Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Svelare la funzione di un batterica Effector da un non-coltivabili fitopatogeni Utilizzando un lievito schermo doppio ibrido

Published: January 20, 2017 doi: 10.3791/55150
Automatic Translation
1, 1
1Department of Molecular Biology - Functional Genomics, Laimburg Research Centre

Summary

proteine ​​effettrici batteriche sono importanti per stabilire le infezioni di successo. Questo protocollo descrive l'identificazione sperimentale di partner di legame proteici di una proteina batterica effettrici nel suo ospite vegetali naturali. Identificare queste interazioni effettrici via lievito schermi doppio ibrido è diventato uno strumento importante per svelare le strategie di patogenicità molecolari.

Abstract

Svelare i meccanismi molecolari di manifestazioni della malattia è importante per capire le patologie e lo sviluppo dei sintomi in scienza delle piante. I batteri si sono evoluti diverse strategie per manipolare il loro metabolismo ospite a proprio vantaggio. Questa manipolazione batterica è spesso accoppiato con sviluppo sintomo grave o la morte delle piante colpite. Determinare le molecole batteriche specifici responsabili della manipolazione ospite è diventato un settore importante nella ricerca microbiologica. Dopo l'identificazione di tali molecole batteriche, chiamati "effettori", è importante chiarire la loro funzione. Un approccio semplice per determinare la funzione di un effettore è individuare partner proteico obbligatorio in ogni suo ospite naturale tramite uno schermo di lievito doppio ibrido (Y2H). Normalmente l'ospite ospita numerosi potenziali partner di legame che non possono essere previsti in misura sufficiente dagli qualsiasi algoritmo in silico. E 'quindi la scelta migliore per Perform a schermo con l'ipotetico effettrici contro un'intera biblioteca di proteine ​​ospite espresse. E 'particolarmente difficile se l'agente eziologico è incoltivabile come fitoplasmi. Questo protocollo fornisce istruzioni passo-passo per la purificazione del DNA da un impianto di fitoplasma-infettati ospite legnoso, l'amplificazione delle potenzialità effettori, e la successiva identificazione di partner di interazione molecolare della pianta con uno schermo Y2H. Anche se gli schermi Y2H sono comunemente usati, vi è una tendenza a esternalizzare questa tecnica per le aziende biotecnologiche che offrono il servizio Y2H ad un costo. Questo protocollo fornisce istruzioni su come eseguire un Y2H in qualsiasi laboratorio di biologia molecolare decentemente attrezzata con tecniche di laboratorio standard.

Introduction

Lievito schermi a due ibridi (Y2H) sono stati sviluppati circa 27 anni fa 1 e da allora sono stati ampiamente utilizzati in vari campi di determinare specifiche interazioni proteina-proteina 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 . L'interazione fisica di un effettore batterica con una proteina bersaglio host è spesso il presupposto per la manipolazione funzionale di questo proteina bersaglio. Analizzando queste interazioni si è spostato al centro di molti diversi settori della biologia delle infezioni 12, 13, 14, 15,"> 16, 17, 18. Il principio della schermata Y2H è che l'interazione di due proteine porta alla ricostituzione di un fattore di trascrizione funzionale che guida l'espressione di geni reporter. L'effettore noto (la" esca ") è traduzionali fuso al dominio di legame al DNA (DBD) del fattore di trascrizione, e le potenziali partner di interazione (il "preda") vengono fuse al dominio di attivazione (aD) del rispettivo fattore di trascrizione. Poiché il partner interagenti è noto, una libreria di potenziale interattori è clonati nel cosiddetto "preda-library." Normalmente, questa libreria è fatta da clonazione cDNA in un apposito preda vettore di espressione plasmidico codificante l'AD che è compatibile con l'esca vettore codificato DBD. Nel caso di una interazione, la fattori di trascrizione ricostituiti inducono l'espressione di geni reporter, che generalmente consentono la selezione crescita del lievito. ilidentificazione di interattori si ottiene sequenziamento del plasmide preda con primer specifici plasmide.

I batteri hanno sviluppato diverse strategie per manipolare e sfruttare il metabolismo del loro ospite o di eludere i meccanismi di difesa e secernere molecole effettrici tramite diversi sistemi di secrezione batterici 19, 20, 21. Determinare i partner di legame di questi effettori batterici è dunque il primo passo per identificare il percorso manipolato nell'ospite. Questo porta ad una migliore comprensione dei meccanismi specifici di patogenicità.

Schermi Y2H vengono eseguiti per identificare interazioni effettori batterica durante fitoplasmosi, e spesso, Y2H è un primo esperimento cruciale per l'ulteriore caratterizzazione dei meccanismi molecolari di patogenicità nella ricerca fitoplasmi 22, 23. Tuttavia, il riunitoDescrizione hod nella maggior parte delle pubblicazioni è piuttosto scarsa, e queste tecniche sono spesso in outsourcing alle aziende biotech. Per attirare l'attenzione sulla fattibilità di questo metodo, questo protocollo fornisce informazioni passo-passo per identificare i partner di interazione di una molecola effettore batterica nel suo ospite naturale.

Nonostante l'ampio uso e l'approccio avanzamento veloce di schermi Y2H, non si deve dimenticare che alcune interazioni non potrebbero verificarsi nel sistema lievito. Ciò è dovuto al fatto che la cellula di lievito viene utilizzato come una sorta di "recipiente di reazione in vivo" con alcune limitazioni biologiche. Diversi autori hanno affrontato i vantaggi e gli svantaggi di Y2H e suoi derivati 11, 24, 25, 26, 27. Considerazioni generali sono, per esempio, che la cellula di lievito potrebbe non fornire la appropriatal'espressione genica, (post) traslazionale, o le condizioni translocational per le rispettive proteine ​​in fase di studio. Questo può portare a risultati falsi negativi nella schermata. Interazioni positive possono a loro volta essere artefatti e potrebbero non verificarsi nella situazione fisica (cioè, nel caso di effettori nell'ospite appropriato). È quindi indispensabile confermare le interazioni del sistema di espressione di lievito eterologa con una prova di interazione indipendente in un sistema biologico più strettamente correlati.

In questo studio, sono stati individuati i partner vincolanti del ATP_00189 effettori del patogeno per le piante non coltivabili Candidatus Phytoplasma mali (P. mali). I risultati forniscono importanti informazioni sui meccanismi molecolari alla base dello sviluppo dei sintomi della proliferazione mela 28, una malattia che provoca elevate perdite economiche nelle regioni melicoltura colpite in Europa 29.

Protocol

1. Raccolta radice e foglia di campioni da alberi di mele infette

Nota: DNA del patogeno-specifica può essere purificato dalle radici o foglie. La sezione seguente fornisce un protocollo per il campionamento di entrambi.

  1. Per la preparazione del DNA
    1. Raccolta dei campioni e preparazione dalle radici
      1. Identificare gli alberi infetti con "Apple proliferation" sintomi specifico d'30, 31 e gli alberi di controllo che sono senza sintomi. Utilizzando forbici pulite, tagliare campioni radice che hanno un diametro di 0,5 - 1 cm e una lunghezza di circa 5 cm. I campioni tagliati dalla tre diversi, i siti distanti del sistema radicale, e metterli in sacchetti di plastica adeguatamente etichettati.
        1. Conservare i campioni in una scatola fredda con pacchetti termali refrigerati e conservarli in frigorifero a 4 ° C, fino al procedimento.
          Nota: l'architettura e la struttura della radice può variare rispetto allo stato fisiologico of l'albero. È importante campionare a tre siti diversi e non prendere radichette troppo sottili. I campioni possono essere conservati per diversi giorni a 4 ° C, ma i tempi di inattività aumentano il rischio di stampaggio. campioni Moldy non possono essere utilizzati per la preparazione del DNA.
      2. Risciacquare i campioni radicolari con acqua per rimuovere il terreno. Metteteli in una capsula di Petri sterile e usare un bisturi sterilizzato per rimuovere l'epidermide radice e la corteccia.
        1. Pulire il bisturi con un panno pulito e privo di lanugine pulire, immergerlo nel 70% (v / v) di acqua di etanolo, e il calore-sterilizzare sopra una fiamma aperta (ad esempio, becco Bunsen). Gratta il floema con il bisturi, tagliare in piccoli pezzi, e un'aliquota di 30 - 100 mg di floema tritato in un tubo di reazione 2,0 ml sterile. Conservare i campioni a -80 ° C per diversi mesi.
    2. la raccolta e la preparazione di foglie di esempio
      1. Identificare un infetto e un albero di controllo asintomatico, unas descritto al punto 1.1.1.1, e raccogliere dieci foglie indenne per albero. Un albero per ogni condizione è sufficiente.
      2. Lavare le foglie con acqua e pulire le superfici a spruzzo 70% (v / v) di etanolo. Mettere le foglie in una capsula di Petri sterile e sezionare la nervatura centrale (vena centrale) di ogni foglia con un bisturi sterile. Rimuovere l'epidermide e la corteccia dalla nervatura centrale, tagliare la nervatura centrale in piccoli pezzi, e un'aliquota di 100 mg del tessuto nervatura centrale in un tubo di reazione da 2,0 ml sterile. Utilizzare i campioni immediatamente per la preparazione del DNA o conservare a -80 ° C per diversi mesi.
        Nota: È conveniente Aliquotare il materiale vegetale in porzioni di 100 mg ed eventualmente congelarli per la conservazione. Ogni aliquota può essere utilizzato direttamente per la preparazione del DNA. Pesatura materiale vegetale surgelati è ingombrante, poiché il materiale vegetale congelato tende a formare blocchi.

