Forskolin-induced נפיחות מעיים Organoids: An<em> במבחנה</em> Assay עבור הערכת תגובה לתרופה בחולי סיסטיק פיברוזיס
Summary
This protocol describes an assay for measuring CFTR function and CFTR modulator responses in cultured tissue from subjects with cystic fibrosis (CF). Biopsy-derived intestinal organoids swell in a cAMP-driven fashion, a response that is defective (or strongly reduced) in CF organoids and can be restored by exposure to CFTR modulators.
Abstract
Recently-developed cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR)-modulating drugs correct surface expression and/or function of the mutant CFTR channel in subjects with cystic fibrosis (CF). Identification of subjects that may benefit from these drugs is challenging because of the extensive heterogeneity of CFTR mutations, as well as other unknown factors that contribute to individual drug efficacy. Here, we describe a simple and relatively rapid assay for measuring individual CFTR function and response to CFTR modulators in vitro. Three dimensional (3D) epithelial organoids are grown from rectal biopsies in standard organoid medium. Once established, the organoids can be bio-banked for future analysis. For the assay, 30-80 organoids are seeded in 96-well plates in basement membrane matrix and are then exposed to drugs. One day later, the organoids are stained with calcein green, and forskolin-induced swelling is monitored by confocal live cell microscopy at 37 °C. Forskolin-induced swelling is fully CFTR-dependent and is sufficiently sensitive and precise to allow for discrimination between the drug responses of individuals with different and even identical CFTR mutations. In vitro swell responses correlate with the clinical response to therapy. This assay provides a cost-effective approach for the identification of drug-responsive individuals, independent of their CFTR mutations. It may also be instrumental in the development of future CFTR modulators.
Introduction
CF נגרמת על ידי מוטציות רגולטור מוליכות הטרנסממברני סיסטיק פיברוזיס (CFTR) גן מקודד ערוץ אניון אפיתל. CF משפיע על כ 85,000 אנשים ברחבי העולם 1. למעלה מ -2,000 מוטציות CFTR זוהו ( www.genet.sickkids.on.ca ). גיוון זה מסביר חלקית קשת רחבה של פנוטיפים מחלת לב ( www.CFTR2.org ) 2, 3. שש כיתות של מוטציות CFTR מוגדרות בהתבסס על השפעתן על ביטוי חלבון CFTR ותפקוד: (I) אין סינתזה, (II) סחר פגום, (III) gating ערוץ פגום, (IV) מוליכות שינה, (V) רמות נמוכות של כלל תפקוד CFTR, ויציבות פני התא נפגם (VI) 4. למרות מוטציות CFTR המשותפות נלמדות היטב, פונקצית CFTR וקשר עם מצב קליני להישאר poorly הבין ברמת הפרט, במיוחד עבור הקבוצה הגדולה של מוטציות נדירות "יתומות" ( www.CFTR2.org ) 1, 3.
לאחרונה, תרופות פותחו למקד חלבון CFTR באופן מוטציה ספציפית. ישנן שתי קבוצות של תרופות CFTR מיקוד-חלבון נמצאות כיום בשימוש קליני יש מצבים שונים של פעולה. Potentiators, כגון VX-770, לשפר את ההסתברות הפתוחה של CFTR מוטצית apically-מקומי ולפעול ישירות על התוספת שלהם לתאים 5. מתקן, כגון VX-809, לשחזר את הסחר של CFTR misfolded הרטיקולום-מקומי endoplasmic ודורש דגירה מראש עם תאים לפני השפעת הם נצפו 6. Potentiator CFTR, VX-770, כבר נרשמו נבדקים עם המוטציה 7 G551D, 8, כמו גם במשך שמונה אחריםCFTR gating מוטציות, כולל S1251N 9; יחד, מוטציות אלה מבוצעים על ידי 5% מכלל הנבדקים CF. ניסויים קליניים אחרים הראו, כי VX-770, בשילוב עם VX-809 המתקן, הגביל השפעות משמעותיות עדיין על תפקוד ריאות ואת גורם לירידה בשיעורי החמרה בנבדקים הומוזיגוטים למוטצית F508del נישאה על ידי 45-50% מהחולים 10, 11.
