Summary
I fattori epigenetici possono interagire con programmi genetici di modulare l'espressione genica e regolare la funzione delle cellule B. Combinando la stimolazione in vitro delle cellule di B, qRT-PCR e microRNA-sequenza di alto-rendimento e sequenza di mRNA approcci, possiamo analizzare la modulazione epigenetica di miRNA e l'espressione genica in cellule di B.
Abstract
Risposte anticorpali sono compiute attraverso diversi processi critici intrinseco delle cellule B, tra cui hypermutation somatico (SHM), classe-interruttore ricombinazione del DNA (CSR) e la differenziazione delle cellule di plasma. Negli ultimi anni, delle modificazioni epigenetiche o fattori, quali la deacetilazione degli istoni e microRNA (Mirna), hanno dimostrati di interagire con programmi genetici delle cellule di B di risposte anticorpali di forma, mentre la disfunzione dei fattori epigenetici è stata trovata per portare a risposte degli autoanticorpi. L'analisi di espressione di miRNA e mRNA di genoma in cellule di B in risposta a modulatori epigenetici è importante per comprendere la regolazione epigenetica della risposta di funzione e dell'anticorpo di B-cell. Qui, dimostriamo un protocollo per indurre le cellule B per subire la differenziazione di CSR e delle cellule di plasma, il trattamento di queste cellule di B con gli inibitori dell'istone deacetilasi (HDAC) (HDIs) e l'analisi di espressione di mRNA e microRNA. In questo protocollo, analizziamo direttamente sequenze complementari di DNA (cDNA) mediante sequenziamento di nuova generazione mRNA (mRNA-seq) e tecnologie di miRNA-seq, mappatura della sequenziazione legge al genoma e trascrizione d'inversione quantitativa (qRT)-PCR. Con questi approcci, abbiamo definito che, in cellule di B indotte per subire la CSR e la differenziazione delle cellule di plasma, HDI, un regolatore epigenetico, selettivamente modula l'espressione di mRNA e miRNA e altera la differenziazione di CSR e delle cellule di plasma.
Introduction
Segni epigenetici o fattori, quali la metilazione del DNA, modificazioni post-traduzionali degli istoni e RNA non codificanti (compresi i microRNA), modulano la funzione delle cellule alterando gene expression1. Modificazioni epigenetiche regolano la funzione dei linfociti B, come ricombinazione di immunoglobulina classe-interruttore del DNA (CSR), ipermutazione somatica (SHM) e differenziazione di cellule B memoria o le cellule di plasma, quindi modulando l'anticorpo e autoanticorpi le risposte2,3. CSR e SHM criticamente richiedono indotta da attivazione citidina deaminasi (aiuti, codificato come Aicda), che è altamente indotta in cellule di B in risposta a T-dipendente e di antigeni T-indipendenti4. Cellule di B di classe-acceso/hypermutated ulteriormente differenziano in cellule di plasma, che secernono grandi quantità di anticorpi in modo criticamente dipendente da proteina di maturazione dei linfociti B-indotta 1 (Blimp1, codificato come Prdm1)5. I cambiamenti epigenetici anormali in cellule di B possono provocare risposte aberranti anticorpo/autoanticorpi, che possono portare alla risposta allergica o autoimmunità1,4. Comprendere i fattori epigenetici come, ad esempio Mirna, modulano intrinseco delle cellule B espressione genica non è solo importante per lo sviluppo di vaccini, ma è anche essenziale per rivelare i meccanismi delle potenziali risposte anormali dell'anticorpo/autoanticorpi.
Deacetilazione e acetilazione dell'istone sono modifiche dei residui di lisina su proteine istoniche in genere catalizzate da istone acetiltransferasi (HAT) e istone deacetilasi (HDAC). Queste modifiche portano all'accessibilità crescente o decrescente della cromatina e ulteriormente consentono o impediscono il legame di fattori di trascrizione o proteine a DNA e l'alterazione del gene espressione5,6, 7 , 8. gli inibitori HDAC (HDI) sono una classe di composti che interferiscono con la funzione di HDAC. Qui, abbiamo usato HDI (VPA) per affrontare il regolamento di HDAC sul profilo di espressione genica intrinseco delle cellule B e sul suo meccanismo.
Mirna sono piccole, non-codificazione RNAs circa 18 a 22 di nucleotidi di lunghezza generati attraverso diverse fasi. geni ospitanti miRNA sono trascritti e formano tornante microRNA primario (pri-miRNA). Sono esportati nel citoplasma, dove pri-miRNA sono ulteriormente trasformati in precursore Mirna (pre-miRNA). Infine, Mirna maturi si formano attraverso la scissione dei pre-miRNA. Mirna riconoscono le sequenze complementari all'interno della regione non tradotta 3' della loro destinazione mRNAs6,7. Attraverso silenziamento post-trascrizionale, Mirna regolano l'attività cellulare, quali proliferazione, differenziamento e apoptosi10,11. Poiché più miRNA possono avere come bersaglio mRNA della stessa, e un singolo miRNA potenzialmente può avere come bersaglio mRNA multipli, è importante avere una vista nel contesto del profilo di espressione di miRNA a comprendere il valore dell'individuo e l'effetto collettivo di Mirna. i miRNA sono stati indicati per essere coinvolti in sviluppo della B-cellula e differenziazione periferica, così come B-differenziamento fase-specifici, risposta anticorpale e autoimmunità1,4,9. Nel 3' UTR di Aicda e Prdm1, ci sono diversi siti previsti o convalidati evolutivamente conservati che possono essere la destinazione di Mirna8.
