Summary
proteínas efectoras bacterianas son importantes para establecer infecciones exitosas. Este protocolo describe la identificación experimental de parejas de unión proteica de una proteína efectora bacteriana en su huésped natural de la planta. La identificación de estas interacciones efectoras a través de levadura híbrido de dos pantallas se ha convertido en una herramienta importante en el descubrimiento de estrategias moleculares de patogenicidad.
Abstract
Desentrañar los mecanismos moleculares de las manifestaciones de la enfermedad es importante comprender las patologías y el desarrollo de síntomas en la ciencia de las plantas. Las bacterias han desarrollado diferentes estrategias para manipular su metabolismo del huésped para su propio beneficio. Esta manipulación bacteriana es a menudo junto con el desarrollo de síntomas graves o la muerte de las plantas afectadas. La determinación de las moléculas bacterianas específicas responsables de la manipulación de acogida se ha convertido en un campo importante en la investigación microbiológica. Después de la identificación de estas moléculas bacterianas, llamados "efectores", es importante aclarar su función. Un método directo para determinar la función de un efector es identificar su compañero de unión proteico en su huésped natural a través de una pantalla de dos híbridos de levadura (Y2H). Normalmente, el anfitrión alberga numerosas parejas de unión potenciales que no se pueden predecir de manera suficiente por cualquier algoritmo en silico. Por lo tanto, es la mejor opción para perform una pantalla con el efector hipotética contra toda una biblioteca de proteínas del huésped expresadas. Es especialmente difícil si el agente causal es cultivable como fitoplasmas. Este protocolo proporciona instrucciones paso a paso para la purificación de ADN a partir de una planta de fitoplasmas infectados de acogida leñosa, la amplificación del efector potencial, y la posterior identificación del compañero de interacción molecular de la planta con una pantalla Y2H. A pesar de que las pantallas Y2H son de uso general, hay una tendencia a externalizar esta técnica para las empresas de biotecnología que ofrecen el servicio a un costo Y2H. Este protocolo proporciona instrucciones sobre cómo realizar una Y2H en cualquier laboratorio de biología molecular decentemente equipado utilizando técnicas de laboratorio estándar.
Introduction
De levadura híbrido de dos pantallas (Y2H) fueron desarrollados hace unos 27 años 1 y desde entonces han sido ampliamente utilizados en diversos campos para determinar las interacciones específicas proteína-proteína 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 . La interacción física de un efector bacteriana con una proteína diana huésped es a menudo la condición previa para la manipulación funcional de esta proteína diana. El análisis de estas interacciones se ha trasladado al centro de muchos sectores diferentes de la infección biología 12, 13, 14, 15,"> 16, 17, 18. El principio de la pantalla Y2H es que la interacción de dos proteínas conduce a la reconstitución de un factor de transcripción funcional que impulsa la expresión de genes informadores. El efector conocido (el" cebo ") se fusiona traduccionalmente el dominio de unión a ADN (DBD) del factor de transcripción, y las parejas de interacción potenciales (la "presa") se fusionan con el dominio de activación (AD) de la respectiva factor de transcripción. Puesto que la interacción socio es desconocida, una biblioteca de potencial interactores se clona en el llamado "presa-biblioteca." Normalmente, se hace esta biblioteca mediante la clonación de ADNc en un plásmido de expresión presa vector apropiado que codifica la AD que es compatible con el cebo-vector codificado DBD. En el caso de una interacción, la factores de transcripción reconstituidas inducen la expresión de genes indicadores, que generalmente permiten la selección crecimiento de la levadura. laidentificación de interactores se logra mediante la secuenciación del plásmido presa con cebadores plásmido específico.
Las bacterias han desarrollado diversas estrategias para manipular y explotar el metabolismo de su anfitrión o para evadir los mecanismos de defensa y secretar moléculas efectoras a través de diferentes sistemas de secreción bacteriana 19, 20, 21. La determinación de las parejas de unión de estos efectores bacterianos es, pues, el primer paso en la identificación de la vía manipulado en el huésped. Esto conduce a una mejor comprensión de los mecanismos de patogenicidad específicos.
Pantallas Y2H se llevan a cabo para identificar las interacciones efectoras bacterianas durante phytoplasmoses, y, a menudo, Y2H es un experimento inicial crucial para la caracterización adicional de los mecanismos de patogenicidad moleculares en la investigación fitoplasmas 22, 23. Sin embargo, el MetDescripción artesa en la mayoría de las publicaciones es más bien escasa, y estas técnicas a menudo se subcontrata a empresas de biotecnología. Para llamar la atención sobre la viabilidad de este método, este protocolo proporciona información paso a paso para identificar socios de la interacción de una molécula efectora bacteriana en su huésped natural.
A pesar del amplio uso y el enfoque de avance rápido de las pantallas Y2H, no hay que olvidar que ciertas interacciones podrían no ocurrir en el sistema de levadura. Esto es debido al hecho de que la célula de levadura se utiliza como una especie de "recipiente de reacción in vivo" con ciertas limitaciones biológicas. Varios autores han abordado las ventajas y desventajas de Y2H y sus derivados 11, 24, 25, 26, 27. Consideraciones generales son, por ejemplo, que la célula de levadura puede no proporcionar la adecuadala expresión génica, el (post) de traslación, o por translocación condiciones para las respectivas proteínas en estudio. Esto puede dar lugar a resultados falsos negativos en la pantalla. Las interacciones positivas pueden a su vez ser artefactos y podrían no ocurrir en la situación natural (es decir, en el caso de los efectores en el huésped apropiado). Por tanto, es indispensable para confirmar las interacciones del sistema de expresión de levadura heterólogo con un ensayo de interacción independiente en un sistema biológico más estrechamente relacionados.
En este estudio, se identificaron las parejas de unión de la ATP_00189 efector de la planta patógeno no cultivables Candidatus Fitoplasmas mali (P. mali). Los resultados proporcionan importantes conocimientos sobre los mecanismos moleculares que subyacen al desarrollo de los síntomas de la proliferación de la manzana 28, una enfermedad que causa grandes pérdidas económicas en las regiones de cultivo de manzanas afectadas en Europa 29.
Protocol
1. Recogida de muestras raíces y las hojas de los árboles infectados de Apple
Nota: DNA específica de un patógeno se puede purificar a partir de raíces u hojas. La siguiente sección proporciona un protocolo para la toma de muestras de ambos.
- Para la preparación de ADN
- Recogida de muestras y preparación de las raíces
- Identificar los árboles infectados con síntomas específicos de la "proliferación" de manzana 30, 31 y los árboles de control que son libres de síntomas. Usando tijeras de podar limpias, cortar muestras de raíces que tienen un diámetro de 0,5 - 1 cm y una longitud de aproximadamente 5 cm. Las muestras cortadas de tres sitios diferentes, distantes del sistema radicular, y los pusieron en bolsas de plástico etiquetados de forma adecuada.
- Mantener las muestras en una caja fría con compresas térmicas refrigeradas y guardarlos en la nevera a 4 ° C hasta su posterior procesamiento.
Nota: arquitectura de las raíces y la estructura pueden variar con respecto al estado fisiológico of árbol. Es importante tomar muestras en tres sitios diferentes y no tomar demasiado delgadas raicillas. Las muestras se pueden almacenar durante varios días a 4 ° C, pero los tiempos de almacenamiento más largos aumentan el riesgo de moldeo. muestras de moho no se pueden utilizar para la preparación de ADN.
- Mantener las muestras en una caja fría con compresas térmicas refrigeradas y guardarlos en la nevera a 4 ° C hasta su posterior procesamiento.
- Enjuagar las muestras de raíces con agua para eliminar la tierra. Ponerlos en una placa de Petri estéril y utilizar un bisturí esterilizado para eliminar la epidermis de la raíz y la corteza.
- Limpiar el bisturí con un paño limpio y sin pelusa limpie, lo mojará en el 70% (v / v) de etanol y agua, y el calor-esterilizarlo sobre una llama abierta (por ejemplo, mechero Bunsen). Rayar el floema con el bisturí, cortar en trozos pequeños, y la alícuota de 30 - 100 mg del floema picada en un tubo de reacción de 2,0 ml estéril. Almacenar las muestras a -80 ° C durante varios meses.
- Identificar los árboles infectados con síntomas específicos de la "proliferación" de manzana 30, 31 y los árboles de control que son libres de síntomas. Usando tijeras de podar limpias, cortar muestras de raíces que tienen un diámetro de 0,5 - 1 cm y una longitud de aproximadamente 5 cm. Las muestras cortadas de tres sitios diferentes, distantes del sistema radicular, y los pusieron en bolsas de plástico etiquetados de forma adecuada.
- Recogida de muestras y preparación de las hojas
- Identificar un infectada y un árbol de control asintomática, unas describen en el paso 1.1.1.1, y recogen diez hojas por árbol ileso. Un árbol por condición es suficiente.
- Enjuagar las hojas con agua y limpiar las superficies por pulverización de 70% (v / v) de solución de etanol. Poner las hojas en una placa de Petri estéril y diseccionar la nervadura central (vena central) de cada hoja con un bisturí estéril. Retire la epidermis y la corteza de la nervadura central, cortar el nervio central en trozos pequeños, y la alícuota de 100 mg de tejido nervio central en un tubo de reacción estéril de 2.0 ml. Utilice las muestras inmediatamente para la preparación de ADN o almacenar a -80 ° C durante varios meses.
Nota: Es conveniente alícuota del material vegetal en porciones de 100 mg y, finalmente, a congelarlos para su almacenamiento. Cada alícuota se puede utilizar directamente para la preparación de ADN. Con un peso de material vegetal congelado es engorroso, ya que el material vegetal congelado tiende a formar trozos.
- Recogida de muestras y preparación de las raíces
2. bromuro de cetiltrimetilamonio (CTAB) a base de ADN Preparación
32.
- Preparar los tampones siguientes:
- Tampón CTAB: Disolver 1% w / v bromuro de cetiltrimetilamonio (CTAB, M r: 364,45 g / mol), mM trishidroximetilaminometano 100 (Tris, M r: 121,14 g / ml), cloruro de sodio 1,4 M (NaCl, M r: 58,44 g / mol), y 20 mM de sal disódica del ácido etilendiaminotetraacético (NaEDTA, M r: 372,24 g / mol) en agua y se ajusta a pH 8,0.
- Tampón de N-lauroilsarcosina: Disolver 10% w / v de sal de sodio de N-lauroilsarcosina 33 (M r: 293,38 g / mol), Tris 100 mM, y NaEDTA 20 mM en agua y ajustar el pH a 8,0.
- Tris-EDTA (TE) tampón: Disolver Tris 10 mM y NaEDTA 1 mM en agua y autoclAve. la solución.
- Solución de acetato de amonio: Preparar un acetato de 5 M de amonio (M r: 77,0825 g / mol) en agua y autoclave que a 120 ° C y 1,2 bar durante 20 min.
- Mezclar 30 - 100 mg de material vegetal picado fresco o congelado (etapa 1.1.2.2.) Con 300 l de tampón CTAB, 30 l de tampón de N-lauroilsarcosina, 6 l de proteinasa K (10 mg / l), y 12 l de 2-mercaptoetanol 34 (M r: 78,13 g / mol). Agitar durante 60 min a 60 ° C. Deje que la mezcla se enfríe a temperatura ambiente antes de continuar.
- Añadir 360 l de solución de acetato de amonio y mezclar enérgicamente. Deje que la solución repose durante 5 minutos, y luego centrifugar a 15.000 xg durante 10 minutos a temperatura ambiente. Transferir el sobrenadante a un vial limpio y añadir 720 l de isopropanol enfriado con hielo 35. Precipitar el ADN durante al menos 30 min a -20 ° C.
- Centrifugar la mezcla a 15.000 xg durante 30 min a 4° C y descartar el sobrenadante. Lavar el precipitado con 500 l de helado de etanol al 70% y girar hacia abajo a 15.000 xg durante 5 min a 4 ° C.
- Descartar el sobrenadante de etanol y sumergir inmediatamente el vial sobre una toalla de papel limpia para eliminar las gotas residuales. Asegúrese de eliminar la mayor cantidad de líquido posible. Deje secar al aire el sedimento durante 15-20 minutos o durante 2-3 min en una centrífuga concentrador de vacío. No sobre-secar el sedimento por calentamiento excesivo o tiempos de evaporación extendidas.
- Resuspender el precipitado en 700 l de tampón TE y finalmente se caliente hasta 37 ° C para facilitar la disolución. Añadir 10 l de RNAsa (10 mg / l) y se incuba durante 15 minutos a 37 ° C, con agitación a 300 rpm.
- Añadir 700 l de cloroformo: alcohol isoamílico 36 24: 1 y mezclar bien. Centrifugar la mezcla a 20.000 xg durante 10 min a 4 ° C y la transferencia de la fase superior del sobrenadante a un nuevo vial, limpio.
- Precipitar el ADN en el sobrenadante mediante la adición de700 l de 2-propanol 35 (isopropanol, M r: 60,1 g / mol) e incubando durante al menos 30 min a -20 ° C. Centrifugar la mezcla a 12.000 xg durante 30 min a 4 ° C y descartar el sobrenadante.
- Lavar el precipitado con 500 l de etanol al 70% y se centrifuga a 12.000 xg durante 5 min a 4 ° C. Secar el pellet como se describe en el paso 2.5. Se disuelven en 50 l de TE.
3. Detección de ADN Candidatus Fitoplasmas mali-específica por PCR
- Diluir el ADN purificado a partir del material vegetal 1:10 en agua libre de nucleasa y ejecutar una PCR con cebadores específicos de patógenos 37.
- Verificar la presencia de P. DNA-mali específico en el material vegetal mediante el uso de un protocolo de PCR cuantitativo con cebadores y sondas específicos para P. fitoplasmas mali 37. Comprobar la ausencia de los otros miembros de fitoplasmas 16SrX mediante la realización de la misma PCR con las sondas respectivas de CaDakota del Norte. P. prunorum y para Cand. P. pyri ADN 37.
NOTA: DNA de un árbol no infectada debe ser probados para confirmar la ausencia de un patógeno en este control. En este paso, es importante que el ADN de otras especies estrechamente relacionadas fitoplasmas está ausente en la muestra, ya que esto aumenta el riesgo de amplificar el efector de una especie fitoplasmas distintos de P. mali. Una infección mixta con otro P. mali fitoplasmas del grupo 16SrX estrechamente relacionados se descarta mediante el análisis de la muestra con las sondas respectivas. Dado que los resultados esperados deberían ser negativos para la otra fitoplasmas 16SrX, es importante incluir los controles positivos apropiados que indican la eficacia de la PCR.
- Verificar la presencia de P. DNA-mali específico en el material vegetal mediante el uso de un protocolo de PCR cuantitativo con cebadores y sondas específicos para P. fitoplasmas mali 37. Comprobar la ausencia de los otros miembros de fitoplasmas 16SrX mediante la realización de la misma PCR con las sondas respectivas de CaDakota del Norte. P. prunorum y para Cand. P. pyri ADN 37.
4. Amplificar el potencial de efectos Gene y subclonación en el vector Y2H cebo
- Amplificar el gen atp_00189 phytoplasmal (que no comprende la parte de péptido señal) de P. Mali usando los cebadores 5-TCTCCTCCTAAAAAAGATTCTA-3 (hacia adelante) y 5-TATTATTTATCTTTATTTTTTTCCTT-3 (inversa), con sitios de restricción para EcoRI y SalI en los extremos 5 'y 3', respectivamente. Se purifica el producto de PCR con un método de purificación de ADN basada en columna.
- Clonar el amplicón en el vector de cebo Y2H pLexA-N a través de EcoRI y SalI de ligación.
NOTA: Aquí, 100 ng de EcoRI y SalI linealizado pLexA-N vector se combinó con 15 ng de digerido de manera similar atp_00189 amplicón PCR y 1 U de T4-ligasa. La ligación se lleva a cabo en tampón que contiene 40 mM Tris-HCl (pH 7,9 a 25 ° C), mM MgCl 10 2, ditiotreitol 10 mM (DTT, M r: 154,25 g / mol), y 0,5 mM de trifosfato de adenosina (ATP, M r: 507,18 g / mol) en un volumen total de 10,0 l a 16 ° C durante la noche (14-20 h). Analizar el ADN del árbol no infectado con los mismos cebadores para descartar la unión a Malus domestica x cebador no específico </ Em> ADN. - Transformada de 1 l de la mezcla de ligación en células de E. coli electrocompetentes E. y seleccionar clones resistentes a la kanamicina en Luria-Bertani (LB) placas suplementadas con 50 g / ml de sulfato de kanamicina 38.
- Se purificó el ADN plásmido de los clones bacterianos seleccionados con un plásmido mini kit preparado a base de la columna, siguiendo las instrucciones del fabricante, y comprobar el éxito de la integración y la orientación del inserto mediante secuenciación 39.
5. Prueba de auto-activación (Auto-activación) de la proteína efectora Potencial
- Preparar los siguientes tampones y medios de cultivo:
NOTA: La nomenclatura de levadura selectivo placas hyphenates las abreviaturas de los aminoácidos que faltan en el medio respectivo con un "-" antes de la abreviatura. Por ejemplo, SD-trp-Leu-sus placas contienen todos los aminoácidos, pero trp, leu y la de él.- 10x mezcla de abandono: Pesar200 mg de monoclorhidrato de L-arginina (M r: 210,66 g / mol), 300 mg de L-isoleucina (M r: 131,17 g / mol), 269 mg de monohidrato de L-lisina (M r: 164,21 g / mol), 200 mg de L-metionina (M r: 149,21 g / mol), 500 mg de L-fenilalanina (M r: 165,19 g / mol), 2 g de L-treonina (M r: 119,12 g / mol), 300 mg de L-tirosina (Mr: 181,19 g / mol), 200 mg de L-uracilo (112,09 g / mol), y 1,5 g de L-valina (M r: 117,15 g / mol). Disolver en 1 L de agua doblemente destilada y esterilizar en autoclave la solución. Mantener la solución a 4 ° C.
NOTA: La mezcla de abandono respectiva puede ser mezclada previamente, también han comprado. - 10x L-adenina suplemento: Pesar 100 mg de sal de L-adenina hemisulfato (ADE, M r: 184,17 g / mol) y se disuelven en 50 ml de agua doblemente destilada. Filtro de esterilizar la solución con un filtro de poro 0,22-micras.
- 10x L-histidina suplemento: Pesar 100 mg de monohidrato de L-histidina monohidrocloruro (su, M r
- 10x-L leucina suplemento: Pesar 500 mg de L-leucina (leu, M r: 113,17 g / mol) en 50 ml de agua doblemente destilada y esterilizar por filtración con un filtro de poro 0,22-micras.
- 10x L-triptófano suplemento: Pesar 100 mg de L-triptófano (trp, M r: 204,23 g / mol) en 50 ml de agua doblemente destilada y esterilizar por filtración con un filtro de poro 0,22-micras.
- SD-trp-leu-his-ade-medio y las placas: Disolver 0,67% w / base de nitrógeno de levadura v (sin aminoácidos) y 2% w / v D-glucosa monohidrato (M r: 198,17 g / mol) en doble agua y autoclave destilada. Para placas de agar, añadir 2% w / v de agar (grado microbiológica) antes de la esterilización en autoclave.
- Para preparar placas selectivas, añadir 1x de la solución madre de aminoácidos con el medio Sd-trp-leu-his-ade autoclave. En la preparación de las placas, asegúrese de que el agar se enfría a ~ 50 ° C antes de añadirlos aminoácidos. Mantener las soluciones madre estéril.
- Medio YPAD: Disolver 1% w / extracto de levadura v, 2% w / v de peptona (grado microbiológica), 0,004% w / v de sal de adenina hemisulfato (M r: 184,17 g / mol), y 2% w / v monohidrato de glucosa para agua y autoclave de doble destilada. Para placas de agar YPAD, añadir 2% w / v de agar antes de la esterilización en autoclave. Para preparar 2x YPAD, utilice dos veces las concentraciones de los ingredientes mencionados anteriormente.
Nota: (Opcional) Debido a la alta concentración de glucosa en el medio, medio 2x YPAD vuelve oscuro-marrón después de la esterilización en autoclave. Como alternativa, un 40% (w / v) solución de glucosa se puede preparar y se esterilizó haciéndola pasar a través de un filtro de 0,22-micras. A continuación se añade la solución de glucosa Stock esterilizada por filtración al autoclave 2x YPAD (glucosa que carece) en condiciones estériles. Para evitar errores de volumen, la 2x YPAD debe estar preparado, teniendo en cuenta que se añade posteriormente una solución de glucosa 10 veces. Eso significa que, por ejemplo, en lugar de 1 L omedio F, se prepara solamente 900 ml (que contiene todos los ingredientes excepto la glucosa) y en autoclave, y después se añade 100 ml de solución de glucosa.
- 10x mezcla de abandono: Pesar200 mg de monoclorhidrato de L-arginina (M r: 210,66 g / mol), 300 mg de L-isoleucina (M r: 131,17 g / mol), 269 mg de monohidrato de L-lisina (M r: 164,21 g / mol), 200 mg de L-metionina (M r: 149,21 g / mol), 500 mg de L-fenilalanina (M r: 165,19 g / mol), 2 g de L-treonina (M r: 119,12 g / mol), 300 mg de L-tirosina (Mr: 181,19 g / mol), 200 mg de L-uracilo (112,09 g / mol), y 1,5 g de L-valina (M r: 117,15 g / mol). Disolver en 1 L de agua doblemente destilada y esterilizar en autoclave la solución. Mantener la solución a 4 ° C.
- transformación de levadura mediada por acetato de litio para las pruebas de auto-activación
- Pasar la cepa de Saccharomyces cerevisiae reportero NMY51 40 (NMY51: MATahis3Δ200 trp1-901 leu2-3,112 ade2 LYS2: :( LexAOp) 4-HIS3 ura3: :( LexAOp) 8-lacZ ade2: :( LexAOp) 8-ADE2 GAL4) a partir de una glicerol congelada acciones sobre una placa de agar YPAD e incubar durante 48 horas a 30 ° C. Recoger las colonias de esta placa e inocular 50 ml de medio YPAD. Deje que la levadura crezca y medir el diámetro exterior 600, para supervisar el crecimiento.
- Deje que la levadura crezca a una DO final 600 de 0,5-0,8. Sedimentar las células por centrifugación ellos en 700 xg durante 5 minutos y volver a suspender en 2,5 ml de agua bidestilada, sometido a autoclave.
- Preparar seis alícuotas con 100 l de suspensión de levadura y añadir 240 l de 50% W / v de polietilenglicol 4000 (PEG, M r: 3.500-4.000 g / mol), 36 l de 1 M de acetato de litio dihidrato (LiOAc, M r: 102,02 g / mol), y 25 l de 2% w / v ADN de esperma de salmón (disuelto). Preparar todos los reactivos con agua bidestilada, estéril.
- Etiquetar los seis viales que contienen la suspensión de levadura de "a" a "f" y añadir el siguiente ADN plásmido vector: controles negativos: (a) 1,5 g de plásmido cebo con el efector (pLexA-N-atp00189 28), (b) 1,5 g de plásmido vacío presa pGAD-HA 41, (c) 1,5 g de cebo vector vacío pLexA N-41, y (d) de 1,5 g de cebo vacío vector pLexA-N y 1,5 g de plásmido vacío presa pGAD-HA; controles positivos: (e) 1,5 mg de control positivo de ADN de plásmido cebo pLexA-p53 41 y 1,5 g de positivo-presa plásmido pACT-Larget 41; y la prueba de auto-activación: (f) 1,5 g de Base plásmido con el efector (pLexA-N-atp00189) y 1,5 g de plásmido vacío presa pGAD-HA.
- Mezclar las reacciones vigorosamente y se incuban durante 45 min a 42 ° C en un baño de agua. Sedimentar las células durante 5 min a 700 xg y descartar el sobrenadante. Resuspender las células en 250 l de 0,9% (w / v) de solución de cloruro de sodio (NaCl, M r: 48,44 g / mol) y se extendió 50 l en las siguientes placas selectivas: SD-trp, Sd-Leu, SD-trp- leu, trp-SD-leu-la suya, y SD-trp-leu-su-ade.
- Se incuban las placas durante 3 - 4 días a 30 ° C. Después del primer día de incubación, sellar las placas con película de parafina de plástico para evitar que las placas se sequen.
- Compruebe el crecimiento de la levadura en los platos.
6. Pruebe la expresión del efector
- Prueba de la expresión del efector mediante transferencia Western 42 con un anticuerpo contra la Lex-A etiqueta que está acoplado en el extremo N-terminal del efector cuandoexpresada a partir de pLexA-N.
Nota: Tenga en cuenta que el fusionado traduccionalmente Lex-Una etiqueta añade alrededor de 24 kDa que el peso real de la proteína de interés. Esto es importante cuando la identificación del tamaño de proteína en la transferencia de Western.
7. La pantalla Y2H
- Pasar la pLexA-atp00189 (efector), transformado NMY51 en una placa SD-trp fresco y se deja crecer durante 2 - 3 días a 30 ° C, hasta la aparición de colonias de color rojo.
- Inocular 3 ml de medio SD-trp en un pequeño matraz de agitación con una colonia de color rojo de la placa de agar y se incuba durante la noche a 30 ° C con agitación a 120-150 rpm.
- Inocular 20 ml de SD-trp en un matraz de agitación con 1 ml del cultivo durante la noche y se deja crecer durante 8 h.
- Ajustar la cultura a OD 600 = 0,2 mediante la adición de medio SD-trp e inocular 2x 100 ml en matraces de agitación con 10 ml del cultivo iniciador cada uno. Crecer durante la noche con agitación a 30 ° C.
Nota: Asegúrese de que la levadura no crece a OD 600> 0,5 y diluir con frescos SD-trp. - Medir el diámetro exterior 600 y el sedimento de 120 OD 600 "unidades". Por ejemplo, si un OD 600 de 1,2 se mide, de girar 100 ml, descartar el sobrenadante y resuspender el precipitado en 800 ml de pre-calentado 2x YPAD en un matraz agitador con una barra de agitación magnética.
- Centrifugar una alícuota de 2 ml, eliminar el sobrenadante y resuspender el precipitado en agua. Asegúrese de que el OD 600 de la suspensión de levadura es de entre 0,15 y 0,2. Si no es así, ajustar con 2x YPAD o agregar más levadura de la cultura durante la noche.
Nota: 2x YPAD es de color marrón oscuro y puede afectar a los resultados de la medición de OD. Por lo tanto, es necesario para volver a suspender las células de levadura en agua antes de la determinación de la OD. Como alternativa, 2x YPAD se puede preparar mediante la esterilización de la glucosa por separado, como se describe en la nota de paso 5.1.8, lo que impide la coloración oscura del medio.
- Centrifugar una alícuota de 2 ml, eliminar el sobrenadante y resuspender el precipitado en agua. Asegúrese de que el OD 600 de la suspensión de levadura es de entre 0,15 y 0,2. Si no es así, ajustar con 2x YPAD o agregar más levadura de la cultura durante la noche.
- Incubar el cultivo de levadura que queda en una aplicacióndimensionado ropriately matraz agitador (800 ml en un matraz agitador de 2 L o dividir 2 x 400 ml en dos matraces 1 L Shaker) y se incuba a 30 ° C, 120 a 150 rpm. Medir el diámetro exterior 600 alrededor de cada 1,5 horas hasta una DO que se alcanza de 0,6 a 600 (tarda 4 - 6 h). Mientras tanto, preparar las soluciones que se describen en el siguiente paso.
- transformación de litio acetato mediada
- Disolver 2% w / ADN de esperma de salmón v en agua y hervir 500 l durante 5 min en un baño de agua a 100 ° C. Se coloca el tubo en hielo durante 2 min y repetir la etapa de calentamiento. Mantenga el ADN en hielo hasta su uso posterior.
- Preparar las siguientes mezclas:
- TE / LiOAc mezcla: Mezclar de 3,08 ml de 1 M LiOAc, 3,08 ml de Tris 100 mM / EDTA 10 mM (pH: 7,5), y 21,84 ml de agua bidestilada estéril.
- PEG / LiOAc mezcla: Combinar 4,2 ml de 1 M LiOAc, 4,2 ml de Tris mM / EDTA 10 mM (pH: 7,5), y 33,6 ml de 50% (w / v) PEG 4000.
- Centrifugar el cultivo de levadura de 800 ml (OD600 = 0,6)a 700 xg durante 5 min para sedimentar las células. Eliminar el sobrenadante y resuspender el precipitado en 200 ml de agua doblemente destilada estéril. Sedimentar las células de nuevo a 700 xg durante 5 min y descartar el sobrenadante. Nota: Si brecha caso, la suspensión en varios viales para centrifugación. Los volúmenes de líquido en 7.7.3. y 7.7.4. referirse a todo el pellet derivado de 800 ml de suspensión.
- Resuspender el precipitado en 16 ml de mezcla TE / LiOAc (véase el paso 7.7.1.1); girar hacia abajo a 700 xg durante 5 min y descartar el sobrenadante. Resuspender el precipitado en 9,6 ml de mezcla TE / LiOAc.
- Preparar la siguiente mezcla de reacción en los vasos de polipropileno de reacción de tamaño apropiado: 12 viales con 7 g de pGAD-HA-ADNc del vector de la biblioteca, 100 l de ADN de esperma de salmón 2% (véase el paso 7.7), y 2,5 ml de mezcla de PEG / LiOAc. Añadir 600 l de suspensión de células de levadura de la etapa 7.10 a cada uno de los 12 viales y se mezcla vigorosamente durante 1 min.
- Incubar la mezcla de reacción durante 45 minutos a 30 ° C en un un baño de aguad mezclar enérgicamente cada 15 minutos. Añadir 160 l de DMSO a cada vial y mezclar vigorosamente. Incubar la mezcla durante otros 20 min a 42 ° C.
- Sedimentar las células a 700 xg durante 5 min, descartar el sobrenadante, y resuspender cada sedimento en 3 ml de 2x YPAD. Piscina todas las células (con un total de 36 ml a partir de los 12 viales) en un matraz de agitador de 100 ml e incubar la levadura durante 90 minutos a 30 ° C y 120 rpm.
- Sedimentar las células durante 5 min a 700 xg y descartar el sobrenadante. Resuspender el precipitado en 4,5 ml de estéril 0,9% (w / v) de NaCl y mezclar bien pipeteando arriba y abajo con cuidado con una pipeta serológica de 10 mL. Retirar 50 l y se preparan diluciones de diez veces en NaCl al 0,9% de 1:10 hasta 1: 1.000. Plate 100 l de cada dilución en placas de Petri de 90 mm que contienen agar SD-trp-leu.
- Difundir el resto de la resuspensión de levadura diluida en 16 x 150 mm placas de Petri con agar diámetro SD-trp-leu-su-ade. Añadir 3-AT al medio para reducir la auto-activación. Incubar la SD-trp-leuplacas para tres días y las placas de la SD-trp-leu-sus-ADE para cuatro días a 30 ° C.
NOTA: Los clones que aparecen en las placas selectivas (potenciales) son pares de interacción y llevan el plásmido que codifica pGAD-HA para el cebo interactuar pareja. - Determinar la eficacia de la transfección contando las colonias de las diferentes diluciones en serie de las placas de selección SD-trp-Leu. Transferir cada clon escogiendo y rayando la colonia con una punta de pipeta estéril en placas frescas SD-trp-leu-su-ade-selectiva. Incubar las placas durante 24 horas a 30 ° C. Repita este paso todos los días hasta que se alcanza un total de cinco pasajes.
8. Análisis de los clones de las placas selectivas
- Preparar un tubo estéril de reacción de 2 ml con 1 ml de SD-trp-leu-his-ade para cada clon bajo una campana estéril. Haz un agujero en cada tubo con una aguja caliente y cubrir el agujero con un trozo de sellador permeable a los gases. Inocular cada vial con el compañero colonia fresca rial de un clon (paso 7.17, el uso de clones después de la 5 º paso) y se incuba durante 24 horas a 30 ° C, con agitación a 150 rpm.
NOTA: Es importante tomar clones a partir de una placa fresca, porque la levadura tomada de placas almacenados durante varios días a 4 ° C no crecen lo suficiente dentro de las 24 h en medio líquido. - Sedimentar las levaduras durante 5 minutos a 4000 xg y descartar el sobrenadante. Resuspender el precipitado en el tampón de resuspensión adecuado (del kit miniprep de ADN de plásmido respectivo) y la transfiere a un nuevo tubo de reacción 2,0 ml. Añadir 100 ml de perlas de vidrio lavadas con ácido (425- a 600-m de diámetro) y se mezcla vigorosamente durante 5 min.
- Añadir el tampón de lisis respectivo y proceder con la purificación de plásmido usando un mini kit de preparación de plásmidos siguiendo las instrucciones del fabricante. Eluir el ADN plásmido con 50 l de agua.
- Utilice el ADN desde el paso 8.3 para una reacción de secuenciación con el cebador-plásmido específica presa, GAL4ADseqref "> 41 5 'ACCACTACAATGGATGATG -3'.
- Verificar la interacción de novo co-transformación de 43, 44 el cebo y el vector presa. Seleccione la levadura transformada en placas de selección SD-trp-Leu-la-ade.
Representative Results
Antes de la pantalla Y2H real se puede realizar el cebo debe ser probado para la auto-activación. Esto se consigue mediante la transformación del vector de expresión de cebo junto con el vector vacío biblioteca presa y el control de crecimiento en placas selectivas.
Para analizar si la proteína ATP_00189 phytoplasmal es auto-activación, se realizó la prueba de auto-activación como se describe en la sección 5. El plásmido cebo está complementando el PRT y la presa plásmido, el leu auxotrofıa de S. cerevisiae NMY51 40. El éxito de co-transformación se caracteriza, pues, por crecimiento en placas selectivas que carecen de trp y leu. La interacción del cebo y presa de proteínas conduce a una complementación de la suya y ade auxotrofıa de NMY51. Si aparece la auto-activación por el cebo en la ausencia de una interacción, la levadura crece en placas selectivas que carecen de él y ade. auto fuerte y débilpuede producirse la activación. Fuerte auto-activación del cebo se caracteriza por el crecimiento de la levadura co-transformada en placas de selección empobrecido trp-leu-his-ADE. autoactivación débil conduce a un crecimiento en trp-leu-la suya, pero no en placas de selección empobrecido trp-leu-su-ade. controles adecuados positivos son indispensables para interpretar los resultados del ensayo de auto-activación. Un resumen de los resultados esperados del ensayo de auto-activación y su interpretación se proporcionan en la Tabla 1 y se visualizan en la Figura 1.
Figura 1: Ejemplo de cebo de pruebas de auto-activación de un cebo antes de realizar una pantalla Y2H. S. cerevisiae NMY51 se co-transformó con la interacción del cebo (pLEX-p53) y la presa (PACT-Larget) como control positivo (panel izquierdo: ac), una auto-activación más una presa vacía débilmente libravector ry (panel central: df) y un cebo no se auto-activación más un vector de la biblioteca presa vacía (panel de la derecha: gi). La levadura co-transformadas se cultivaron en placas SD que carecen de trp y leu (panel superior: a, d, g), trp, leu y su (panel central: b, e, h) y trp, leu, la suya y ADE (menor Panel: c, f, i). Selección en un medio que carece de trp y leu es un control positivo para el éxito de co-transformación, como el vector de cebo complementa la auxotrofia trp y el vector presa la auxotrofia leu de NMY51 (crecimiento en SD-trp-leu). En caso de una interacción entre el cebo y presa o una auto-activación de la carnada, la expresión del indicador de NMY51 se enciende y se complementa la suya y auxotrofıa ade (crecimiento en SD-trp-leu-su-ADE). Un auto-activación débil se caracteriza por un crecimiento en el SD-trp-leu sus placas (panel central, df). Débil auto-activación de un cebo debe ser disminuida antes de analizar el ceboEn una pantalla de Y2H, por ejemplo, mediante la adición de 3-AT a los medios de comunicación selectiva. agotamientos de aminoácidos se indican con "-" en el nombre del medio respectivo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| pLexA-N-atp00189 | ninguna | colonias | sin crecimiento | sin crecimiento | sin crecimiento | sin crecimiento |
| ninguna | pGAD-HA | sin crecimiento | colonias | sin crecimiento | sin crecimiento | sin crecimiento |
| pLexA-N | ninguna | colonias | sin crecimiento | sin crecimiento | sin crecimiento | sin crecimiento |
| pLexA-N | pGAD-HA | colonias | colonias | sin crecimiento | sin crecimiento | |
| pLexA-p53 | pacto Larget | colonias | colonias | colonias | colonias | colonias |
| pLexA-N-atp00189 | pGAD-HA | colonias | colonias | colonias | sin crecimiento | sin crecimiento |
Tabla 1: Resultados esperados en un ensayo de auto-activación de cebo. La transformación de S. cerevisiae NMY51 rendimientos en crecimiento diferencial en medios selectivos basados en las características de co-transformada cebo y presa. Se evaluó el crecimiento en placas selectivas en la transformación de diferentes combinaciones de vectores (AF) después de 72 h de incubación a 30 ° C. autoactivación débil se caracteriza por el crecimiento de la levadura en el SD-trp-leu-la suya y fuerte auto-activación por crecimiento en SD-trp-leu-su-ade plat selecciónES en la ausencia de una pareja de interacción. El pLexA-N phytoplasmal codificada efector ATP_00189 no presenta la auto-activación, que se caracteriza por la incapacidad del vector cebo transformó NMY51 para crecer en la ausencia de su y ade.
Dependiendo del cebo, una pantalla de Y2H puede ganar numerosos clones de levadura que crecen en placas selectivas. Todos los clones deben ser analizados y revisados por posibles redundancias. Incluso si una biblioteca de ADNc normalizado se ha utilizado, es muy probable que un interactor se representa en muchos clones diferentes. Dependiendo de la técnica de clonación de la biblioteca, también es posible que sólo los fragmentos del gen completo se insertan en algunos vectores de presa. Por tanto, es aconsejable de novo amplificar (a partir de cDNA) y subclonar el gen de longitud completa de la interactor y para probar la interacción en un análisis de Y2H uno-a-uno (Figura 2).
Figura 2: Ejemplo de una interacción entre el cebo y presa en un experimento Y2H. Una pantalla de dos híbridos de levadura (Y2H) se realizó y se purificaron los plásmidos de los clones positivos interactor. El vector de la presa se secuenció y se identificaron los socios de la interacción huésped Malus x domestica MdTCP24 y MdTCP25. Como MdTCP34 control negativo (para los que no se identificó ningún elemento interactuante en la pantalla de la biblioteca Y2H) se subclonó en paralelo. Los genes de longitud completa se amplificaron a partir de ADNc de manzana, se subclonó en el vector presa (que expresan co-cistronically el dominio AD de activación) y de novo co-transformada con el vector de cebo que expresa la ATP_00189 efector bacteriana acoplado al dominio de unión a ADN (BD). Esta cifra se toma de 28. Haga clic aquí para ver una más grandeversión de esta figura.
Discussion
En la pantalla Y2H, la proteína efectora potencial es co-expresada con diferentes proteínas que interactúan hipotéticos (paso 7). Cada clon de crecimiento de la levadura contiene el cebo, pero un (potencialmente) interactor diferente. Las proteínas que interactúan se codifican en una biblioteca de ADNc que se clonó en plásmidos de presa. El cebo y la presa plásmidos cada código de co-cistronically para una parte de un factor de transcripción de levadura. En el caso de una interacción física entre el cebo (efector) y un interactor codificada por plásmidos presa, las dos partes de factores de transcripción (el dominio de unión a ADN y el dominio de activación) se unen, y se induce la expresión del gen indicador. La levadura es capaz de crecer en placas de selección SD de histidina y adenina-agotado. El tipo de biblioteca de ADNc de presa depende del efector seleccionados y se debe elegir en consecuencia. El vector de presa y cebo, así como la cepa de levadura, deben ser compatibles. En esta pantalla, un ADN LexA y el dominio de activación Gal4 domain se utilizaron como las unidades de factor de transcripción de levadura compatibles. La biblioteca de ADNc puede construirse de forma individual, por encargo, o comercialmente obtenido. La preparación de la biblioteca de ADNc de presa no es parte de este protocolo. En este protocolo, un, biblioteca de ADNc normalizado construido por la propia a partir del ARN de Malus domestica x hojas se utilizó y se clonó en pGAD-HA 41. El efector (cebo) que expresan la cepa de levadura se transformó con la biblioteca de presa, y los clones fueron seleccionados sobre placas de selección SD de histidina y adenina-agotado. Para extraer el ADN plásmido de las colonias de levadura, un plásmido de ADN mini kit basado en columnas para las bacterias se recomienda en combinación con una etapa de rotura mecánica utilizando perlas de vidrio para mejorar la lisis de la levadura (paso 8). En este plásmido la purificación, el cebo y el vector presa se purificaron simultáneamente en concentraciones relativamente bajas. Sin embargo, la cantidad de ADN plásmido es suficiente para identificar la pareja de interacción a través de ingenio secuenciaciónHout propagación plásmido previo (paso 8.4). Como alternativa, el ADN purificado en el paso 8.4 se puede transformar en E. coli competente y se selecciona con resistencia a los antibióticos mediada por vectores presa (por ejemplo, ampicilina el en caso de pGAD-HA). La E. coli seleccionado colonias llevan sólo el plásmido biblioteca pGAD-HA, y el plásmido de purificación de alto rendimiento se puede realizar con estos clones.
La transformación exitosa de pLexA-N y pGAD-HA construcciones complementa el triptófano y leucina auxotrofıa de NMY51. Una interacción entre el efector y una proteína (codificada en pGAD-HA) conduce a la activación del sistema reportero en NMY51 cepas. En el caso de la auto-activación, NMY51 transformó con el efector expresar pLexA-N en combinación con el vector de biblioteca vacía pGAD-HA crece en placas selectivas que carecen de trp-leu-his-ade, debido a la activación no deseada del sistema informador NMY51 40. La auto-activación puede ser wEAK y puede ocurrir en ausencia de trp-leu-his, o la activación puede ser fuerte y se caracteriza por crecimiento en placas de trp-leu-his-ade 41. Auto-activación puede causar un fondo masiva de clones falsos positivos en la pantalla de Y2H real. Para evitar esto, una prueba de auto-activación con el cebo debe llevarse a cabo, en el que el vector efector-expresión es co-transformada con el vector de la biblioteca vacía. En este contexto experimental, no debe inducirse la expresión del gen reportero. Si la auto-activación (es decir, el crecimiento en placas selectivas) es visible en la prueba, el medio se puede complementar con diferentes concentraciones de 3-amino-1,2,4-triazol 45 (3-AT). 3-AT es un inhibidor de la deshidratasa imidazoleglycerol-fosfato (HIS3), una enzima importante durante la biosíntesis de histidina 46. La suplementación con 3-AT puede reducir los efectos débiles de auto-activación durante las pantallas de Y2H 47,48. Diferentes concentraciones de 3-AT deben ser probados. En este protocolo, 1 - Se utilizaron 40 mM de 3-AT. La concentración más baja que conduce a la represión de la auto-activación, posteriormente, se debe utilizar en la pantalla Y2H. Las placas selectivas de ensayo auto-activación sólo puede ser evaluada Si las placas SD-trp-leu de la co-transformación contienen un número suficiente de clones. Como una indicación ≥ 500 colonias por 90 mm (diámetro) placa de Petri son suficientes. Para determinar la eficiencia de transfección exacta, se recomienda para preparar diluciones en serie de la levadura co-transformada y extendió sobre placas SD-trp-Leu.
Para reducir la auto-activación, el efector puede ser clonado en pLexA-C, un vector de expresión de cebo que fusiona la etiqueta LexA a la C-terminal de la proteína. La orientación de la Lex-Una etiqueta puede atenuar la autoactivación 24. Sin embargo, no es posible en todos los casos para reducir o suprimir la auto-activación. La formacion decolonias de color rojo o rojizo indica una interacción débil o falsos positivos. El gen informador ade2 de NMY51 sólo se activa cuando se trata de una interacción proteína-proteína, que en vez bloquea la acumulación de un colorante rojo en esta cepa de levadura 40. En ausencia de una interacción, NMY51 son rojizo, mientras que las colonias que llevan interactores fuertes son de color blanco. La observación del color de las colonias en las placas de selección por lo tanto proporciona un indicio importante además para juzgar si las colonias respectivas son interactores TrueType o falsos positivos.
Es el tiempo necesario para adaptar o cambiar ciertos ajustes de ensayo con respecto a la naturaleza de la carnada y las características de interacción. Por ahora, una serie de mejoras y técnicas derivadas de la Y2H común se han establecido para permitir el análisis de las interacciones proteína bastante difíciles en diferentes sistemas host. Una revisión por Stynen et al. 49 direcciones de unand se describen diferentes aspectos de Y2H, sus mejoras y adaptaciones, y por lo tanto proporciona información útil acerca de cómo elegir el ensayo de interacción apropiada.
Y2H pantallas y técnicas de derivados se han utilizado ampliamente en diferentes campos de investigación, siempre que se requiera la identificación de las interacciones proteína binario. Incluso si se realizan controles críticos, tales como las pruebas de auto-activación de la carnada y uno-a-uno vuelve a las transformaciones de las proteínas que interactúan identificadas, el Y2H es dar lugar a falsos resultados 26, 50, 51. La levadura como modelo no es adecuado para todos los estudios de interacción. La levadura no constituye necesariamente un entorno celular que soporta la modificación posterior a la traducción apropiada y plegado para cada proteína de 24. Por otra parte, en el entorno Y2H, las proteínas se sobre-expresan, y su expresión no es de controlencabezados por su promotor natural. El Y2H obliga a los compañeros de interacción proteínicos al núcleo, que no es necesariamente el destino subcelular natural. Las circunstancias celulares nativas de la interacción por lo tanto no pueden ser reflejados por la levadura y pueden dar lugar a resultados falsos negativos o falsos positivos. La mayoría Y2H se basa en la complementación de levadura auxotrofia como un principio selectivo. Esta selección nutricional se caracteriza por una alta sensibilidad, pero a costa de la selectividad disminuido en comparación con otro (por ejemplo, el reportero cromogénico) ensayos 49. Si la auto-activación irreducible (ver arriba) u otras limitaciones se producen durante un cierto efector, la Y2H no es un ensayo apropiado 25. En la Tabla 1 y la Figura 1, se dan los resultados esperados de la prueba de auto-activación. La ausencia de interacciones reales (es decir, falsos negativos) puede ser causada por la toxicidad de la proteína, la proteína de la traducción incorrectaprocesamiento, el impedimento estérico de la interacción, los compañeros de interacción con baja representación en la biblioteca de la presa, la localización de membrana de la carnada, o que falten componentes necesarios para la interacción 24.
Se recomienda de novo amplificar el gen de longitud completa de la proteína de interacción identificado a partir de ADNc, subclonar en pGAD-HA, y llevar a cabo un ensayo de interacción de uno a uno por la transformación de la generada pGAD-HA constructo en el cebo que expresan NMY51 cepa. Esto es necesario ya que el interactor observado presentes en la biblioteca presa solamente podría ser un fragmento de una proteína más grande. Sin embargo, la información para el gen de longitud completa correspondiente sólo se puede acceder si considerables datos de la secuencia genómica y transcriptómica está disponible. El protocolo de transformación para el ensayo de auto-activación descrito aquí se puede aplicar para un ensayo de este tipo uno-a-uno, y la interacción entre el cebo y el interactor debe ser reproducible.
Malus x domestica se verificó in planta con la complementación bimolecular de fluorescencia (BiFC) en Nicotiana benthamiana protoplastos 28 (no es parte de este protocolo). El ATP_00189 proteína efectora se deriva de la planta patógeno P. mali. En planta BiFC fue elegido tanto para verificar las interacciones con los ATP_00189 Malus x domestica factores de transcripción previamente identificados en el Y2H 28. BiFC es un ensayo de interacción proteína-proteína que no requiere la translocación subcelular de las proteínas que interactúan al núcleo con el fin de activar el sistema reportero <sup class = "xref"> 52. Por otra parte, los de expresión in planta y maquinaria de modificación imita el entorno de la interacción natural entre el efector bacteriana planta en su planta huésped. Sin embargo, una pantalla global utilizando BiFC no es factible.
Hay varios pasos en el protocolo que debe ser tratado con cuidado. Cuando la amplificación del gen de interés (paso 4), es importante para descartar que los cebadores se unen a ADN de la planta. Por lo tanto, el ADN de las plantas no infectadas debe ser incluido como un control negativo. La secuencia del gen de interés no debe contener los sitios de restricción EcoRI y SalI que se utilizan para la clonación direccional de la inserción. Si la secuencia contiene estos sitios, diferentes enzimas de restricción para la clonación deben ser elegidos. transformación de levadura es un método central durante este protocolo. Transfección eficiencia depende de la competencia de las células de levadura, su viabilidad, el estado de crecimiento, y la calidad de la transfección reagent 53, 54. Para el protocolo propuesto, se recomienda utilizar la levadura a partir de placas frescas de no más de dos semanas (se mantiene a 4 ° C) cuando se realizan las transformaciones. A menudo, el crecimiento de la levadura transformada se retrasa cuando se inoculan cultivos líquidos selectivos con las colonias de las viejas placas de agar. También es útil el uso de un cultivo iniciador líquido como inóculo para los experimentos reales y no utilizar la levadura directamente de la placa. La baja eficiencia cuando la transfección de la presa en la levadura que expresan cebo puede conducir a la representación insuficiente de ciertas proteínas presa (posibles interactianos) y por lo tanto puede sesgar toda la pantalla. En este protocolo, una eficiencia de transfección de levadura de ~ 150.000 ufc / g de ADN transfectado en el Y2H funcionó bien.
El conocimiento de los defectos e inconvenientes de la técnica Y2H e interpretar los resultados de una manera crítica y adecuada es indispensable para la elaboración de la correct conclusiones. ensayos de Y2H y los derivados se han utilizado durante muchos años y han sido objeto de muchas mejoras y adaptaciones con respecto a las diferentes características de cebo, la localización subcelular de la interacción, las parejas de unión que se espera, y otros factores que podrían ser necesarias para la interacción (ver Y3H 55, 56, 57). Recientemente, pantallas Y2H basadas en matrices se han desarrollado que permite el análisis automatizado, de alto rendimiento de numerosos cebos contra millones de presas 58. El futuro más probable es la automatización y de alto rendimiento enfoques para este ensayo para permitir el esclarecimiento de las vías de señalización complejos y interactomes en diferentes campos de investigación.
Disclosures
Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.
Acknowledgments
Damos las gracias a Christine Kerschbamer, Thomas Letschka, Sabine Oettl, Margot Raffeiner, y Florian Senoner del Centro de Investigación y Laimburg Mirelle Borges Dias Schnetzer de Dualsystems Biotech AG para el apoyo técnico y Julia Strobl para la corrección del manuscrito. Este trabajo se realizó como parte del proyecto APPL2.0 y fue financiado en parte por la Provincia Autónoma de Bolzano / Bolzano, Italia y el Consorcio de Apple del Tirol del Sur.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cetyltrimethylammonium bromide (CTAB) | Applichem | A6284 | for DNA preparation |
| Trishydroxymethylaminomethane (Tris) | Applichem | A2264 | for media and buffer |
| Sodium chloride (NaCl) | Applichem | A2942 | for media and buffer |
| Ethylenediaminetetraacetic acid Disodium salt (NaEDTA) | Applichem | A2937 | for media and buffer |
| N-Lauroylsarcosin sodium salt | Applichem | A7402 | for DNA preparation |
| ammonium acetate | Sigma-Aldrich (Fluka) | 9688 | for DNA preparation |
| 2-mercaptoethanol | Applichem | A1108 | for DNA preparation |
| Isopropanol (2-Propanol) | Applichem | A3928 | for DNA preparation |
| Ethanol | Sigma-Aldrich (Fluka) | 51976 | for DNA preparation |
| RNAse | Applichem | A2760 | for DNA preparation |
| Chloroform:Isoamyl 24:1 | Applichem | A1935 | for DNA preparation |
| Proofreading Polymerase (e.g. iProof) | Bio-Rad | 203433 | for PCR |
| EcoRI | Thermo Scientific | ER0271 | for cloning |
| SalI | Thermo Scientific | ER0641 | for cloning |
| Column-based DNA Purification Kit (e.g. QIAquick) | Qiagen | 28104 | for cloning |
| Kanamycin Sulfate | Applichem | A1493 | for microbiological selection |
| 3-Amino-1,2,4-Triazole (3-AT) | Sigma-Aldrich | A8056 | for self-activation assay |
| L-Arginine Monohydrochloride | Applichem | A3680 | for yeast culture |
| L-Isoleucine | Applichem | A3642 | for yeast culture |
| L-lysine Monohydrate | Applichem | A3448 | for yeast culture |
| L-Methionine | Applichem | A3897 | for yeast culture |
| L-Phenylalanine | Applichem | A3464 | for yeast culture |
| L-Threonine | Applichem | A3946 | for yeast culture |
| L-Tyrosine | Applichem | A3401 | for yeast culture |
| L-Uracile | Applichem | A0667 | for yeast culture |
| L-Valine | Applichem | A3406 | for yeast culture |
| L-Adenine Hemisulfate Salt | Applichem | A1596 | for yeast culture |
| 0.22 µm Pore Filter | Sartorius | 16541 | for sterile filtration |
| L-Histidine Monohydrochloride | Applichem | A3719 | for yeast culture |
| L-Leucine | Applichem | A3496 | for yeast culture |
| L-Tryptophane | Applichem | A3410 | for yeast culture |
| Yeast Nitrogen Base | Sigma-Aldrich | 51483 | for yeast culture |
| D-Glucose Monohydrate | Applichem | A1349 | for yeast culture |
| Agar | Fisher Scientific | BP2641-1 | for yeast and bacteria culture |
| Peptone | Applichem | A2208 | for yeast culture |
| Polyethylene Glycol 4000 (PEG) | Applichem | A1249 | for yeast transformation |
| Lithium Acetate Dihydrate (LiOAc) | Applichem | A3478 | for yeast transformation |
| Salmon Sperm DNA | Applichem | A2159 | for yeast transformation |
| Antibody against Lex-A tag (e.g. Anti-LexA DNA binding region) | Millipore | 06-719 | for Western blot |
| Plasmid Miniprep kit (e.g. GenElute Plasmid Miniprep Kit) | Sigma-Aldrich | PLN350 | for plasmid purification from yeast and bacteria |
| Acid Washed Glass Beads | Sigma-Aldrich | G8772 | for plasmid purification from yeast |
| Ampicillin Sodium Salt | Applichem | A0839 | for microbiological selection |
| Yeast Extract | Applichem | A1552 | for yeast culture |
| Vacuum concentrator centrifuge (e.g. Concentrator 5301) | Eppendorf | Z368245 (Sigma) | for DNA preparation |
| Bait vector (e.g. pLexA-N) | Dualsystems | P01004 | for Y2H |
| Prey vector (e.g. pGAD-HA) | Dualsystems | P01004 | for Y2H |
| Control prey vector (e.g. pLexA-p53) | Dualsystems | P01004 | for Y2H |
| Control bait vector (e.g. pACT-largeT) | Dualsystems | P01004 | for Y2H |
| Electrocompetent E. coli (e.g. MegaX DH10B T1R Electrocomp Cells) | Invitrogen | C640003 | for cloning |
| Yeast reporter strain (NMY51:MATahis3Δ200 trp1-901 leu2-3,112 ade2 LYS2::(lexAop)4-HIS3 ura3::(lexAop)8-lacZ ade2::(lexAop)8-ADE2 GAL4, e.g. NMY51) | Dualsystems | P01004 | for Y2H |
| Plastic paraffin film (e.g. Parafilm M) | Sigma-Aldrich | P7793-1EA | for yeast and bacteria culture |
| Gas permeable sealer (e.g. BREATHseal) | Greiner | 676 051 | for yeast culture |
| PCR Cycler (e.g. T100 Thermal Cycler) | Bio-Rad | 1861096 | for PCR |
| quantitative PCR Cycler (e.g. CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System) | Bio-Rad | 1855195 | for quantitative PCR |
| Microcentrifuge (e.g. Centrifuge 5417 R) | Eppendorf | 5417 R | general lab equipment |
| Centrifuge (e.g. Centrifuge 5804 R) | Eppendorf | 5804 R | general lab equipment |
| Nuclease-free water (DNAse-free, RNAse-free, Protease-free) | 5Prime | 2500010 | for PCR and DNA works |
| Scalpell | Swann-Morton | 0301 | for DNA preparation |
| Sterile filter (0.22 µm; Polyethersulfone) | VWR-International | 514-0073 (European Catalogue number) | for yeast and bacteria culture |
| Petri dishes Ø 90 mm | Greiner Bio-One | 633180 | for yeast and bacteria culture |
| Petri dishes Ø 150 mm | Greiner Bio-One | 639161 | for yeast culture |
| Photometer (e.g. BioPhotometer) | Eppendorf | 550507804 | for yeast culture |
| Photometer Cuvettes | Brand | 759015 | for yeast culture |
| Water Bath (e.g. Water Bath Memmert WB7) | Memmert | WB7 | for yeast transformation |
| Western Blot Equipment | Bio-Rad | diverse | for protein detection |
| dNTPs | 5Prime | 2201210 | for cloning |
| Shaker (Erlenmeyer) Flasks (100 mL; 1,000 mL; 2,000 mL) and breathable cotton plugs (e.g. Duran Erlenmeyer narrow-neck flasks) | Sigma Aldrich | Z232793, Z232858, Z232866 | for yeast and bacteria culture |
| Shaking Incubator (e.g. GFL 3031) | GFL | 3031 | for yeast and bacteria culture |
| Incubator | Binder | KB 53 (E3.1) | for yeast and bacteria culture |
| Ice Maker (e.g. Ice Maker IF 825) | Omniwash | IF 825 | general lab equipment |
| 0.2 mL, 1.5 mL and 2.0 mL Reaction Vials (Polypropylene) | Eppendorf | 0030.124.332 (0.2 ml); 0030.123.328 (1.5 ml); 0030.123.344 (2.0 ml) | general lab equipment |
| Pipettes and disposable pipette Tips (different volumina: 10 - 1,000 µL) | Eppendorf | diverse | general lab equipment |
| Spreader | Sigma-Aldrich | SPR-L-S01 | for yeast and bacteria culture |
| Vortex shaker (e.g. MS 3 Minishaker) | IKA | 3617000 | general lab equipment |
| T4-Ligase | Thermo Fisher | EL0011 | for cloning |
| Fridge (4 °C) (e.g. Liebherr Medline FKEX 5000) | Liebherr | 81.767.580.4 | general lab equipment |
| Freezer (-20 °C) (e.g. Liebherr Comfort Professional G5216) | Liebherr | G5216 | general lab equipment |
| Graduated Cylinder (e.g. Brand) | Sigma Aldrich | Z327352; Z327417; Z327441 | general lab equipment |
| Serological Pipettes (e.g. Fisherbrand) | Thermo Fisher | S55701 | for yeast and bacteria culture |
| Mechanical Pipettor (e.g. Pipetboy acu 2) | Integra-Biosciences | 155000 | general lab equipment |
| Cuvettes for Electroporation (1 mm) | Molecular Bio Products | 5510-11 | for bacteria transformation |
| Electroporator (e.g. Eporator) | Eppendorf | 4309000019 | for bacteria transformation |
| Gel and Blot imaging system (e.g. ChemiDoc MP System) | Bio-Rad | 1708280 | general lab equipment |
| Conical centrifuge tubes (Polypropylene) (50 mL) | VWR-International | 525-0403 (European Catalogue number) | general lab equipment |
| Conical centrifuge tubes (Polypropylene) (13 mL) | BD Falcon | 352096 | general lab equipment |
| Dithiothreitol (DTT; 1 M) | Thermo Scientific | P2325 | for ligation |
| adenosine triphosphate (ATP, e.g. ATP Solution (10 mM)) | Ambion | AM8110G (distributed by Thermo Scientific) | for ligation |
| Dropout mix without histidine, leucine, tryptophan, and adenine (DO, e.g. Yeast Synthetic Drop-out Medium Supplements) | Sigma-Aldrich | Y2021 Sigma | for yeast culture (ready-made mix) |
References
- Fields, S., Song, O. -K. A novel genetic system to detect protein-protein interactions. Nature. 340 (6230), 245-246 (1989).
- Dombrosky-Ferlan, P. -M., Corey, S. -J. Yeast two-hybrid in vivo association of the Src kinase Lyn with the proto-oncogene product Cbl but not with the p85 subunit of PI 3-kinase. Oncogene. 14, 2019-2024 (1997).
- Singh, R. Rice Mitogen-Activated Protein Kinase Interactome Analysis Using the Yeast Two-Hybrid System. Plant Physiol. 160, 477-487 (2012).
- Lee, H. -J., et al. Interaction of NADPH oxidase 1 with Toll-like receptor 2 induces migration of smooth muscle cells. Cardiovasc. Res. 99, 483-493 (2013).
- Del Bene, F., Tessmar-Raible, K., Wittbrodt, J. Direct interaction of geminin and Six3 in eye development. Nature. 427 (6976), 745-749 (2004).
- Kumar, A., Godwin, J. -W., Gates, P. -B., Garza-Garcia, A. -A., Brockes, J. -P. Molecular Basis for the Nerve Dependence of Limb Regeneration in an Adult Vertebrate. Science. 318 (5851), 772-777 (2007).
- Park, S. -Y., et al. Abscisic Acid Inhibits Type 2C Protein Phosphatases via the PYR/PYL Family of START Proteins. Science. 324 (5930), 1068-1071 (2009).
- Selyunin, A. S., et al. The assembly of a GTPase-kinase signalling complex by a bacterial catalytic scaffold. Nature. 469 (7328), 107-111 (2011).
- Uetz, P., et al. Herpesviral Protein Networks and Their Interaction with the Human Proteome. Science. 311 (5758), 239-242 (2006).
- Ushioda, R., Hoseki, J., Araki, K., Jansen, G., Thomas, D. Y., Nagata, K. ERdj5 Is Required as a Disulfide Reductase for Degradation of Misfolded Proteins in the ER. Science. 321 (5888), 569-572 (2008).
- Young, K. -H. Yeast two-hybrid: so many interactions, (in) so little time. Biol. Reprod. 58, 302-311 (1998).
- Krachler, A. M., Woolery, A. R., Orth, K. Manipulation of kinase signaling by bacterial pathogens. J. Cell Biol. 195 (7), 1083-1092 (2011).