ניסויים קליניים קונבנציונליים לזהות נושאי סמי תגובה בתוך 50% הנותרים של חולי CF הם יקרים זמן רב ואינם אפשריים עבור אנשים עם גנוטיפים CFTR הנדירים ביותר. רומן, חסכונית, שיטות אישית הם קריטיים כדי להתאים את מספר הגדל וההולך של מאפנני CFTR ליחידים נושאים כל סוג של מוטצית CFTR. עד עכשיו, הכללת הבדיקה של קבוצות חולות נושאת מוטציות CFTR ספציפיות כבר מונחה על ידי מחקרים באמצעות transfection גן CFTR מוטנטי h מערכות תא eterologous, ואחריו מחקרים אלקטרו Ussing תאי 5, 6, 12. בשל חוסר במודלים של בעלי חיים נאותים CF, מחקרים יעילים תרופה בתאי אפיתל סימפונות אוויר נוזלים ממשק בדיל נגזרו חומרי explant CF ריאות שמשו לפיתוח תרופות 13, 14, 15. עם זאת, הזמינות המוגבלת של רקמות explant ריאות ואת הפרוצדורות פולשניות כדי להשיג תאי סימפונות נושאים ללא מחלת סופנית להקשות על הניתוח של מוטציות CFTR נפוצות פחות ולמנוע בדיקות סמים באופן אישי. כדי להתגבר על המגבלות האלה, "גישה קלה" רקמות, כגון organoids הגס, תאים בדרכי נשימת אף, ותאי דרך נשימה שמקורם בתאי גזע מושרים, הן נבדקות כיום טיפולים תרופתיים אישית.
<p class= "jove_content"> בעבר, הקמנו פרוטוקולים לתאי גזע אפיתל תרבות מכל איבר העיכול בצורה של 3D organoids 16, 17. עבור המעי הגס / החלחולת האנושי, תנאי התרבות לערב גורמי גדילה מוגדר (פקטור גדילה אפיתל (EGF), Gastrin, Wnt-3A, R-spondin 3 (Rspo3), ו noggin) בשילוב עם מולקולות קטנות (Nicotinamide, A83-01, ו SB202190) במטריצה קרום במרתף. בתנאים אלה, תאי גזע יחידים או שברי רקמה קטנים לגדול לתוך סגור, פיברוזיס, מבני 3D נוצרו על ידי אפיתל פערים מקוטב עם הצד הבסיסי שלה מכוון כלפי חוץ. כל סוגי התאים בדרך כלל מופיעים יחסים והעמדות הרגילים שלהם. Organoids ניתן להרחיב פני תקופות זמן ארוכות על ידי הפרעה מכאנית שבועית מחדש ציפוי. הם גנטיים ויציבים phenotypically ניתן לאחסן, המאפשרים התרחבות לטווח ארוכים ביו-בנקאי 17. הם ניתניםכל המניפולציות הגנטיות / סטנדרטי התא ביולוגי וטכניקות ניתוח שפותחו עבור שורות תאי 2D 18.אנחנו הוכחנו לאחרונה כי פונקצית CFTR ניתן למדוד בקלות organoids המעי גס נפיחות הנגרמת forskolin (FIS) assay 19, 20. כאשר נחשף forskolin (FSK) או, לחלופין, כדי רעלן הכולרה, organoids במהירות להגדיל monophosphate אדנוזין המחזורי שלהם (cAMP) רמות, שבתורה גוררת בפתיחת ערוץ CFTR 19. Organoids מיחידים בריא, או נבדקים עם מוטציות CFTR הקשורים בתפקוד שיורית, יהיה בהמשך להתנפח כתוצאה יון ותחבורה מים לומן organoid, המקבילה במבחנה של שלשול הפרשה. תגובת FIS של organoids הגס הוצגה בעבר להיות מלא CFTR תלוי, כפי שצוינה על ידי organoids נגזר אנשי CFTR-nullND על ידי שימוש במעכבי CFTR תרופתי ספציפי 19. ערכות נתונים נושאות ספציפית גדולות יכולות להיגזר בתוך מספר שבועות לאחר נטילת ביופסיה.
