Summary
Эпигенетических факторов может взаимодействовать с генетической программы модуляции экспрессии генов и регулировать функции B клеток. Объединив в vitro клетки B стимуляции, qRT-PCR и высок объём микроРНК последовательности и мРНК последовательность подходов, мы можем анализировать эпигеномные модуляции экспрессии Мирна и генов в клетки B.
Abstract
Антитело ответы выполняются через несколько критических клетки B внутренние процессы, включая соматических Гипермутационный (ГИМ), класс переключатель рекомбинации ДНК (КСО) и дифференцировки клеток плазмы. В последние годы эпигеномные изменения или факторов, таких как гистона диацетилморфина и микроРНК (интерферирующим), было показано взаимодействовать с B-клетки генетических программах ответов антитела форму, в то время, как было установлено, что дисфункция эпигенетических факторов приводят к аутоантитела ответы. Анализ генома общесистемной Мирна и мРНК выражение в B клеток в ответ на эпигеномный модуляторы имеет важное значение для понимания эпигеномные регулирование B-клеточной функции и антител реакции. Здесь мы демонстрируем протокол для заставить клетки B пройти КСО и плазматических клеток дифференциации, рассматривая эти клетки с Ингибиторы гистоновых деацетилаз (ГДАЦ) (ГУВБ) и анализа выражение mRNA и микроРНК. В этом протоколе, мы непосредственно анализировать дополнительные ДНК — (cDNA кДНК) последовательности, используя последовательность мРНК следующего поколения (мРНК seq) и Мирна seq технологий, картирование секвенирования читает генома и количественная обратная транскрипция (qRT)-PCR. С этими подходами мы определили, что в индуцированной пройти КСО и дифференцировки клеток плазмы клетки B, ИРЧП, эпигенетических регулятор, выборочно модулирует Мирна и мРНК выражения и изменяет КСО и плазматических клеток дифференциации.
Introduction
Эпигенетических меток или факторов, таких как метилирование ДНК, Посттрансляционная изменения гистона и РНК-кодирования (включая микроРНК), модулировать функции клеток путем изменения выражения гена1. Эпигенетические модификации регулировать функции лимфоцитов, например иммуноглобулинов класса переключатель рекомбинации ДНК (КСО), соматические Гипермутационный (ГИМ) и дифференциации в памяти B клетки или клетки плазмы, таким образом модулируя антитела и аутоантитела ответы2,3. КСО и SHM критически требуют активации индуцированной Цитидин Аденозиндеминазный (помощь, кодируются как Aicda), который высоко индуцируется в B клеток в ответ на Т-зависимых и T-независимая антигены4. Класс включен/hypermutated клетки B Далее дифференцироваться в плазматические клетки, которые выделяют большое количество антител в значительной степени зависит от созревания лимфоцитов индуцированного белка моды 1 (Blimp1, кодируются как Prdm1)5. Аномальные эпигеномные изменения в клетках B может привести к аномальным антитела/аутоантител ответы, которые могут привести к аллергической реакции или Аутоиммунная реакция1,4. Понимание как эпигенетических факторов, таких как адаптивной, модулировать клетки B встроенные выражения гена важно не только для разработки вакцины, но важно также выявить механизмы потенциальной реакции ненормальные антител/аутоантител.
Ацетилирование гистона и диацетилморфина являются модификациями остатков лизина на гистоны обычно катализируемой гистона ацетилтрансфераза (ШЛЯПУ) и гистоновых деацетилаз (ГДАЦ). Эти изменения приводят к рост или снижение доступности хроматина и далее разрешить или запретить связывание транскрипционных факторов или белки ДНК и изменением ген выражение5,6, 7 , 8. ингибиторы ГДАЦ (ИРЧП) являются класс соединений, которые вмешиваются с функцией гда. Здесь мы использовали HDI (VPA) для решения регулирование HDAC на профиль выражение внутренней гена B клеток и его механизм.
интерферирующим являются маленькие, -кодирования RNAs приблизительно 18-22 нуклеотидов в длину, создаваемые через несколько этапов. Мирна хост генов являются расшифрованный и формируют шпилька первичной микроРНК (pri адаптивной). Они экспортируются в цитоплазму, где pri адаптивной Далее перерабатывается в адаптивной прекурсоров (pre адаптивной). Наконец зрелый интерферирующим образуются путем расщепления pre адаптивной. интерферирующим признают взаимодополняющие последовательности в 3' непереведенные регионе их целевой mRNAs6,7. Через post-transcriptional глушителей, адаптивной регулировать клеточную активность, например распространение, дифференциация и апоптоз10,11. Поскольку несколько интерферирующим можно ориентировать же мРНК, а один единый Мирна потенциально может предназначаться нескольких мРНК, важно иметь представление в контексте выражение профиля Мирна понять значение человеческой личности и коллективный эффект адаптивной. интерферирующим было показано, быть вовлечены в развитие B-клеток периферической дифференциации, а также B-клеточной стадии конкретных дифференциации, реакции антитела и аутоиммунные заболевания1,4,9. В 3' УТР Aicda и Prdm1есть несколько проверенных или прогнозируемых эволюционно сохранены сайтов, которые могут быть объектом интерферирующим8.
