Forskolin प्रेरित आंतों में सूजन Organoids: एक<em> इन विट्रो</em> सिस्टिक फाइब्रोसिस रोगियों में दवा प्रतिक्रिया का आकलन करने के लिए परख
Summary
This protocol describes an assay for measuring CFTR function and CFTR modulator responses in cultured tissue from subjects with cystic fibrosis (CF). Biopsy-derived intestinal organoids swell in a cAMP-driven fashion, a response that is defective (or strongly reduced) in CF organoids and can be restored by exposure to CFTR modulators.
Abstract
Recently-developed cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR)-modulating drugs correct surface expression and/or function of the mutant CFTR channel in subjects with cystic fibrosis (CF). Identification of subjects that may benefit from these drugs is challenging because of the extensive heterogeneity of CFTR mutations, as well as other unknown factors that contribute to individual drug efficacy. Here, we describe a simple and relatively rapid assay for measuring individual CFTR function and response to CFTR modulators in vitro. Three dimensional (3D) epithelial organoids are grown from rectal biopsies in standard organoid medium. Once established, the organoids can be bio-banked for future analysis. For the assay, 30-80 organoids are seeded in 96-well plates in basement membrane matrix and are then exposed to drugs. One day later, the organoids are stained with calcein green, and forskolin-induced swelling is monitored by confocal live cell microscopy at 37 °C. Forskolin-induced swelling is fully CFTR-dependent and is sufficiently sensitive and precise to allow for discrimination between the drug responses of individuals with different and even identical CFTR mutations. In vitro swell responses correlate with the clinical response to therapy. This assay provides a cost-effective approach for the identification of drug-responsive individuals, independent of their CFTR mutations. It may also be instrumental in the development of future CFTR modulators.
Introduction
सीएफ सिस्टिक फाइब्रोसिस transmembrane प्रवाहकत्त्व नियामक (CFTR) जीन है कि एक उपकला आयनों चैनल को कूटबद्ध में परिवर्तन के कारण होता है। सीएफ दुनिया भर में 1 लगभग 85,000 लोगों को प्रभावित करता है। 2,000 से अधिक CFTR म्यूटेशन पहचान की गई है ( www.genet.sickkids.on.ca )। यह विविधता आंशिक रूप से मनाया रोग phenotypes (की एक व्यापक स्पेक्ट्रम बताते www.CFTR2.org ) 2, 3। CFTR परिवर्तन के छह वर्गों CFTR प्रोटीन अभिव्यक्ति और समारोह पर उनके प्रभाव के आधार पर परिभाषित कर रहे हैं: (मैं) कोई संश्लेषण, (द्वितीय) बिगड़ा तस्करी, (तृतीय) दोषपूर्ण चैनल gating, (iv) बदल चालकता, (वि) कम सामान्य रूप से का स्तर CFTR कामकाज, और (vi) बिगड़ा कोशिका की सतह स्थिरता 4। हालांकि आम CFTR म्यूटेशन अच्छी तरह से अध्ययन कर रहे हैं, CFTR समारोह और नैदानिक स्थिति के साथ संबंध poorl रहनेवाई, व्यक्ति के स्तर पर समझ में आ विशेष रूप से दुर्लभ "अनाथ" म्यूटेशन (के बड़े समूह के लिए www.CFTR2.org ) 1, 3।
