs | 664 | |
| Corning cellgro RPMI 1640 Medium (Mod.) 1X with L-Glutamine (Size: 6 x 500mL; With L-Glutamine) | Fisher Scientific | MT 10-040-CV | |
| FBS | Hyclone | SH300 | |
| HyClone Antibiotic Antimycotic Solution 100 mL | Fisher Scientific - Hyclone | SV3007901 | |
| β-Mercaptoethanol | Fisher Scientific | 44-420-3250ML | |
| Falcon Cell Strainers | Fisher Scientific | 21008-952 | |
| Trypan Blue Stain 0.04% | GIBCO/Life Technologies/Inv | 15250 | |
| ACK Lysis Buffer | Fisher Scientific | BW10-548E | |
| Hausser Scientific Bright-Line Counting Chamber | Fisher Scientific | 02-671-51B | |
| EasySep Magnet | Stem Cell Technologies | 18000 | |
| Falcon Round-Bottom Polystyrene Tubes with Cap | Fisher Scientific | 14-959-1A | |
| EasySep Mouse B cell Isolation Kit | Stem Cell Tech | 19854 | |
| BD Needle Only 18 Gauge 1.5 inch SHORT BEVEL 100/box | BD Biosciences | 305199 | |
| PE/Cy7 anti-mouse CD138 (Syndecan-1) Antibody | BioLegend | 142513 (25 ug) | |
| PE-Cy7 B220 antibody | BioLegend | 103222 | |
| 7-AAD (1 mg) | Sigma Aldrich | A9400-1MG | |
| APC anti-mouse/human CD45R/B220 antibody | Biolegend | 103212 | |
| Mouse APC-IgG1 200 µg | Biolegend | 406610 | |
| FITC anti-mouse IgM Antibody | Biolegend | 406506 | |
| FITC anti-mouse/human CD45R/B220 Antibody | Biolegend | 103206 | |
| PE Anti-Human/Mouse CD45R (B220) (RA3-6B2) | Biolegend | 103208 | |
| HBSS 1X | Fisher Scientific | MT-21-022-CM | |
| Bovine Serum Albumin, Fraction V, Heat Shock Treated | Fisher Scientific | BP1600-100 | |
| LPS 25mg (Lipopolysaccharides from Escherichia coli 055:B5) | Sigma Aldrich | L2880-25MG | |
| Recombinant mouse IL-4 (carrier-free) | BioLegend | 574302 (size: 10 ug) | |
| Valproic acid sodium salt | Sigma Aldrich | P4543 | |
| SterilGARD e3 Class II Type A2 Biosafety Cabinet | The Baker Company | SG404 | |
| Large-Capacity Reach-In CO2 Incubator | Thermo Scientific | 3950 | |
| Isotemp Digital-Control Water Baths: Model 205 | Fisher Scientific | 15-462-5Q | |
| 5mL Round Bottom Polystyrene Test Tube | Fisher Scientific | 14-959-5 | |
| Corning CentriStar 15ml Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 05-538-59A | |
| 1.7 mL Microtube, clear | Genesee | 22-282 | |
| Higher-Speed Easy Reader Plastic Centrifuge Tubes 50ml | Fisher Scientific | 06-443-18 | |
| ELMI SkySpin CM-6MT | ELMI | CM-6MT | |
| Rotor 6M | ELMI | 6M | |
| Rotor 6M.06 | ELMI | 6M.06 | |
| Drummond Portable Pipet-Aid XP Pipet Controller | Drummond Scientific | 4-000-101 | |
| 25 mL serological pipette tips | Fisher Scientific | 89130-900 | |
| 10 mL serological pipette tips | Fisher Scientific | 89130-898 | |
| 5 mL serological pipette tips | Fisher Scientific | 898130-896 | |
| 48-well plates | Fisher Scientific | 07-200-86 | |
| Allegra 6 Benchtop Centrifuge, Non-Refrigerated | Beckman Coulter | 366802 | |
| GH-3.8A Rotor, Horizontal, ARIES Smart Balance | Beckman Coulter | 366650 | |
| Allegra 25R Benchtop Centrifuge, Refrigerated | Beckman Coulter | 369434 | |
| TA-15-1.5 Rotor, Fixed Angle | Beckman Coulter | 368298 | |
| Fisher Scientific AccuSpin Micro 17 | Fisher Scientific | 13-100-675 | |
| Fisher Scientific Analog Vortex Mixer | Fisher Scientific | 02-215-365 | |
| miRNeasy Mini Kit (50) | Qiagen | 217004 | |
| Direct-zol RNA MiniPrep kit | Zymo Research | R2050 | |
| Chloroform (Approx. 0.75% Ethanol as Preservative/Molecular Biology) | Fisher Scientific | BP1145-1 | |
| Rnase-Free Dnase set (50) | QIAGEN | 79254 | |
| NanoDrop 2000 Spectrophotometers | Thermo Scientific | ND-2000 | |
| Superscript III First-strand Synthesis System RT-PCR | Invitrogen | 175013897 | |
| iTaq Universal SYBR Green Supermix | Bio-rad | 172-5121 | |
| Fisherbrand 96-Well Semi-Skirted PCR Plates, case of 25 | Fisher | 14-230-244 | |
| Microseal 'B' Adhesive Seals | Bio-Rad | MSB-1001 | |
| MyiQ Optics Module | Bio-Rad | 170-9744 | |
| iCycler Chassis | Bio-Rad | 170-8701 | |
| Optical Kit | Bio-Rad | 170-9752 | |
| BD LSR II Flow Cytometry Analyzer | BD Biosciences | ||
| FACSDiva software | BD Biosciences | ||
| FlowJo 10 | BD Biosciences | ||
| 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2943CA | |
| S200 Focused-ultrasonicator | Covaris | S200 | |
| SPRIworks Fragment Library System I for Illumina | Beckman Coulter | A288267 | |
| cBot Cluster Generation Station | illumina | SY-312-2001 | |
| HiSeq 2000 Genome Sequencer | Illumina | SY-401-1001 | |
| TruSeq RNA Library Prep Kit v2 | Illumina | RS-122-2001 | |
| TruSeq Small RNA Library Prep Kit | Illumina | RS-200-0012 | |
| NEXTflex Illumina Small RNA Sequencing Kit v3 | Bioo Scientific | 5132-05 | |
| 2200 TapeStation | Agilent | G2964AA |
References
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