Modulazione epigenetica, tra cui modifica post-trascrizione dell'istone e Mirna, visualizzare un modello di regolamento fase-specifici delle cellule e cellula-tipo di gene espressione9. Qui, descriviamo i metodi per definire la modulazione HDI-mediata di miRNA ed espressione di mRNA, CSR e differenziazione delle cellule di plasma. Questi includono protocolli per indurre le cellule di B per subire la CSR e la differenziazione delle cellule di plasma; per il trattamento delle cellule di B con HDI; e per l'analisi di espressione di miRNA e mRNA da qRT-PCR, miRNA-seq e mRNA-seq10,11,12,8,13.
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Protocol
il protocollo segue le linee guida di cura degli animali di The Animal Care istituzionali e commissioni di utilizzo della University of Texas Health Science Center a San Antonio.
1. stimolazione di cellule di B del topo per CSR, la differenziazione delle cellule di Plasma e HDI trattamento
- preparazione delle sospensioni di cellule di milza
Nota: eseguire tutti i passaggi in una cappa a flusso laminare ad eccezione del mouse eutanasia e dissezione.- Euthanize gli specifici esenti da patogeni C57BL/6J mouse (8-12 settimane di età) per inalazione di CO 2.
- Pone il mouse sulla scheda di dissezione con l'addome rivolto verso l'alto. Perno di tutti e quattro i piedi del mouse con gli aghi ipodermici di 1.5 - in calibro 18,.
- Sterilizzare la pelle uso salviettine imbevuto di etanolo 70%.
- Utilizzare un set di strumenti chirurgici sterilizzati nell'autoclave (pinze e le forbici per dissezione) per tagliare attraverso la pelle appena sotto la gabbia toracica per visualizzare la milza (sul lato sinistro dell'addome, appena sotto il fegato).
- Utilizzare un altro pinze sterili e le forbici per estrarre la milza, che si trova sotto la curvatura maggiore dello stomaco, milza di bloccaggio delicatamente con le pinzette e tagliando fuori tutto il tessuto di collegamento con la dissezione. Assicurarsi di rimuovere tutto il tessuto comunicante.
- Posizionare la milza in un tubo per microcentrifuga da 1,5 mL contenente 1.000 µ l di terreno di RPMI1640 completo (medium RPMI 1640 supplementato con 10% inattivati siero fetale del vitello (FBS), 2 mM L-Glutammina, 100 µ g/mL di penicillina, 100 µ g/mL streptomicina, 0,25 µ g/mL di amfotericina B e 50 µM β-mercaptoetanolo).
- Mettere un colino di cella di 70 µm in una provetta da centrifuga a fondo conico in polipropilene da 50 mL e versare la milza dal tubo del microcentrifuge sul filtro delle cellule. Usare la punta di un tubo di polipropilene centrifuga a fondo conico da 15 mL per schiacciare delicatamente la milza attraverso il colino. Sciacquare il filtro cella con 15-20 mL di terreno completo.
- Spin-down le cellule a 350 x g per 5 min e scartare il supernatante.
- Rimuovere i globuli rossi da sospensioni di cellule di milza. Risospendere il pellet cellulare in tampone di lisi ACK (5ml per milza). Incubare per 4 min a temperatura ambiente con agitazione occasionale e poi placare con 25 mL di terreno completo.
- Spin giù le cellule a 350 x g per 5 min e scartare il surnatante. Risospendere il pellet cellulare in 1 o 10 mL di terreno completo. Contare le cellule vitali utilizzando un emocitometro.
- B-cella di isolamento
Nota: B isolare cellule di selezione negativa dopo il produttore ' s istruzioni. Le cellule non-B sono mirate per la rimozione con anticorpi biotinilati contro cellule non-B (CD4, CD8, CD11b, CD43, CD49b, CD90.2, Ly-6C/G (Gr-1) e TER119) e particelle magnetiche rivestite con streptavidina.- Preparare una sospensione di cellule 0,25 a 2 mL di 1 x 10 8 cellule/mL in terreno completo in un polistirolo sterile 5 mL (12 x 75 mm) tubo tondo-fondo. Aggiungere siero normale di ratto (50 µ l/mL) nell'esempio.