Эпигеномные модуляции, включая изменения гистона после транскрипции и адаптивной, отображать шаблон типа клеток и клеток стадии конкретных правил выражение гена9. Здесь мы описываем методы для определения HDI-опосредованной модуляции Мирна и выражение mRNA, КСО и дифференцировки клеток плазмы. К ним относятся протоколы для заставить клетки B пройти КСО и дифференцировки клеток плазмы; для лечения клетки B с ИРЧП; и для анализа Мирна и мРНК выражение qRT-PCR, Мирна seq и мРНК seq10,11,12,8,13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
протокол руководящими животных ухода институциональный уход животных и использование комитетов в университете центра науки здоровья Техас в Сан-Антонио.
1. стимуляции B клетки мыши для КСО, дифференцировки клеток плазмы и ИРЧП лечения
- приготовления суспензий клеток селезенки
Примечание: выполнить все шаги в Ламинарный шкаф за исключением мыши эвтаназии и рассечение.- Euthanize конкретного возбудителя свободный C57BL/6J мышь (8-12 недель возраста), CO 2 ингаляции.
- Лежит мыши на борту рассечения живота вверх. Закрепить все четыре ноги мыши с 18-калибровочного, иглы 1.5 - в.
- Стерилизации кожи с помощью 70% этанола, пропитанной салфетки.
- Использовать один набор газобетона хирургические инструменты (щипцы и рассечения ножницы), чтобы прорваться через кожу чуть ниже грудной клетки для визуализации селезенки (на левой стороне живота, чуть ниже печени).
- Использовать другой стерильный пинцет и ножницы Ножницы для извлечения селезенки, которая находится под более кривизны желудка, зажимные селезенки аккуратно пинцетом и отрезать все соединительные ткани с рассечения. Убедитесь в том удалить все соединительные ткани.
- Место селезенки в 1,5 мл microcentrifuge трубка, содержащая 1000 мкл полного RPMI1640 среднего (средне RPMI 1640 дополнена 10% тепло инактивированная плода теленка сыворотки (ФБС), 2 мм L-глютамином, 100 мкг/мл пенициллин, 100 мкг/мл стрептомицин, амфотерицин B 0,25 мкг/мл и 50 мкм β-меркаптоэтанол).
- Место стрейнер ячейки 70 мкм в 50-мл полипропиленовые конические пластиковых пробирок и залить хандры от microcentrifuge трубу на клетки ситечко. Используйте кончик трубки 15 мл полипропиленовые конические центрифуги для осторожно Маш селезенки через стрейнер. Промойте ситечко ячейки с 15 до 20 мл полного среднего.
- Оборотов клетки на 350 g x 5 мин и удалить супернатант.
- Удаление красных кровяных клеток из суспензий клеток селезенки. Ресуспензируйте Пелле ячейки в буфер lysis ACK (5 мл на селезенки). Инкубируйте 4 мин при комнатной температуре с время от времени встряхивая и затем утолить с 25 мл полной среды.
- Спин вниз клетки на 350 g x 5 минут и удалить супернатант. Ресуспензируйте Пелле клеток в 1 или 10 мл полной среды. Количество жизнеспособных клеток с помощью Горяева.
- B-клетки изоляции
Примечание: изолировать B клеток негативный выбор после производитель ' s инструкции. Non-B клетки предназначены для удаления с биотинилированным антитела, направленные против не-лимфоцитов (CD4, CD8, CD11b, CD43, CD49b, CD90.2, Ly-6C/G (Gr-1) и TER119) и покрытием стрептавидина магнитные частицы.- Подготовить 0,25-2 мл суспензии клеток 1 x 10 8 клеток/мл в полной среде в стерильный 5 мл (12 x 75 мм) полистирола раунд дно трубки. Добавление нормальных крыс сыворотка (50 мкл/мл) в.
- Добавьте 50 мкл/мл изоляции коктейль для образца. Mix клетки мягко дозирование вверх и вниз 2 - 3 раза и инкубации при комнатной температуре на 10 мин
- Добавить 75 мкл/мл стрептавидина покрытием магнитных частиц в образце. Смешайте смесь осторожно закупорить вверх и вниз 2 - 3 раза и инкубировать в течение 2,5 мин при комнатной температуре и.
- Добавить полный RPMI 1640 среднего. Mix клетки мягко закупорить вверх и вниз 2 - 3 раза.
- Положите трубку (без крышки) магнит и инкубации при комнатной температуре за 2,5 мин налить покинуть супернатанта, содержащий нетронутой клетки B в новом 15-мл конические.
- Количество жизнеспособных клеток с помощью Горяева и Трипановый синий пятно. Оценить чистоту клетки B cytometry анализ потока B-клеточной поверхности маркеров, например B220 и CD19.