עבור assay FIS תיאר בפרוטרוט כאן, organoids מתורבתים ביופסיות רקטלית שניתן להשיג בכל גיל ועם אי נוחות מוגבלת בלבד 21. Organoids הם passaged שבועי על ידי הפרעה מכנית לתוך מאורות יחיד בקלות לחתום מחדש ויוצרים organoids חדש. להרצת assay FIS, ~ 30-80 של organoids קצת שיבשו אלה הם מצופה בכל טוב של צלחת 96-גם 19. באותו יום של assay, organoids מגואלות ירוק calcein, צבע תא חדיר פלורסנט כי זה נשמר בתוך תאים חיים, בהנחיית הדמיה לחיות. לאחר מכן, FSK, אשר מעלה cAMP התאית ובכך מפעיל CFTR, מתווסף על מנת לעורר נפיחות organoid. Potentiators שפועל על CFTR הפסגה מתווסף זמנית wה- i forskolin, ואילו מתקן כי לשחזר סחר CFTR מתווספים 24 שעות לפני תוספת של FSK. נפיחות organoid היא לכמת ידי ניתוח תמונה אוטומטי המחשב את העלייה היחסית השטח הכולל של כל אובייקטי הניאון עבור כל נקודת זמן על תוספת forskolin.
3D organoid נפיחות מספק יתרונות וחסרונות על readouts CFTR אלקטרו קיימים תאים בדרכי הנשימה תרבותי 2D ב Ussing תאי. יתרון עיקרי הוא התפוקה של assay הנפיחות. הם תאים בתרבית ו assayed שימוש באמצעי אחד בלבד של מדיום התרבות, ו טכנאי מנוסה יכול תרבות עד 25 דגימות organoid על בסיס שבועי ואילו לכימותים כ -1,200 נקודות נתונים בשבוע ב -12 דגימות חולות. אנחנו כמקובל הקלידו תנאי ניסוי יחידים על ידי מדידות כפולות או בשלושה עותקים לכל צלחת וחזרו מדידות כאלה בשלוש נקודות זמן דגירה עצמאיות. בסך הכל, כ 300-500 single organoid מבנים אז נמדדים לפי תנאי הניסוי, אשר מוביל מדידות מדויקות מאוד של תפקוד CFTR עם השתנות טכנית מוגבלת. דיוק זה מאפשר לנו להגדיר הבדלים בבהירות בתפקוד שיורית בתגובה מאפננת CFTR ומאפשר לנו להרים אפקטי רקע גנטיים בקלות בין חולי נושאת מוטציות CFTR זהים 19, 22, 23, 24, 25. איכות הנתונים ניתן להעריך בקלות מתמונות מיקרוסקופ. בעוד FIS הוא CFTR תלוי באופן מלא, זה למדידת תוצאה עקיפה לתפקוד CFTR, לקריאה החוצה שלה נגרמת על ידי הצימוד של תחבורת יון לתחבורה נוזלת. זאת לעומת מדידות פונקצית CFTR ישירות בתאי Ussing, אשר מודדות זרמי transepithelial יון 26. תאי Ussing לאפשר הגירוי הנבחר של ג פסגה או basolateralompartments (שבו assay organoid אינו מאפשר); על ידי permeabilizing ממברנות basolateral, הפרשת אניון הפסגה תלויה CFTR ניתן למדוד 27 באופן סלקטיבי.
Protocol
Representative Results
Discussion
כאן, אנו מספקים פרוטוקול מלא ל הדור, הרחבה, הקפאה, הפשרה של organoids הגס האנושי. בעוד הקמנו תרבויות organoid אדם קצת זמן לפני 17, זה לפעמים הוכיח קשה לקבוע את הטכנולוגיה במעבדות אחרות בלי הדרכה מעשית. אנו צופים כי הפרוטוקולים הללו יחליפו הכשרה כזו.