2. cetiltrimetilammonio bromuro (CTAB) a base di DNA Preparazione

32.

  1. Preparare i seguenti tamponi:
    1. Tampone CTAB: Sciogliere 1% w / v cetiltrimetilammonio bromuro (CTAB, M r: 364,45 g / mol), 100 mM tris-idrossimetilamminometano (Tris, M r: 121.14 g / mL), 1,4 M di cloruro di sodio (NaCl, M r: 58,44 g / mol), e 20 mm etilendiamminotetraacetico sale disodio (L 'NaEDTA, M R: 372,24 g / mol) in acqua e ad adattarsi a pH 8.0.
    2. N-Lauroylsarcosine buffer: Sciogliere 10% w / v sale di sodio N-lauroylsarcosine 33 (M r: 293,38 g / mol), 100 mM Tris, e 20 mM L 'NaEDTA in acqua e regolare il pH a 8,0.
    3. Tris-EDTA (TE) buffer: Sciogliere 10 mM Tris e 1 mM L 'NaEDTA in acqua e autoclave la soluzione.
    4. Soluzione di acetato di ammonio: Preparare un 5 M di acetato di ammonio (M r: 77,0825 g / mol) soluzione in acqua e autoclave è a 120 ° C e 1,2 bar per 20 min.
  2. Mix 30 - 100 mg di materiale vegetale tritato fresco o surgelato (passo 1.1.2.2.) Con 300 ml di tampone CTAB, 30 ml di tampone N-Lauroylsarcosine, 6 ml di proteinasi K (10 mg / mL) e 12 ml di 2-mercaptoetanolo 34 (M r: 78,13 g / mol). Agitare per 60 min a 60 ° C. Lasciate che la miscela raffreddare a temperatura ambiente prima di procedere.
  3. Aggiungere 360 ​​ml di soluzione di acetato di ammonio e mescolare energicamente. Sia la soluzione riposare per 5 minuti, quindi si centrifuga che a 15.000 xg per 10 min a temperatura ambiente. Trasferire il surnatante in una provetta pulita e aggiungere 720 ml di ghiacciata isopropanolo 35. Precipitare il DNA per almeno 30 min a -20 ° C.
  4. Centrifugare la miscela a 15.000 xg per 30 min a 4° C e scartare il surnatante. Lavare il pellet con 500 ml di ghiacciata etanolo al 70% e spin giù a 15.000 xg per 5 minuti a 4 ° C.
  5. Eliminare il surnatante etanolo e immergere immediatamente il flaconcino su un tovagliolo di carta pulito per rimuovere le goccioline residue. Assicurarsi di rimuovere quanto più liquido possibile. Far asciugare il pellet per 15-20 minuti o per 2-3 minuti in una centrifuga a vuoto concentratore. Non over-asciugare il pellet da tempi di evaporazione estesi riscaldamento eccesso o.
  6. Risospendere il pellet in 700 ml di tampone TE e infine scaldare a 37 ° C per facilitare la dissoluzione. Aggiungere 10 ml di RNAsi (10 mg / mL) e incubare per 15 min a 37 ° C, agitando a 300 rpm.
  7. Aggiungere 700 ml di cloroformio: alcool isoamilico 36 24: 1 e mescolare bene. Centrifugare la miscela a 20.000 xg per 10 min a 4 ° C e trasferire la fase superiore del surnatante in una nuova provetta pulita.
  8. Precipitare il DNA nel surnatante aggiungendo700 ml di 2-propanolo 35 (isopropanolo, M r: 60.1 g / mol) e incubando per almeno 30 min a -20 ° C. Centrifugare la miscela a 12.000 xg per 30 min a 4 ° C e scartare il surnatante.
  9. Lavare il pellet con 500 microlitri di etanolo al 70% e centrifugare a 12.000 xg per 5 minuti a 4 ° C. Asciugare il pellet come descritto al punto 2.5. Sciogliere in 50 ml di TE.

3. Individuare Candidatus Phytoplasma DNA mali-specifica mediante PCR

  1. Diluire il DNA purificato dal materiale vegetale 1:10 in acqua priva di nucleasi ed eseguire una PCR con primer specifici patogeni 37.
    1. Verificare la presenza di P. DNA specifiche mali nel materiale vegetale utilizzando un protocollo quantitativa PCR con primer e sonde specifiche per P. fitoplasmi mali 37. Controllare l'assenza degli altri membri fitoplasmi 16SrX eseguendo la stessa PCR con le rispettive sonde per CaND. P. prunorum e per Cand. P. pyri DNA 37.
      NOTA: DNA da un albero non infetto deve essere testato anche per confermare l'assenza di un agente patogeno in questo controllo. A questo punto, è importante che il DNA da altre specie strettamente correlate fitoplasmi è assente nel campione, poiché ciò aumenta il rischio di amplificare l'effettore da una specie fitoplasmi diversi da P. mali. Una infezione mista con un altro strettamente correlato P. mali gruppo fitoplasmi 16SrX è escluso analizzando il campione con le rispettive sonde. Poiché i risultati attesi dovrebbero essere negativa per altri phytoplasma 16SrX, è importante includere i controlli appropriati positivi che indicano PCR efficacia.

4. amplificando il potenziale Effector Gene e subcloning nel vettore Y2H Bait

  1. Amplificare il gene atp_00189 phytoplasmal (che non comprende la parte del segnale peptide) di P. Mali utilizzando i primer 5-TCTCCTCCTAAAAAAGATTCTA-3 (in avanti) e 5-TATTATTTATCTTTATTTTTTTCCTT-3 (reverse), con siti di restrizione per EcoRI e SalI al 5 'e al 3' estremità, rispettivamente. Purificare il prodotto di PCR con un metodo di purificazione di DNA basata su colonne.
  2. Clonare il amplicone nel vettore Y2H esca PLEXA-N tramite EcoRI e SalI legatura.
    NOTA: Qui, 100 ng di EcoRI e SalI linearizzato PLEXA-N vettore è stato combinato con 15 ng di simile digerito atp_00189 PCR amplicone e 1 U di T4-ligasi. La legatura è stata effettuata in tampone contenente 40 mM Tris-HCl (pH 7,9 a 25 ° C), 10 mM MgCl 2, 10 mM ditiotreitolo (DTT, M r: 154.25 g / mol), e 0,5 mM adenosina trifosfato (ATP, M r: 507,18 g / mol) in un volume totale di 10,0 microlitri a 16 ° C per una notte (14-20 h). Analizzare il DNA dall'albero non infetto con gli stessi primer per escludere fondo non specifico legame con Malus domestica x </ Em> DNA.
  3. Transform 1 ml di miscela di legamento in cellule di E. coli electrocompetent e selezionare per i cloni resistenti kanamicina su Luria-Bertani (LB) piastre integrato con 50 mg / ml kanamicina solfato 38.
  4. Purificare il DNA plasmide dai cloni batterici selezionati con un mini kit di preparazione plasmide colonna a base seguendo le istruzioni del produttore, e controllare la riuscita integrazione e l'orientamento dell'inserto mediante sequenziamento 39.