- B-клетки стимуляции и ИРЧП лечение
- Ресуспензируйте очищенный клетки в полной RPMI 1640 среде в конечной концентрации 0,3 x 10 6 клеток/мл.
- Использовать плиты культуры клеток 48-хорошо для клеточной культуры. Для каждой скважины добавляют 1 мл очищенной B-клетка подвески (0,3 x 10 6 клеток/мл), ПЛАСТИНКИ (конечная концентрация 3 мкг/мл) от кишечной палочки, Ил-4 (конечная концентрация 5 нг/мл) и 0 или 500 мкм HDI (вальпроевая кислота; VPA).
- Инкубации клеток при 37 ° C и 5% CO 2 для 60 h qRT-PCR и высок объём мРНК - и Мирна последовательности анализа или 96 h для анализа потока цитометрии.
- Потока cytometry анализ КСО и дифференцировки клеток плазмы
- после 96 h культуры, отсоедините клетки от каждой скважины, закупорить клетки вверх и вниз несколько раз. Передача суспензию клеток в 1,5 мл microcentrifuge трубку. Спин вниз клетки на 350 g x 5 минут с помощью настольная центрифуга и удалить супернатант.
- Ресуспензируйте клетки с 100 мкл буфера HBSS, содержащей 1% BSA и 0,5 нг/мл флуоресцеин (FITC) - конъюгированных коза анти-– мыши IgM антител (Ab) , 0.2 аллофикоцианин нг/мл (APC)-конъюгированных крыса анти мыши IgG1 моноклональных Ab (МАБ), 0,2 нг/мл фикоэритрин (PE)-конъюгированных крыса анти мыши B220 МАБ, 0.2 нг/мл PE-Cy7-конъюгированных крыса анти мыши CD138 МАБ и 2 нг/мл 7-aminoactinomycin D (7-AAD).
- Инкубировать клетки с флуоресценции конъюгированных антител (шаг 1.4.2) в темноте при комнатной температуре за 30 мин.
- Мыть ячейки с 1 мл раствора HBSS с 1% BSA.
- Оборотов клетки на 1500 g x 5 минут с помощью настольная центрифуга и удалить супернатант.
- Ресуспензируйте клетки в 300 мкл HBSS с 1% BSA и передачи суспензию клеток в раунд дно из полистирола трубку. Обложка трубку с фольгой, чтобы избежать воздействия света.
- Выполнение потока cytometry анализ на одну ячейку подвеска. Соберите 50 000 событий для каждого образца, компенсации и 250 000 для других образцов. Анализировать данные с помощью программного обеспечения оборудования.
- Ликвидации мусора и Дуплеты с помощью импульса геометрии ворота (FSC-H x FSC-A и SSC-H x SSC-A). Надлежащим образом ворот участка на 7-AAD исключить мертвые клетки.
2. Высок-объём мРНК Seq
- после 60 h культуры, извлечение всего РНК из 2-4 × 10 6 клеток с использованием всего РНК изоляции комплект, который может восстановить малые РНК после производитель ' s инструкции. Включать DNase я лечения шаг.
- Проверки целостности РНК с помощью bioanalyzer, после производитель ' s инструкции.
- Использовать 500-1000 нг высокого качества всего РНК (РНК целостности номер Рин > 8.0) для РНК seq библиотека подготовки с коммерческой РНК образец pREP комплект после производитель ' s инструкции.
- Бассейн библиотек отдельных мРНК seq, на основе их соответствующих 6-bp индекс части адаптеров и последовательности библиотек в 50 bp/последовательности. Использовать систему ДНК высокой пропускной способности, по словам производителя ' протоколы ф.
- После выполнения виртуализации, использовать мультиплексирование с CASAVA для создания fastq файла для каждого образца. Выполнять чтение сопоставления и анализа биоинформатики, как ранее изложенные 11.
- Выровнять все последовательности чтения с их ссылку геномов (mm9 построения геноме UCSC мыши) с использованием параметров по умолчанию TopHat2 14. Процесс bam файлы из выравнивание с помощью HTSeq граф для получения сиг / ген во всех пробах.
3. Высок-объём Мирна Seq
- использования 100 нг-1 мкг высокого качества всего РНК, подготовленную в шаг 2.1, для малых РНК seq библиотека подготовки с использованием коммерческих малых РНК seq Кит.
- Ligate выродились 3 ' адаптер на 5 ′ концы начиная малых молекул РНК с комплектом коммерческих перевязки. Перевязать выродились 5 ' адаптер на 3 ′ концы начиная малых молекул РНК с комплектом коммерческих перевязки. Преобразовать РНК cDNA, обратной транскрипции и усиливать малые РНК seq библиотека по амплификации PCR с коммерческие наборы.
- Использовать 6% КЭ родной страница гель для изоляции окончательный малых РНК seq библиотеки. Побегите гель с 1 X TBE буфера на 200 V до тех пор, пока группа бромфеноловый синий, отслеживание краситель приближается к нижней части геля (0,5 - 1 см).