<p class="jove_content" sty…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי תכנית HIT-CF של קרן CF ההולנדית (NCFS), ZonMW (40-00812-98-14103), קרן המחקר החולה וילהלמינה הילדים ו CZ, ו Zilverenkruis / Achmea. ברצוננו להודות ס Heida-מישל, M. Geerdink, KM דה וינטר-דה גרוט, וג 'Berkers (מחלקת ריאות ילדים, ביה"ח של וילהלמינה ילדים, UMC אוטרכט), ו RHJ Houwen (המחלקה לגסטרואנטרולוגיה ילדים, וילהלמינה בית החולים לילדים, אוטרכט UMC) מתקרב החולים מקבלים ביופסיות עבור הדור של Biobank CF.
Materials
| Advanced Dulbecco’s Modified Eagles Medium with Nutrient Mixture F-12 Hams (Ad-DF) 500ml | Thermo Fisher Scientific: Invitrogen | #12634 | stored at 4 °C |
| GlutaMax | Thermo Fisher Scientific: Invitrogen | #35050 | stored at 4 °C |
| Hepes | Thermo Fisher Scientific: Invitrogen | # 15630-056 | stored at 4 °C |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Fisher Scientific: Invitrogen | #15140-122 | stored at -20 °C |
| 96 well culture plate | Cellstar | #655180 | |
| 24 well culture plate | Cellstar | #662160 | |
| 6 well culture plate | Cellstar | #657160 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (-) CaCl2 (-) MgCl2) (DPBS) | Life Technologies: Gibco | #14190-094 | stored at 4 °C |
| Dulbecco’s Modified Eagles Medium (DMEM) 500ml | Thermo Fisher Scientific: Invitrogen | #31966-021 | For Wnt-3A Conditioned Medium Production. Stored at 4 °C |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Bovogen | #SFBS LOT#11113 | For Wnt-3A Conditioned Medium Production. Stored at -20 °C |
| L Wnt3A cell line | ATCC | #CRL-2647 | For Wnt-3A Conditioend Medium Production. |
| TOP/FOP plasmids | Millipore | #17-285 | For measuring Wnt activity |
| pTK-Renilla | Promega | #E2241 | For measuring Wnt activity |
| HEK-293 | ATCC | #CRL-1573 | For measuring Wnt activity |
| Dual-Luciferase Reporter Assay System | Promega | #E1910 | For measuring Wnt activity |
| Zeocin | Thermo Fisher Scientific: Invitrogen | #R250-01 | For Wnt-3A Cell line selection |
| B27 supplement | Thermo Fisher Scientific: Invitrogen | #17504-044 | stored at -20 °C |
| N-Acetylcysteine | Sigma Aldrich | #A9165-5G | stored at -20 °C |
| Nicotinamide | Sigma Aldrich | #N0636 | stored at -20 °C |
| Human Epithelial Growth Factor (hEGF) | PrepoTech | #AF-100-15 | stored at -20 °C |
| Gastrin | Sigma Aldrich | #G9145 | stored at -20 °C |
| TGFb type I Receptor inhibitor (A83-01) | Tocris | #2939 | stored at -20 °C |
| Y-27632 dihydrochloride (RhoKi) | Selleckchem | #S1049 | stored at -20 °C |
| p38 MAPK inhibitor (p38i) (SB202190) | Sigma Aldrich | #S7067 | stored at -20 °C |
| Primocin | InvivoGen | #ant-pm-1 | stored at -20 °C |
| Human Noggin (hNoggin) | PrepoTech | #120-10C | stored at -20 °C |
| Human R-spondin 3 (hRspo-3) | R&D Systems | #3500-RS/CF | stored at -20 °C |
| Vancomycin | Sigma Aldrich | #861987- 250mg | stored at -20 °C |
| Gentamycin | Life Technologies: Gibco | #15710-049 | stored at -20 °C |
| Ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA) | Sigma Aldrich | #431788 | Stored at 4 °C |
| Matrigel | Corning | #354230 | stored at -80 °C |
| TryplE Express | Life Technologies: Gibco | #12605-010 | for trypsinizing organoids for freezing |
| Recovery Cell Culture Freezing Medium | Life Technologies: Gibco | #12648010 | for freezing |