5. Prova di auto-attivazione (Auto-attivazione) della proteina potenziale Effector

  1. Preparare i seguenti tamponi e mezzi di crescita:
    NOTA: La nomenclatura per piatti divide le lievito-selettivo le abbreviazioni degli aminoacidi mancanti nella rispettiva media con un "-" prima della sigla. Ad esempio, SD-TRP-Leu-sue lastre contengono tutti gli amminoacidi, ma trp, leu e la sua.
    1. 10x dropout mix: Pesare200 mg di L-arginina monocloridrato (M r: 210,66 g / mol), 300 mg di L-isoleucina (M r: 131.17 g / mol), 269 mg di monoidrato L-lisina (M r: 164.21 g / mol), 200 mg di L-metionina (M r: 149.21 g / mol), 500 mg di L-fenilalanina (M r: 165,19 g / mol), 2 g di L-treonina (M r: 119.12 g / mol), 300 mg di L-tirosina (Mr: 181.19 g / mol), 200 mg di L-uracile (112.09 g / mol), e 1,5 g di L-valina (M r: 117.15 g / mol). li Sciogliere in 1 L di acqua bidistillata e autoclave la soluzione. Mantenere la soluzione a 4 ° C.
      NOTA: Il rispettivo mix di abbandono può essere premiscelato anche acquistati.
    2. 10x L-adenina supplemento: Pesare 100 mg di sale di L-adenina hemisulfate (ade, M r: 184.17 g / mol) e scioglierli in 50 ml di acqua bidistillata. Filtro sterilizzare la soluzione con un filtro pori 0,22 micron.
    3. 10x L-istidina supplemento: Pesare 100 mg di L-istidina monocloridrato monoidrato (il suo, M r
    4. 10x L-leucina supplemento: Pesare 500 mg di L-leucina (Leu, M r: 113.17 g / mol) in 50 mL di acqua bidistillata e filtro sterilizzare con un filtro pori 0,22 micron.
    5. 10x L-triptofano supplemento: Pesare 100 mg di L-triptofano (trp, M r: 204.23 g / mol) in 50 mL di acqua bidistillata e filtro sterilizzare con un filtro pori 0,22 micron.
    6. SD-trp-leu-his-ade-media e piastre: Sciogliere 0,67% w / v base azotata di lievito (senza amminoacidi) e 2% w / v D-glucosio monoidrato (M r: 198,17 g / mol) in doppio acqua e autoclave distillata. Per piastre di agar, aggiungere 2% w / v di agar (grado microbiologica) prima di sterilizzazione in autoclave.
    7. Per preparare piatti selettive, aggiungere 1x del aminoacido soluzione madre al mezzo Sd-TRP-Leu-la-ade autoclave. Nel preparare lastre, assicurarsi che l'agar viene raffreddata a ~ 50 ° C prima di aggiungeregli aminoacidi. Conservare le soluzioni madre sterili.
    8. Media YPAD: sciogliere 1% w / v di estratto di lievito, 2% w / v peptone (grado microbiologica), 0,004% w / v adenina hemisulfate sale (M r: 184.17 g / mol), e 2% w / v di glucosio monoidrato per acqua e autoclave bidistillata. Per piastre di agar YPad, aggiungere 2% w / v di agar prima di sterilizzazione in autoclave. Per preparare 2x YPAD, utilizzare due volte le concentrazioni degli ingredienti di cui sopra.
      Nota: (opzionale) A causa della elevata concentrazione di glucosio nel mezzo, medio 2x YPAD diventa scuro-brunastro dopo la sterilizzazione in autoclave. In alternativa, un 40% (w / v) di soluzione di glucosio può essere preparato e sterilizzato facendolo passare attraverso un filtro di 0,22 micron. Il glucosio magazzino soluzione sterilizzata per filtrazione viene quindi aggiunto al autoclavato 2x YPAD (privo di glucosio) in condizioni sterili. Per evitare errori di volume, l'2x YPAD deve essere preparato, tenendo presente che una soluzione di glucosio 10x viene successivamente aggiunto. Ciò significa che, per esempio, invece di 1 L of media, solo 900 ml è preparato (che contiene tutti gli ingredienti tranne il glucosio) e sterilizzati in autoclave, e poi viene aggiunto 100 ml di soluzione di glucosio.
  2. trasformazione di lievito litio acetato-mediata per il test di auto-attivazione
    1. Streak il ceppo Saccharomyces cerevisiae giornalista NMY51 40 (NMY51: MATahis3Δ200 trp1-901 leu2-3,112 ADE2 LYS2: :( lexAop) 4 HIS3 URA3: :( lexAop) 8-lacZ ADE2: :( lexAop) 8-ADE2 GAL4) da un glicerolo congelati magazzino su una piastra di agar YPAD e incubare per 48 ore a 30 ° C. Scegliere colonie di questo piatto e inoculare 50 ml di terreno YPAD. Lasciate che il lievito crescere e misurare il diametro esterno 600 regolarmente per monitorare la crescita.
    2. Lasciate che il lievito a crescere ad un diametro finale 600 di 0,5-0,8. Agglomerare le cellule da essi centrifugazione a 700 xg per 5 minuti e risospendere in 2,5 ml di acqua bidistillata, autoclave.
    3. Preparare sei aliquote con 100 ml di sospensione di lievito e aggiungere 240 ml di 50% W / v polietilenglicole 4000 (PEG, M r: 3.500-4.000 g / mol), 36 ml di 1 M di litio acetato diidrato (LiOAc, M r: 102.02 g / mol), e 25 ml di 2% w / v DNA dello sperma di salmone (disciolto). Preparare tutti i reagenti con acqua bidistillata sterile.
    4. Etichettare i sei fiale contenenti la sospensione di lievito da "a" a "f" e aggiungere il seguente DNA plasmide vettore: controlli negativi: (a) 1,5 mg di esche plasmide con il effettrici (Plexa-N-atp00189 28), (b) 1,5 mg di plasmide preda vuoto PGAD-HA 41, (c) 1.5 mg di vettore esca vuoto PLEXA-N 41, e (d) 1,5 mg di esche vettore vuoto PLEXA-N e 1,5 mg di vuoto preda plasmide PGAD-HA; controlli positivi: (e) 1,5 mg di positivo-controllo esca plasmide DNA PLEXA-p53 41 e 1,5 mg di positivo-preda plasmide PACT-larget 41; e il test di auto-attivazione: (f) 1,5 mg di baesso plasmide con il effettrici (Plexa-N-atp00189) e 1,5 mg di vuoto preda plasmide PGAD-HA.
    5. Mescolare le reazioni vigorosamente e incubare per 45 min a 42 ° C in un bagno d'acqua. Agglomerare le cellule per 5 minuti a 700 xg ed eliminare il surnatante. Risospendere le cellule in 250 ml di 0,9% (w / v) di cloruro di sodio (NaCl, M r: 48.44 g / mol) e la diffusione 50 microlitri sui seguenti piastre selettive: SD-trp, Sd-leu, SD-trp- leu, SD-TRP-Leu-la, e SD-TRP-Leu-la-Ade.
    6. Incubare le piastre per 3 - 4 giorni a 30 ° C. Dopo il primo giorno di incubazione, sigillare le piastre con parafilm plastica per evitare che le piastre si secchi.
    7. Controllare la crescita del lievito sulle piastre.

6. Verificare l'espressione del Effector

  1. Testare l'espressione del effettore mediante Western blot 42 con un anticorpo contro la Lex-A tag che è accoppiato al N-terminale della effettore quandoespresso da PLEXA-N.
    Nota: Si consideri che il translationally fuso Lex-Un tag aggiunge circa 24 kDa al peso effettivo della proteina di interesse. Questo è importante quando si identifica la dimensione proteina nel Western blot.

