Protocol
すべての動物実験は、国立衛生研究所の実験動物の管理と使用に関するガイドの推奨事項に厳密に従って実施しました。動物プロトコルは、アーカンソー医科大学の施設内動物管理使用委員会によって承認されました。新鮮な空気と、標準的なげっ歯類の餌と水に自由にアクセスの15時間ごとのサイクル - すべての動物は、10と20±2℃で、標準的なエアコン付きの動物施設で飼育されました。到着すると、マウスを1週間検疫で開催されたと認定齧歯動物食を提供しました。
1.Radiation曝露と中期細胞のインビボ逮捕で
- 照射室で2 Gyの全身照射に非麻酔したマウスを公開します。照射中、彼らは自由に移動し、均一な線量を受けていないことを確認する風通しのよい保持室にマウスを置きます。
- 0.05％コルヒチン溶液100μLを注入（C腹腔内に1mlの使い捨て注射器を取り付けた25 G針を使用して、カルシウム及びマグネシウムを含まないPBSに溶解olchicine粉末）。任意の器官に直接注入は避けてください。
- 骨髄細胞の収穫前に2時間ケージに動物を残します。痛みや苦痛の徴候のために動物を観察します。
2.骨髄細胞収穫と密度勾配遠心分離により骨髄単核細胞の単離
- CO 2窒息によりマウスを安楽死させます。
- 背と腹側の70％エタノールをスプレーします。
- 鋭いハサミで腹部皮膚上の2cmの切開を行います。鈍ピンセットで切開部の両側に皮膚をつかみ、ゆっくりと腹筋を開き引き出します。
- ハサミで後ろ足の両方を切断し、すぐに4％のFBSを予め冷却PBSでそれらを置きます。
- 慎重に鋭いカミソリの刃と綿ガーゼ包帯で後肢に接続されているすべての筋肉を清掃してください。
- 大腿骨から脛骨を区切ります。カミソリの刃でそれぞれの骨の両方の先端をトリミング。
- 3 mLシリンジに取り付けた23 Gの針を用いて（4％FBSを含む）3 mLのPBSで骨髄の内容をフラッシュし、15 mL遠心チューブ内のコンテンツを収集します。単一細胞懸濁液を作製するために針を通して細胞懸濁液を少なくとも10回通過します。
- 細胞懸濁液と、リンパ球分離媒体との間の界面を乱すことなく、リンパ球分離媒体（3 mL）を等量の細胞懸濁液を慎重に重なります。室温で30分間、400×gで遠心分離します。
- 新しい15 mL遠心管に他の層と転送を乱すことなく、慎重にバフィーコートを収集します。
中期細胞スプレッドの調製
- バフィーコートを含むチューブに10 mLのPBSを追加します。
- 室温で5分間、400×gで遠心分離します。
- 上清を注意深く取り除きます。その後、トンを破ります彼は穏やかなタッピングでペレットをセルと10 mLのPBSを追加します。
- 室温で5分間、400×gで遠心分離します。
- 、細胞ペレットを乱すことなく上清を除去し、ペレットを分割し、予め温めた低張0.075 M塩化カリウム溶液の4 mLを加え。穏やか一定に振盪しながら降下により低張液滴を追加します。
- 水浴中で37℃で20分間細胞をインキュベートします。
- （：氷酢酸、3：メタノール1 v / v）を低張処理した後、固定液の等量（4 ml）を追加し15 mLチューブにおいて、チューブを反転させることにより穏やかに混合します。
- 室温で5分間、400×gで遠心分離し、上清を捨てます。
- 数秒間穏やかにボルテックス続いタッピングして細胞ペレットを破砕し、一定に振盪しながら降下により固定液滴の3ミリリットルを追加します。
- 室温で30分間インキュベートし、次いで5分間400×gで遠心します。
- 、上清を除去ゲントで細胞ペレットを破りますルは、タッピング、および3 mLの新鮮な固定液を追加します。
- 室温で5分間、400×gで遠心分離し、上清を除去します。穏やかなタッピングで細胞ペレットを破壊し、そして新鮮な3 mLの固定液を追加します。
- 手順を繰り返し3.12倍以上。
- 室温で5分間、400×gで遠心分離し、細胞ペレットを乱すことなく、上清を除去します。そして、400〜600μLの固定液を追加し、ピペッティングでよく混ぜます。
- 45°の角度で傾斜予備洗浄とウェットスライド上に30μLの固定細胞を削除し、完全に一晩空気乾燥さスライドを可能にします。
mFISH 4.マウス染色体の絵画
- 染色体変性
- 室温で2分間、2×SSC中で中期細胞のスプレッドを含むスライドを置きます。
- 70％、80％、100％で2分間、連続エタノール洗浄によってスライドを脱水。 65℃で60分間インキュベートします。