| Calcein | Life Technologies: Gibco | #C3100MP | stored at -20 °C |
| Forskolin | R&D Systems | #1099-50 mg | stored at -80 °C |
| Lumacaftor (VX-809) | Selleckchem | #s1565 | stored at -80 °C |
| Ivacaftor (VX-770) | Selleckchem | #s1144 | stored at -80 °C |
| Name of Reagents/Material | Solvent | Stock Concentration | Final Concentration |
| GlutaMax | 200 mM | 2m M | |
| Hepes | 1 M | 10 mM | |
| Penicillin/Streptomycin | 10K U/ml 10K µg/ml | 100 U/ml 100 µg/ml | |
| Zeocin | 100 mg/ml | 125 µg/ml | |
| B27 supplement | 100 x | 1 x | |
| N-Acetylcysteine | MiliQ H20 | 500 mM | |
| Nicotinamide | DPBS | 1 M | 10 mM |
| Human Epithelial Growth Factor (hEGF) | DPBS 0.1%BSA | 0.5 mg/ml | 50 ng/ml |
| Gastrin | DPBS | 100 µM | 10 nM |
| TGFb type I Receptor inhibitor (A83-01) | DMSO | 5 mM | 500 nM |
| Y-27632 dihydrochloride (RhoKi) | DMSO | 10 mM | 10 µM |
| p38 MAPK inhibitor (p38i) (SB202190) | DMSO | 30 mM | 10 µM |
| Primocin | 50 mg/ml | 100 µg/ml | |
| Human Noggin (hNoggin) | DPBS 0.1%BSA | 100 µg/ml | 100 ng/ml |
| Human R-spondin 3 (hRspo-3) | varies per lot | 300 ng/ml | |
| Vancomycin | 10 mg/ml | 50 µg/ml | |
| Gentamycin | 10 mg/ml | 50 µg/ml | |
| Ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA) | MiliQ H20 | 0.5 M | 2 mM |
| Calcein | DMSO | 10 µg/ml | 3.3 ng/ml |
| Forskolin | DMSO | 10 mM | variable |
| Lumacaftor (VX-809) | DMSO | 20 mM | variable |
| Ivacaftor (VX-770) | DMSO | 20 mM | variable |
References
- De Boeck, K., Amaral, M. D. Progress in therapies for cystic fibrosis. Lancet Respir Med. 4 (8), 662-674 (2016).
- Cutting, G. R. Cystic fibrosis genetics: from molecular understanding to clinical application. Nature Rev Genet. 16 (1), 45-56 (2015).
- Sosnay, P. R., Siklosi, K. R., et al. Defining the disease liability of variants in the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator gene. Nature Genet. 45 (10), 1160-1167 (2013).
- Zielenski, J. Genotype and phenotype in cystic fibrosis. Respiration. 67 (2), 117-133 (2000).
- Van Goor, F., Hadida, S., et al. Rescue of CF airway epithelial cell function in vitro by a CFTR potentiator, VX-770. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 106 (44), 18825-18830 (2009).
- Van Goor, F., Hadida, S., et al. Correction of the F508del-CFTR protein processing defect in vitro by the investigational drug VX-809. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 108 (46), 18843-18848 (2011).
- Accurso, F. J., Rowe, S. M., et al. Effect of VX-770 in persons with cystic fibrosis and the G551D-CFTR mutation. N Engl J Med. 363 (21), 1991-2003 (2010).
- Ramsey, B. W., Davies, J., et al. A CFTR potentiator in patients with cystic fibrosis and the G551D mutation. N Engl J Med. 365 (18), 1663-1672 (2011).
- De Boeck, K., Munck, A., et al. Efficacy and safety of ivacaftor in patients with cystic fibrosis and a non-G551D gating mutation. J Cyst Fibros. 13 (6), 674-680 (2014).
- Boyle, M. P., Bell, S. C., et al. A CFTR corrector (lumacaftor) and a CFTR potentiator (ivacaftor) for treatment of patients with cystic fibrosis who have a phe508del CFTR mutation: a phase 2 randomised controlled trial. Lancet Respir Med. 2 (7), 527-538 (2014).
- Wainwright, C. E., Elborn, J. S., et al. Lumacaftor-Ivacaftor in Patients with Cystic Fibrosis Homozygous for Phe508del CFTR. N Engl J Med. 373 (3), 220-231 (2015).