7. La schermata Y2H

  1. Streak il PLEXA-atp00189 (attuatore) -transformed NMY51 su un piatto SD-trp fresco e lasciarlo crescere per 2 - 3 giorni a 30 ° C, fino a quando appaiono colonie rosse.
  2. Seminare 3 mL di terreno SD-trp in una piccola boccetta agitando con una colonia rossa dalla piastra agar e incubare una notte a 30 ° C con agitazione a 120 - 150 rpm.
  3. Inoculare 20 mL di SD-trp in un pallone agitazione con 1 ml di cultura durante la notte e lasciarlo crescere per 8 ore.
  4. Regolare la cultura di OD 600 = 0,2 con l'aggiunta di media SD-trp e inoculare 2x 100 ml in agitazione boccette con 10 ml di coltura starter ciascuno. Crescere durante la notte con agitazione a 30 ° C.
    Nota: Assicurarsi che il lievito non cresce a OD 600> 0.5 e diluire con fresca SD-trp.
  5. Misurare il diametro esterno 600 e il pellet 120 OD 600 "unità". Ad esempio, se un OD 600 di 1,2 è misurata, centrifugare 100 mL, scartare il surnatante e risospendere il pellet in 800 ml di pre-riscaldato 2x YPAD in un pallone shaker con ancoretta magnetica.
    1. Spin giù una aliquota di 2 ml, togliere il surnatante, e risospendere il pellet in acqua. Assicurarsi che il diametro esterno 600 della sospensione di lievito è compresa tra 0,15 e 0,2. In caso contrario, regolare con 2x YPAD o aggiungere più lievito dalla cultura durante la notte.
      Nota: 2x YPAD è marrone scuro e può influenzare i risultati della misurazione OD. Pertanto, è necessario per risospendere le cellule di lievito in acqua prima di determinare il OD. In alternativa, 2x YPAD può essere preparato mediante sterilizzazione glucosio separatamente, come descritto nel passaggio 5.1.8 nota, che impedisce la colorazione scura del mezzo.
  6. Incubare la cultura rimanente lievito in un appropriately dimensioni matraccio agitatore (800 mL in un matraccio agitatore 2 L o dividere 2 x 400 mL in due beute 1 L shaker) e incubare a 30 ° C 120 - 150 rpm. Misurare il diametro esterno 600 circa ogni 1,5 ore fino a quando un OD 600 di 0,6 viene raggiunta (prende 4 - 6 h). Nel frattempo preparare le soluzioni descritte nel passaggio successivo.
  7. Litio trasformazione acetato-mediata
    1. Sciogliere 2% w / v DNA di sperma di salmone in acqua e far bollire 500 microlitri per 5 minuti in un bagno d'acqua a 100 ° C. Posizionare la provetta in ghiaccio per 2 minuti e ripetere la fase di riscaldamento. Mantenere il DNA in ghiaccio fino a nuovo uso.
    2. Preparare le seguenti mescole:
      1. TE / LiOAC mix: Mescolare 3.08 ml di 1 M LiOAC, 3,08 ml di 100 mM Tris / 10 mM EDTA (pH: 7,5), e 21,84 ml di acqua bidistillata sterile.
      2. PEG / LiOAc mix: Combinare 4,2 mL di 1 M LiOAc, 4.2 mL di mM Tris / EDTA 10 mM (pH: 7,5), e 33,6 ml di 50% (w / v) di PEG 4000.
    3. Centrifuga la cultura di lievito 800 ml (OD 600 = 0,6)a 700 xg per 5 minuti per agglomerare le cellule. Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet in 200 ml di acqua bidistillata sterile. Agglomerare le cellule di nuovo a 700 g per 5 minuti e scartare il surnatante. Nota: se necessario dividere la sospensione in diverse fiale per centrifugazione. I volumi liquidi in 7.7.3. e 7.7.4. riferirsi a tutta pellet derivato da 800 ml di sospensione.
    4. Risospendere il pellet in 16 ml di TE / LiOAc mix (vedi punto 7.7.1.1); spin down a 700 xg per 5 minuti e scartare il surnatante. Risospendere il pellet in 9,6 ml di TE / LiOAC mix.
    5. Preparare la seguente reazione si mescola in modo appropriato dimensioni vasi reazione polipropilene: 12 fiale con 7 mg di PGAD-HA-cDNA vettore biblioteca, 100 ml di 2% del DNA dello sperma di salmone (vedi punto 7.7) e 2,5 ml di PEG / LiOAc mix. Aggiungere 600 microlitri di sospensione cellulare di lievito dal passo 7.10 a ciascuno dei 12 fiale e mescolare vigorosamente per 1 min.
    6. Incubare la miscela di reazione per 45 minuti a 30 ° C in un bagno d'acquad mescolare energicamente ogni 15 min. Aggiungere 160 ml di DMSO ad ogni fiala e mescolare energicamente. Incubare la miscela per altri 20 minuti a 42 ° C.
    7. Agglomerare le cellule a 700 xg per 5 minuti, scartare il surnatante, e risospendere ogni pellet in 3 mL di 2x YPAD. Pool tutte le cellule (per un totale di 36 mL da 12 fiale) in un matraccio da 100 mL shaker e incubare il lievito per 90 min a 30 ° C e 120 rpm.
    8. Agglomerare le cellule per 5 minuti a 700 xg ed eliminare il surnatante. Risospendere il pellet in 4,5 mL di soluzione sterile 0,9% (w / v) di NaCl e mescolare bene accuratamente pipettando su e giù con una pipetta sierologica 10 mL. Prelevare 50 ml e preparare diluizioni di dieci volte in NaCl allo 0,9% da 1:10 fino a 1: 1.000. Piatto 100 ml di ogni diluizione su piastre di Petri di 90 mm contenenti SD-TRP-leu agar.
    9. Stendere il resto della risospensione di lievito diluito in 16 x 150 mm di diametro piatti di Petri con SD-TRP-Leu-la-ade agar. Aggiungere 3-AT al mezzo per ridurre auto-attivazione. Incubare la SD-TRP-leupiastre per tre giorni e piatti della SD-TRP-Leu-suoi-Ade per quattro giorni a 30 ° C.
      NOTA: I cloni che compaiono sulle piastre selettive sono (potenziali) coppie che interagiscono e portano la codifica plasmide PGAD-HA per l'esca interagire partner.
    10. Determinare l'efficienza di trasfezione contando le colonie delle diverse diluizioni seriali sulle piastre di selezione SD-TRP-Leu. Trasferire ogni clone con la scelta e striature la colonia con una punta pipetta sterile su piastre fresche SD-TRP-Leu-la-ade-selettivo. Incubare le piastre per 24 ore a 30 ° C. Ripetere questa operazione ogni giorno fino a raggiungere un totale di cinque passaggi.

8. Analisi dei cloni dalle piastre selettivi

  1. Preparare una sterile tubo di reazione da 2 ml con 1 ml di SD-TRP-Leu-la-Ade per ogni clone sotto una cappa sterile. Effettuare un foro in ogni provetta con un ago caldo e coprire il foro con un pezzo di isolante permeabile ai gas. Seminare ciascun flacone con compagno di colonia fresca rial da un clone (passo 7,17; utilizzare cloni dopo il 5 ° passaggio) e incubare per 24 ore a 30 ° C, agitando a 150 rpm.
    NOTA: È importante prendere cloni da una piastra fresca, perché lievito preso dalle lastre memorizzati per diversi giorni a 4 ° C non crescono sufficientemente entro 24 h nel mezzo liquido.
  2. Pellet il lievito per 5 minuti a 4000 xg ed eliminare il surnatante. Risospendere il pellet nel tampone di risospensione appropriata (dal rispettivo kit miniprep plasmide DNA) e trasferirlo ad un tubo di reazione da 2,0 mL fresco. Aggiungere 100 ml di perline di vetro lavata con acido (425- 600 micron di diametro) e mescolare energicamente per 5 min.
  3. Aggiungere il rispettivo tampone di lisi e procedere con la purificazione plasmide utilizzando un mini kit di preparazione plasmide seguendo le istruzioni del produttore. Eluire il DNA plasmide con 50 ml di acqua.
  4. Utilizzare il DNA dal punto 8.3 per una reazione di sequenziamento con la preda primer specifico-plasmide, GAL4ADseqref "> 41 5'- ACCACTACAATGGATGATG -3 '.
  5. Verificare l'interazione da parte de novo co-trasformazione 43, 44 l'esca e il vettore preda. Selezionare il lievito trasformato su piastre di selezione SD-TRP-Leu-la-Ade.

Representative Results

Prima che lo schermo Y2H reale può essere eseguita l'esca deve essere testato per l'auto-attivazione. Questo risultato è ottenuto trasformando il vettore di espressione esca insieme con il vettore libreria preda vuoto e di controllo della crescita su piastre selettive.

Per analizzare se la proteina ATP_00189 phytoplasmal è auto-attivazione, il test di auto-attivazione è stata eseguita come descritto nel paragrafo 5. Il plasmide esca è complementare il trp e la preda plasmide il auxotrofia leu di S. cerevisiae NMY51 40. Un successo di co-trasformazione è quindi caratterizzato da una crescita su piastre selettive prive trp e leu. L'interazione dell'esca e una proteina preda porta ad una complementazione del suo e ade auxotrofia di NMY51. Se appare autoattivazione dall'esca in assenza di una interazione, il lievito cresce su piastre selettive prive sua e ade. Forte e debole autoattivazione può verificarsi. Strong autoattivazione dell'esca è caratterizzata da una crescita del lievito co-trasformato on trp-leu-his-ade impoverito piastre di selezione. Debole auto-attivazione porta alla crescita su trp-Leu-la, ma non su TRP-Leu-la-Ade impoverito piastre di selezione. controlli adeguati positivi sono indispensabili per interpretare i risultati del test di auto-attivazione. Una sintesi dei risultati attesi del test di auto-attivazione e la loro interpretazione è fornito nella tabella 1 e visualizzati nella figura 1.

Figura 1
Figura 1: Esempio di Bait test auto-attivazione di un esca prima di eseguire una schermata Y2H. S. cerevisiae NMY51 è stato co-trasformato con l'interazione esca (PLEX-p53) e prede (PACT-larget) come controllo positivo (pannello di sinistra: ac), una debole auto-attivazione più una preda vuoto library vettore (pannello centrale: df) e un esca non auto-attivazione più un vettore libreria preda vuoto (pannello di destra: gi). Il lievito co-trasformato sono state coltivate su piastre SD prive trp e leu (pannello superiore: a, d, g), trp, leu e il suo (pannello centrale: B, E, H) e trp, leu, la sua e la facciata (in basso pannello: C, F, I). Selezione sul mezzo privo di trp e leu è un controllo positivo per il successo di co-trasformazione, come il vettore esca completa il auxotrofia trp e il vettore preda leu auxotrofia di NMY51 (crescita su SD-TRP-leu). Nel caso di una interazione tra esca e la preda o di un auto-attivazione della esca, l'espressione giornalista di NMY51 sia acceso e completa il suo e ade auxotrofia (crescita su SD-TRP-Leu-la-Ade). Un debole auto-attivazione è caratterizzato da una crescita su SD-TRP-Leu-suoi piatti (pannello centrale, df). Debole autoattivazione di un'esca deve essere diminuito preventiva per analizzare l'escain una schermata Y2H, ad esempio aggiungendo 3-AT ai mezzi selettivi. esaurimento aminoacidi sono indicate con "-" nel rispettivo nome del supporto. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

PLEXA-N-atp00189 nessuna colonie nessuna crescita nessuna crescita nessuna crescita nessuna crescita
nessuna PGAD-HA nessuna crescita colonie nessuna crescita nessuna crescita nessuna crescita
PLEXA-N nessuna colonie nessuna crescita nessuna crescita nessuna crescita nessuna crescita
PLEXA-N PGAD-HA colonie colonie nessuna crescita nessuna crescita
PLEXA-p53 PACT-larget colonie colonie colonie colonie colonie
PLEXA-N-atp00189 PGAD-HA colonie colonie colonie nessuna crescita nessuna crescita

Tabella 1: Risultati attesi in un saggio Self-attivazione esca. La trasformazione di S. cerevisiae NMY51 produce in crescita differenziale su terreni selettivi in base alle caratteristiche di esche co-trasformato e prede. La crescita su piastre selettive stata valutata misurando la trasformazione di diverse combinazioni vettoriali (af) dopo 72 ore di incubazione a 30 ° C. Debole auto-attivazione è caratterizzato da una crescita del lievito su SD-TRP-Leu-la e forte auto-attivazione crescita su SD-TRP-Leu-la-Ade selezione plates in assenza di un partner di interazione. Il PLEXA-N phytoplasmal codificato effettrici ATP_00189 non presenta auto-attivazione, che si caratterizza per l'incapacità del vettore esca trasformato NMY51 di crescere in assenza del suo e ade.