- 予熱40 mLの変性溶液（70％ホルムアミド/ 2×SSC; 30分間ガラスコプリンジャー中で70℃（±2℃）にpHが7.0）。 1.5分 - 1のための予熱した変性溶液中でスライドをインキュベートすることによって染色体を変性させます。
- 変性処理を停止するとともに、再アニーリングから変性染色体を防ぐために2分間氷冷70％エタノール中で直ちにクエンチスライド。次に2分間80％エタノールで洗浄することにより脱水します。 2分間100％エタノールでエタノール洗浄を繰り返します。完全に室温でスライドを乾燥させます。
- プローブ混合物の変性およびハイブリダイゼーション
- 簡単に言うと、製造業者によって供給されたプローブの混合物を遠心分離し、7分間水浴中で80℃（±2℃）でインキュベートすることによりキャップ遠心管をスナップ500μLにプローブ混合物の10μLを転送し、変性。
- 10分間37℃の水浴中でプローブ混合物を用いた遠心分離管を置きます。
- 変性chromosoでスライド上に変性したプローブ混合物を適用しますMES。
- 慎重に18ミリメートルX 18ミリメートルガラスカバースリップでエリアをカバーし、非常に静かにスライドさせるカバースリップを押すことにより、目に見える気泡を除去します。ゴムセメントでカバースリップのすべての4つの側面をシールし、ハイブリダイゼーションのための加湿チャンバー内で37℃、暗所で16時間〜12時間インキュベートします。
- ポストハイブリダイゼーション洗浄および検出
- 慎重にゴムセメントとカバースリップを削除します。
- 5分間74℃（±2℃）で予熱した0.4×SSCに入れスライド。
- 2分間の洗浄溶液II（4×SSC / 0.1％のTween-20）で洗浄スライド。
- DAPIの対比（1.5μgの/ mL）で抗退色封入剤の20μLを置き、ガラスカバースリップでカバーしています。気泡や過剰取り付け溶液を除去するためのラボの組織とカバースリップ上でそっと押し。マニキュアでカバースリップの端をシールします。
- 適切なフィルターを備えた蛍光顕微鏡を使用して表示スライド。
マウス染色体の5スペクトル核型分析（SKY）
- 染色体およびプローブ変性
- 振盪せず、2分間、室温で2×SSC中でスライドを平衡化します。
- 室温で2分間、エタノールシリーズ（70％、80％、および100％エタノール）中でスライドを脱水します。エタノールを完全に除去するために、スライドを空気乾燥させます。
- ウォーム40 mLの変性溶液（70％ホルムアミド/ 2×SSC; pH7.0）で30分間ガラスコプリンジャーです。
- 1〜1.5分間予熱した変性溶液中でスライドをインキュベートします。
- 直ちに変性プロセスを停止するとともに、再アニーリングから変性染色体を防ぐために2分間氷冷70％エタノールにスライドを浸します。
- 2分間80％エタノール中に置き、次いで室温で2分間、100％エタノールにすることによってスライドを脱水。
- 80℃（±2℃）に設定された水浴中でSKYプローブ（メーカーによって供給されたバイアル＃1）変性7分間、その後すぐに10分間37℃に設定し、異なる水浴中に配置します。
- プローブのハイブリダイゼーション
- 変性した染色体上に変性SKYプローブの10μLを追加します。
- 空気の泡がカバースリップの下に閉じ込めされないように、慎重にSKYプローブ上に18ミリメートル×18ミリメートルのガラスカバースリップを配置。
- ゴムセメントでカバースリップの端をシールします。
- 加湿遮光チャンバー内でスライドを置き、36時間〜24時間、37℃の暗所でインキュベートします。
- ハイブリダイゼーション後の洗浄及び蛍光検出
- カバースリップを乱すことなく、非常に慎重にゴムセメントを削除します。
- 振盪しながら5分間72℃（±2℃）で予熱した迅速な洗浄溶液（0.4×のSSC）にスライドを置きます。洗浄液III（4×SSC / 0.1％のTween 20）にスライドを浸し、振とうしながら1分間インキュベートします。
- オプション：ブロッキング試薬の80μLを追加します。ハイブリダイゼーションの領域上に（製造業者によって供給されたバイアル＃2）の24mm×60ミリメートルのプラスチックカバースリップを置き、加湿チャンバー内で37℃で30分間、暗所でインキュベートします。
- 静かにプラスチックカバースリップを削除し、5分間予熱した（45ºC）洗浄液IIIとスライドを洗います。