- Isolamento di aggiungere 50 µ l/mL cocktail al campione. Miscelare le cellule pipettando delicatamente su e giù 2 - 3 volte e incubare a temperatura ambiente per 10 min.
- Aggiungere particelle magnetiche rivestite con streptavidina µ l/mL 75 al campione. Mescolare la miscela pipettando delicatamente su e giù 2 - 3 volte e incubare per 2,5 min a temperatura ambiente.
- Aggiungere terreno completo RPMI 1640. Mescolare le cellule pipettando delicatamente su e giù per 2 - 3 volte.
- Inserire il tubo (senza coperchio) il magnete e incubare a temperatura ambiente per un minimo di 2,5 Pour il sovranatante contenente cellule B intatte in una provetta conica da 15 mL nuova.
- Contare le cellule vitali utilizzando un emocitometro e macchia blu di Trypan. Valutare la purezza delle cellule di B dall'analisi di citometria a flusso degli indicatori della superficie delle cellule di B, come B220 e CD19.
- Stimolazione B-cellula e trattamento HDI
- risospendere le cellule B purificate in terreno completo RPMI 1640 ad una concentrazione finale di 0,3 x 10 6 cellule/mL.
- Utilizzare una piastra di coltura cellulare 48 pozzetti per colture cellulari. Per ogni bene, aggiungere 1 mL di sospensione di cellule B purificata (0,3 x 10 6 cellule/mL), LPS (concentrazione finale di 3 µ g/mL) da Escherichia coli, IL-4 (concentrazione finale di 5 ng/mL) e 0 o 500 µM HDI (acido valproico; VPA).
- Incubare le cellule a 37 ° C e 5% di CO 2 per 60 h per qRT-PCR e l'analisi del mRNA e miRNA sequenziamento high throughput o 96 h per analisi di citometria a flusso.
- Flusso cytometry analisi della RSI e la differenziazione delle cellule di plasma
- dopo 96 h di cultura, staccare le cellule da ogni pozzetto pipettando le celle su e giù più volte. Trasferire la sospensione cellulare in una provetta per microcentrifuga da 1,5 mL. Rotazione verso il basso le cellule a 350 x g per 5 min utilizzando una centrifuga di banco e scartare il surnatante.
- Risospendere le cellule con 100 µ l di tampone HBSS contenente BSA 1% e 0,5 ng/mL della fluorescina (FITC) - capra coniugato anti IgM – anticorpo (Ab) , 0,2 ng/mL allophycocyanin (APC)-ratto coniugati anti-topo IgG1 Anticorpo monoclonale (mAb), ficoeritrina di 0,2 ng/mL (PE)-coniugato ratto anti-topo B220 mAb, 0,2 ng/mL del ratto PE-Cy7-coniugato anti-topo CD138 mAb e 2 ng/mL 7-aminoactinomycin D (7-AAD).
- Incubare le cellule con anticorpi coniugati a fluorescenza (punto 1.4.2) al buio a temperatura ambiente per 30 min.
- Lavare le cellule con 1 mL di HBSS con BSA 1%.
- Spin-down le cellule a 1.500 x g per 5 min utilizzando una centrifuga da banco e scartare il supernatante.
- Risospendere le cellule in 300 µ l di HBSS con BSA 1% e trasferire la sospensione cellulare in una provetta di polistirene di turno-fondo. Coprire il tubo con un foglio per evitare l'esposizione alla luce.
- Eseguire analisi di citometria a flusso su una sospensione unicellulare. Raccogliere 50.000 eventi per ciascun campione di compensazione e 250.000 eventi per altri campioni. Analizzare i dati utilizzando attrezzature software.
- Eliminare i detriti e doppietti tramite un cancello di geometria di impulso (FSC-H x FSC-A e SSC-H x SSC-A). Cancello in modo appropriato la trama su 7-AAD per escludere le cellule morte.
2. High-Throughput mRNA-Seq
- dopo 60 h di cultura, estratto il RNA totale da 2-4 × 10 6 celle utilizzando un kit di isolamento di RNA totale che può recuperare il piccolo RNA seguendo il produttore ' s istruzioni. Includere una dnasi io passo trattamento.
- Verificare l'integrità di RNA con un bioanalyzer, seguendo il produttore ' istruzioni s.
- Utilizzare 500-1.000 ng di RNA totale di alta qualità (numero di RNA integrità RIN > 8.0) per RNA-seq preparazione libreria con un RNA commerciale campione pkit Rep seguendo il produttore ' istruzioni s.
- Piscina le librerie di singoli mRNA-seq sulla loro parti rispettive 6-bp indice delle schede di base e le librerie a 50 bp/sequenza di sequenza. Utilizzare un sistema di DNA di alto-rendimento secondo il produttore ' protocolli di s.
- Dopo l'esecuzione di sequenziamento, demultiplex con CASAVA per generare il file fastq per ciascun campione. Eseguire letture di mappatura e l'analisi bioinformatica, come precedentemente descritto 11.