A seconda l'esca, uno schermo Y2H può guadagnare numerosi cloni di lievito che cresce su piastre selettive. Tutti i cloni devono essere analizzati e controllati per eventuali esuberi. Anche se è stata utilizzata una libreria di cDNA normalizzata, è molto probabile che un interactor è rappresentata in molti cloni differenti. A seconda della tecnica di clonazione biblioteca, è anche possibile che solo frammenti del gene completo sono inseriti alcuni vettori preda. È pertanto consigliabile de novo amplificare (da cDNA) e subclone il gene lunghezza della interattore e testare l'interazione in un'analisi Y2H uno-a-uno (Figura 2).

"Figura Figura 2: Esempio di una interazione tra Bait and Prey in un esperimento Y2H. Uno schermo lievito doppio ibrido (Y2H) è stata eseguita e plasmidi da cloni Interactiano positivi sono stati purificati. Il vettore preda è stato sequenziato e le Malus domestica x partner di interazione ospite MdTCP24 e MdTCP25 sono stati identificati. Come MdTCP34 controllo negativo (per i quali non è stato identificato interattore nella schermata della libreria Y2H) è stato subclonato in parallelo. I geni di lunghezza completa sono stati amplificati dal cDNA mela, subclonato nel vettore preda (che esprime co-cistronically l'attivazione dominio AD) e de novo co-trasformato con il vettore esca che esprime la ATP_00189 effettori batterica accoppiato al dominio di legame al DNA (BD). Questa figura è presa da 28. Clicca qui per visualizzare un più grandeversione di questa figura.

Discussion

Nella schermata Y2H, il potenziale di proteine ​​effettrici è co-espresso con diverse proteine ​​che interagiscono ipotetici (passo 7). Ogni crescita del lievito clone contiene l'esca, ma una (potenzialmente) Interactiano diverso. Le proteine ​​che interagiscono sono codificati in una libreria di cDNA che viene clonato in plasmidi preda. L'esca e la preda plasmidi ciascun codice co-cistronically per una parte di un fattore di trascrizione di lievito. In caso di interazione fisica tra l'esca (effettori) e un interattore plasmidica preda, le due parti del fattore di trascrizione (il dominio di legame al DNA e il dominio di attivazione) sono uniti, e l'espressione del gene reporter è indotta. Il lievito è in grado di crescere su piastre di selezione SD histidine- e adenina-impoverito. Il tipo di libreria di cDNA preda dipende dalla effettore schermati e deve essere scelta di conseguenza. La preda ed esca vettore, così come il ceppo di lievito, devono essere compatibili. In questa schermata, un DNA LexA dominio di legame e l'attivazione di GAL4 Domain sono stati utilizzati come unità di fattore di trascrizione del lievito compatibili. La libreria di cDNA può essere costruito individualmente, su misura, o commercialmente ottenuti. La preparazione della libreria cDNA preda non è parte di questo protocollo. In questo protocollo, un auto-costruito, libreria di cDNA normalizzata dalla RNA di Malus x domestica foglie è stato utilizzato e clonato in PGAD-HA 41. Il effettrici (esca) esprimente il ceppo di lievito è stato trasformato con la libreria preda, e cloni sono stati selezionati su piastre di selezione SD histidine- e adenina-impoverito. Per estrarre DNA plasmidico dalle colonie di lievito, un mini kit plasmide DNA basata su colonne per i batteri è raccomandato in combinazione con un passo rottura meccanica con perline di vetro per migliorare lievito lisi (fase 8). In questa purificazione plasmide, l'esca e il vettore preda saranno purificati simultaneamente in concentrazioni relativamente basse. Tuttavia, la quantità di DNA plasmide è sufficiente per identificare il partner di interazione attraverso il sequenziamento ingegnoHout propagazione plasmide prima (fase 8.4). In alternativa, il DNA purificato nel passaggio 8.4 può essere trasformato in competente E. coli e selezionato con la preda resistenza agli antibiotici vettore-mediata (ad esempio, ampicillina l'in caso di PGAD-HA). Il E. coli selezionato colonie portano solo la libreria plasmide PGAD-HA, e ad alto rendimento purificazione plasmide può essere eseguita con questi cloni.

La trasformazione di successo di PLEXA-N e PGAD-HA costrutti completa il triptofano e leucina auxotrofia di NMY51. Un'interazione tra l'effettore e una proteina (codificati sulla PGAD-HA) porta all'attivazione del sistema reporter in NMY51 ceppi. Nel caso di auto-attivazione, NMY51 trasformato con l'effettore esprimere Plexa-N in combinazione con il vettore libreria vuota PGAD-HA cresce su piastre selettive privi trp-leu-his-ade, causa l'attivazione indesiderata del sistema reporter NMY51 40. L'auto-attivazione può essere weak e può verificarsi in assenza di trp-leu-la, o l'attivazione può essere forte e caratterizzato da una crescita su piastre trp-Leu-la-ade 41. Auto-attivazione può causare uno sfondo massiccia di cloni falsi positivi nella schermata Y2H vero e proprio. Per evitare questo, deve essere condotto un test di auto-attivazione con l'esca, in cui il vettore effettore esprimente è co-trasformato con il vettore libreria vuota. In questa impostazione sperimentale, l'espressione genica giornalista non deve essere indotta. Se auto-attivazione (cioè, la crescita su piastre selettive) è visibile nella prova, il mezzo può essere integrata con differenti concentrazioni di 3-ammino-1,2,4-triazolo 45 (3-AT). 3-AT è un inibitore della dehydratase imidazoleglycerol-fosfato (HIS3), un enzima importante durante istidina biosintesi 46. La supplementazione con 3-AT può ridurre gli effetti deboli di auto-attivazione durante schermi Y2H 47,48. Differenti concentrazioni di 3-AT devono essere testati. In questo protocollo, 1 - 40 mm 3-AT sono stati utilizzati. La concentrazione più bassa che porta alla repressione di auto-attivazione dovrebbe successivamente essere utilizzato nella schermata Y2H. Le piastre selettive del saggio autoattivazione possono essere valutati solo se le piastre SD-trp-leu del co-trasformazione contengono un numero sufficiente di cloni. Come ≥ un'indicazione 500 colonie per 90 mm (diametro) Petri sono sufficienti. Per determinare l'esatto efficienza di trasfezione, si consiglia di preparare diluizioni seriali del lievito co-trasformato e di diffonderli su piastre SD-TRP-Leu.

Per ridurre autoattivazione, l'effettore può essere clonato in PLEXA-C, un vettore di espressione esca che fonde il tag LexA al C-terminale della proteina. L'orientamento della Lex-Un tag può attenuare auto-attivazione 24. Tuttavia, non è possibile in ogni caso per ridurre o abolire autoattivazione. La formazione dicolonie rosse o rossastre indica una interazione debole o falso-positivo. Il gene reporter ADE2 di NMY51 viene attivato solo quando si tratta di un'interazione proteina-proteina, che a sua volta blocca l'accumulo di un colorante rosso in questo ceppo di lievito 40. In assenza di una interazione, NMY51 sono rossastra, mentre le colonie trasportano interactors forti sono bianchi. L'osservazione del colore delle colonie sulle piastre di selezione prevede quindi un ulteriore importante suggerimento per giudicare se le rispettive colonie sono interattori TrueType o falsi-positivi.