हाल ही में, दवाओं विकसित किया गया है कि एक उत्परिवर्तन विशेष फैशन में CFTR प्रोटीन लक्ष्य। CFTR प्रोटीन को निशाना दवाओं के दो वर्गों नैदानिक प्रयोग में है और कार्रवाई की अलग मोड है। ऐसे VX-770 के रूप में Potentiators, ऊर्ध्वस्थ होते हुए स्थानीय उत्परिवर्ती CFTR की खुली संभावना को बढ़ाने और कोशिकाओं 5 करने के लिए उनके अलावा पर सीधे काम करते हैं। ऐसे VX-809 के रूप में correctors, जालिका-स्थानीय misfolded CFTR की तस्करी को बहाल करने और प्रभाव पहले कोशिकाओं 6 मनाया जाता है के साथ पूर्व ऊष्मायन की आवश्यकता होती है। CFTR potentiator, वीएक्स-770, साथ ही आठ अन्य के लिए के रूप में G551D उत्परिवर्तन 7, 8 के साथ विषयों के लिए पंजीकृत किया गया है,CFTR म्यूटेशन gating, S1251N 9 सहित; साथ में, इन सभी म्यूटेशन सीएफ विषयों के 5% से किया जाता है। अन्य नैदानिक परीक्षण, संकेत दिया है कि VX-770, पढ़नेवाला VX-809 के साथ संयुक्त, फेफड़ों पर अभी तक महत्वपूर्ण प्रभाव सीमित है और विषयों में गहरा दरों में कमी के रोगियों के 10 में से 45-50% द्वारा किए F508del उत्परिवर्तन के लिए homozygous का कारण बनता है 11।
सीएफ रोगियों के शेष 50% के भीतर दवा संवेदनशील विषयों की पहचान करने के लिए परम्परागत क्लिनिकल परीक्षण महंगा है और समय लेने वाली हैं और अत्यंत दुर्लभ CFTR जीनोटाइप के साथ व्यक्तियों के लिए संभव नहीं है। उपन्यास, लागत प्रभावी, व्यक्तिगत तरीकों CFTR उत्परिवर्तन के किसी भी प्रकार को ले जाने के व्यक्तियों के लिए CFTR modulators की बढ़ती संख्या के मैच के लिए महत्वपूर्ण हैं। अब तक, विशिष्ट CFTR म्यूटेशन ले जाने के रोगी समूहों का परीक्षण शामिल किए जाने के ज में उत्परिवर्ती जीन CFTR अभिकर्मक का उपयोग अध्ययन द्वारा निर्देशित किया गया हैeterologous सेल प्रणाली, कक्षों 5, 6, 12 ussing में electrophysiological अध्ययन के द्वारा पीछा किया। पर्याप्त सीएफ पशु मॉडल, हवा तरल इंटरफेस-भेदभाव ब्रोन्कियल उपकला सीएफ फेफड़ों explant सामग्री से ली गई कोशिकाओं में दवा प्रभावकारिता अध्ययन की कमी के कारण दवा के विकास 13, 14, 15 के लिए इस्तेमाल किया गया है। हालांकि, फेफड़ों explant ऊतकों और आक्रामक प्रक्रियाओं की सीमित उपलब्धता अंत मंच रोग के बिना विषयों से ब्रोन्कियल कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए कम आम CFTR म्यूटेशन के विश्लेषण में बाधा और एक व्यक्तिगत फैशन में दवा परीक्षण को रोकने के। इन सीमाओं, ऐसे कोलोरेक्टल organoids, नाक airway कोशिकाओं, और airway कोशिकाओं प्रेरित pluripotent स्टेम कोशिकाओं से व्युत्पन्न के रूप में "आसान पहुँच" ऊतकों, पर काबू पाने के लिए, वर्तमान में व्यक्तिगत दवा उपचार के लिए पता लगाया जा रहा है।
<p class= "jove_content"> इससे पहले, हम संस्कृति उपकला स्टेम कोशिकाओं के लिए प्रोटोकॉल किसी भी जठरांत्र अंग से 3 डी organoids 16, 17 के रूप में स्थापित किया। मानव पेट के / मलाशय के लिए, संस्कृति की स्थिति में परिभाषित शामिल वृद्धि कारक (उपकला ग्रोथ फैक्टर (EGF), Gastrin, wnt -3 ए, आर spondin 3 (Rspo3), और नोगिन) छोटे अणुओं (Nicotinamide, A83-01 के साथ संयुक्त, और SB202190) एक तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स में। इन शर्तों के तहत, एकल स्टेम कोशिकाओं या छोटे ऊतक टुकड़े बंद कर दिया, पित्ताशय, 3 डी अपने बेसल बाहर की ओर उन्मुख ओर से अत्यधिक ध्रुवीकृत उपकला द्वारा गठित संरचनाओं में बाहर हो जाना। सभी प्रकार की कोशिकाओं को आम तौर पर अपने सामान्य अनुपात और स्थितियों में दिखाई देते हैं। Organoids साप्ताहिक यांत्रिक व्यवधान और फिर से चढ़ाना द्वारा लंबे समय अवधि में विस्तार किया जा सकता है। वे आनुवंशिक रूप से और phenotypically स्थिर रहे हैं और, संग्रहित किया जा सकता लंबी अवधि के विस्तार और जैव-बैंकिंग 17 इजाजत दी। वे करने के लिए उत्तरदायी हैंसभी मानक सेल जैविक / आनुवंशिक जोड़तोड़ और विश्लेषणात्मक तकनीकों 2 डी सेल लाइनों 18 के लिए विकसित की है।