- Удалить гель из стекла и пятно бромидом ethidium (в воде 0,5 мкг/мл) в чистую емкость на 2-3 мин визуализировать гель полос на transilluminator УФ или другого инструмента документации гель.
- Вырезать из группы ~ 150-ВР, с использованием чистого бритвой и поместить его в 1,7 мл трубку.
- Извлечь ДНК, используя набор извлечения геля в инструкции производителя.
- Проверить распределение по размерам окончательный библиотека с коммерческого анализа ДНК высок чувствительности и концентрации с коммерческой dsDNA assay на производителей ' инструкции.
- Бассейн библиотек для амплификации и последующие последовательности запуска с коммерческой системы секвенирования ДНК высок объём за производитель ' протоколы ф.
- Демультиплексирования с CASAVA для создания fastq файла для каждого образца в производителя ' протоколы ф.
- Для малых РНК seq анализа каждого образца, используйте мерцания для малых РНК выравнивания на производителя ' s протоколы.
- Удалить чтений, которые выровняны загрязняющих веществ, таких как митохондрии, рРНК, грунты и так далее.
- Выравнивание данных в зрелые Мирна последовательностей.
- Выравнивание данных в последовательности цикла шпильки (прекурсор miRNA).
- Выравнивание данных в других малых РНК последовательности (с использованием базы данных fRNA) 15.
- После того, как все образцы количественно, определения дифференциального выраженной интерферирующим между различными группами/образцы. Предсказать адаптивной, выбранных мРНК или мРНК, которые могут быть объектом селективного Мирна, используя онлайн Мирна целевого прогноза инструменты, такие как TargetScan 16, микрокосм 17 и PicTar 18 .
- Если необходима функциональная Аннотация или путь анализ, представить предсказал гены изобретательность пути анализа (IPA) или Дэвид.
4. Количественная ПЦР (qRT-PCR) мРНК и адаптивной
- qRT ПЦР-анализа мРНК
- извлечь РНК от 0,2-5 × 10 6 клеток с использованием коммерческих всего РНК изоляции комплект, который может восстановить малые РНК, после Производитель ' s инструкции. Включать DNase я лечения шаг.
- Синтез cDNA от общего РНК с использованием праймера oligo-dT системы синтеза cDNA перв стренги.
- Количественно cDNA qRT-ПЦР с соответствующей грунтовки, используя следующий протокол 2 x реальном масштабе времени PCR Мастер микс: 95 ° C 15 s, 40 циклов 94 ° C 10 сек, 60 ° C за 30 s и 72 ° C для 30 s.
- Выполняет сбор данных на этапе расширения 72 ° C и анализ плавления кривой от 72 до 95 ° C.
- qRT ПЦР анализ Мирна
- аликвота РНК из образцов, подготовленную на этапе 4.1.1.
- , Реверс транскрибировать РНК в cDNA. Использовать коммерческие микроРНК обратной транскрипции Кит, после производитель ' s инструкции.
- Выполнять ПЦР в реальном времени с помощью SYBR зеленый реального времени PCR мастер смесь с 250 Нм Зрелые Мирна вперед грунтовки в сочетании с универсальным обратный грунт микроРНК.
- Оттепель 2 x ПЦР Мастер микс, Мирна специфического праймера вперед и реверс Универсальный грунт при комнатной температуре. Сочетание индивидуальных решений. Следующим
- готовят смесь реакции для тома 25 мкл за ну реакции (используется в 96-луночных ПЦР планшетов):
2 x 12,5 Mix Master ПЦР мкл
miRNA вперед грунтовки (2,5 мкм) 2,5 мкл
Universal обратный грунтовка (2,5 мкм) 2,5 мкл
RN ASE бесплатная воды5 мкл - Добавить 22,5 мкл реакция смеси к 96-луночных ПЦР-планшете. 2.5 мкл шаблон cDNA (50 ПГ-3 нг) для отдельных лунках.
- Плотно печать фильм пластины. Центрифуга пластину за 1 мин 1000 x g и комнатной температуре.
- Место пластину в реальном времени циклователь и запустить программу следующие Велоспорт: 95 ° C за 5 мин, 40 циклов 94 ° C 15 s, 55 ° C за 30 s и 72 ° C за 30 s.
- Используйте метод ΔΔCt для анализа данных qRT ПЦР с электронной таблицей. Нормализует выражения соответствующих интерферирующим выражение малых ядерных/ядрышковые РНК Rnu6/RNU61/2, Snord61/SNORD61, Snord68/SNORD68, и Snord70/SNORD70.
- Статистический анализ
- выполнять статистический анализ, чтобы определить значения p парные и непарные студент ' s t - тест с использованием таблицы и рассматривать значения p < 0,05 а значительное.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
С помощью нашего протокола, очищенный клетки B с ПЛАСТИНОК (3 мкг/мл) и Ил-4 (5 нг/мл) за 96 ч может вызвать 30-40% КСО для IgG1 и ~ 10% дифференцировки клеток плазмы. После лечения с HDI (500µM VPA), КСО для IgG1 сократилось до 10-20%, а дифференцировки клеток плазмы снизилась до ~ 2% (рис. 1). HDI-опосредованной ингибирование КСО далее подтвердили снижение числа после рекомбинации Iμ-Cγ1 и зрелые VHDJH-Cγ1 стенограмм, которые являются отличительной чертой завершенных КСО. Как измеряется qRT-PCR, выражение Aicda, который имеет решающее значение для КСО/SHM и Prdm1 и Xbp1, которые являются важными для дифференцировки клеток плазмы, были продемонстрированы тормозится VPA (рис. 2).