- Allineare tutte le letture di sequenziamento con loro genomi di riferimento (UCSC mouse genome compilazione mm9) utilizzando TopHat2 predefinito impostazioni 14. Elaborare i file bam dall'allineamento utilizzando HTSeq-conteggio per ottenere i conteggi al gene in tutti i campioni.
3. High-Throughput miRNA-Seq
- uso 100 ng-1 µ g di RNA totale di alta qualità, preparata nel passaggio 2.1, per piccoli RNA-seq preparazione di libreria utilizzando un kit commerciale piccolo RNA-seq.
- Legano il degenerato 3 ' adattatore sul 5 ′ estremità di partenza le piccole molecole di RNA con un kit commerciale legatura. Legare il degenerato 5 ' adattatore sul 3 ′ estremità di partenza le piccole molecole di RNA con un kit commerciale legatura. Convertire il RNA in cDNA da trascrizione d'inversione e amplificare la piccola biblioteca di RNA-seq dall'amplificazione di PCR con kit commerciali.
- Usa un gel di pagina 6% nativo di TBE per isolare la piccola biblioteca di RNA-seq finale. Esegua il gel con 1 tampone di X TBE a 200 V, fino a quando la band di bromofenolo tracciante si avvicina alla parte inferiore del gel (0,5 - 1 cm).
- Rimuovere il gel dalle lastre di vetro e macchia con etidio bromuro (0,5 µ g/mL in acqua) in un contenitore pulito per un minimo di 2-3 Visualize fasce per il gel su un transilluminatore UV o un altro strumento di documentazione gel.
- Tagliare fuori la band ~ 150-bp utilizzando un rasoio pulito e metterlo in una provetta 1,7 mL.
- Estrarre DNA utilizzando un kit di estrazione del gel secondo le istruzioni del produttore.
- Verifica la distribuzione delle dimensioni della biblioteca finale con un dosaggio di DNA di alto-sensibilità commerciale e la concentrazione con un dosaggio di dsDNA commerciale per i produttori ' istruzioni.
- Piscina le librerie per amplificazione e un ordinamento successivo eseguito con un sistema di sequenziamento di DNA ad alta velocità commerciale per il produttore ' protocolli di s.
- Demultiplex con CASAVA per generare il file fastq per ciascun campione per il produttore ' protocolli di s.
- Per piccoli RNA-seq analisi di ciascun campione, utilizzare Flicker per l'allineamento per il produttore piccolo-RNA ' protocolli di s.
- Rimuovere letture che sono allineate agli agenti inquinanti, come i mitocondri, rRNA, primer e così via.
- Allineare i dati in modo maturo sequenze miRNA.
- Allineamento dei dati alle sequenze di ciclo tornante (precursore miRNA).
- Allineare i dati di altri piccoli RNA sequenze (utilizzando il database di fRNA) 15.
- Dopo tutti i campioni sono quantificati, definire i miRNA espressi differenziali tra diversi gruppi/campioni. Prevedere i miRNA che target selezionato mRNAs o mRNAs che possa essere la destinazione di un miRNA selettivo utilizzando strumenti di previsione di destinazione miRNA online, ad esempio TargetScan 16, microcosmo 17 e PicTar 18 .
- Se è necessaria l'analisi funzionale di annotazione o pathway, presentare geni predetti per analisi dei percorsi di ingegno (IPA) o DAVID.
4. RT-PCR quantitativa (qRT-PCR) del mRNA e Mirna
- qRT-PCR analisi del mRNA
- estrarre RNA da 0.2-5 × 10 6 celle utilizzando un kit di isolamento del RNA commerciale per totale che può recuperare il piccolo RNA, seguendo il produttore ' s istruzioni. Includere una dnasi io passo trattamento.
- Sintetizzare cDNA da RNA totale con un sistema di sintesi del cDNA del primo-filo con primer oligo-dT.
- Quantificare cDNA mediante qRT-PCR con primer appropriato, utilizzando 2 x mix master di Real-Time PCR con il seguente protocollo: 95 ° C per 15 s, 40 cicli di 94 ° C per 10 s, 60 ° C per 30 s e 72 ° C per 30 s.
- Effettuare l'acquisizione di dati durante la fase di estensione 72 ° C ed eseguire analisi della curva di fusione da 72 a 95 ° C.
- analisi di miRNA qRT-PCR
- Aliquot RNA dai campioni preparati al punto 4.1.1.
- Reverse-trascrivere il RNA nel cDNA. Utilizzare un kit di trascrizione inversa commerciale microRNA, seguendo il produttore ' istruzioni s.
- Eseguire PCR in tempo reale per microRNA usando un mix master di PCR in tempo reale SYBR Green con 250 nM miRNA maturo avanti gli iniettori in combinazione con un primer universale inverso.
- Disgelo 2 x PCR Master Mix, miRNA specifici primer forward e reverse universal primer a temperatura ambiente. Mescolare le soluzioni individuali.