हमने हाल ही में प्रदर्शन किया है कि CFTR समारोह आसानी से एक forskolin प्रेरित सूजन (वित्तीय संस्थाओं) परख 19, 20 में कोलोरेक्टल organoids में मापा जा सकता है। जब forskolin (FSK) या, वैकल्पिक रूप से, हैजा विष को उजागर करने के लिए, organoids तेजी से, उनके चक्रीय adenosine monophosphate (शिविर) के स्तर में वृद्धि जो CFTR चैनल 19 के उद्घाटन में बारी परिणामों में। Organoids स्वस्थ व्यक्तियों से, या CFTR अवशिष्ट समारोह के साथ जुड़े म्यूटेशन, साथ विषयों से बाद में organoid लुमेन, स्रावी दस्त की इन विट्रो बराबर करने के लिए आयन और जल परिवहन का एक परिणाम के रूप में प्रफुल्लित होगा। कोलोरेक्टल organoids की वित्तीय संस्थाओं की प्रतिक्रिया के रूप में पहले से CFTR अशक्त व्यक्तियों से प्राप्त होता organoids ने संकेत दिया है, पूरी तरह CFTR निर्भर होना दिखाया गया था एकविशिष्ट औषधीय CFTR अवरोधकों 19 के उपयोग से एन डी। बड़े विषय विशेष डेटा सेट एक बायोप्सी लेने के बाद कई हफ्तों के भीतर प्राप्त किया जा सकता है।
विस्तार में यहाँ वर्णित वित्तीय संस्थाओं परख के लिए, organoids गुदा बायोप्सी है कि किसी भी उम्र में और केवल सीमित असुविधा 21 के साथ प्राप्त किया जा सकता से सुसंस्कृत हैं। Organoids एकल तहखाने है कि आसानी से reseal और नए organoids फार्म में यांत्रिक व्यवधान द्वारा साप्ताहिक passaged हैं। वित्तीय संस्थाओं परख चलाने के लिए, ~ इन बाधित थोड़ा organoids के 30-80 एक 96 अच्छी तरह से थाली 19 के प्रत्येक कुएं में चढ़ाया जाता है। परख के दिन में organoids calcein हरे, एक फ्लोरोसेंट सेल पारगम्य डाई कि यह जीवित कोशिकाओं के भीतर बनाए रखा है, लाइव इमेजिंग की सुविधा के साथ दाग रहे हैं। फिर, FSK, जो intracellular शिविर उठाती है और इस तरह CFTR को सक्रिय करता है, आदेश organoid सूजन को प्रोत्साहित करने में जोड़ा जाता है। Potentiators कि शिखर CFTR पर कार्य एक साथ डब्ल्यू जुड़ जाते हैंforskolin ith, correctors कि CFTR की तस्करी बहाल जबकि FSK के अलावा पहले 24 घंटा जोड़ रहे हैं। organoid सूजन एक स्वचालित छवि विश्लेषण कि forskolin अलावा पर हर समय बिंदु के लिए सभी फ्लोरोसेंट वस्तुओं के कुल क्षेत्रफल में रिश्तेदार वृद्धि की गणना के द्वारा मात्रा निर्धारित है।
3 डी organoid सूजन कक्षों ussing में 2 डी सुसंस्कृत एयरवे कोशिकाओं में मौजूदा electrophysiological CFTR readouts से अधिक लाभ और नुकसान है। एक प्रमुख लाभ सूजन परख के throughput है। कोशिकाओं सुसंस्कृत और संस्कृति के माध्यम से एक ही प्रकार का उपयोग कर यत्न कर रहे हैं, और एक अनुभवी तकनीशियन एक साप्ताहिक आधार पर 25 organoid नमूनों को संस्कृति, जबकि 12 मरीज के नमूनों में प्रति सप्ताह लगभग 1,200 डेटा बिंदुओं बढ़ाता कर सकते हैं। हम पारंपरिक प्रति प्लेट डुप्लिकेट या तीन प्रतियों माप द्वारा एक एकल प्रायोगिक हालत टाइप करें और तीन स्वतंत्र ऊष्मायन समय बिंदुओं पर इस तरह के मापन दोहराएँ। कुल में, लगभग 300-500 रोंचिमनी organoid संरचनाओं तो प्रयोगात्मक हालत है, जो सीमित तकनीकी परिवर्तनशीलता के साथ CFTR समारोह की बहुत सटीक मापन करने के लिए सुराग के अनुसार मापा जाता है। इस सटीक हमें स्पष्ट रूप से