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Genetics

एकाधिक प्रतिदीप्ति द्वारा इंटर-गुणसूत्र स्थिर aberrations की जांच doi: 10.3791/55162 Published: January 11, 2017

Protocol

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सभी जानवरों के अध्ययन की देखभाल और स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों की प्रयोगशाला पशु के उपयोग के लिए गाइड में सिफारिशों के साथ सख्त अनुसार किए गए। पशु प्रोटोकॉल मेडिकल साइंसेज के लिए अर्कांसस विश्वविद्यालय की संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था। ताजा हवा और मानक कृंतक भोजन और पानी के लिए स्वतंत्र पहुँच के 15 प्रति घंटा चक्र - सभी जानवरों 10 के साथ 20 ± 2 डिग्री सेल्सियस पर मानक वातानुकूलित जानवरों की सुविधा के तहत रखे गए थे। आगमन पर, चूहों 1 सप्ताह के लिए संगरोध में आयोजित किया है और प्रमाणित कृंतक चाउ प्रदान किया गया।

1.Radiation एक्सपोजर और मेटाफ़ेज़ प्रकोष्ठों के विवो गिरफ्तारी में

  1. बेनकाब एक विकिरण कक्ष में 2 Gy पूरे शरीर विकिरण करने के लिए संयुक्त राष्ट्र के anesthetized चूहों। विकिरण के दौरान, एक अच्छी तरह हवादार होल्डिंग कक्ष में जगह चूहों यकीन है कि वे आसानी से ले जाने नहीं करते हैं और एक समान खुराक प्राप्त करने के लिए।
  2. 0.05% colchicine समाधान के 100 μL इंजेक्षन (गolchicine पाउडर कैल्शियम और मैग्नीशियम मुक्त पीबीएस में भंग) intraperitoneally एक 25 जी सुई 1 एमएल डिस्पोजेबल सिरिंज के साथ संलग्न इस्तेमाल करते हैं। इंजेक्शन किसी भी अंग में सीधे से बचें।
  3. अस्थि मज्जा सेल फसल से पहले 2 घंटे के लिए पिंजरे में पशु छोड़ दें। दर्द या संकट के किसी भी लक्षण के लिए पशु पालन।

2. अस्थि मज्जा सेल हार्वेस्ट और घनत्व ढाल centrifugation द्वारा अस्थि मज्जा कोशिकाओं mononuclear का अलगाव

  1. सीओ 2 asphyxiation द्वारा माउस euthanize।
  2. पृष्ठीय और उदर पक्ष पर 70% इथेनॉल स्प्रे।
  3. तेज कैंची के साथ पेट की त्वचा पर एक 2 सेमी चीरा। कुंद चिमटी के साथ चीरा के दोनों तरफ त्वचा समझ और धीरे पेट की मांसपेशियों को खोलने खींच।
  4. दोनों कैंची से पिछले पैरों कट और तुरंत 4% FBS के साथ पूर्व ठंडा पीबीएस में उन्हें जगह है।
  5. ध्यान से सभी की मांसपेशियों को एक तेज razorblade और कपास धुंध पट्टी के साथ हिंद अंग से जुड़ी साफ।
  6. फीमर से टिबिया के अलग करें। एक razorblade के साथ प्रत्येक हड्डी के दोनों सुझावों के ट्रिम।
  7. 3 एमएल पीबीएस (4% FBS के साथ) के साथ अस्थि मज्जा की सामग्री को एक 23 जी सुई एक 3 एमएल सिरिंज से जुड़ी का उपयोग कर फ्लश और एक 15 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब में सामग्री इकट्ठा। सुई के माध्यम से सेल निलंबन दर्रे पर कम से कम 10 बार एक ही सेल निलंबन बनाने के लिए।
  8. ध्यान से सेल निलंबन और लिम्फोसाइट जुदाई मध्यम बीच इंटरफेस के बिना परेशान लिम्फोसाइट जुदाई मध्यम (3 एमएल) के एक बराबर मात्रा पर सेल निलंबन उपरिशायी। कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए 400 XG पर अपकेंद्रित्र।
  9. एक नया 15 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब में अन्य परतों और हस्तांतरण के बिना परेशान ध्यान बफी कोट ले लीजिए।