- Preparare una miscela di reazione come segue per un volume di reazione di 25 µ l per pozzetto (utilizzato in piastre da 96 pozzetti PCR):
2 x PCR Master Mix 12,5 µ l
miRNA forward primer (2,5 μM) 2,5 µ l
Universal reverse primer (2,5 μM) 2,5 µ l
RN ASE-libero acqua5 µ l - aggiungere 22.5 μL di miscela di reazione per una piastra PCR a 96 pozzetti. Aggiungere 2,5 µ l di modello cDNA (50 ng pg-3) singola piastra pozzetti.
- Sigillare ermeticamente il film piatto. Centrifugare la piastra per 1 min a 1.000 x g e a temperatura ambiente.
- Mettere la piastra il ciclatore in tempo reale e cominciare il seguente programma ciclismo: 95 ° C per 5 min, 40 cicli di 94 ° C per 15 s, 55 ° C per 30 s e 72 ° C per 30 s.
- Utilizzare il metodo ΔΔCt per l'analisi di dati di qRT-PCR con un foglio di calcolo. Normalizzare l'espressione dei miRNA rilevanti per l'espressione del piccolo nucleare/nucleolar RNA Rnu6/RNU61/2, Snord61/SNORD61, Snord68/SNORD68 e Snord70/SNORD70.
- Analisi statistica
- eseguire analisi statistica per determinare i valori di p a accoppiato e spaiati studente ' s t - test utilizzando un foglio di calcolo e considerare i valori di p < 0,05 come significativo.
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Representative Results
Utilizzando il nostro protocollo, purificato le cellule B disposto con LPS (3 µ g/mL) e IL-4 (5 ng/mL) per 96 h può indurre il 30-40% della RSI a IgG1 e ~ 10% di differenziazione delle cellule di plasma. Dopo il trattamento con HDI (VPA 500 µm), la RSI a IgG1 è diminuito a 10-20%, mentre la differenziazione delle cellule di plasma è diminuito a ~ 2% (nella figura 1). HDI-ha mediato l'inibizione della RSI è stato ulteriormente confermato da un numero in diminuzione di post-ricombinazione Iμ-Cγ1 e maturo VHDJH-Cγ1 trascrizioni, che sono i tratti distintivi della RSI completato. Come misurato mediante qRT-PCR, l'espressione di Aicda, che è critica per CSR/SHM e Prdm1 e Xbp1, che sono importanti per la differenziazione delle cellule di plasma, sono stati indicati per essere inibiti da VPA (Figura 2).
La modulazione dell'espressione di mRNA da HDI in cellule di B era altamente selettiva. Come misurato da mRNA-seq in cellule B stimolate con LPS e IL-4, soltanto lo 0,3% di questi mRNAs altamente espressi erano sovraregolati da HDI più di due volte e solo 0,36% di altamente espressi (> 20 copie/delle cellule in cellule di B senza trattamento HDI) mRNA, tra cui AICDA, Prdm1, e Xbp1, sono stati ridotti da HDI più del 50% (Figura 3).
Il downregulation di Aicda, Prdm1e Xbp1 espressione potenzialmente potrebbe essere mediato da Mirna, che sono negativi regolatori dell'espressione genica. Utilizzando strumenti di previsione (TargetScan.org, miRNA.org e miRbase.org) di targeting di miRNA, abbiamo identificato più miRNA possono potenzialmente destinati a Aicda o Prdm1. L'analisi di miRNA-seq di profilatura di miRNA in cellule di B trattati con HDI o nil che ha mostrato HDIs selettivamente upregulate Aicda - e Prdm1 -targeting Mirna (figure 4-6).
Figura 1. Espressione di superficie di cellule B marcatore B220 e superficie anticorpo IgG1 marcatore delle cellule di plasma CD138 sono stati analizzati tramite flusso cytometry.
B220+ IgG1+ cellule erano cellule di B commutate a IgG1. B220bassoCD138+ cellule erano cellule di plasma. La percentuale di cellule B commutazione di IgG1 e cellule di plasma dalle cellule di B stimolate con LPS e IL-4 in presenza di nil o HDI (VPA, 500m) per 96 h sono indicati come i numeri all'interno dei cancelli. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Nella figura 2. Espressione dei segni distintivi della RSI completata; maturo VHDJH-Cγ1 trascrizioni e post-ricombinazione Iμ-Cγ1 trascrizioni; e Aicda, Prdm1e Xbp1 sono stati analizzati mediante qRT-PCR, normalizzato di Cd79b trascrizioni e mostrato in un istogramma.
Espressione genica in cellule B stimolate con LPS e IL-4 in presenza di 500 µM VPA e rilevanti per l'espressione genica in B celle con gli stessi stimoli in presenza di nil sono stati descritti come 1. I dati sono da tre esperimenti indipendenti. valori di p , accoppiata di t-test. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Nella figura 3. Cellule di B sono state stimolate con LPS e IL-4 e trattate con HDI (VPA, 500 µM) o pari a zero per l'espressione del mRNA h. 60 è stato analizzato da mRNA-segg.