CFTR modulators को अवशिष्ट समारोह और जवाब में मतभेद को परिभाषित करने की अनुमति देता है और हमें की अनुमति देता है आसानी से समान CFTR म्यूटेशन 19, 22, 23, 24, 25 को ले जाने के मरीजों के बीच आनुवंशिक पृष्ठभूमि प्रभाव लेने के लिए। डेटा की गुणवत्ता आसानी से माइक्रोस्कोप छवियों से मूल्यांकन किया जा सकता है। जबकि वित्तीय संस्थाओं को पूरी तरह से CFTR पर निर्भर है, यह CFTR समारोह के लिए एक अप्रत्यक्ष परिणाम उपाय है, तरल पदार्थ परिवहन के लिए आयन परिवहन के युग्मन की वजह से इसकी पढ़ने के लिए बाहर। इस ussing कक्षों में प्रत्यक्ष CFTR समारोह माप, जो transepithelial आयन धाराओं 26 को मापने के साथ विरोधाभासों। Ussing कक्षों शिखर या basolateral सी का चयन करें उत्तेजना की अनुमति देते हैंompartments (जो organoid परख की अनुमति नहीं है); basolateral झिल्ली permeabilizing द्वारा, शिखर CFTR निर्भर आयनों स्राव चुनिंदा 27 मापा जा सकता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
यहाँ, हम पीढ़ी, विस्तार, ठंड, और मानव कोलोरेक्टल organoids का विगलन के लिए एक पूर्ण प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं। हम मानव organoid संस्कृतियों कुछ समय पहले 17 की स्थापना की है, वहीं यह कभी कभी हाथों पर प्रशिक्ष?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम डच सीएफ फाउंडेशन (NCFS), ZonMW (40-00812-98-14103), Wilhelmina बच्चों के अस्पताल रिसर्च फंड और जेड, और Zilverenkruis / Achmea की हिट-CF कार्यक्रम के द्वारा समर्थित किया गया। हम शुक्रिया अदा करने के एस Heida मिशेल, एम Geerdink, के.एम. डी सर्दी-de Groot, और जी Berkers (बाल चिकित्सा Pulmonology, Wilhelmina बच्चों के अस्पताल, यूएमसी एम्सटर्डम विभाग), और RHJ Houwen (बाल चिकित्सा गैस्ट्रोएंटरोलॉजी, Wilhelmina विभाग चाहते हैं बच्चों के अस्पताल, यूएमसी यूट्रेक्ट) रोगियों आ रहा है और एक CF Biobank की पीढ़ी के लिए बायोप्सी प्राप्त करने के लिए।
Materials
| Advanced Dulbecco’s Modified Eagles Medium with Nutrient Mixture F-12 Hams (Ad-DF) 500ml | Thermo Fisher Scientific: Invitrogen | #12634 | stored at 4 °C |
| GlutaMax | Thermo Fisher Scientific: Invitrogen | #35050 | stored at 4 °C |
| Hepes | Thermo Fisher Scientific: Invitrogen | # 15630-056 | stored at 4 °C |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Fisher Scientific: Invitrogen | #15140-122 | stored at -20 °C |
| 96 well culture plate | Cellstar | #655180 | |
| 24 well culture plate | Cellstar | #662160 | |
| 6 well culture plate | Cellstar | #657160 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (-) CaCl2 (-) MgCl2) (DPBS) | Life Technologies: Gibco | #14190-094 | stored at 4 °C |
| Dulbecco’s Modified Eagles Medium (DMEM) 500ml | Thermo Fisher Scientific: Invitrogen | #31966-021 | For Wnt-3A Conditioned Medium Production. Stored at 4 °C |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Bovogen | #SFBS LOT#11113 | For Wnt-3A Conditioned Medium Production. Stored at -20 °C |
| L Wnt3A cell line | ATCC | #CRL-2647 | For Wnt-3A Conditioend Medium Production. |
| TOP/FOP plasmids | Millipore | #17-285 | For measuring Wnt activity |
| pTK-Renilla | Promega | #E2241 | For measuring Wnt activity |
| HEK-293 | ATCC | #CRL-1573 | For measuring Wnt activity |