Модуляции экспрессии мРНК ИРЧП в клетки B был весьма избирательно. Как измеряется мРНК seq в клетки B стимулируется с ПЛАСТИНОК и Ил-4, лишь 0,3% этих весьма выраженным mRNAs были upregulated ИРЧП более чем два раза и только 0,36% сильно выраженной (> 20 копий/клеток в клетки без лечения ИРЧП) мРНК, включая Aicda, Prdm1, и Xbp1, были сокращены на HDI более чем на 50% (рис. 3).
Даунрегуляция Aicda, Prdm1и Xbp1 выражение потенциально может быть опосредовано адаптивной, которые являются отрицательные регуляторы экспрессии генов. С помощью Мирна ориентации инструменты прогнозирования (TargetScan.org, miRNA.org и miRbase.org), мы определили несколько адаптивной, который может потенциально целевой Aicda или Prdm1. Мирна seq анализ Мирна профилирования в клетки B относились с ИРЧП или ноль показали, что ГУВБ выборочно upregulate Aicda - и Prdm1 -ориентации интерферирующим (рисунки 4-6).
Рис. 1. Поверхности выражение маркер B220 B-клеток, поверхностные антитела IgG1 и клетки плазмы маркер CD138 были проанализированы подачей cytometry.
B220+ IgG1+ клетки были клетки B переключился на IgG1. B220низкойCD138+ клетки были плазматические клетки. Процент коммутацией IgG1 B клеток и клеток плазмы из клетки B стимулируется с ПЛАСТИНОК и Ил-4 при наличии ноль или HDI (VPA, 500 М) за 96 ч обозначаются как на номера в пределах ворот. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2. Выражение клейма завершенных КСО; Зрелые VHDJH-Cγ1 стенограммы и после рекомбинации Iμ-Cγ1 стенограмм; и Aicda, Prdm1и Xbp1 были проанализированы qRT-PCR, нормализуется до Cd79b стенограммы и показано в гистограмму.
Экспрессия генов в клетки B стимулируется с ПЛАСТИНОК и Ил-4 при наличии 500 мкм VPA и отношение к экспрессии генов в B клеток с же стимулы присутствии Нил были изображены как 1. Данные взяты из трех независимых экспериментов. p значения, парных t-теста. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
На рисунке 3. B клетки были стимулируется с ПЛАСТИНОК и Ил-4 и относились с HDI (VPA 500 мкм) или ноль для 60 h. выражение mRNA был проанализирован мРНК seq.
(A) средние уровни mRNA выражение в трех независимых экспериментах (читает за kilobase за миллион сопоставленных читает, RPKMs) были изображены в точечные участки. Каждый участок соответствует уровню одного индивидуального мРНК выражения. Две пунктирные линии являются два раза линии. Разброс участки, расположенные выше верхней пунктирной линии или ниже нижней пунктирные линии указывают на мРНК, которые выражают более чем в два раза или менее чем половину когда индуцированных VPA и ноль, соответственно. (B бар графики изображают среднего изменения в уровнях выражения мРНК (средняя RPKMs из трех независимых экспериментов) в ЛПС и Ил-4-стимулирует клетки лечат ИРЧП, по сравнению с теми в клетки B относились с нулевыми. Только mRNAs в среднем RPKM > 20 ПЛАСТИНОК и Ил-4-стимулирует B включены в клетках, обработанных с нулевым. Выражение mRNA в каждый индивидуальный эксперимент, как показано точечной (C) или гистограммы (D), изображены в так же, как в (A) и (B). p значения, парных t-теста. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4. B клетки были стимулируется с ПЛАСТИНОК и Ил-4 и относились с HDI (VPA 500 мкм) или ноль для 60 h. Мирна выражения был проанализирован Мирна seq.
(A) изменение в уровнях выражения средняя микроРНК в B-клетках, обработанных с ИРЧП по сравнению с в клетки B относиться с Нил были изображены на гистограммы. (B) изменения в уровнях выражения микроРНК в B клетках, обработанных с ИРЧП по сравнению с которые в клетки B лечить с нулевыми в трех независимых экспериментов были изображены на гистограммы. Только интерферирующим в среднем об/мин > 0,5 в ПЛАСТИНОК и Ил-4-стимулирует B включены клетках, обработанных с нулевым. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 5. ИРЧП увеличивает выражение Aicda -ориентация адаптивной, как показано, Мирна seq.