(A) media livelli di espressione di mRNA in tre esperimenti indipendenti (letture per kilobase per milione letture mappate, RPKMs) sono stati rappresentati in grafici a dispersione. Ogni trama corrisponde a un livello individuale di espressione di mRNA. Le due linee tratteggiate sono piegato in due linee. Situate sopra la linea tratteggiata superiore a dispersione o sotto il fondo linea tratteggiata indicare mRNAs che esprimono più di due volte o meno della metà quando indotto da VPA e pari a zero, rispettivamente. (B) i grafici a barre raffigurano la variazione media nei livelli di espressione di mRNA (media RPKMs da tre esperimenti indipendenti) in LPS e cellule di B di IL-4-stimulated trattate con HDI, rispetto a quelli in cellule di B trattati con nil. Solo i mRNAs presso un RPKM medio > 20 LPS e IL-4-stimulated B cellule trattate con nil sono incluse. L'espressione di mRNA in ogni singolo esperimento, come mostrato da un grafico a dispersione (C) o grafico a barre (D), sono raffigurati nella stesso modo come in (A) e (B). valori di p , accoppiata di t-test. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Nella figura 4. Cellule di B sono state stimolate con LPS e IL-4 e trattate con HDI (VPA, 500 µM) o pari a zero per espressione dei miRNA h. 60 è stato analizzato da miRNA-segg.
(A) il cambiamento nei livelli di espressione di miRNA medio in B cellule trattate con HDI rispetto a quella in B cellule trattati con nil sono stati rappresentati da grafici a barre. Cellule (B) il cambiamento nei livelli di espressione di miRNA in B trattate con HDI rispetto a quella in B cellule trattati con nil in tre esperimenti indipendenti sono state rappresentate da grafici a barre. Solo i miRNA a giri medio > 0,5 in LPS e IL-4-stimulated B cellule trattate con nil sono incluse. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Nella figura 5. HDI aumenta l'espressione di Aicda -targeting Mirna, come mostrato da miRNA-segg.
(A) allineamento di sequenza dei loro siti di destinazione nel 3' UTR degli mRNA Aicda e i miRNA. (B) cellule B sono state coltivate con LPS e IL-4 in presenza o assenza di HDI (VPA, 500m) per 60 h. L'espressione dei miRNA stimati a destinazione Aicda 3' UTR sono stati analizzati da miRNA-seq e raffigurato come giri/min. valori di p , accoppiata di t-test. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Nella figura 6. HDI aumenta l'espressione di Prdm1 -targeting Mirna, come mostrato da miRNA-segg.
(A) allineamento di sequenza di Mirna e loro siti di destinazione nel 3' UTR degli mRNA di Prdm1 . (B) B cellule sono state coltivate con LPS e IL-4 in presenza o assenza di HDI (VPA, 500m) per 60 h. espressione dei miRNA che erano previsti per indirizzare Prdm1 3' UTR sono stati analizzati da miRNA-seq e raffigurato come giri/min. valori di p , accoppiata di t-test. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Questo protocollo fornisce gli approcci completi per indurre switching di classe B delle cellule e differenziazione delle cellule di plasma; per analizzare l'impatto di modulatori epigenetici, vale a dire HDI; e per rilevare l'effetto di HDI sull'espressione del mRNA e miRNA in queste cellule. La maggior parte di questi approcci è utilizzabile anche per analizzare l'impatto del fattore epigenetico sull'espressione di funzione e mRNA/miRNA B-cellula umana. Per analizzare le cellule B isolate da topi trattati con modulatori epigenetici, quali HDIs utilizzabile anche il qRT-PCR e approcci di mRNA-seq/miRNA-seq.
Il modulare epigenetici possono influenzare molte funzioni differenti delle cellule, quali la proliferazione delle cellule e vitalità, che potrebbero influenzare la differenziazione di CSR e delle cellule di plasma. Di conseguenza, la proliferazione delle cellule, vitalità e i cicli delle cellule delle cellule di B, con o senza trattamento di HDI, dovrebbero essere analizzati. Una delle sfide per l'analisi della modulazione dell'espressione di mRNA e miRNA da HDI o altri regolatori epigenetici mediante qRT-PCR sta scegliendo un gene housekeeping adatto o piccolo RNA. Molti geni housekeeping comune possono essere alterati a vari gradi di modulatori epigenetici. I livelli di espressione di molti geni housekeeping diversi dovrebbero essere misurati e utilizzati per normalizzare l'espressione di specifici geni mediante qRT-PCR. Questo problema può essere risolto anche da mRNA-seq e miRNA-seq, dove l'espressione di singoli mRNA o Mirna possa essere normalizzato da livelli di mRNA o miRNA di genoma.