| Dual-Luciferase Reporter Assay System | Promega | #E1910 | For measuring Wnt activity |
| Zeocin | Thermo Fisher Scientific: Invitrogen | #R250-01 | For Wnt-3A Cell line selection |
| B27 supplement | Thermo Fisher Scientific: Invitrogen | #17504-044 | stored at -20 °C |
| N-Acetylcysteine | Sigma Aldrich | #A9165-5G | stored at -20 °C |
| Nicotinamide | Sigma Aldrich | #N0636 | stored at -20 °C |
| Human Epithelial Growth Factor (hEGF) | PrepoTech | #AF-100-15 | stored at -20 °C |
| Gastrin | Sigma Aldrich | #G9145 | stored at -20 °C |
| TGFb type I Receptor inhibitor (A83-01) | Tocris | #2939 | stored at -20 °C |
| Y-27632 dihydrochloride (RhoKi) | Selleckchem | #S1049 | stored at -20 °C |
| p38 MAPK inhibitor (p38i) (SB202190) | Sigma Aldrich | #S7067 | stored at -20 °C |
| Primocin | InvivoGen | #ant-pm-1 | stored at -20 °C |
| Human Noggin (hNoggin) | PrepoTech | #120-10C | stored at -20 °C |
| Human R-spondin 3 (hRspo-3) | R&D Systems | #3500-RS/CF | stored at -20 °C |
| Vancomycin | Sigma Aldrich | #861987- 250mg | stored at -20 °C |
| Gentamycin | Life Technologies: Gibco | #15710-049 | stored at -20 °C |
| Ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA) | Sigma Aldrich | #431788 | Stored at 4 °C |
| Matrigel | Corning | #354230 | stored at -80 °C |
| TryplE Express | Life Technologies: Gibco | #12605-010 | for trypsinizing organoids for freezing |
| Recovery Cell Culture Freezing Medium | Life Technologies: Gibco | #12648010 | for freezing |
| Calcein | Life Technologies: Gibco | #C3100MP | stored at -20 °C |
| Forskolin | R&D Systems | #1099-50 mg | stored at -80 °C |
| Lumacaftor (VX-809) | Selleckchem | #s1565 | stored at -80 °C |
| Ivacaftor (VX-770) | Selleckchem | #s1144 | stored at -80 °C |
| Name of Reagents/Material | Solvent | Stock Concentration | Final Concentration |
| GlutaMax | 200 mM | 2m M | |
| Hepes | 1 M | 10 mM | |
| Penicillin/Streptomycin | 10K U/ml 10K µg/ml | 100 U/ml 100 µg/ml | |
| Zeocin | 100 mg/ml | 125 µg/ml | |
| B27 supplement | 100 x | 1 x | |
| N-Acetylcysteine | MiliQ H20 | 500 mM | |
| Nicotinamide | DPBS | 1 M | 10 mM |
| Human Epithelial Growth Factor (hEGF) | DPBS 0.1%BSA | 0.5 mg/ml | 50 ng/ml |
| Gastrin | DPBS | 100 µM | 10 nM |
| TGFb type I Receptor inhibitor (A83-01) | DMSO | 5 mM | 500 nM |
| Y-27632 dihydrochloride (RhoKi) | DMSO | 10 mM | 10 µM |
| p38 MAPK inhibitor (p38i) (SB202190) | DMSO | 30 mM | 10 µM |
| Primocin | 50 mg/ml | 100 µg/ml | |
| Human Noggin (hNoggin) | DPBS 0.1%BSA | 100 µg/ml | 100 ng/ml |
| Human R-spondin 3 (hRspo-3) | varies per lot | 300 ng/ml | |
| Vancomycin | 10 mg/ml | 50 µg/ml | |
| Gentamycin | 10 mg/ml | 50 µg/ml | |
| Ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA) | MiliQ H20 | 0.5 M | 2 mM |
| Calcein | DMSO | 10 µg/ml | 3.3 ng/ml |
| Forskolin | DMSO | 10 mM | variable |
| Lumacaftor (VX-809) | DMSO | 20 mM | variable |
| Ivacaftor (VX-770) | DMSO | 20 mM | variable |
References
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