- Van Goor, F., Yu, H., Burton, B., Hoffman, B. J. Effect of ivacaftor on CFTR forms with missense mutations associated with defects in protein processing or function. J Cyst Fibros. 13 (1), 29-36 (2014).
- Neuberger, T., Burton, B., Clark, H., Van Goor, F. Use of primary cultures of human bronchial epithelial cells isolated from cystic fibrosis patients for the pre-clinical testing of CFTR modulators. Methods Mol Biol. 741, 39-54 (2011).
- Randell, S. H., Fulcher, M. L., O’Neal, W., Olsen, J. C. Primary epithelial cell models for cystic fibrosis research. Methods Mol Biol. 742, 285-310 (2011).
- Karp, P. H., Moninger, T. O., et al. An in vitro model of differentiated human airway epithelia. Methods for establishing primary cultures. Methods Mol Biol. 188, 115-137 (2002).
- Sato, T., Vries, R. G., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Sato, T., Stange, D. E., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett’s epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
- Clevers, H. Modeling development and disease with Organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
- Dekkers, J. F., Wiegerinck, C. L., et al. A functional CFTR assay using primary cystic fibrosis intestinal organoids. Nature Med. 19 (7), 939-945 (2013).
- Dekkers, J. F., van der Ent, C. K., Beekman, J. M. Novel opportunities for CFTR-targeting drug development using organoids. Rare Diseases. 1 (1), e27112 (2014).
- Servidoni, M. F., Sousa, M., et al. Rectal forceps biopsy procedure in cystic fibrosis: technical aspects and patients perspective for clinical trials feasibility. BMC gastroenterology. 13, 91 (2013).
- Ommen, D. D. Z. -. V., Vijftigschild, L. A. W., et al. Limited premature termination codon suppression by read-through agents in cystic fibrosis intestinal organoids. J Cyst Fibros. 15 (2), 158-162 (2016).
- Dekkers, J. F., Gogorza Gondra, R. A., et al. Optimal correction of distinct CFTR folding mutants in rectal cystic fibrosis organoids. Eur Respir J. , (2016).
- Dekkers, J. F., Van Mourik, P., et al. Potentiator synergy in rectal organoids carrying S1251N, G551D, or F508del CFTR mutations. J Cyst Fibros. , (2016).
- Dekkers, J. F., Berkers, G., et al. Characterizing responses to CFTR-modulating drugs using rectal organoids derived from subjects with cystic fibrosis. Sci Transl Med. 8 (344), 344ra84 (2016).
- Li, H., Sheppard, D. N., Hug, M. J. Transepithelial electrical measurements with the Ussing chamber. J Cyst Fibros. 3, 123-126 (2004).
- Sheppard, D. N., Carson, M. R., Ostedgaard, L. S., Denning, G. M., Welsh, M. J. Expression of cystic fibrosis transmembrane conductance regulator in a model epithelium. Am J Physiol. 266 (4 Pt 1), L405-L413 (1994).
- Farin, H. F., van Es, J. H., Clevers, H. Redundant sources of Wnt regulate intestinal stem cells and promote formation of Paneth cells. Gastroenterology. 143 (6), 1518-1529 (2012).
- Drost, J., et al. Organoid culture systems for prostate epithelial and cancer tissue. Nat Protoc. 11 (2), 347-358 (2016).
- Vijftigschild, L. A. W., Berkers, G., et al. β2-adrenergic receptor agonists activate CFTR in organoids and subjects with cystic fibrosis. Eur Respir J. 48 (3), 768-779 (2016).
- Dekkers, R., et al. A bioassay using intestinal organoids to measure CFTR in human plasma. J Cyst Fibros. 14 (2), 178-181 (2015).
- Graeber, S. Y., et al. Intestinal Current Measurements Detect Activation of Mutant CFTR in Patients with Cystic Fibrosis with the G551D Mutation Treated with Ivacaftor. Am J Respir Crit Care Med. 192 (10), 1252-1255 (2015).
- Van Goor, F., et al. Ivacaftor potentiation of multiple CFTR channels with gating mutations. Journal of Cystic Fibrosis: Official Journal of the Eur Cyst Fibrosis. 11 (3), 237-245 (2012).