3. मेटाफ़ेज़ सेल फैलता तैयारी

  1. बफी कोट युक्त ट्यूब के लिए 10 एमएल पीबीएस जोड़ें।
  2. कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 400 XG पर अपकेंद्रित्र।
  3. ध्यान से सतह पर तैरनेवाला हटा दें। तो टी को तोड़नेवह कोमल दोहन के साथ गोली सेल और 10 एमएल पीबीएस जोड़ें।
  4. कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 400 XG पर अपकेंद्रित्र।
  5. सेल गोली परेशान बिना सतह पर तैरनेवाला निकालें, गोली को तोड़ने, और पूर्व गर्म hypotonic 0.075 एम पोटेशियम क्लोराइड समाधान के 4 एमएल जोड़ने। कोमल लगातार झटकों के साथ ड्रॉप द्वारा hypotonic समाधान बूंद जोड़ें।
  6. एक पानी के स्नान में 37 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए कोशिकाओं को सेते हैं।
  7. (: हिमनदों एसिटिक एसिड, 3: मेथनॉल 1 वी / वी) hypotonic उपचार के बाद, लगानेवाला के एक बराबर मात्रा (4 एमएल) जोड़ने के 15 एमएल ट्यूब में और ट्यूब inverting द्वारा धीरे मिश्रण।
  8. कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 400 XG पर अपकेंद्रित्र और सतह पर तैरनेवाला त्यागें।
  9. कुछ सेकंड के लिए कोमल भंवर से पीछा दोहन के साथ सेल गोली तोड़ने के लिए और लगातार झटकों के साथ ड्रॉप द्वारा ड्रॉप लगानेवाला समाधान के 3 मिलीलीटर जोड़ें।
  10. कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए सेते हैं और फिर 5 मिनट के लिए 400 XG पर अपकेंद्रित्र।
  11. सतह पर तैरनेवाला निकालें, सज्जन के साथ सेल गोली को तोड़नेLe दोहन, और 3 एमएल ताजा लगानेवाला जोड़ें।
  12. कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 400 XG पर अपकेंद्रित्र, और सतह पर तैरनेवाला हटा दें। कोमल दोहन के साथ सेल गोली को तोड़ने, और ताजा 3 एमएल लगानेवाला जोड़ें।
  13. दोहराएँ कदम 3.12 दो बार अधिक।
  14. कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 400 XG पर अपकेंद्रित्र, और सेल गोली परेशान बिना सतह पर तैरनेवाला हटा दें। तब 600 μL लगानेवाला करने के लिए 400 जोड़ने और pipetting के साथ अच्छी तरह मिला लें।
  15. एक 45 डिग्री के कोण पर झुका पूर्व साफ और गीला स्लाइड पर तय कोशिकाओं गिरा 30 μL और शुष्क हवा की स्लाइड पूरी तरह से रात भर देते हैं।