(A) последовательности выравнивание адаптивной и их целевых сайтов в 3' УТР Aicda мРНК. (B) B клетки были культивировали с ПЛАСТИНОК и Ил-4 в наличие или отсутствие HDI (VPA, 500 М) для 60 h. Выражение адаптивной, которые были предсказаны в целевых Aicda 3' УТР были проанализированы Мирна seq и изображается как об/мин. p значения, парных t-теста. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 6. ИРЧП увеличивает выражение Prdm1 -ориентация адаптивной, как показано, Мирна seq.
(A) последовательности выравнивание адаптивной и их целевых сайтов в 3' УТР Prdm1 мРНК. (B) B клетки были культивировали с ПЛАСТИНОК и Ил-4 в наличие или отсутствие HDI (VPA, 500 М) для 60 h. выражение адаптивной, которые были предсказаны целевой Prdm1 3' УТР были проанализированы Мирна seq и изображается как об/мин. p значения, парных t-теста. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Этот протокол обеспечивает всеобъемлющие подходы к заставить клетки B класса переключения и дифференцировки клеток плазмы; для анализа их воздействия на эпигеномный модуляторы, а именно ИРЧП; и обнаружить влияние ИРЧП на мРНК и Мирна выражение в этих клетках. Большинство из этих подходов может также использоваться для анализа влияния эпигеномные фактора на человека B-клеточной функции и мРНК/Мирна выражения. QRT-PCR и мРНК seq/Мирна seq подходы могут также использоваться для анализа клетки B изолированы от мышей, получавших с эпигенетическими модуляторы, например ГУВБ.
Эпигеномные модулировать может повлиять множество различных клеточных функций, таких как жизнеспособности, которые могут повлиять на КСО и плазматических клеток дифференциации и пролиферации клеток. Таким образом пролиферации клеток, жизнеспособность и циклы клетки клетки B, с или без лечения ИРЧП, должны быть проанализированы. Одной из задач для анализа модуляции мРНК и Мирна выражение ИРЧП или других эпигеномные регуляторы qRT-ПЦР является выбор подходящих уборки ген или малые РНК. Многие общие хозяйственные генов может быть изменено в различной степени, эпигенетических модуляторы. Уровни выражения многих различных уборки генов следует измерять и используется для нормализации экспрессии определенных генов qRT-ПЦР. Эта проблема может также решаться мРНК seq и Мирна seq, где выражение индивидуальных mRNAs или адаптивной могут быть нормированы генома общесистемной mRNA или Мирна уровнями.
мРНК seq можно определить не только профиль выражение mRNA с соответствующим биоинформатики конвейера, но этот подход можно также определить профиль длиной некодирующих РНК (lncRNA). мРНК seq обычно включает обогащение poly(A) + РНК путем отбора oligo(dT). Как известно, что количество lncRNA не хватает poly(A) хвосты, мРНК seq подхода, предусматривающего выбор oligo (dT) не может определить полную информацию о lncRNA выражения. Для достижения полного охвата профилей выражение mRNA и lncRNA, должны использоваться РНК seq подход с участием рРНК истощения. В большинстве наших экспериментов мы используем коммерческих комплект для извлечения всего РНК, включая Мирна, Мирна seq, мРНК seq и qRT-PCR. До создания высокопроизводительного секвенирования Библиотека, общее качество РНК проверяется путем запуска Алиготе на автоматизированной РНК, ДНК и белка образец КК системы. Рекомендуется, что РНК образцы имеют Рин количество 7.0 или выше, если они должны использоваться для малых РНК библиотека приготовления. Образцы с более низкими номерами Рин имеют высокий процент деградированных РНК продуктов в диапазоне размеров от малых РНК видов (15-30 нуклеотидов). Когда число Рин ниже 7.0, покрытие не будет так хорошо. Еще один вариант для менее чем идеальных образцов РНК — выполнить рРНК истощения подход, а не изоляции подход мРНК, но это требует, чтобы образцы по крайней мере 10 нг/мл.
Протоколы для мРНК seq используется здесь оптимизированы для 100-1000 нг всего РНК. Для Мирна seq, используя меньше 100 нг всего РНК, малые РНК seq библиотека подготовки должны следовать более чувствительны малых РНК seq подготовки протокола, который использует естественную структуру общих для большинства известных микроРНК молекул. Большинство зрелых интерферирующим имеют 5'-фосфат и 3'-гидроксильную группу в результате их биогенеза путь. Вследствие этого 3 и 5' адаптеры в этот комплект непосредственно лигируют для адаптивной.