È eventualmente necessario adattare o modificare alcune impostazioni del test rispetto alla natura dell'esca e le caratteristiche di interazione. Ormai, sono stati stabiliti una serie di miglioramenti e di tecniche derivate del Y2H comuni per consentire l'analisi di piuttosto difficili interazioni proteina in diversi sistemi host. Una revisione da Stynen et al. 49 indirizzi di unND descrive i diversi aspetti della Y2H, i suoi miglioramenti e adattamenti, e, quindi, fornisce informazioni utili su come scegliere il saggio di interazione appropriata.

schermi Y2H e tecniche derivate si sono ampiamente utilizzati in diversi campi di ricerca, laddove è richiesta l'identificazione di interazioni proteina binari. Anche se i controlli vengono eseguiti critici, come ad esempio i test di auto-attivazione della esca e one-to-one ri-trasformazione delle proteine che interagiscono identificate, il Y2H è incline a produrre falsi risultati 26, 50, 51. Il lievito come modello non è adatto per tutti gli studi di interazione. Lievito non costituisce necessariamente un ambiente cellulare che supporta la modificazione post-traslazionale appropriato e pieghevole per ogni proteina 24. Inoltre, nel contesto Y2H, le proteine ​​sono sovra-espressi, e la loro espressione non è il controlloguidati dal loro promotore naturale. Il Y2H costringe i partner di interazione proteici al nucleo, che non è necessariamente la loro destinazione naturale subcellulare. Le circostanze nativi cellulari di interazione, quindi, non possono essere riflesse dal lievito e possono portare a risultati falsi negativi o falsi positivi. La maggior parte Y2H si basano sui lieviti auxotrofia complementazione come principio selettivo. Questa selezione nutrizionale è caratterizzato da un'elevata sensibilità, ma a costo di una ridotta selettività rispetto ad altri (ad esempio, cromogenico giornalista) Saggi 49. Se unreducible auto-attivazione (vedi sopra) o altre limitazioni si verificano per un certo effettori, il Y2H non è un test adeguato 25. In Tabella 1 e Figura 1, i risultati attesi del test di auto-attivazione sono dati. L'assenza di interazioni reali (vale a dire, i falsi negativi) può essere causato dalla tossicità della proteina, la proteina traslazionale erratoelaborazione, impedimento sterico dell'interazione, partner di interazione sottorappresentati nella libreria preda, localizzazione di membrana dell'esca, o mancanti componenti necessari per l'interazione 24.

Si raccomanda di de novo amplificare il gene intera lunghezza della proteina interagente identificato dal cDNA, subclone in PGAD-HA, ed eseguire un test interazione uno-a-uno, trasformando l'generata PGAD-HA costrutto nel esca esprimono ceppo NMY51. Ciò è necessario in quanto l'interagente osservata presente nella libreria preda potrebbe essere solo un frammento di una proteina più grande. Tuttavia, le informazioni per il rispettivo gene full-length è accessibile solo se considerevole di dati sequenza genomica e trascrittomica è disponibile. Il protocollo di trasformazione per il saggio autoattivazione qui descritto può essere applicato per un tale test uno-a-uno, e l'interazione tra l'esca e l'interagente deve essere riproducibile.

Malus x domestica è stata verificata in planta con complementazione fluorescenza biomolecolare (BiFC) in Nicotiana benthamiana protoplasti 28 (non fa parte di questo protocollo). Il ATP_00189 proteine ​​effettrici è stato derivato dalla pianta patogeno P. mali. In planta BiFC è stato quindi deciso di verificare le interazioni ATP_00189 con i x domestica fattori di trascrizione Malus precedentemente identificati nel Y2H 28. BiFC è un saggio di interazione proteina-proteina che non richiede la traslocazione subcellulare delle proteine ​​interagenti al nucleo per attivare il sistema reporter <sup class = "xref"> 52. Inoltre, i in planta di espressione e macchinari modifica imita l'ambiente di interazione naturale tra la effettori batterica impianto nella sua pianta ospite. Tuttavia, uno schermo globale utilizzando BiFC non è fattibile.

Ci sono diversi passaggi del protocollo che deve essere affrontato con attenzione. Quando amplificando il gene di interesse (step 4), è importante escludere che i primer si legano al DNA vegetale. Pertanto, il DNA da piante non infette deve essere incluso come controllo negativo. La sequenza del gene di interesse non deve contenere i siti di restrizione EcoRI e SalI che vengono utilizzati per la clonazione direzionale dell'inserto. Se la sequenza contiene questi siti, diversi enzimi di restrizione per la clonazione devono essere scelti. Lievito trasformazione è un metodo centrale durante questo protocollo. efficienza di trasfezione dipende dalla competenza delle cellule di lievito, la vitalità, lo stato di crescita, e la qualità del REAG trasfezioneent 53, 54. Per il protocollo proposto, si consiglia vivamente di utilizzare il lievito dai piatti freschi, non più di due settimane (conservate a 4 ° C) durante l'esecuzione delle trasformazioni. Spesso, la crescita del lievito trasformato è in ritardo quando colture liquide selettivi vengono inoculate con le colonie da vecchie piastre di agar. E 'anche utile usare una coltura starter liquido come inoculo per gli esperimenti reali e non utilizzare il lievito direttamente dalla piastra. Bassa efficienza quando transfecting la preda nel lievito esca esprimono può portare alla sottorappresentazione di alcune proteine ​​preda (potenziali Interactiani) e può quindi inclinare l'intero schermo. In questo protocollo, una efficienza di trasfezione di lievito di ~ 150.000 ufc / mg di DNA trasfettato in Y2H ha funzionato bene.

Conoscere i difetti e gli svantaggi della tecnica Y2H e interpretare i risultati in modo critico e adeguato è indispensabile per disegnare la correct conclusioni. saggi Y2H ei derivati ​​sono stati utilizzati per molti anni e hanno subito molti miglioramenti e adattamenti in relazione alle differenti caratteristiche esca, la localizzazione subcellulare dell'interazione, i partner di legame attesi, e altri fattori che possono essere richiesti per l'interazione (vedi Y3H 55, 56, 57). Recentemente, sono stati sviluppati schermi Y2H basate su array che consentono l'analisi automatizzata, ad alta produttività di numerose esche contro milioni di prede 58. Il futuro più probabile sta nella automazione e high throughput approcci per questo test per consentire la delucidazione delle vie di segnalazione complessi e interactomi in diversi campi di ricerca.