mFISH द्वारा 4. माउस क्रोमोजोम चित्रकारी

  1. क्रोमोजोम विकृतीकरण
    1. कमरे के तापमान पर 2 मिनट के लिए 2x एसएससी में metaphase सेल फैलता युक्त स्लाइड रखें।
    2. 70% में 2 मिनट प्रत्येक, 80%, और 100% के लिए धारावाहिक इथेनॉल धोने से स्लाइड निर्जलीकरण। 65 डिग्री सेल्सियस पर 60 मिनट के लिए सेते हैं।
    3. पहले से गरम 40 एमएल विकृतीकरण समाधान (70% formamide / 2x एसएससी; 30 मिनट के लिए एक गिलास Coplin जार में पीएच 7.0) 70 डिग्री सेल्सियस (± 2 डिग्री सेल्सियस)। 1.5 मिनट - 1 के लिए पूर्व गर्म विकृतीकरण समाधान में स्लाइड incubating द्वारा गुणसूत्रों denature।
    4. ठंडा 70% इथेनॉल में तुरंत स्लाइड 2 मिनट विकृतीकरण प्रक्रिया को रोकने के लिए और साथ ही फिर से annealing से विकृत गुणसूत्रों को रोकने के लिए बुझा लेते हैं। फिर 2 मिनट के लिए 80% इथेनॉल के साथ धोने से निर्जलीकरण। 2 मिनट के लिए 100% इथेनॉल के साथ इथेनॉल धोने दोहराएँ। पूरी तरह से कमरे के तापमान पर स्लाइड सूखी।
  2. विकृतीकरण और जांच मिश्रण के संकरण
    1. संक्षेप में जांच मिश्रण निर्माता द्वारा आपूर्ति अपकेंद्रित्र, जांच मिश्रण के 10 μL एक 500 μL में 80 डिग्री सेल्सियस (± 2 डिग्री सेल्सियस) पर एक पानी के स्नान में 7 मिनट के लिए हस्तांतरण तस्वीर टोपी अपकेंद्रित्र ट्यूब, और ऊष्मायन से denature।
    2. 10 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर एक पानी के स्नान में जांच के मिश्रण के साथ अपकेंद्रित्र ट्यूब रखें।
    3. विकृत chromoso साथ स्लाइड पर विकृत जांच मिश्रण लागू करेंएमईएस।
    4. ध्यान से एक 18 मिमी x 18 मिमी गिलास को कवर पर्ची के साथ क्षेत्र को कवर किया और बहुत धीरे कवर पर्ची स्लाइड करने के लिए दबाकर किसी भी दृश्य हवा के बुलबुले को खत्म करने। रबर सीमेंट के साथ कवर पर्ची के सभी चार पक्षों को सील करने और संकरण के लिए एक humidified कक्ष में 37 डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे में 16 घंटे के लिए 12 घंटे के लिए सेते हैं।
  3. पोस्ट संकरण धोने और जांच
    1. ध्यान से रबर सीमेंट और कवर पर्ची निकाल दें।
    2. 5 मिनट के लिए 74 डिग्री सेल्सियस (± 2 डिग्री सेल्सियस) पर पूर्व गर्म 0.4x एसएससी में रखें स्लाइड।
    3. धोने के समाधान द्वितीय (4x एसएससी / 0.1% बीच 20) 2 मिनट के लिए में धो स्लाइड।
    4. 20 μL DAPI counterstain (1.5 माइक्रोग्राम / एमएल) के साथ विरोधी फीका बढ़ते मध्यम की जगह और एक गिलास coverslip के साथ कवर। हवा के बुलबुले और अतिरिक्त बढ़ते समाधान निकालने के लिए धीरे प्रयोगशाला ऊतक के साथ coverslip पर प्रेस। नेल पॉलिश के साथ coverslip के किनारों को सील।
    5. स्लाइड दृश्य एक फ्लोरोसेंट उपयुक्त फिल्टर से लैस माइक्रोस्कोप का उपयोग।

    5. स्पेक्ट्रल Karyotyping माउस गुणसूत्रों की (आकाश)