Чтобы проанализировать влияние ИРЧП на B-клетки мРНК и Мирна выражение в естественных условиях, мышей можно лечить с помощью VPA или других ГУВБ, добавив этот HDI к питьевой воде и внутрибрюшинного введения этих мышей с Т-зависимых антигенов NP-КЭУ или T-независимой антиген NP-ПЛАСТИНОК может быть выполнена. B-клетки могут быть очищены от хандры через 10 дней после вакцинации.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют, что они не имеют никаких финансовых интересов.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана NIH грантов Ай 105813 и 079705 Ай (для ПК), Альянс для идентификации целевых исследований волчанки в Lupus Грант ALR 295955 (для ПК) и артрит, Национальный исследовательский фонд исследования Грант (в Гц). TS была поддержана педиатрии медицинский центр, второй Xiangya больницы, Центральный Южный университет, Чанша, Китай, в контексте программы посещения медицинских студент Xiangya-UT школа медицины Сан-Антонио.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL/6 mice | Jackson Labs | 664 | |
| Corning cellgro RPMI 1640 Medium (Mod.) 1X with L-Glutamine (Size: 6 x 500mL; With L-Glutamine) | Fisher Scientific | MT 10-040-CV | |
| FBS | Hyclone | SH300 | |
| HyClone Antibiotic Antimycotic Solution 100 mL | Fisher Scientific - Hyclone | SV3007901 | |
| β-Mercaptoethanol | Fisher Scientific | 44-420-3250ML | |
| Falcon Cell Strainers | Fisher Scientific | 21008-952 | |
| Trypan Blue Stain 0.04% | GIBCO/Life Technologies/Inv | 15250 | |
| ACK Lysis Buffer | Fisher Scientific | BW10-548E | |
| Hausser Scientific Bright-Line Counting Chamber | Fisher Scientific | 02-671-51B | |
| EasySep Magnet | Stem Cell Technologies | 18000 | |
| Falcon Round-Bottom Polystyrene Tubes with Cap | Fisher Scientific | 14-959-1A | |
| EasySep Mouse B cell Isolation Kit | Stem Cell Tech | 19854 | |
| BD Needle Only 18 Gauge 1.5 inch SHORT BEVEL 100/box | BD Biosciences | 305199 | |
| PE/Cy7 anti-mouse CD138 (Syndecan-1) Antibody | BioLegend | 142513 (25 ug) | |
| PE-Cy7 B220 antibody | BioLegend | 103222 | |
| 7-AAD (1 mg) | Sigma Aldrich | A9400-1MG | |
| APC anti-mouse/human CD45R/B220 antibody | Biolegend | 103212 | |
| Mouse APC-IgG1 200 µg | Biolegend | 406610 | |
| FITC anti-mouse IgM Antibody | Biolegend | 406506 | |
| FITC anti-mouse/human CD45R/B220 Antibody | Biolegend | 103206 | |
| PE Anti-Human/Mouse CD45R (B220) (RA3-6B2) | Biolegend | 103208 | |
| HBSS 1X | Fisher Scientific | MT-21-022-CM | |
| Bovine Serum Albumin, Fraction V, Heat Shock Treated | Fisher Scientific | BP1600-100 | |
| LPS 25mg (Lipopolysaccharides from Escherichia coli 055:B5) | Sigma Aldrich | L2880-25MG | |
| Recombinant mouse IL-4 (carrier-free) | BioLegend | 574302 (size: 10 ug) | |
| Valproic acid sodium salt | Sigma Aldrich | P4543 | |
| SterilGARD e3 Class II Type A2 Biosafety Cabinet | The Baker Company | SG404 | |
| Large-Capacity Reach-In CO2 Incubator | Thermo Scientific | 3950 | |
| Isotemp Digital-Control Water Baths: Model 205 | Fisher Scientific | 15-462-5Q | |
| 5mL Round Bottom Polystyrene Test Tube | Fisher Scientific | 14-959-5 | |
| Corning CentriStar 15ml Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 05-538-59A | |
| 1.7 mL Microtube, clear | Genesee | 22-282 | |
| Higher-Speed Easy Reader Plastic Centrifuge Tubes 50ml | Fisher Scientific | 06-443-18 | |
| ELMI SkySpin CM-6MT | ELMI | CM-6MT | |
| Rotor 6M | ELMI | 6M | |
| Rotor 6M.06 | ELMI | 6M.06 | |
| Drummond Portable Pipet-Aid XP Pipet Controller | Drummond Scientific | 4-000-101 | |
| 25 mL serological pipette tips | Fisher Scientific | 89130-900 | |
| 10 mL serological pipette tips | Fisher Scientific | 89130-898 | |
| 5 mL serological pipette tips | Fisher Scientific | 898130-896 | |
| 48-well plates | Fisher Scientific | 07-200-86 | |
| Allegra 6 Benchtop Centrifuge, Non-Refrigerated | Beckman Coulter | 366802 | |
| GH-3.8A Rotor, Horizontal, ARIES Smart Balance | Beckman Coulter | 366650 | |
| Allegra 25R Benchtop Centrifuge, Refrigerated | Beckman Coulter | 369434 | |
| TA-15-1.5 Rotor, Fixed Angle | Beckman Coulter | 368298 | |
| Fisher Scientific AccuSpin Micro 17 | Fisher Scientific | 13-100-675 | |