Disclosures

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Acknowledgments

Ringraziamo Christine Kerschbamer, Thomas Letschka, Sabine Oettl, Margot Raffeiner, e Florian Senoner dal Centro Ricerche Laimburg e Mirelle Borges Dias Schnetzer da Dualsystems Biotech AG per il supporto tecnico e Julia Strobl per la correzione del manoscritto. Questo lavoro è stato svolto come parte del progetto APPL2.0 ed è stato parzialmente finanziato dalla Provincia Autonoma di Bolzano / Bolzano, l'Italia e il Consorzio Mela Alto Adige.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cetyltrimethylammonium bromide (CTAB) Applichem A6284 for DNA preparation
Trishydroxymethylaminomethane (Tris) Applichem A2264 for media and buffer
Sodium chloride (NaCl) Applichem A2942 for media and buffer
Ethylenediaminetetraacetic acid Disodium salt (NaEDTA) Applichem A2937 for media and buffer
N-Lauroylsarcosin sodium salt Applichem A7402 for DNA preparation
ammonium acetate  Sigma-Aldrich (Fluka) 9688 for DNA preparation
2-mercaptoethanol Applichem A1108 for DNA preparation
Isopropanol (2-Propanol) Applichem A3928 for DNA preparation
Ethanol Sigma-Aldrich (Fluka) 51976 for DNA preparation
RNAse Applichem A2760 for DNA preparation
Chloroform:Isoamyl 24:1 Applichem A1935 for DNA preparation
Proofreading Polymerase (e.g. iProof) Bio-Rad 203433 for PCR
EcoRI Thermo Scientific ER0271 for cloning
SalI Thermo Scientific ER0641 for cloning
Column-based DNA Purification Kit (e.g. QIAquick) Qiagen 28104 for cloning
Kanamycin Sulfate Applichem A1493 for microbiological selection
3-Amino-1,2,4-Triazole (3-AT) Sigma-Aldrich A8056 for self-activation assay
L-Arginine Monohydrochloride  Applichem A3680 for yeast culture
L-Isoleucine  Applichem A3642 for yeast culture
L-lysine Monohydrate  Applichem A3448 for yeast culture
L-Methionine  Applichem A3897 for yeast culture
L-Phenylalanine  Applichem A3464 for yeast culture
L-Threonine  Applichem A3946 for yeast culture
L-Tyrosine  Applichem A3401 for yeast culture
L-Uracile Applichem A0667 for yeast culture
L-Valine  Applichem A3406 for yeast culture
L-Adenine Hemisulfate Salt  Applichem A1596 for yeast culture
0.22 µm Pore Filter Sartorius 16541 for sterile filtration
L-Histidine Monohydrochloride Applichem A3719 for yeast culture
L-Leucine  Applichem A3496 for yeast culture
L-Tryptophane  Applichem A3410 for yeast culture
Yeast Nitrogen Base  Sigma-Aldrich 51483 for yeast culture
D-Glucose Monohydrate  Applichem A1349 for yeast culture
Agar Fisher Scientific BP2641-1 for yeast and bacteria culture
Peptone Applichem A2208 for yeast culture
Polyethylene Glycol 4000 (PEG) Applichem A1249 for yeast transformation
Lithium Acetate Dihydrate (LiOAc) Applichem A3478 for yeast transformation
Salmon Sperm DNA  Applichem A2159 for yeast transformation
Antibody against Lex-A tag (e.g. Anti-LexA DNA binding region) Millipore 06-719 for Western blot
Plasmid Miniprep kit (e.g. GenElute Plasmid Miniprep Kit) Sigma-Aldrich PLN350 for plasmid purification from yeast and bacteria
Acid Washed Glass Beads Sigma-Aldrich G8772 for plasmid purification from yeast
Ampicillin Sodium Salt Applichem A0839 for microbiological selection
Yeast Extract Applichem A1552 for yeast culture
Vacuum concentrator centrifuge (e.g. Concentrator 5301) Eppendorf Z368245 (Sigma) for DNA preparation
Bait vector (e.g. pLexA-N) Dualsystems P01004 for Y2H
Prey vector (e.g. pGAD-HA) Dualsystems P01004 for Y2H
Control prey vector (e.g. pLexA-p53) Dualsystems P01004 for Y2H
Control bait vector (e.g. pACT-largeT) Dualsystems P01004 for Y2H
Electrocompetent E. coli (e.g. MegaX DH10B T1R Electrocomp Cells) Invitrogen C640003 for cloning
Yeast reporter strain (NMY51:MATahis3Δ200 trp1-901 leu2-3,112 ade2 LYS2::(lexAop)4-HIS3 ura3::(lexAop)8-lacZ ade2::(lexAop)8-ADE2 GAL4, e.g. NMY51) Dualsystems P01004 for Y2H
Plastic paraffin film (e.g. Parafilm M) Sigma-Aldrich P7793-1EA for yeast and bacteria culture
Gas permeable sealer (e.g. BREATHseal) Greiner 676 051 for yeast culture
PCR Cycler (e.g. T100 Thermal Cycler) Bio-Rad 1861096 for PCR
quantitative PCR Cycler (e.g. CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System) Bio-Rad 1855195 for quantitative PCR
Microcentrifuge (e.g. Centrifuge 5417 R) Eppendorf 5417 R general lab equipment
Centrifuge (e.g. Centrifuge 5804 R) Eppendorf 5804 R general lab equipment
Nuclease-free water (DNAse-free, RNAse-free, Protease-free) 5Prime 2500010 for PCR and DNA works
Scalpell Swann-Morton 0301 for DNA preparation
Sterile filter (0.22 µm; Polyethersulfone) VWR-International 514-0073 (European Catalogue number) for yeast and bacteria culture
Petri dishes Ø 90 mm  Greiner Bio-One 633180 for yeast and bacteria culture
Petri dishes Ø 150 mm  Greiner Bio-One 639161 for yeast culture
Photometer (e.g. BioPhotometer) Eppendorf 550507804 for yeast culture
Photometer Cuvettes Brand 759015 for yeast culture
Water Bath (e.g. Water Bath Memmert WB7) Memmert WB7 for yeast transformation
Western Blot Equipment Bio-Rad diverse for protein detection
dNTPs 5Prime 2201210 for cloning
Shaker (Erlenmeyer) Flasks (100 mL; 1,000 mL; 2,000 mL) and breathable cotton plugs (e.g. Duran Erlenmeyer narrow-neck flasks) Sigma Aldrich Z232793, Z232858, Z232866 for yeast and bacteria culture
Shaking Incubator (e.g. GFL 3031) GFL 3031 for yeast and bacteria culture
Incubator Binder KB 53 (E3.1) for yeast and bacteria culture
Ice Maker (e.g. Ice Maker IF 825) Omniwash IF 825 general lab equipment
0.2 mL, 1.5 mL and 2.0 mL Reaction Vials (Polypropylene) Eppendorf 0030.124.332 (0.2 ml); 0030.123.328 (1.5 ml); 0030.123.344 (2.0 ml) general lab equipment
Pipettes and disposable pipette Tips (different volumina: 10 - 1,000 µL) Eppendorf diverse general lab equipment
Spreader Sigma-Aldrich SPR-L-S01 for yeast and bacteria culture
Vortex shaker (e.g. MS 3 Minishaker) IKA 3617000 general lab equipment
T4-Ligase Thermo Fisher EL0011 for cloning
Fridge (4 °C) (e.g. Liebherr Medline FKEX 5000) Liebherr 81.767.580.4 general lab equipment
Freezer (-20 °C) (e.g. Liebherr Comfort Professional G5216) Liebherr G5216 general lab equipment
Graduated Cylinder (e.g. Brand) Sigma Aldrich Z327352; Z327417; Z327441   general lab equipment
Serological Pipettes (e.g. Fisherbrand) Thermo Fisher S55701 for yeast and bacteria culture
Mechanical Pipettor (e.g. Pipetboy acu 2) Integra-Biosciences 155000 general lab equipment
Cuvettes for Electroporation (1 mm) Molecular Bio Products 5510-11 for bacteria transformation
Electroporator (e.g. Eporator) Eppendorf 4309000019 for bacteria transformation
Gel and Blot imaging system (e.g. ChemiDoc MP System) Bio-Rad 1708280 general lab equipment
Conical centrifuge tubes (Polypropylene) (50 mL) VWR-International  525-0403 (European Catalogue number) general lab equipment
Conical centrifuge tubes (Polypropylene) (13 mL) BD Falcon 352096 general lab equipment
Dithiothreitol (DTT; 1 M) Thermo Scientific P2325 for ligation
adenosine triphosphate (ATP, e.g. ATP Solution (10 mM)) Ambion  AM8110G (distributed by Thermo Scientific) for ligation
Dropout mix without histidine, leucine, tryptophan, and adenine (DO, e.g. Yeast Synthetic Drop-out Medium Supplements) Sigma-Aldrich Y2021 Sigma  for yeast culture (ready-made mix)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Fields, S., Song, O. -K. A novel genetic system to detect protein-protein interactions. Nature. 340 (6230), 245-246 (1989).
  2. Dombrosky-Ferlan, P. -M., Corey, S. -J. Yeast two-hybrid in vivo association of the Src kinase Lyn with the proto-oncogene product Cbl but not with the p85 subunit of PI 3-kinase. Oncogene. 14, 2019-2024 (1997).
  3. Singh, R. Rice Mitogen-Activated Protein Kinase Interactome Analysis Using the Yeast Two-Hybrid System. Plant Physiol. 160, 477-487 (2012).
  4. Lee, H. -J., et al. Interaction of NADPH oxidase 1 with Toll-like receptor 2 induces migration of smooth muscle cells. Cardiovasc. Res. 99, 483-493 (2013).
  5. Del Bene, F., Tessmar-Raible, K., Wittbrodt, J. Direct interaction of geminin and Six3 in eye development. Nature. 427 (6976), 745-749 (2004).
  6. Kumar, A., Godwin, J. -W., Gates, P. -B., Garza-Garcia, A. -A., Brockes, J. -P. Molecular Basis for the Nerve Dependence of Limb Regeneration in an Adult Vertebrate. Science. 318 (5851), 772-777 (2007).
  7. Park, S. -Y., et al. Abscisic Acid Inhibits Type 2C Protein Phosphatases via the PYR/PYL Family of START Proteins. Science. 324 (5930), 1068-1071 (2009).
  8. Selyunin, A. S., et al. The assembly of a GTPase-kinase signalling complex by a bacterial catalytic scaffold. Nature. 469 (7328), 107-111 (2011).
  9. Uetz, P., et al. Herpesviral Protein Networks and Their Interaction with the Human Proteome. Science. 311 (5758), 239-242 (2006).