    1. क्रोमोजोम और जांच विकृतीकरण
      1. 2 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर 2x एसएससी में स्लाइड संतुलित करना, मिलाते हुए बिना।
      2. 2 कमरे के तापमान पर प्रत्येक मिनट के लिए (100% इथेनॉल के 70%, 80%, और) एक इथेनॉल श्रृंखला में स्लाइड निर्जलीकरण। पूरी तरह से इथेनॉल दूर करने के लिए स्लाइड हवा शुष्क।
      3. गर्म 40 एमएल विकृतीकरण समाधान (70% formamide / 2x एसएससी, 7.0 पीएच) 30 मिनट के लिए एक गिलास Coplin जार में।
      4. 1 से 1.5 मिनट के लिए पूर्व गर्म विकृतीकरण समाधान में स्लाइड सेते हैं।
      5. इसके तत्काल बाद 2 मिनट विकृतीकरण प्रक्रिया को रोकने के लिए और साथ ही फिर से annealing से विकृत गुणसूत्रों को रोकने के लिए ठंडा 70% इथेनॉल में स्लाइड विसर्जित कर दिया।
      6. यह 80% इथेनॉल में कमरे के तापमान पर 2 मिनट के लिए 100% इथेनॉल में 2 मिनट के लिए रखने और फिर से स्लाइड निर्जलीकरण।
      7. एक पानी के स्नान में 80 डिग्री सेल्सियस (± 2 डिग्री सेल्सियस) के लिए सेट में आकाश जांच (शीशी # 1 निर्माता द्वारा आपूर्ति) denature7 मिनट के लिए, और फिर तुरंत एक अलग नहाने के पानी में 10 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस के लिए सेट में जगह है।
    2. जांच संकरण
      1. विकृत स्काई जांच के 10 μL विकृत गुणसूत्रों पर जोड़ें।
      2. ध्यान से स्काई जांच पर एक 18 मिमी x 18 मिमी गिलास coverslip इतनी जगह है कि कोई हवाई बुलबुले coverslip के तहत फंस रहे हैं।
      3. रबर सीमेंट के साथ coverslip के किनारों को सील।
      4. एक humidified lightproof कक्ष में स्लाइड प्लेस और 36 घंटे के लिए 24 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे में सेते हैं।
    3. पोस्ट-संकरण धोने और प्रतिदीप्ति पता लगाने
      1. रबर सीमेंट हटाये बहुत ध्यान से coverslip परेशान करने के बिना।
      2. लगातार झटकों के साथ 5 मिनट के लिए 72 डिग्री सेल्सियस (± 2 डिग्री सेल्सियस) पर पूर्व गर्म तेजी से धोने के समाधान (0.4x एसएससी) में स्लाइड रखें। धोने के समाधान तृतीय (4x एसएससी / 0.1% बीच 20) में स्लाइड को विसर्जित कर दिया और 1 मिनट के लिए सेते हैं, जबकि मिलाते हुए।
      3. वैकल्पिक: अवरुद्ध अभिकर्मक के 80 μL जोड़े(शीशी # 2 निर्माता द्वारा आपूर्ति) संकरण के क्षेत्र पर, एक 24 मिमी x 60 मिमी प्लास्टिक coverslip जगह है, और एक humidified कक्ष में 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे में सेते हैं।
      4. धीरे प्लास्टिक coverslip हटाने और 5 मिनट के लिए पूर्व गर्म (45 डिग्री सेल्सियस) धोने के समाधान III के साथ स्लाइड धो लें।
      5. लागू 80 Cy5 की μL धुंधला अभिकर्मक (शीशी # 3 निर्माता द्वारा आपूर्ति), एक 24 मिमी x 60 मिमी प्लास्टिक coverslip जगह है, और एक humidified कक्ष में 40 मिनट के लिए अंधेरे में 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
      6. एक गिलास Coplin युक्त जार में स्लाइड डुबकी पूर्व गर्म (45 डिग्री सेल्सियस) धोने के समाधान तृतीय (4x एसएससी / 0.1% बीच 20) और झटकों के साथ 2 मिनट के लिए एक पानी के स्नान में 45 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं। इस धोने कदम दोहराएँ 3 बार।
      7. लागू 80 Cy5.5 की μL धुंधला अभिकर्मक (शीशी # 4 निर्माता द्वारा आपूर्ति), एक 24 मिमी x 60 मिमी प्लास्टिक coverslip जगह है, और एक humidified कक्ष में 40 मिनट के लिए अंधेरे में 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
      8. पूर्व गर्म के साथ स्लाइड 3 बार धोएं (45 डिग्री सेल्सियस) धोने के समाधान तृतीय।
      9. एक कागज तौलिया के खिलाफ एक झुका स्थिति अधिक तरल पदार्थ के निकास के लिए स्लाइड में पकड़ो। 20 μL विरोधी फीका DAPI अभिकर्मक (शीशी # 5 निर्माता द्वारा आपूर्ति) जोड़ें और ध्यान से किसी भी हवाई बुलबुले को शुरू करने के बिना एक 24 मिमी x 60 मिमी कांच coverslip जगह। नेल पॉलिश के साथ coverslip के किनारों को सील करने और एक epifluorescence आसमान छवियों पर कब्जा करने के लिए सुसज्जित खुर्दबीन के साथ निरीक्षण करते हैं।

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Representative Results

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कुल शरीर विकिरण विकिरणित चूहों की अस्थि मज्जा कोशिकाओं में कई गुणसूत्र aberrations लाती है। वर्तमान प्रोटोकॉल विकिरण जोखिम के बाद अस्थि मज्जा की कोशिकाओं के vivo mitotic गिरफ्तारी के लिए अनुकूलित है, घनत्व ढाल centrifugation, metaphase सेल फैलता की तैयारी, और बाद से विकिरणित चूहों, अस्थि मज्जा कोशिकाओं mononuclear के अलगाव के पिछले पैरों से अस्थि मज्जा की कोशिकाओं की फसल mFISH और स्काई तकनीक से विकिरण प्रेरित स्थिर गुणसूत्र aberrations का पता लगाने। क्रोमोजोम का उपयोग कर इन तकनीकों का पता लगाने और विभिन्न pathophysiological शर्तों के जोखिम का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता पेंटिंग।

चित्रा 1 प्रतिनिधि metaphase सेल सामान्य और न्यायपालिका माउस गुणसूत्र जोड़े -1, -2, और -3 के साथ फैलता है पता चलता है। चित्रा 2 सामान्य और असामान्य माउस metaphase गुणसूत्रों के वर्णक्रम karyotyping पता चलता है।ये परिणाम है कि विकिरण के प्रसार murine अस्थि मज्जा कोशिकाओं है, जो मुख्य रूप से स्टेम और पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं है कि आत्म नवीकरण और विविध प्रकार की कोशिकाओं में भेदभाव के लिए जिम्मेदार हैं के शामिल है में अंतर-गुणसूत्र स्थिर aberrations लाती दिखा। स्टेम और पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं में Cytogenetic परिवर्तन कैंसर सहित विभिन्न नैदानिक ​​रोग, के साथ संबद्ध करने के लिए दिखाया गया है, और रोग की गंभीरता और समग्र अस्तित्व के लिए सबसे मजबूत भविष्यवक्ताओं माना जाता है। इसलिए, यह अनुमान है कि विकिरण प्रेरित स्थिर अंतर-गुणसूत्र aberrations कैंसर के विकास का खतरा बढ़ कारण हो सकता है तार्किक है।