| Fisher Scientific Analog Vortex Mixer | Fisher Scientific | 02-215-365 | |
| miRNeasy Mini Kit (50) | Qiagen | 217004 | |
| Direct-zol RNA MiniPrep kit | Zymo Research | R2050 | |
| Chloroform (Approx. 0.75% Ethanol as Preservative/Molecular Biology) | Fisher Scientific | BP1145-1 | |
| Rnase-Free Dnase set (50) | QIAGEN | 79254 | |
| NanoDrop 2000 Spectrophotometers | Thermo Scientific | ND-2000 | |
| Superscript III First-strand Synthesis System RT-PCR | Invitrogen | 175013897 | |
| iTaq Universal SYBR Green Supermix | Bio-rad | 172-5121 | |
| Fisherbrand 96-Well Semi-Skirted PCR Plates, case of 25 | Fisher | 14-230-244 | |
| Microseal 'B' Adhesive Seals | Bio-Rad | MSB-1001 | |
| MyiQ Optics Module | Bio-Rad | 170-9744 | |
| iCycler Chassis | Bio-Rad | 170-8701 | |
| Optical Kit | Bio-Rad | 170-9752 | |
| BD LSR II Flow Cytometry Analyzer | BD Biosciences | ||
| FACSDiva software | BD Biosciences | ||
| FlowJo 10 | BD Biosciences | ||
| 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2943CA | |
| S200 Focused-ultrasonicator | Covaris | S200 | |
| SPRIworks Fragment Library System I for Illumina | Beckman Coulter | A288267 | |
| cBot Cluster Generation Station | illumina | SY-312-2001 | |
| HiSeq 2000 Genome Sequencer | Illumina | SY-401-1001 | |
| TruSeq RNA Library Prep Kit v2 | Illumina | RS-122-2001 | |
| TruSeq Small RNA Library Prep Kit | Illumina | RS-200-0012 | |
| NEXTflex Illumina Small RNA Sequencing Kit v3 | Bioo Scientific | 5132-05 | |
| 2200 TapeStation | Agilent | G2964AA |
References
- Allis, C. D., Jenuwein, T. The molecular hallmarks of epigenetic control. Nat Rev Genet. 17, 487-500 (2016).
- Li, G., Zan, H., Xu, Z., Casali, P. Epigenetics of the antibody response. Trends Immunol. 34, 460-470 (2013).
- Zan, H., Casali, P. Epigenetics of Peripheral B-Cell Differentiation and the Antibody Response. Front Immunol. 6, 631 (2015).
- Xu, Z., Zan, H., Pone, E. J., Mai, T., Casali, P. Immunoglobulin class-switch DNA recombination: induction, targeting and beyond. Nat. Rev. Immunol. 12, 517-531 (2012).
- Nutt, S. L., Hodgkin, P. D., Tarlinton, D. M., Corcoran, L. M. The generation of antibody-secreting plasma cells. Nat. Rev. Immunol. 15, 160-171 (2015).
- Bartel, D. P. MicroRNAs: target recognition and regulatory functions. Cell. 136, 215-233 (2009).
- Fabian, M. R., Sonenberg, N., Filipowicz, W. Regulation of mRNA translation and stability by microRNAs. Annu. Rev. Biochem. 79, 351-379 (2010).
- White, C. A., et al. Histone deacetylase inhibitors upregulate B cell microRNAs that silence AID and Blimp-1 expression for epigenetic modulation of antibody and autoantibody responses. J Immunol. 193, 5933-5950 (2014).
- Farh, K. K., et al. Genetic and epigenetic fine mapping of causal autoimmune disease variants. Nature. 518, 337-343 (2015).
- Nagalakshmi, U., Waern, K., Snyder, M. RNA-Seq: a method for comprehensive transcriptome analysis. Curr Protoc Mol Biol. , 11-13 (2010).
- Martin, J. A., Wang, Z. Next-generation transcriptome assembly. Nat Rev Genet. 12, 671-682 (2011).
- Luo, S. MicroRNA expression analysis using the Illumina microRNA-Seq Platform. Methods Mol. Biol. 822, 183-188 (2012).
- Shen, T., Sanchez, H. N., Zan, H., Casali, P. Genome-wide analysis reveals selective modulation of microRNAs and mRNAs by histone deacetylase inhibitor in B cells induced to uUndergo class-switch DNA recombination and plasma cell differentiation. Front. Immunol. 6, 627 (2015).
- Trapnell, C., et al. Differential gene and transcript expression analysis of RNA-seq experiments with TopHat and Cufflinks. Nat Protoc. 7, 562-578 (2012).
- Kin, T., et al. fRNAdb: a platform for mining/annotating functional RNA candidates from non-coding RNA sequences. Nucleic Acids Res. 35, D145-D148 (2007).
- Agarwal, V., Bell, G. W., Nam, J. W., Bartel, D. P. Predicting effective microRNA target sites in mammalian mRNAs. Elife. 4, (2015).
- Griffiths-Jones, S., Saini, H. K., van Dongen, S., Enright, A. J. miRBase: tools for microRNA genomics. Nucleic Acids Res. 36, D154-D158 (2008).
- Anders, G., et al. doRiNA: a database of RNA interactions in post-transcriptional regulation. Nucleic Acids Res. 40, D180-D186 (2012).