mRNA-seq non può solo definire il profilo di espressione di mRNA con una pipeline di bioinformatica appropriato, ma questo approccio può anche definire il profilo di RNA (lncRNA) lungo non codificante. mRNA-seq in genere comporta l'arricchimento di poli (a) + RNA da selezione oligo (distacco). Come un numero di lncRNA sono noti per la mancanza di code di poli (a), l'approccio di mRNA-seq che coinvolge la selezione di oligo (dT) non è possibile determinare le informazioni complete dell'espressione di lncRNA. Al fine di ottenere una copertura completa dei profili di espressione di mRNA e di lncRNA, deve essere utilizzato un approccio di RNA-seq che coinvolgono lo svuotamento del rRNA. Nella maggior parte dei nostri esperimenti, usiamo un kit commerciale per estrarre il RNA totale, tra cui miRNA, per miRNA-seq, mRNA-seq e qRT-PCR. Prima della costruzione di una biblioteca di sequenziamento ad alta produttività, la qualità di RNA totale è validata mediante l'esecuzione di una parte aliquota su un sistema di controllo di qualità del campione RNA, DNA e proteina automatizzato. Si raccomanda che i campioni di RNA hanno un RIN numero di 7.0 o versione successiva se devono essere usati per la preparazione di libreria piccolo RNA. Campioni con i numeri più bassi di RIN hanno una percentuale maggiore di prodotti degradati di RNA nell'intervallo di dimensioni di piccole specie di RNA (15-30 nucleotidi). Quando il numero RIN è inferiore a 7.0, è possibile che la copertura non sarà buona. Un'altra opzione per i campioni di RNA di meno-che-ideale è quello di eseguire un approccio di svuotamento del rRNA, piuttosto che un approccio di isolamento di mRNA, ma questo richiede che i campioni siano almeno 10 ng/mL.
I protocolli per il mRNA-seq utilizzati qui sono ottimizzati per 100-1.000 ng di RNA totale. Per miRNA-seq usando meno di 100 ng di RNA totale, piccola preparazione di RNA-seq biblioteca dovrebbe seguire un più sensibile piccolo protocollo di preparazione RNA-seq, che sfrutta la naturale struttura comune alla maggior parte delle molecole di microRNA noto. Mirna più maturi hanno un 5'-fosfato e un gruppo di 3'-idrossile come conseguenza del loro percorso di biogenesi. Per questo motivo, le schede 3' e 5' in questo kit sono direttamente legate a Mirna.
Per analizzare l'impatto di HDI sulle cellule B mRNA e miRNA espressione in vivo, i topi possono essere trattati con VPA o altri HDIs aggiungendo questa HDI per l'acqua potabile e l'iniezione intraperitoneale di questi topi con antigene T-dipendente NP-CGG o T-indipendente antigene NP-LPS può essere eseguita. Le cellule di B possono essere purificate dalla milza 10 giorni dopo l'immunizzazione.
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Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere nessun concorrenti interessi finanziari.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato supportato da NIH sovvenzioni AI 105813 e AI 079705 (per PC), l'Alleanza per l'identificazione di Target di ricerca Lupus in Lupus Grant ALR 295955 (per PC) e la ricerca di artrite National Research Foundation concedere (HZ). TS è stato sostenuto dal centro medico pediatria, secondo Xiangya Hospital, Central South University, Changsha, Cina, nell'ambito del programma di visita di studente di medicina Xiangya-UT School di medicina San Antonio.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL/6 mice | Jackson Labs | 664 | |
| Corning cellgro RPMI 1640 Medium (Mod.) 1X with L-Glutamine (Size: 6 x 500mL; With L-Glutamine) | Fisher Scientific | MT 10-040-CV | |
| FBS | Hyclone | SH300 | |
| HyClone Antibiotic Antimycotic Solution 100 mL | Fisher Scientific - Hyclone | SV3007901 | |
| β-Mercaptoethanol | Fisher Scientific | 44-420-3250ML | |
| Falcon Cell Strainers | Fisher Scientific | 21008-952 | |
| Trypan Blue Stain 0.04% | GIBCO/Life Technologies/Inv | 15250 | |
| ACK Lysis Buffer | Fisher Scientific | BW10-548E | |
| Hausser Scientific Bright-Line Counting Chamber | Fisher Scientific | 02-671-51B | |
| EasySep Magnet | Stem Cell Technologies | 18000 | |