  10. Ushioda, R., Hoseki, J., Araki, K., Jansen, G., Thomas, D. Y., Nagata, K. ERdj5 Is Required as a Disulfide Reductase for Degradation of Misfolded Proteins in the ER. Science. 321 (5888), 569-572 (2008).
  11. Young, K. -H. Yeast two-hybrid: so many interactions, (in) so little time. Biol. Reprod. 58, 302-311 (1998).
  12. Krachler, A. M., Woolery, A. R., Orth, K. Manipulation of kinase signaling by bacterial pathogens. J. Cell Biol. 195 (7), 1083-1092 (2011).
  13. Hewezi, T., Baum, T. J. Manipulation of Plant Cells by Cyst and Root-Knot Nematode Effectors. Mol. Plant Microbe Interact. 26 (1), 9-16 (2012).
  14. McGhie, E. J., Brawn, L. C., Hume, P. J., Humphreys, D., Koronakis, V. Salmonella takes control: effector-driven manipulation of the host. Curr. Opin. Microbiol. 12 (1), 117-124 (2009).
  15. Kay, S., Bonas, U. How Xanthomonas type III effectors manipulate the host plant. Curr. Opin. Microbiol. 12 (1), 37-43 (2009).
  16. Navarro-Garcia, F., Serapio-Palacios, A., Ugalde-Silva, P., Tapia-Pastrana, G., Chavez-Dueñas, L. Actin Cytoskeleton Manipulation by Effector Proteins Secreted by Diarrheagenic Escherichia coli Pathotypes. Biomed. Res. Int. 2013, 22 (2013).
  17. Bhat, B. S., Shanaz, E. Effectors-Role in Host-Pathogen Interaction. J. Agr. Env. Sci. 3 (2), 265-285 (2014).
  18. Bhavsar, A. P., Guttman, J. A., Finlay, B. B. Manipulation of host-cell pathways by bacterial pathogens. Nature. 449 (7164), 827-834 (2007).
  19. Natale, P., Brüser, T., Driessen, A. -J. -M. Sec- and Tat-mediated protein secretion across the bacterial cytoplasmic membrane-Distinct translocases and mechanisms. Biochimica et Biophysica Acta-Biomembranes. 1778 (9), 1735-1756 (2008).
  20. Costa, T. R. D., et al. Secretion systems in Gram-negative bacteria: structural and mechanistic insights. Nat Rev Micro. 13 (6), 343-359 (2015).
  21. Tseng, T. -T., Tyler, B. M., Setubal, J. C. Protein secretion systems in bacterial-host associations, and their description in the Gene Ontology. BMC Microbiol. 9 (1), 1-9 (2009).
  22. MacLean, A. M., et al. Phytoplasma effector SAP54 hijacks plant reproduction by degrading MADS-box proteins and promotes insect colonization in a RAD23-dependent manner. PLoS Biol. 12 (4), e1001835 (2014).
  23. Sugio, A., Kingdom, H. N., MacLean, A. M., Grieve, V. M., Hogenhout, S. A. Phytoplasma protein effector SAP11 enhances insect vector reproduction by manipulating plant development and defense hormone biosynthesis. Proc Natl Acad Sci. 108 (48), 1254-1263 (2011).
  24. van Criekinge, W., Beyaert, R. Yeast Two-Hybrid: State of the Art. Biol Proced Online. 2 (1), 1-38 (1999).
  25. Bruckner, A., Polge, C., Lentze, N., Auerbach, D., Schlattner, U. Yeast two-hybrid, a powerful tool for systems biology. Int. J. Mol. Sci. 10 (6), 2763-2788 (2009).
  26. Serebriiskii, I., Estojak, J., Berman, M., Golemis, E. A. Approaches to Detecting False Positives in Yeast Two-Hybrid Systems. Biotech. 28 (2), 328-336 (2000).
  27. Golemis, E. A., Serebriiskii, I., Law, S. F. The yeast two-hybrid system: criteria for detecting physiologically significant protein-protein interactions. Curr. Issues Mol. Biol. 1 (1-2), 31-45 (1999).
  28. Janik, K., Mithöfer, A., Raffeiner, M., Stellmach, H., Hause, B., Schlink, K. An effector of apple proliferation phytoplasma targets TCP transcription factors - a generalized virulence strategy of phytoplasma. Mol. Plant Pathol. , (2016).
  29. Strauss, E. Microbiology. Phytoplasma research begins to bloom. Science. 325 (5939), 388-390 (2009).
  30. Kartte, S., Seemüller, E. Variable response within the genus Malus to the apple proliferation disease. J. Plant Dis. Protect. 95 (1), 25-34 (1988).
  31. Bovey, R. Observations and experiments on apple proliferation disease. Phytopath. Mediterr. 2 (3), 111-114 (1963).
  32. Schlink, K., Reski, R. Preparing High-Quality DNA From Moss (Physcomitrella patens). Plant. Mol. Biol. Rep. 20, 423 (2002).
  33. Applichem. N-Lauroylsarcosine sodium salt. , https://www.applichem.com/fileadmin/datenblaetter/A7402_en_GB.pdf (2015).
  34. Applichem. 2-Mercaptoethanol. , https://www.applichem.com/fileadmin/datenblaetter/A1108_en_GB.pdf (2015).
  35. Applichem. 2-Propanol. , https://www.applichem.com/fileadmin/datenblaetter/A3928_en_GB.pdf (2015).
  36. Applichem. Chloroform:Isoamyl alcohol (24:1). , https://www.applichem.com/fileadmin/datenblaetter/A3928_en_GB.pdf (2015).
  37. Mehle, N., Nikolić, P., Gruden, K., Ravnikar, M., Dermastia, M. Real-time PCR for specific detection of three phytoplasmas from the apple proliferation group. Methods Mol. Biol. 938, 269-281 (2013).
  38. Applichem. Kanamycin sulfate. , https://www.applichem.com/fileadmin/datenblaetter/A1493_en_GB.pdf (2015).
  39. Smith, L. M., et al. Fluorescence detection in automated DNA sequence analysis. Nature. 321 (6071), 674-679 (1986).
  40. Lentze, N., Auerbach, D. Membrane-Based Yeast Two-Hybrid System to Detect Protein Interactions. Current Protocols in Protein Science. , Wiley Interscience. 1917-1952 (2008).
  41. Dualsystems Biotech AG. DUALhubrid Kit - Manual P01004 B06. www.dualsystems.com. , 1-44 (2012).
  42. Kurien, B. -T., Scofield, R. -H. Protein Blotting and Detection. , Humana Press. (2009).
  43. Gietz, R. D., Schiestl, R. H. High-efficiency yeast transformation using the LiAc/SS carrier DNA/PEG method. Nat. Protocols. 2 (1), 31-34 (2007).
  44. Yeast Transformation and Cloning. , JoVE Science Education Database. Cambridge, MA (USA). (2016).
  45. Sigma-Aldrich. 3-Amino-1,2,4-triazole. , http://www.sigmaaldrich.com/MSDS/MSDS/DisplayMSDSPage.do?country=IT&language=EN-generic&productNumber=A8056&brand=SIGMA&PageToGoToURL=http%3A%2F%2Fwww.sigmaaldrich.com%2Fcatalog%2Fproduct%2Fsigma%2Fa8056%3Flang%3Dit (2016).
  46. Ames, B. -N. The Biosynthesis of Histidine: d-erythro-Imidazole-Glycerol Phosphate Dehydrase. J. Biol. Chem. 228, 131-143 (1957).
  47. Joung, J. -K., Ramm, E. -I., Pabo, C. -O. A bacterial two-hybrid selection system for studying protein-DNA and protein-protein interactions. Prot Natl Acad Sci. 97, 7382-7387 (2000).
  48. Brennan, M. -B., Struhl, K. Mechanisms of Increasing Expression of a Yeast Gene in Escherichia coli. J. Mol. Biol. 136, 333-338 (1980).
  49. Stynen, B., Tournu, H., Tavernier, J., van Dijck, P. Diversity in genetic in vivo methods for protein-protein interaction studies: from the yeast two-hybrid system to the mammalian split-luciferase system. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 76 (2), 331-382 (2012).
  50. Hengen, P. -H. Methods and reagents: False positives from the yeast two-hybrid system. Trends Biochem Sci. 22 (1), 33-34 (1997).
  51. Vidalain, P. -O., Boxem, M., Ge, H., Li, S., Vidal, M. Increasing specificity in high-throughput yeast two-hybrid experiments. Methods. 32 (4), 363-370 (2004).
  52. Pattanaik, S., Werkman, J. -R., Yuan, L. Bimolecular Fluorescence Complementation as a Tool to Study Interactions of Regulatory Proteins in Plant Protoplasts. Plant Transcription Factors: Methods and Protocols. Yuan, L., Perry, E. S. , Humana Press. Totowa, NJ. 185-193 (2011).
  53. Ito, H., Fukuda, Y., Murata, K., Kimura, A. Transformation of Intact Yeast Cells Treated with Alkali Cations. J. Bacteriol. 153 (1), (1983).
  54. Kawai, S., Hashimoto, W., Murata, K. Transformation of Saccharomyces cerevisiae and other fungi. Bioeng Bugs. 1 (6), 395-403 (2010).
  55. Bernstein, D. -S., Buetr, N., Stumpf, C., Wickens, M. Analyzing mRNA-protein complexes using a yeast three-hybrid system. Methods. 26, 123-141 (2002).
  56. Stumpf, C. -R., Opperman, L., Wickens, M. Analysis of RNA-Protein Interactions Using a Yeast Three-Hybrid System. Methods Enzymol. 449, 295-315 (2008).
  57. Cottier, S., et al. The yeast three-hybrid system as an experimental platform to identify proteins interacting with small signaling molecules in plant cells: potential and limitations. Front. Plant Sci. 2, 1-12 (2011).
  58. Häuser, R., Stellberger, T., Rajagopala, S. V., Uetz, P. Array-Based Yeast Two-Hybrid Screens: A Practical Guide. Two Hybrid Technologies: Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology. , 21-38 (2012).

Tags

L'infezione lievito doppio ibrido Y2H batteri fitoplasmi auto-attivazione effettrici interazioni proteina-proteina
Svelare la funzione di un batterica Effector da un non-coltivabili fitopatogeni Utilizzando un lievito schermo doppio ibrido
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Janik, K., Schlink, K. Unravelling… More

Janik, K., Schlink, K. Unravelling the Function of a Bacterial Effector from a Non-cultivable Plant Pathogen Using a Yeast Two-hybrid Screen. J. Vis. Exp. (119), e55150, doi:10.3791/55150 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter