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Immunology and Infection

从非耕种植物病原菌利用酵母双杂交筛选Unravelling一个细菌效应中的作用

Published: January 20, 2017 doi: 10.3791/55150
Automatic Translation
1, 1
1Department of Molecular Biology - Functional Genomics, Laimburg Research Centre

Summary

细菌效应蛋白是用于建立成功的感染很重要的。这个协议描述在其天然植物宿主细菌效应蛋白的蛋白质结合配偶的实验鉴定。识别通过酵母双杂交屏幕这些效应的相互作用已成为解开分子致病性策略的一个重要工具。

Abstract

Unravelling疾病表现的分子机制重要的是要了解植物科学病理和症状的发展。细菌已经进化不同的战略来操纵其主机的新陈代谢为自己的利益。此细菌操作常常与严重症状的发展，或受影响植物的死亡。确定负责主机操纵特异性细菌分子已经成为微生物研究的一个重要领域。这些细菌分子，称为鉴定后“效应，”这阐明它们的功能是非常重要的。一个简单的方法来确定的效应的功能是通过酵母双杂交（Y2H）屏幕，以确定在其自然宿主中的蛋白质结合伴侣。通常主机怀有不能由任何在硅片算法充分预测许多潜在的结合配偶体。因此，这是对PERFO最好的选择RM屏幕与对表达宿主蛋白的全库中的假想效应。如果病原体是uncultivable植一样，是特别具有挑战性。该协议提供了从植原体感染的木本寄主植物的潜在效应的放大，工厂的分子相互作用合作伙伴的后续识别与屏幕Y2H DNA纯化一步一步的指示。即使Y2H屏幕常用，有这种技术外包给生物技术公司，在一个成本提供Y2H服务的趋势。该协议提供了有关如何使用标准实验室技术的任何体面的装备分子生物学实验室进行Y2H指令。

Introduction

酵母双杂交屏幕（Y2H）的大约27年前1开发，至今已被广泛地应用于各个领域，以确定特定的蛋白质-蛋白质相互作用2，3，4，5，6，7，8，9，10，11 。与主机靶蛋白的细菌效应的物理相互作用常常是用于本目标蛋白质的功能操作的前提条件。分析这些相互作用已经转移到感染生物学12，13，14，15多个不同行业的焦点，“> 16，17，18。在Y2H屏幕的原则是，两种蛋白质的相互作用导致驱动的报告基因的表达的功能性转录因子的重构。已知效应（的”诱饵“）被翻译融合至DNA结合结构域的转录因子（DBD），和潜在的相互作用伙伴（在“猎物”）被融合到相应的转录因子的活化结构域（AD），由于相互作用伴侣是未知的，潜在的库交互件是由克隆的cDNA插入合适的猎物载体的表达质粒编码的AD是与编码DBD诱饵载体兼容克隆到所谓的“猎物库”。通常，该库是由在相互作用的情况下，该重组转录因子诱导报道基因，其通常使酵母的生长选择的表达。该交互件识别是通过测序与特定的质粒引物的猎物质粒实现。

细菌已经制定各种策略来操纵和利用其宿主的代谢或逃避防御机制，并通过不同的细菌分泌系统19，20，21分泌效应分子。确定这些细菌效应的结合配偶从而在识别在宿主中操纵途径的第一个步骤。这导致特定致病机制的改善的理解。

Y2H屏幕进行phytoplasmoses期间识别细菌效应相互作用，常常，Y2H为分子致病机制植研究22，23中的进一步表征了至关重要的初始实验。然而，遇到了在大多数出版物HOD描述是相当稀少，并且这些技术通常外包给生物技术公司。要提醒大家注意这种方法的可行性，该协议提供了一步一步的信息来确定它的自然宿主细菌效应分子相互作用的合作伙伴。

尽管广泛使用和Y2H屏幕的快进的方式，它不应该忘记，某些相互作用可能不会在酵母系统发生。这是由于酵母细胞被用作一种“ 体内反应容器”具有一定的生物限制的事实。几位作者已经解决的优点和Y2H及其衍生物11，24，25，26，27的缺点。一般考虑为，例如，酵母细胞可能无法提供适当的基因的表达，（后）的平移，或者针对各个蛋白质translocational条件正在研究中。这可能导致在屏幕假阴性结果。阳性相互作用可以反过来是人工制品和（在适当的宿主，即，在效应的情况下）可能不会发生在自然情况。它因此不可缺少确认以更密切相关的生物系统从与独立相互作用测试异源酵母表达系统中的相互作用。

在这项研究中，效应ATP_00189的从非可培养植物病原体暂定植原马里（P.马里）的结合伴侣进行鉴定。研究结果提供了重要的见解苹果增殖28，导致受影响的苹果种植区高昂的经济损失在29欧洲疾病的症状发展的分子机制。

Protocol

1.从被感染的苹果树收集根和叶片样品

注意：病原体特异性DNA可以从根或叶进行纯化。以下部分提供了两个采样的协议。

  1. 对于DNA制备
    1. 样品采集和准备从源头抓起
      1. 认同“苹果扩散”特异性症状30,31和控制树在无症状感染的树木。使用干净修剪机，切割具有的直径为0.5根样品 - 1cm到约5cm的长度。从三个不同的根系远处部位切割样品，并把它们放到适当标记的塑料袋。
        1. 保持样品在用冷却热包冷箱，并在4℃在冰箱中存储它们，直到进一步处理。
          注：根架构和结构方面有所不同生理状况ØF中的树。它在三个不同地点进行采样，不要采取过于薄细根是非常重要的。可将样本在4℃保存数日，但更长的贮存时间增加成型的危险。发霉样品不能用于DNA制备。
      2. 冲洗根样品与水以除去泥土。把它们在无菌培养皿中，并用无菌解剖刀除去根表皮和皮层。
        1. 清洁手术刀用干净，不起毛的纸巾擦拭，将它浸入70％（V / V）乙醇水溶液，加热消毒就在明火（如本生灯）。划伤韧皮部用手术刀，它切成小片，并且等分试样30 - 100毫克切碎韧皮部的进入无菌2.0毫升反应管中。储存在-80℃的样本数月。
    2. 样品采集和叶制剂
      1. 确定被感染和无症状的控制树，S IN一步1.1.1.1描述，并挑选每棵树10毫发无伤的叶子。每一个条件树是足够了。
      2. 冲洗用水的叶子，并通过喷雾70％（体积/体积）乙醇溶液清洗的表面上。放的叶子在无菌培养皿中，并用无菌解剖刀解剖每个叶片的中脉（中央静脉）。从脉除去表皮和皮层，切脉小块，并且等分试样100mg的中脉组织进入无菌的2.0毫升反应管。立即使用的样本DNA制备或储存在-80℃下几个月。
        注意：为方便起见，分装的植物材料中的100毫克部分和最终冻结它们进行存储。每个等分试样可直接用于DNA制备。称重速冻植物材料是麻烦的，因为冷冻植物材料会形成块。

2.十六烷基三甲铵（CTAB）为基础的DNA制备方法

32所述的改性的协议进行。

  1. 准备以下缓冲区：
    1. CTAB缓冲液：溶解1％w / v的十六烷基三甲基溴化铵（CTAB中，M R：364.45克/摩尔），100毫羟基甲基氨基甲烷（TRIS，Mr 为 ：121.14克/毫升），1.4M的氯化钠（NaCl中，M R：58.44克在水372.24克/摩尔）和它们调整至pH 8.0：/摩尔），和20mM乙二胺四乙酸二钠盐（NaEDTA，男河
    2. 的N-十二烷基肌氨酸缓冲液：将10％w / v的N-月桂酰肌氨酸钠盐33（M R：293,38克/摩尔），100毫摩尔Tris，和20mM NaEDTA在水中并调节pH值至8.0。
    3. 三 - EDTA（TE）缓冲液：将10毫摩尔Tris和1mM NaEDTA水和autoclAVE的溶液。
    4. 乙酸铵溶液：在水溶液中，在120℃高压灭菌，并为20分钟1.2巴：准备一个的5M乙酸铵（77,0825克/摩尔的M r）的 。
  2. 混合30 - 100毫克新鲜或冷冻切碎的植物材料（步骤1.1.2.2）。用300微升的CTAB缓冲液，N-十二烷基肌氨酸缓冲液30微升，蛋白酶K 6微升（10微克/微升）和12微升2-巯基乙醇34（M R：78,13克/摩尔）。振摇在60℃下60分钟。让组合继续之前冷却至室温。
  3. 加乙酸铵溶液360μL，大力混合。让该溶液静置5分钟，然后以15,000 xg离心离心它在室温下10分钟。将上清转移到一个干净的瓶中，加入冰冷的异丙醇35的720微升。沉淀DNA在-20℃至少30分钟。
  4. 离心在15000 XG混合在4 30分钟°C和丢弃上清液。用冰冷的70％乙醇500微升洗涤沉淀，并在4℃下旋转下来以15,000 xg离心5分钟。
  5. 丢弃乙醇上清液，并立即浸在干净的纸巾小瓶以除去残留的水滴。请务必以去除尽可能多的液体越好。空气干燥沉淀15-20分钟，或在真空浓缩器离心2-3分钟。不要过度干燥过量加热或延长蒸发时间的沉淀。
  6. 重悬在TE缓冲液700微升沉淀，并最终暖机至37℃以促进溶解。添加RNA酶的10微升（10微克/微升），在37°C孵育它为15分钟，以300rpm摇动。
  7. 加入700μl氯仿：异戊醇36 24：1，拌匀。离心混合物以20,000×g离心10分钟，在4℃和上清液的上层相转移至新的，干净的小瓶中。
  8. 通过加入沉淀上清液中的DNA的700微升的2-丙醇35（异丙醇，Mr 为 60.1克/摩尔），并在-20℃温育至少30分钟。离心混合物以12,000×g离心30分钟，在4℃并丢弃上清液。
  9. 洗用70％乙醇和离心机的500微升沉淀以12,000 xg离心在4℃下5分钟。如步骤2.5中所述干燥沉淀。溶解在TE中50微升。

通过PCR检测3.植原暂定马里特异性DNA

  1. 稀释在无核酸酶水从植物材料1:10纯化DNA，并运行与病原体特异性引物37的PCR。
    1. 通过使用引物和特异性探针为P.马里植37定量PCR协议验证在植物材料P马里特异性DNA的存在。通过用钙的各探针进行同样的PCR检查缺席其他16SrX植构件ND。 P. prunorum和C和。 P.螨DNA 37。
      注意：从非感染树DNA的应测试以及，确认没有在此控制的病原体。在此步骤中，重要的是从其他密切相关的植物种的DNA样品中不存在，因为这将增加从比P.马里其他一个植物种扩增的效应的风险。与其他密切相关的P.马里16SrX组植原体混合感染是通过分析与各自的探头样本排除。由于预期的结果应为负，其他16SrX植原体，它包括指示PCR疗效适当的阳性对照是非常重要的。

4.放大效应的潜在基因亚克隆到Y2H诱饵载体

  1. 扩增P的phytoplasmal基因atp_00189（未包括信号肽部分）使用引物5 马里-TCTCCTCCTAAAAAAGATTCTA-3（正向）和5- TATTATTTATCTTTATTTTTTTCCTT -3-（反向），以在5'和3'末端，分别限制性位点为EcoRⅠ和SalⅠ位 。净化与基于列的DNA纯化方法中的PCR产物。
  2. 克隆扩增子成通过 Eco RI和Sal结扎Y2H诱饵载体pLexA-N。
    注：在这里，100纳克Eco RI和Sal的线性pLexA-N载体与类似消化atp_00189 PCR扩增子和1个单位T4连接酶15纳克相结合。在含有40毫摩尔的Tris-HCl（pH为7.9，在25℃）缓冲液中进行连接反应，10毫的MgCl 2，10毫二硫苏糖醇（DTT中，M R：154.25克/摩尔），和0.5mM三磷酸腺苷（ATP，男△：在10.0微升在16℃过夜（14-20八）总体积507.18克/摩尔）。从分析使用相同的引物的未感染的树中的DNA，以排除非特异性引物结合到苹果点¯x家蝇</ em>的DNA。
  3. 变换连接混合物到大肠杆菌电感受态细胞的1微升，并选择在Luria-BERTANI卡那霉素抗性克隆（LB）平板补充有50微克/毫升卡那霉素硫酸盐38。
  4. 净化从以下制造商的说明基于列的质粒微型制备试剂盒的选定的细菌克隆的质粒DNA，并通过测序39检查插入的成功整合和方向。

5.测试潜在效应蛋白的自我激活（自动激活）

  1. 准备下列缓冲和生长介质：
    注：对于酵母选择性平板叫法的命名法在各自的培养基中的缺失的氨基酸与缩写一个“ - ”之前的缩写。例如，SD-TRP-LEU-他的板包含所有氨基酸，但色氨酸，亮氨酸和他。
    1. 10X辍学混合：称取200毫克L-精氨酸盐酸盐（M R：210.66克/摩尔），300毫克L-异亮氨酸（M R：131.17克/摩尔），269毫克的L-赖氨酸一水合物（M R：164.21克/摩尔）， 200毫克L-蛋氨酸（M R：149.21克/摩尔），500毫克L-苯丙氨酸（M R：165.19克/摩尔），2克L-苏氨酸（M R：119.12克/摩尔），300毫克L-酪氨酸（先生：181.19克/摩尔），200毫克的L-尿嘧啶（112.09克/摩尔）和1.5克L-缬氨酸（M R：117.15克/摩尔）。将它们溶解在1升的双蒸水和高压灭菌的溶液中。保持在4℃的溶液中。
      注：各辍学拌匀即可还购买预混。
    2. 10倍的L-腺嘌呤补充：称取100毫克的L-腺嘌呤半硫酸盐（ADE中，M R：184.17克/摩尔）和在50ml的双蒸水溶解。过滤消毒用0.22μm的微孔过滤的溶液。
    3. 10X L-组氨酸补充：称取100毫克L-组氨酸盐酸盐一水合物（他的，Mr 为
    4. 10倍的L-亮氨酸补充：在50ml的双蒸水和过滤用0.22微米的微孔过滤消毒它：称取500毫克的L-亮氨酸（113.17克/摩尔亮氨酸，男r）的的。
    5. 10倍的L-色氨酸补充：在50ml的双蒸水和过滤用0.22微米的微孔过滤消毒它：称取100毫克的L-色氨酸（204.23克/摩尔trp启动中，M R）的。
    6. SD-TRP-LEU-他-ADE-介质和板材：将0.67％w / v的酵母氮碱（无氨基酸）和2％w / v的D-葡萄糖一水合物（M R：198.17克/摩尔）的双蒸馏水和高压釜中。对琼脂平板，加2％w / v的琼脂（微生物级）之前高压灭菌。
    7. 为了准备选择性平板，添加氨基酸原液的1倍至蒸压自Süd-TRP-列伊 - 他 - 埃德网上平台。当准备盘子，确保琼脂是增加前冷却到〜50°C的氨基酸。保持储备溶液无菌。
    8. YPAD培养基：溶解1％w / v的酵母提取物，2％w / v的蛋白胨（微生物级），0.004％w / v的腺嘌呤半硫酸盐（M R：184.17克/摩尔），和2％w / v的葡萄糖一水合物双蒸水和高压釜中。为YPAD琼脂平板，w / v的琼脂高压灭菌之前添加2％。为了准备2个YPAD，使用上面提到的成分的两倍浓度。
      注：（可选）由于在中高浓度的葡萄糖，2个YPAD中变成高压灭菌后黑褐色。作为一种替代，一个40％（重量/体积）葡萄糖储液可制备并使其通过一个0.22微米的过滤器进行灭菌。然后将过滤灭菌的葡萄糖原液在无菌条件下加入到高压灭菌2×YPAD（缺乏葡萄糖）。为了避免卷错误，2倍YPAD必须做好准备，牢记10倍的葡萄糖溶液随后加入。这意味着，例如，代替1升Ò的F培养基中，只有900毫升制备（含有除葡萄糖的所有成分）并高压灭菌，然后加入100毫升的葡萄糖储液。
  2. 用于测试自激活醋酸锂介导的酵母转化
    1. Streak的酿酒酵母报告菌株NMY51 40（NMY51：MATahis3Δ200trp1-901 leu2-3,112 ADE2 LYS2：:( lexAop）4 HIS3 URA3：:( lexAop）8 lacZ的ADE2：:( lexAop）8 ADE2 GAL4）从上的YPAD琼脂平板冷冻甘油库存，并在30°C孵育它48小时。接此片菌落接​​种50毫升YPAD培养基。让酵母生长和定期测量的OD 600来监控生长。
    2. 让酵母生长至最终OD 0.5-0.8 600。通过在700 xg离心离心他们5分钟沉淀细胞，并在2.5毫升双蒸，高压灭菌水重悬。
    3. 准备六节等分用100微升酵母悬浮并加入50微升240％w / v的聚乙二醇4000（PEG中，M R：3,500-4,000克/摩尔），36微升的1M醋酸锂二水合物（LiOAc中，M R：102.02克/摩尔），和2％的25微升w / v的鲑鱼精子DNA（溶解的）。准备所有试剂用双蒸无菌水。
    4. 标签从“A”到“F”含有酵母悬浮六瓶，并添加以下质粒载体DNA：阴性对照：（1）1.5与效应（pLexA-N-atp00189 28）诱饵质粒微克，（B） 1.5微克空猎物质粒pGAD-HA 41，（C）1.5微克空诱饵载体pLexA-N 41，和（d）的空诱饵载体pLexA-N 1.5微克和空猎物质粒pGAD-HA 1.5微克;阳性对照：（E）的阳性对照诱饵质粒pLexA-P53 41和1.5微克正猎物质粒的pACT-largeT 41为1.5μg;和自活化试验：（F）BA 1.5微克它与效应（pLexA-N-atp00189）和1.5微克空猎物质粒pGAD-HA的质粒。
    5. 混合反应剧烈并在水浴中在42℃孵育他们45分钟。沉淀细胞在700 xg离心5分钟并弃上清。将细胞重悬于250微升0.9％（重量/体积）的氯化钠溶液（氯化钠中，M R：48.44克/摩尔）和铺在下面的选择性平板50微升：SD-trp启动，SD-亮氨酸，SD-trp-列伊，SD-TRP-LEU-他和SD-TRP-列伊 - 他 - 埃德。
    6. 孵育3板 - 第4天，30℃。培养后的第一天，密封件用塑料石蜡膜板，以防止所述板干燥。
    7. 检查板上的酵母生长。

6.测试效应的表达

  1. 测试通过Western印迹42的效应的表达与抗被耦合在所述效应器时的N-末端的莱克斯-A标记的抗体从pLexA-N表示。
    注：认为翻译融合的Lex-A标签增加了约24 kDa的感兴趣的蛋白质的实际重量。识别所述Western印迹的蛋白质尺寸时，这是很重要的。

7. Y2H屏幕

  1. 条纹的pLexA-atp00189（效应） - 转化NMY51在新鲜的SD-trp启动板，让它生长2 - 1天在30℃，直至红色菌落出现。
  2. 接种3毫升的SD-trp启动介质的与来自琼脂板红色菌落的小摇瓶中，并在30℃下以120振摇孵育过夜 - 150转。
  3. 接种20毫升SD-TRP在1毫升过夜培养的摇瓶，让它生长8小时。
  4. 调整培养通过添加SD-trp启动平台向OD 600 = 0.2，并在用10毫升的每个起始培养的摇瓶接种2×100毫升。在30℃振荡生长过夜。
    注：确保酵母不会达到OD 600> 0.5，并用新鲜的SD-trp启动稀。
  5. 测量OD 600和粒料120 OD 600“单位”。例如，如果600的1.2的OD测量，降速100毫升，弃上清，重悬在800毫升预热2×YPAD的粒料在用磁力搅拌棒的摇瓶中。
    1. 降速2毫升等分试样，除去上清液，重悬沉淀于水中。确保酵母悬浮液的OD 600为0.15和0.2之间。如果不是，调整2倍YPAD或过夜培养添加更多的酵母。
      注：2倍YPAD是深褐色，可以影响OD测量结果。因此，有必要确定OD之前悬浮在水中的酵母细胞。作为替代，2×YPAD可以通过单独灭菌的葡萄糖来制备，如在步骤5.1.8音符，从而防止介质的暗着色说明。
  6. 孵育剩余的酵母培养物中的应用ropriately尺寸摇瓶（800毫升中的2L摇瓶或除以2×400毫升成两个1升摇瓶）中，在30℃，120孵育 - 150转。测量外径600大约每1.5小时，直到OD达到0.6 600（需要4 - 6小时）。在此同时，准备在下一步骤中描述的解决方案。
  7. 醋酸锂介导的转化
    1. 溶解2％w / v的鲑鱼精子DNA在水中，在100℃的水浴中煮沸500微升5分钟。放置在冰上的管2分钟，然后重复加热步骤。置于冰上的DNA备用。
    2. 准备下列混合物：
      1. TE / LiOAC混合：混合3.08毫升的1M LiOAC的，3.08毫升的100mM的Tris / 10mM EDTA的（pH值：7.5），和21.84毫升无菌双蒸水。
      2. PEG / LiOAc混合：联合4.2毫升的1摩尔LiOAc的，4.2毫升毫米的Tris的/ 10毫EDTA（pH值：7.5），和33.6毫升的50％（重量/体积）的PEG 4000。
    3. 离心机800毫升酵母培养物（OD 600 = 0.6）在700×g离心5分钟以沉淀细胞。除去上清液和重悬沉淀在200毫升的无菌双蒸水。再次沉淀细胞，在700×g离心5分钟并弃上清。注意：如果需要分暂停分成几个小瓶离心。液体卷7.7.3。 7.7.4和。指的是从800毫升悬浮液中产生的整个颗粒。
    4. 重悬在16毫升TE / LiOAc混合颗粒（见步骤7.7.1.1）;降速在700×g离心5分钟并弃上清。重悬9.6毫升TE / LiOAC混合沉淀。
    5. 准备下列反应混入适当大小的反应聚丙烯容器：12小瓶pGAD-HA-cDNA文库载体7微克，100微升2％鲑鱼精子DNA（见步骤7.7），和2.5毫升PEG / LiOAc组合。从步骤7.10到每个12小瓶添加酵母细胞悬浮液的600微升和1分钟剧烈混合。
    6. 孵育45分钟，反应混合物在30℃的水浴中一ð剧烈混合，每15分钟。加入DMSO 160μL每小瓶大力混合。孵育另外20分钟，混合，在42℃。
    7. 沉淀细胞，在700×g离心5分钟，弃去上清液，并在3毫升2×YPAD的悬浮每个粒料。池在100毫升摇瓶中的所有细胞（从12小瓶总共36毫升），并孵育酵母在30℃下90分钟和120转。
    8. 沉淀细胞在700 xg离心5分钟并弃上清。重悬沉淀4.5毫升无菌的0.9％（重量/体积）NaCl和通过仔细上下吹打用10毫升血清吸管拌匀。撤销50微升，并准备在0.9％氯化钠十倍稀释1:10到1：1000。板100μL含SD-TRP-列伊琼脂90毫米培养皿中每个稀释度。
    9. 传播与SD-TRP-列伊 - 他 - 埃德琼脂16×150毫米直径的培养皿未稀释的酵母悬浮的其余部分。添加3-AT向培养基中，以减少自激活。孵育SD-TRP-列伊三天板与SD-TRP-LEU-他-阿德板四天在30℃。
      注：出现在选择平板克隆（潜在）相互作用对，开展为诱饵进行交互合作伙伴pGAD-HA质粒编码。
    10. 通过在SD-TRP-亮氨酸选择平板计数不同系列稀释的菌落确定转染效率。通过挑选和新鲜SD-TRP-LEU-他-ADE-选择平板无菌的枪头裸奔殖民地转移每个克隆。孵育24小时将板在30℃。直至达到总共五个通道每天重复此步骤。

8.从选择性平板分析克隆人

  1. 准备一台无菌2毫升的反应用1毫升SD-TRP-列伊 - 他 - 埃德每个克隆的管无菌罩下。冲一个孔进入每个管与热针和盖用一块气体可渗透密封剂的孔。接种新鲜菌落队友每一瓶里亚尔从一个克隆（步骤7.17;使用的第 5 次传代后的克隆），并在30°C孵育24小时，以150rpm摇动。
    注意：这是从一个新鲜板取克隆重要的，因为在4℃下从存储数天板采取酵母不允许液体培养基在24小时内充分生长。
  2. 沉淀5分钟的酵母在4000 xg离心并弃去上清液。重悬在合适的重悬浮缓冲液的粒料（来自各质粒DNA小量制备试剂盒），并转移到一个新的2.0毫升反应管。加入100微升的酸洗的玻璃珠（425- 600微米直径）和5分钟剧烈混合。
  3. 添加相应的裂解缓冲液并使用按照制造商的指示质粒制备mini试剂盒的质粒纯化进行。洗脱用的水50微升质粒DNA。
  4. 从步骤8.3使用该DNA用于与捕食特定质粒引物，GAL4ADseq测序反应REF“> 41 5'- ACCACTACAATGGATGATG -3”。
  5. 验证由所述相互作用从头共转化43,44诱饵和猎物载体。选择SD-TRP-列伊 - 他 - 埃德选择板转化的酵母。

Representative Results

可以执行实际Y2H屏幕之前诱饵必须为自激活进行测试。这是通过用空猎物文库载体一起转化诱饵表达载体，并检查在选择性平板上生长实现的。

分析phytoplasmal蛋白ATP_00189是自激活，如第5诱饵质粒补充色氨酸和猎物质粒酿酒酵母 NMY51 40列伊营养缺陷的描述进行自我激活测试。因此，一个成功的合作转型的特点是生长在缺乏色氨酸和亮氨酸选择性平板。诱饵和猎物的蛋白质相互作用导致NMY51的他和阿德营养缺陷型的互补。如果出现自激活由诱饵在不存在相互作用，酵母生长在缺乏他和ADE选择性平板。强与弱的自我可以进行激活。诱饵的强自活化的特征是在trp启动-LEU-他-阿德耗尽选择平板的共转化的酵母的生长。弱自激活导致生长在TRP-LEU-他，但不是在TRP-列伊 - 他 - 埃德耗尽选择平板。合适的阳性对照是用于解释自激活测定法的结果不可缺少的。自活化测定的预期结果的总结和它们的解释在表1中提供了与图1中显示。

图1
图1： 一个诱饵的诱饵自我激活试验的实施例执行Y2H屏幕前 。 酿酒酵母 NMY51被共转化与相互作用诱饵（PLEX化p53）和猎物（PACT-largeT）作为阳性对照（ 左图：交流电 ），弱自激活加上一个空的猎物天秤RY向量（ 中图：DF）和不能自我激活诱饵加上一个空的猎物库矢量（ 右图：GI）。 ，trp启动，亮氨酸和他的（ 中图：B，E，H）：该共转化的酵母被上缺乏trp和亮氨酸（A，D，G上面板 ）的SD平板上培养和trp，亮氨酸，他和ADE（ 低级面板：C，F，I）。上介质缺乏色氨酸和亮氨酸的选择是成功共转化的阳性对照，作为诱饵载体补充了色氨酸营养缺陷和猎物载体NMY51（在SD-TRP-亮氨酸生长）的亮氨酸营养缺陷型。在诱饵和猎物或诱饵的自活化之间的相互作用的情况下，NMY51的报告基因的表达被接通并补充了他和ADE营养缺陷型（在SD-TRP-LEU-他-ADE生长）。弱自激活的特点是生长在SD-TRP-LEU-他的板（ 中间面板，DF）。诱饵弱自激活必须分析诱饵前的被削弱在Y2H屏幕， 例如通过添加3-AT到选择性培养基。氨基酸枯竭都标有“ - ”在各自的媒体名称。 请点击此处查看该图的放大版本。

pLexA-N-atp00189 没有群落没有增长没有增长没有增长没有增长
没有 pGAD-HA 没有增长群落没有增长没有增长没有增长
pLexA-N 没有群落没有增长没有增长没有增长没有增长
pLexA-N pGAD-HA 群落群落没有增长没有增长
pLexA-P53 的pACT-largeT 群落群落群落群落群落
pLexA-N-atp00189 pGAD-HA 群落群落群落没有增长没有增长

表1：诱饵自活化实验的预期结果。 酿酒酵母 NMY51的转型，基于共同转化诱饵和猎物的特点选择性培养基不同的生长产生。在选择性平板上生长，在30℃下经72小时后培养不同载体的组合（AF）的转化进行评价。弱自激活的特点是酵母生长在SD-TRP-LEU-他并通过在SD-TRP-列伊 - 他 - 埃德选择开发平台的强劲增长自激活ES在不存在相互作用配偶的。所述pLexA-N编码phytoplasmal效应ATP_00189不表现自激活，其特点是不能转化NMY51在没有他和ADE的生长诱饵载体。

根据不同的饵，一Y2H屏幕能获得大量的酵母克隆选择性平板上生长。所有克隆必须分析和检查可能的冗余。即使归一化的cDNA文库已被使用，它很可能是一个交互件在许多不同克隆表示。根据库克隆技术，它也有可能是仅完整基因的片段被插入一些猎物载体。它因此可取的从头 （从cDNA）扩增和亚克隆交互件的全长基因，并测试在一对一的Y2H分析（ 图2）的相互作用。

“图2”SRC 图2： 在Y2H实验诱饵和猎物之间的相互作用的例子。进行酵母双杂交（Y2H）屏幕，并纯化从正相互作用分子克隆质粒。猎物载体测序， 海棠点¯x家蝇宿主相互作用的合作伙伴MdTCP24和MdTCP25进行鉴定。作为阴性对照MdTCP34（对于没有交互件是在Y2H库筛选中鉴定）并联亚克隆。全长基因从苹果的cDNA扩增，克隆到捕食载体（共cistronically表达的激活域AD）和从头共转化用表达耦合至DNA结合结构域（BD）的细菌效应ATP_00189诱饵载体。这个数字是从28所。 请点击此处查看大图版本这个数字。

Discussion

在Y2H屏幕，潜在效应蛋白与不同假想相互作用蛋白（步骤7）共表达。每个生长酵母克隆含有诱饵但一个（可能）不同交互件。的相互作用的蛋白质被编码在被克隆到捕食的质粒cDNA文库。诱饵和猎物质粒对酵母转录因子的一部分，每个合作cistronically代码。在诱饵（效应）和猎物质粒编码交互件之间的物理相互作用的情况下，两个转录因子份（DNA结合结构域和活化结构域）团结，并且报告基因的表达被诱导。酵母是能够在组氨酸和腺嘌呤的贫的SD选择平板上生长。那种猎物cDNA文库的是依赖于筛选效应，必须相应地选择。猎物和诱饵载体，以及酵母菌株，必须兼容。在此屏幕上，一个LexA的DNA结合结构域和GAL4激活domaiÑ被用作相容酵母转录因子单元。 cDNA文库可以单独构成，定制，或商购获得。该cDNA文库猎物的准备是不是该协议的一部分。在这个协议中，使用的是来自苹果点¯x家蝇叶RNA的自行建造，归一化的cDNA文库，并克隆到pGAD-HA 41。 -expressing酵母菌株的效应（诱饵）与捕食文库转化，并选择对组氨酸和腺嘌呤的贫的SD选择平板的克隆。提取的酵母菌落的质粒DNA，细菌的基于列的DNA质粒mini试剂盒中的组合，建议使用玻璃珠，以提高酵母裂解（步骤8）的机械破碎步骤。在此质粒纯化，诱饵和猎物载体将同时在相对低浓度纯化。然而，质粒DNA的量足以通过测序机智识别相互作用配偶豪特之前质粒传播（步骤8.4）。作为替代，在步骤8.4纯化DNA可以转化到感受态大肠杆菌和猎物载体介导的抗生素抗性选择（ 例如，在pGAD-HA的情况下氨苄青霉素的）。选定的大肠杆菌菌落仅携带pGAD-HA文库质粒，和高产质粒纯化可以用这些克隆进行。

pLexA-N和pGAD-HA结构的成功转型补充NMY51的色氨酸和亮氨酸营养缺陷。效应和蛋白质（编码在pGAD-HA）之间的相互作用导致了报告系统的在NMY51菌株的活化。在自激活的情况下，NMY51转化有表达pLexA-N结合的空文库载体pGAD-HA生长在缺乏色氨酸-LEU-他-ADE，选择性平板效应由于NMY51报告系统的不希望的活化40。自激活可以为wEAK和可发生在没有trp启动-LEU-他的，或激活能强和其特征在于生长上的trp-LEU-他-阿德板41。自激活可引起假阳性克隆中的实际Y2H屏幕大规模背景。为了避免这种情况，与诱饵的自激活测试必须进行，其中，所述效应子表达载体是共转化用空文库载体。在这个实验设置，报告基因的表达不能被诱导。如果自激活（ 即，在选择性平板上生长）是在测试可见，培养基可以补充有不同浓度的3-氨基-1,2,4-三唑45（3-AT）的。 3-AT是imidazoleglycerol磷酸脱水酶（HIS3），酶组氨酸生物合成46中重要的抑制剂。补充3-AT可以减少在Y2H屏幕47自激活的作用较弱，48。不同浓度的3-AT的进行测试。在这个协议中，1 - 40毫米3-AT中使用。这导致自我激活抑制的最低浓度应随后在Y2H屏幕使用。自活化测定的选择性平板可以，如果共转化的SD-TRP-Leu平板含有足够数量的克隆只进行评估。作为指示≥每90毫米（直径）的培养皿500个菌落是足够的。确定准确的转染效率，建议以制备共转化的酵母的连续稀释液并把它们散布在SD-TRP-Leu平板。

以减少自激活，效应可以克隆到pLexA-C，即融合了LexA的标签的蛋白质的C末端的诱饵表达载体。莱克斯-A标签的方向可以减轻自激活24。然而，这是不可能在所有情况下，以减少或消除自激活。的形成红色或淡红色菌落表示弱或假阳性的互动。 NMY51的ADE2报告基因，当涉及到一个蛋白质-蛋白质相互作用，仅激活这反过来块红色染料的在此酵母菌株40的积累。在缺乏互动，NMY51都偏红，同时搭载强大的干扰作用的菌落是白色的。在选择平板的菌落颜色的观察因此提供进一步的重要的暗示以判断如果各个菌落道道或假阳性相互作用物。

它是最终要适应或相对于该诱饵的性质和作用特性的更改某些测定法设置。现在，一些改进和共同Y2H的衍生物技术已经建立，以允许在不同的主机系统相当困难蛋白质相互作用的分析。通过Stynen 等进行审查。 49地址的第二描述Y2H，其改进和适应的各个方面，从而提供了有关如何选择适当的互动分析有用的信息。

Y2H屏幕和衍生技术已被广泛应用于不同的研究领域，任何需要二进制蛋白质相互作用的鉴定。即使关键控制被执行，如诱饵的自激活试验和鉴定相互作用的蛋白质的一到一个重新变换，在Y2H是容易产生错误的结果26，50，51。酵母作为模型并不适用于所有的相互作用研究。酵母并不一定构成支持适当的翻译后修饰和折叠为每个蛋白24的蜂窝环境。此外，在Y2H设置，蛋白质过表达，并且它们的表达是不控制其天然启动子领导。在Y2H迫使蛋白质相互作用配偶到细胞核，这不一定是它们的天然亚细胞目标。相互作用的天然细胞环境因此可能不会通过酵母中反映出来，并可能导致假阴性或假阳性结果。最Y2H基于酵母营养缺陷型互补作为选择原则。此营养选择的特征是高灵敏度，但在相对于其他的选择性降低的成本（ 例如，发色记者）测定49。如果不可还原自激活（见上文）或发生了一定的效应的其他限制，Y2H不是合适的测定25。在表1和图1中 ，自激活试验的预期结果中给出。缺乏真正的相互作用（ 即假阴性），可通过蛋白的毒性，不正确的翻译蛋白质引起的必要的互动24处理，互动的空间位阻，在猎物库未被充分代表的互动合作伙伴，诱饵膜定位，或缺少的组件。

建议从头扩增来自cDNA的所识别的相互作用蛋白的全长基因，亚克隆入pGAD-HA，并且通过转化产生的pGAD-HA构建成执行一对一的相互作用测定诱饵表达NMY51应变。这是必要的，因为存在于猎物文库观察到的交互器可能仅是一个更大的蛋白质的片段。但是，对于相应的全长基因的信息是只有当相当的基因组和转录组序列数据可用访问。变换协议为这里所描述的自活化试验可以应用于这样一对一的测定中，以及在诱饵和交互件之间的相互作用必须是可重复的。

海棠点¯x家蝇的TCP转录因子的相互作用在植物证实在本塞姆氏烟草双分子荧光互补（附设）原生质体28（未此协议的一部分）。的效应蛋白ATP_00189从植物病原体P.马里而得。 在植物附设就这样选择了验证与海棠点¯x家蝇转录因子相互作用ATP_00189 先前在Y2H 28标识。附设是不需要的相互作用蛋白到细胞核的亚细胞易位以激活报告系统<蛋白质 - 蛋白质相互作用测定法SUP类=“外部参照”> 52。此外， 在植物中表达和修改机器模仿在其植物宿主植物细菌效应之间的自然交互的环境中。然而，使用附设一个全局画面是不可行的。

有在，必须谨慎处理的协议几个步骤。当扩增的利息（步骤4）的基因，它排除引物结合到植物DNA是非常重要的。因此，来自非感染植物的DNA必须包含作为阴性对照。感兴趣的基因的序列不能包含用于插入件的定向克隆的EcoRI和SalI限制性位点。如果序列确实包含这些网站上，用于克隆不同的限制酶必须选择。酵母转化是该协议中的核心方法。转染效率依赖于酵母细胞的能力，它们的生存能力，生长状态，并转染REAG的质量耳鼻喉科53,54。对于所提出的协议，这是强烈建议在执行变换时，使用从新鲜平板酵母不超过两周（保持在4℃）以上。通常情况下，当选择液体培养物与来自旧琼脂平板的菌落接种转化的酵母的生长被延迟。这也有利于用液态起子培养作为实际实验的接种物，而不是直接从板使用酵母。转染效率低，当猎物进入诱饵表达酵母可导致某些猎物蛋白（潜在相互作用者）的人数不足，因此可以扭曲整个屏幕。在这个协议中，在Y2H〜15万CFU /微克DNA转染的酵母转染效率运作良好。

知道了Y2H技术的缺陷和弊端，并在关键的和适当的方式解释结果是必不可少的绘制科尔等结论。 Y2H测定和衍生物已被使用多年，并已进行了许多改进和调整相对于所述不同的诱饵特性，相互作用的亚细胞定位，这可能是必需的相互作用的预期的结合伙伴，以及其他因素（见Y3H 55，56，57）。最近，基于阵列的Y2H屏幕已经开发了允许对数以百万计的猎物58的众多诱饵自动化，高通量分析。将来很可能在于自动化和高通量的方法来该测定，以允许在不同的研究领域复杂信号传导途径和interactomes的澄清。

Disclosures

作者宣称，他们没有竞争的经济利益。

Acknowledgments

我们感谢恭Kerschbamer，托马斯Letschka，萨宾Oettl，玛戈Raffeiner和弗洛里安Senoner从Dualsystems生物技术公司的技术支持和Julia施特罗布尔的Laimburg研究中心和Mirelle博尔赫斯迪亚斯Schnetzer校对稿件。这项工作是为APPL2.0项目的一部分进行和波森/意大利博尔扎诺自治省和南蒂罗尔苹果联盟被部分资助。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cetyltrimethylammonium bromide (CTAB) Applichem A6284 for DNA preparation
Trishydroxymethylaminomethane (Tris) Applichem A2264 for media and buffer
Sodium chloride (NaCl) Applichem A2942 for media and buffer
Ethylenediaminetetraacetic acid Disodium salt (NaEDTA) Applichem A2937 for media and buffer
N-Lauroylsarcosin sodium salt Applichem A7402 for DNA preparation
ammonium acetate  Sigma-Aldrich (Fluka) 9688 for DNA preparation
2-mercaptoethanol Applichem A1108 for DNA preparation
Isopropanol (2-Propanol) Applichem A3928 for DNA preparation
Ethanol Sigma-Aldrich (Fluka) 51976 for DNA preparation
RNAse Applichem A2760 for DNA preparation
Chloroform:Isoamyl 24:1 Applichem A1935 for DNA preparation
Proofreading Polymerase (e.g. iProof) Bio-Rad 203433 for PCR
EcoRI Thermo Scientific ER0271 for cloning
SalI Thermo Scientific ER0641 for cloning
Column-based DNA Purification Kit (e.g. QIAquick) Qiagen 28104 for cloning
Kanamycin Sulfate Applichem A1493 for microbiological selection
3-Amino-1,2,4-Triazole (3-AT) Sigma-Aldrich A8056 for self-activation assay
L-Arginine Monohydrochloride  Applichem A3680 for yeast culture
L-Isoleucine  Applichem A3642 for yeast culture
L-lysine Monohydrate  Applichem A3448 for yeast culture
L-Methionine  Applichem A3897 for yeast culture
L-Phenylalanine  Applichem A3464 for yeast culture
L-Threonine  Applichem A3946 for yeast culture
L-Tyrosine  Applichem A3401 for yeast culture
L-Uracile Applichem A0667 for yeast culture
L-Valine  Applichem A3406 for yeast culture
L-Adenine Hemisulfate Salt  Applichem A1596 for yeast culture
0.22 µm Pore Filter Sartorius 16541 for sterile filtration
L-Histidine Monohydrochloride Applichem A3719 for yeast culture
L-Leucine  Applichem A3496 for yeast culture
L-Tryptophane  Applichem A3410 for yeast culture
Yeast Nitrogen Base  Sigma-Aldrich 51483 for yeast culture
D-Glucose Monohydrate  Applichem A1349 for yeast culture
Agar Fisher Scientific BP2641-1 for yeast and bacteria culture
Peptone Applichem A2208 for yeast culture
Polyethylene Glycol 4000 (PEG) Applichem A1249 for yeast transformation
Lithium Acetate Dihydrate (LiOAc) Applichem A3478 for yeast transformation
Salmon Sperm DNA  Applichem A2159 for yeast transformation
Antibody against Lex-A tag (e.g. Anti-LexA DNA binding region) Millipore 06-719 for Western blot
Plasmid Miniprep kit (e.g. GenElute Plasmid Miniprep Kit) Sigma-Aldrich PLN350 for plasmid purification from yeast and bacteria
Acid Washed Glass Beads Sigma-Aldrich G8772 for plasmid purification from yeast
Ampicillin Sodium Salt Applichem A0839 for microbiological selection
Yeast Extract Applichem A1552 for yeast culture
Vacuum concentrator centrifuge (e.g. Concentrator 5301) Eppendorf Z368245 (Sigma) for DNA preparation
Bait vector (e.g. pLexA-N) Dualsystems P01004 for Y2H
Prey vector (e.g. pGAD-HA) Dualsystems P01004 for Y2H
Control prey vector (e.g. pLexA-p53) Dualsystems P01004 for Y2H
Control bait vector (e.g. pACT-largeT) Dualsystems P01004 for Y2H
Electrocompetent E. coli (e.g. MegaX DH10B T1R Electrocomp Cells) Invitrogen C640003 for cloning
Yeast reporter strain (NMY51:MATahis3Δ200 trp1-901 leu2-3,112 ade2 LYS2::(lexAop)4-HIS3 ura3::(lexAop)8-lacZ ade2::(lexAop)8-ADE2 GAL4, e.g. NMY51) Dualsystems P01004 for Y2H
Plastic paraffin film (e.g. Parafilm M) Sigma-Aldrich P7793-1EA for yeast and bacteria culture
Gas permeable sealer (e.g. BREATHseal) Greiner 676 051 for yeast culture
PCR Cycler (e.g. T100 Thermal Cycler) Bio-Rad 1861096 for PCR
quantitative PCR Cycler (e.g. CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System) Bio-Rad 1855195 for quantitative PCR
Microcentrifuge (e.g. Centrifuge 5417 R) Eppendorf 5417 R general lab equipment
Centrifuge (e.g. Centrifuge 5804 R) Eppendorf 5804 R general lab equipment
Nuclease-free water (DNAse-free, RNAse-free, Protease-free) 5Prime 2500010 for PCR and DNA works
Scalpell Swann-Morton 0301 for DNA preparation
Sterile filter (0.22 µm; Polyethersulfone) VWR-International 514-0073 (European Catalogue number) for yeast and bacteria culture
Petri dishes Ø 90 mm  Greiner Bio-One 633180 for yeast and bacteria culture
Petri dishes Ø 150 mm  Greiner Bio-One 639161 for yeast culture
Photometer (e.g. BioPhotometer) Eppendorf 550507804 for yeast culture
Photometer Cuvettes Brand 759015 for yeast culture
Water Bath (e.g. Water Bath Memmert WB7) Memmert WB7 for yeast transformation
Western Blot Equipment Bio-Rad diverse for protein detection
dNTPs 5Prime 2201210 for cloning
Shaker (Erlenmeyer) Flasks (100 mL; 1,000 mL; 2,000 mL) and breathable cotton plugs (e.g. Duran Erlenmeyer narrow-neck flasks) Sigma Aldrich Z232793, Z232858, Z232866 for yeast and bacteria culture
Shaking Incubator (e.g. GFL 3031) GFL 3031 for yeast and bacteria culture
Incubator Binder KB 53 (E3.1) for yeast and bacteria culture
Ice Maker (e.g. Ice Maker IF 825) Omniwash IF 825 general lab equipment
0.2 mL, 1.5 mL and 2.0 mL Reaction Vials (Polypropylene) Eppendorf 0030.124.332 (0.2 ml); 0030.123.328 (1.5 ml); 0030.123.344 (2.0 ml) general lab equipment
Pipettes and disposable pipette Tips (different volumina: 10 - 1,000 µL) Eppendorf diverse general lab equipment
Spreader Sigma-Aldrich SPR-L-S01 for yeast and bacteria culture
Vortex shaker (e.g. MS 3 Minishaker) IKA 3617000 general lab equipment
T4-Ligase Thermo Fisher EL0011 for cloning
Fridge (4 °C) (e.g. Liebherr Medline FKEX 5000) Liebherr 81.767.580.4 general lab equipment
Freezer (-20 °C) (e.g. Liebherr Comfort Professional G5216) Liebherr G5216 general lab equipment
Graduated Cylinder (e.g. Brand) Sigma Aldrich Z327352; Z327417; Z327441   general lab equipment
Serological Pipettes (e.g. Fisherbrand) Thermo Fisher S55701 for yeast and bacteria culture
Mechanical Pipettor (e.g. Pipetboy acu 2) Integra-Biosciences 155000 general lab equipment
Cuvettes for Electroporation (1 mm) Molecular Bio Products 5510-11 for bacteria transformation
Electroporator (e.g. Eporator) Eppendorf 4309000019 for bacteria transformation
Gel and Blot imaging system (e.g. ChemiDoc MP System) Bio-Rad 1708280 general lab equipment
Conical centrifuge tubes (Polypropylene) (50 mL) VWR-International  525-0403 (European Catalogue number) general lab equipment
Conical centrifuge tubes (Polypropylene) (13 mL) BD Falcon 352096 general lab equipment
Dithiothreitol (DTT; 1 M) Thermo Scientific P2325 for ligation
adenosine triphosphate (ATP, e.g. ATP Solution (10 mM)) Ambion  AM8110G (distributed by Thermo Scientific) for ligation
Dropout mix without histidine, leucine, tryptophan, and adenine (DO, e.g. Yeast Synthetic Drop-out Medium Supplements) Sigma-Aldrich Y2021 Sigma  for yeast culture (ready-made mix)

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从非耕种植物病原菌利用酵母双杂交筛选Unravelling一个细菌效应中的作用
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Janik, K., Schlink, K. Unravelling… More

Janik, K., Schlink, K. Unravelling the Function of a Bacterial Effector from a Non-cultivable Plant Pathogen Using a Yeast Two-hybrid Screen. J. Vis. Exp. (119), e55150, doi:10.3791/55150 (2017).

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