- Hewezi, T., Baum, T. J. Manipulation of Plant Cells by Cyst and Root-Knot Nematode Effectors. Mol. Plant Microbe Interact. 26 (1), 9-16 (2012).
- McGhie, E. J., Brawn, L. C., Hume, P. J., Humphreys, D., Koronakis, V. Salmonella takes control: effector-driven manipulation of the host. Curr. Opin. Microbiol. 12 (1), 117-124 (2009).
- Kay, S., Bonas, U. How Xanthomonas type III effectors manipulate the host plant. Curr. Opin. Microbiol. 12 (1), 37-43 (2009).
- Navarro-Garcia, F., Serapio-Palacios, A., Ugalde-Silva, P., Tapia-Pastrana, G., Chavez-Dueñas, L. Actin Cytoskeleton Manipulation by Effector Proteins Secreted by Diarrheagenic Escherichia coli Pathotypes. Biomed. Res. Int. 2013, 22 (2013).
- Bhat, B. S., Shanaz, E. Effectors-Role in Host-Pathogen Interaction. J. Agr. Env. Sci. 3 (2), 265-285 (2014).
- Bhavsar, A. P., Guttman, J. A., Finlay, B. B. Manipulation of host-cell pathways by bacterial pathogens. Nature. 449 (7164), 827-834 (2007).
- Natale, P., Brüser, T., Driessen, A. -J. -M. Sec- and Tat-mediated protein secretion across the bacterial cytoplasmic membrane-Distinct translocases and mechanisms. Biochimica et Biophysica Acta-Biomembranes. 1778 (9), 1735-1756 (2008).
- Costa, T. R. D., et al. Secretion systems in Gram-negative bacteria: structural and mechanistic insights. Nat Rev Micro. 13 (6), 343-359 (2015).
- Tseng, T. -T., Tyler, B. M., Setubal, J. C. Protein secretion systems in bacterial-host associations, and their description in the Gene Ontology. BMC Microbiol. 9 (1), 1-9 (2009).
- MacLean, A. M., et al. Phytoplasma effector SAP54 hijacks plant reproduction by degrading MADS-box proteins and promotes insect colonization in a RAD23-dependent manner. PLoS Biol. 12 (4), e1001835 (2014).
- Sugio, A., Kingdom, H. N., MacLean, A. M., Grieve, V. M., Hogenhout, S. A. Phytoplasma protein effector SAP11 enhances insect vector reproduction by manipulating plant development and defense hormone biosynthesis. Proc Natl Acad Sci. 108 (48), 1254-1263 (2011).
- van Criekinge, W., Beyaert, R.
- Bruckner, A., Polge, C., Lentze, N., Auerbach, D., Schlattner, U. Yeast two-hybrid, a powerful tool for systems biology. Int. J. Mol. Sci. 10 (6), 2763-2788 (2009).
- Serebriiskii, I., Estojak, J., Berman, M., Golemis, E. A. Approaches to Detecting False Positives in Yeast Two-Hybrid Systems. Biotech. 28 (2), 328-336 (2000).
- Golemis, E. A., Serebriiskii, I., Law, S. F. The yeast two-hybrid system: criteria for detecting physiologically significant protein-protein interactions. Curr. Issues Mol. Biol. 1 (1-2), 31-45 (1999).
- Janik, K., Mithöfer, A., Raffeiner, M., Stellmach, H., Hause, B., Schlink, K. An effector of apple proliferation phytoplasma targets TCP transcription factors - a generalized virulence strategy of phytoplasma. Mol. Plant Pathol. , (2016).
- Strauss, E. Microbiology. Phytoplasma research begins to bloom. Science. 325 (5939), 388-390 (2009).
- Kartte, S., Seemüller, E. Variable response within the genus Malus to the apple proliferation disease. J. Plant Dis. Protect. 95 (1), 25-34 (1988).
- Bovey, R. Observations and experiments on apple proliferation disease. Phytopath. Mediterr. 2 (3), 111-114 (1963).
- Schlink, K., Reski, R. Preparing High-Quality DNA From Moss (Physcomitrella patens). Plant. Mol. Biol. Rep. 20, 423 (2002).
- Applichem. N-Lauroylsarcosine sodium salt. , https://www.applichem.com/fileadmin/datenblaetter/A7402_en_GB.pdf (2015).
- Applichem. 2-Mercaptoethanol. , https://www.applichem.com/fileadmin/datenblaetter/A1108_en_GB.pdf (2015).
- Applichem. 2-Propanol. , https://www.applichem.com/fileadmin/datenblaetter/A3928_en_GB.pdf (2015).
- Applichem. Chloroform:Isoamyl alcohol (24:1). , https://www.applichem.com/fileadmin/datenblaetter/A3928_en_GB.pdf (2015).
- Mehle, N., Nikolić, P., Gruden, K., Ravnikar, M., Dermastia, M. Real-time PCR for specific detection of three phytoplasmas from the apple proliferation group. Methods Mol. Biol. 938, 269-281 (2013).
- Applichem. Kanamycin sulfate. , https://www.applichem.com/fileadmin/datenblaetter/A1493_en_GB.pdf (2015).
- Smith, L. M., et al. Fluorescence detection in automated DNA sequence analysis. Nature. 321 (6071), 674-679 (1986).
- Lentze, N., Auerbach, D. Membrane-Based Yeast Two-Hybrid System to Detect Protein Interactions. Current Protocols in Protein Science. , Wiley Interscience. 1917-1952 (2008).
- Dualsystems Biotech AG. DUALhubrid Kit - Manual P01004 B06. www.dualsystems.com. , 1-44 (2012).
- Kurien, B. -T., Scofield, R. -H. Protein Blotting and Detection. , Humana Press. (2009).
- Gietz, R. D., Schiestl, R. H. High-efficiency yeast transformation using the LiAc/SS carrier DNA/PEG method. Nat. Protocols. 2 (1), 31-34 (2007).
- Yeast Transformation and Cloning. , JoVE Science Education Database. Cambridge, MA (USA). (2016).
- Sigma-Aldrich. 3-Amino-1,2,4-triazole. , http://www.sigmaaldrich.com/MSDS/MSDS/DisplayMSDSPage.do?country=IT&language=EN-generic&productNumber=A8056&brand=SIGMA&PageToGoToURL=http%3A%2F%2Fwww.sigmaaldrich.com%2Fcatalog%2Fproduct%2Fsigma%2Fa8056%3Flang%3Dit (2016).
- Ames, B. -N. The Biosynthesis of Histidine: d-erythro-Imidazole-Glycerol Phosphate Dehydrase. J. Biol. Chem. 228, 131-143 (1957).
- Joung, J. -K., Ramm, E. -I., Pabo, C. -O. A bacterial two-hybrid selection system for studying protein-DNA and protein-protein interactions. Prot Natl Acad Sci. 97, 7382-7387 (2000).
- Brennan, M. -B., Struhl, K. Mechanisms of Increasing Expression of a Yeast Gene in Escherichia coli. J. Mol. Biol. 136, 333-338 (1980).
- Stynen, B., Tournu, H., Tavernier, J., van Dijck, P. Diversity in genetic in vivo methods for protein-protein interaction studies: from the yeast two-hybrid system to the mammalian split-luciferase system. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 76 (2), 331-382 (2012).
- Hengen, P. -H. Methods and reagents: False positives from the yeast two-hybrid system. Trends Biochem Sci. 22 (1), 33-34 (1997).
- Vidalain, P. -O., Boxem, M., Ge, H., Li, S., Vidal, M. Increasing specificity in high-throughput yeast two-hybrid experiments. Methods. 32 (4), 363-370 (2004).
- Pattanaik, S., Werkman, J. -R., Yuan, L. Bimolecular Fluorescence Complementation as a Tool to Study Interactions of Regulatory Proteins in Plant Protoplasts. Plant Transcription Factors: Methods and Protocols. Yuan, L., Perry, E. S. , Humana Press. Totowa, NJ. 185-193 (2011).
- Ito, H., Fukuda, Y., Murata, K., Kimura, A. Transformation of Intact Yeast Cells Treated with Alkali Cations. J. Bacteriol. 153 (1), (1983).
- Kawai, S., Hashimoto, W., Murata, K. Transformation of Saccharomyces cerevisiae and other fungi. Bioeng Bugs. 1 (6), 395-403 (2010).
- Bernstein, D. -S., Buetr, N., Stumpf, C., Wickens, M. Analyzing mRNA-protein complexes using a yeast three-hybrid system. Methods. 26, 123-141 (2002).
- Stumpf, C. -R., Opperman, L., Wickens, M. Analysis of RNA-Protein Interactions Using a Yeast Three-Hybrid System. Methods Enzymol. 449, 295-315 (2008).
- Cottier, S., et al. The yeast three-hybrid system as an experimental platform to identify proteins interacting with small signaling molecules in plant cells: potential and limitations. Front. Plant Sci. 2, 1-12 (2011).
- Häuser, R., Stellberger, T., Rajagopala, S. V., Uetz, P. Array-Based Yeast Two-Hybrid Screens: A Practical Guide. Two Hybrid Technologies: Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology. , 21-38 (2012).