| Falcon Round-Bottom Polystyrene Tubes with Cap | Fisher Scientific | 14-959-1A | |
| EasySep Mouse B cell Isolation Kit | Stem Cell Tech | 19854 | |
| BD Needle Only 18 Gauge 1.5 inch SHORT BEVEL 100/box | BD Biosciences | 305199 | |
| PE/Cy7 anti-mouse CD138 (Syndecan-1) Antibody | BioLegend | 142513 (25 ug) | |
| PE-Cy7 B220 antibody | BioLegend | 103222 | |
| 7-AAD (1 mg) | Sigma Aldrich | A9400-1MG | |
| APC anti-mouse/human CD45R/B220 antibody | Biolegend | 103212 | |
| Mouse APC-IgG1 200 µg | Biolegend | 406610 | |
| FITC anti-mouse IgM Antibody | Biolegend | 406506 | |
| FITC anti-mouse/human CD45R/B220 Antibody | Biolegend | 103206 | |
| PE Anti-Human/Mouse CD45R (B220) (RA3-6B2) | Biolegend | 103208 | |
| HBSS 1X | Fisher Scientific | MT-21-022-CM | |
| Bovine Serum Albumin, Fraction V, Heat Shock Treated | Fisher Scientific | BP1600-100 | |
| LPS 25mg (Lipopolysaccharides from Escherichia coli 055:B5) | Sigma Aldrich | L2880-25MG | |
| Recombinant mouse IL-4 (carrier-free) | BioLegend | 574302 (size: 10 ug) | |
| Valproic acid sodium salt | Sigma Aldrich | P4543 | |
| SterilGARD e3 Class II Type A2 Biosafety Cabinet | The Baker Company | SG404 | |
| Large-Capacity Reach-In CO2 Incubator | Thermo Scientific | 3950 | |
| Isotemp Digital-Control Water Baths: Model 205 | Fisher Scientific | 15-462-5Q | |
| 5mL Round Bottom Polystyrene Test Tube | Fisher Scientific | 14-959-5 | |
| Corning CentriStar 15ml Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 05-538-59A | |
| 1.7 mL Microtube, clear | Genesee | 22-282 | |
| Higher-Speed Easy Reader Plastic Centrifuge Tubes 50ml | Fisher Scientific | 06-443-18 | |
| ELMI SkySpin CM-6MT | ELMI | CM-6MT | |
| Rotor 6M | ELMI | 6M | |
| Rotor 6M.06 | ELMI | 6M.06 | |
| Drummond Portable Pipet-Aid XP Pipet Controller | Drummond Scientific | 4-000-101 | |
| 25 mL serological pipette tips | Fisher Scientific | 89130-900 | |
| 10 mL serological pipette tips | Fisher Scientific | 89130-898 | |
| 5 mL serological pipette tips | Fisher Scientific | 898130-896 | |
| 48-well plates | Fisher Scientific | 07-200-86 | |
| Allegra 6 Benchtop Centrifuge, Non-Refrigerated | Beckman Coulter | 366802 | |
| GH-3.8A Rotor, Horizontal, ARIES Smart Balance | Beckman Coulter | 366650 | |
| Allegra 25R Benchtop Centrifuge, Refrigerated | Beckman Coulter | 369434 | |
| TA-15-1.5 Rotor, Fixed Angle | Beckman Coulter | 368298 | |
| Fisher Scientific AccuSpin Micro 17 | Fisher Scientific | 13-100-675 | |
| Fisher Scientific Analog Vortex Mixer | Fisher Scientific | 02-215-365 | |
| miRNeasy Mini Kit (50) | Qiagen | 217004 | |
| Direct-zol RNA MiniPrep kit | Zymo Research | R2050 | |
| Chloroform (Approx. 0.75% Ethanol as Preservative/Molecular Biology) | Fisher Scientific | BP1145-1 | |
| Rnase-Free Dnase set (50) | QIAGEN | 79254 | |
| NanoDrop 2000 Spectrophotometers | Thermo Scientific | ND-2000 | |
| Superscript III First-strand Synthesis System RT-PCR | Invitrogen | 175013897 | |
| iTaq Universal SYBR Green Supermix | Bio-rad | 172-5121 | |
| Fisherbrand 96-Well Semi-Skirted PCR Plates, case of 25 | Fisher | 14-230-244 | |
| Microseal 'B' Adhesive Seals | Bio-Rad | MSB-1001 | |
| MyiQ Optics Module | Bio-Rad | 170-9744 | |
| iCycler Chassis | Bio-Rad | 170-8701 | |
| Optical Kit | Bio-Rad | 170-9752 | |
| BD LSR II Flow Cytometry Analyzer | BD Biosciences | ||
| FACSDiva software | BD Biosciences | ||
| FlowJo 10 | BD Biosciences | ||
| 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2943CA | |
| S200 Focused-ultrasonicator | Covaris | S200 | |
| SPRIworks Fragment Library System I for Illumina | Beckman Coulter | A288267 | |
| cBot Cluster Generation Station | illumina | SY-312-2001 | |
| HiSeq 2000 Genome Sequencer | Illumina | SY-401-1001 | |
| TruSeq RNA Library Prep Kit v2 | Illumina | RS-122-2001 | |
| TruSeq Small RNA Library Prep Kit | Illumina | RS-200-0012 | |
| NEXTflex Illumina Small RNA Sequencing Kit v3 | Bioo Scientific | 5132-05 | |
| 2200 TapeStation | Agilent | G2964AA |
References
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