आकृति 1
चित्रा 1: एक विकिरणित माउस की अस्थि मज्जा की कोशिकाओं पर विकिरण के प्रभाव के रूप में mFISH द्वारा पता लगाया। और बी चर्चा के सामान्य जोड़े के साथ एक माउस metaphase सेल प्रसार दिखानेromosome-1 (लाल), गुणसूत्र -2 (हरा), और गुणसूत्र-3 (एक्वा)। अन्य सभी गुणसूत्रों DAPI (नीला) के साथ counterstained रहे हैं। सी स्थिर शामिल गुणसूत्र-1, गुणसूत्र -1 का एक हिस्सा है, एक गैर चित्रित (DAPI) गुणसूत्र में एकीकृत किया गया है, जबकि एक अन्य हिस्सा एक acentric टुकड़ा का गठन किया है विपथन से पता चलता है। डी चलता गुणसूत्र-2 के एक भाग का एक हिस्सा गैर चित्रित गुणसूत्र में एकीकृत किया गया है। स्थिर गुणसूत्र -3 को शामिल विपथन का प्रतिनिधित्व करता है। एफ एक स्थिर सभी तीन चित्रित गुणसूत्रों को शामिल विपथन से पता चलता है। ब्रेक प्वाइंट और रंग जंक्शनों तीर द्वारा संकेत कर रहे हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2: अस्थि Marr पर विकिरण के प्रभावविकिरणित माउस की ओउ प्रकोष्ठों के रूप में आकाश से पता लगाया। ऊपरी पैनल C57BL / 6 महिला माउस के एक सामान्य वर्णक्रम karyotyping (आकाश) से पता चलता है। मध्यम पैनल एक स्थिर गुणसूत्र-4 और गुणसूत्र-12 से जुड़े विपथन से पता चलता है। कम पैनल गुणसूत्र-7 और गुणसूत्र-10 से जुड़े एक स्थिर गुणसूत्र विपथन के साथ माउस वर्णक्रम karyotyping पता चलता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Formamide Sigma-Aldrich 221198-100ML
SSC Buffer 20× Concentrate Sigma-Aldrich S6639-1L
SKY Laboratory Reagent for Mouse Applied Spectral Imaging FPRPR0030/M40
CAD - Concentrated Antibody Detection Kit Applied Spectral Imaging FPRPR0033
Single Paints Customized - 3 Colors; Mouse chromosome 1: Red, Mouse chromosome 2: Green, Mouse chromosome 3: Aqua Applied Spectral Imaging FPRPR0182/10
Glass coverslips Fisher Scientific 12-545B
Tween 20 Fisher Scientific BP337-100
Hydrochloric acid, 37%, Acros Organics Fisher Scientific AC45055-0025 
Fisherbrand Glass Staining Dishes  with Screw Cap Fisher Scientific 08-816
KaryoMAX Potassium Chloride Solution  Life Technologies 10575-090
Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides Fisher Scientific 12-550-15
Colcemid powder Fisher Scientific 50-464-757 
Histopaque-1083  Sigma-Aldrich 10831
Shepherd Mark I, model 25 137Cs irradiator J. L. Shepherd & Associates Model 484B
Syringe 1 mL BD Biosciences 647911
Ethyl Alcohol, 200 Proof Fisher Scientific MEX02761
PBS, (1x PBS Liq.), w/o Calcium and Magnesium Fisher Scientific ICN1860454
Fetal Bovine Serum Fisher Scientific 10-437-010
Methanol Fisher Scientific A454SK-4
Glacial acetic acid Fisher Scientific AC295320010
Zeiss Microscope Zeiss AXIO Imager.Z2

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References

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एकाधिक प्रतिदीप्ति द्वारा इंटर-गुणसूत्र स्थिर aberrations की जांच<em&gt; बगल में</em&gt; संकरण (mFISH) और विकिरणित चूहे में स्पेक्ट्रल Karyotyping (आकाश)
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Pathak, R., Koturbash, I., Hauer-Jensen, M. Detection of Inter-chromosomal Stable Aberrations by Multiple Fluorescence In Situ Hybridization (mFISH) and Spectral Karyotyping (SKY) in Irradiated Mice. J. Vis. Exp. (119), e55162, doi:10.3791/55162 (2017).More

Pathak, R., Koturbash, I., Hauer-Jensen, M. Detection of Inter-chromosomal Stable Aberrations by Multiple Fluorescence In Situ Hybridization (mFISH) and Spectral Karyotyping (SKY) in Irradiated Mice. J. Vis. Exp. (119), e55162, doi:10.3791/55162 (2017).

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