- 80μLのCy5の染色試薬（メーカーによって供給されたバイアル＃3）を適用し、24ミリメートル×60ミリメートルのプラスチック製カバースリップを置き、加湿チャンバー内で40分間、暗所で37℃でインキュベートします。
- （4×SSC / 0.1％Tween 20）で予熱した（45ºC）洗浄液IIIを含有するガラスコプリンジャーにスライドを浸漬し、振盪しながら2分間、水浴中で45℃でインキュベートします。この洗浄工程を3回繰り返します。
- 80μLのCy5.5の染色試薬（メーカーによって供給されたバイアル＃4）を適用し、24ミリメートル×60ミリメートルのプラスチック製カバースリップを置き、加湿チャンバー内で40分間、暗所で37℃でインキュベートします。
- （予め温めてスライドを3回洗浄45ºC）洗浄液III。
- 余分な水分を排出するためにペーパータオルに対する傾斜位置でスライドを保持します。 20μL抗フェードDAPI試薬（メーカーによって供給されたバイアル＃5）を追加し、慎重に気泡を導入することなく、24ミリメートル×60ミリメートルのガラスカバースリップを配置。マニキュアでカバースリップの端をシールし、SKY画像を取り込むために装備落射蛍光顕微鏡で観察します。
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Representative Results
全身照射は、照射したマウスの骨髄細胞における多数の染色体異常を誘発します。現在のプロトコルは、放射線暴露後の骨髄細胞のin vivoでの有糸分裂停止のために最適化され、密度勾配遠心分離、中期細胞スプレッドの調製、およびそれに続くによって照射されたマウス骨髄単核細胞の単離の後脚から骨髄細胞の採取mFISHとSKY技術による放射線誘発安定した染色体異常の検出。これらの技術を用いて塗装染色体は、種々の病態生理学的状態のリスクを検出し、評価することができます。
図1は、代表的な中期細胞は、正常と異常なマウス染色体のペア-1、-2、および-3で広がりを示しています。 図2は 、正常と異常のマウスの中期染色体のスペクトル核型分析を示しています。これらの結果は、電離放射線は、主に、多様な細胞型への自己再生および分化に関与している幹細胞および前駆細胞から構成されて増殖し、マウス骨髄細胞におけるインター染色体安定異常を誘発することを示します。幹細胞および前駆細胞における細胞遺伝学的変化は、癌を含む種々の臨床疾患に関連付けることが示されており、疾患の重症度および全体的な生存のための最も強力な予測因子であると考えられています。したがって、放射線誘発性の安定した相互染色体異常をイオン化する癌の発生の危険性の増加を引き起こす可能性があることを推測することは論理的です。
図1：mFISHによって検出されるように照射したマウスの骨髄細胞に対する放射線の影響。 A及びBは 、CH、通常の対を有するマウスの中期細胞の広がりを示しますromosome-1（赤）、染色体2（緑）、および染色体3（水）。他のすべての染色体はDAPI（青）で対比されています。 Cは安定した収差含む染色体-1を示し、他の部分は無動原体断片を形成している一方で、染色体-1の一部は、非塗装（DAPI）染色体に統合されました。 Dは、染色体-2の部分の一部は非塗装染色体に統合されている示しています。 Eは、染色体-3を含む安定した収差を表しています。 Fはすべての3つの塗装の染色体を含む安定した収差を示しています。ブレークポイントとカラー接合が矢印で示されています。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2： 骨マーへの放射線の影響SKYによって検出されるように照射したマウスのOW細胞。上のパネルは、C57BL / 6雌マウスの正常なスペクトル核型分析（SKY）を示しています。中央のパネルは、染色体-4および染色体12を含む安定した収差を示しています。下のパネルは、染色体7および染色体-10を含む安定した染色体異常を持つマウススペクトル核型を示しています。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
いくつかの重要なステップは、mFISHとSKYの成功を決定します。最初の最も重要なステップは、骨髄単核細胞のin vivoでの有糸分裂停止のためのコルヒチン処理を最適化することです。コルヒチン濃度と処理時間個別に、または分裂指数だけでなく、染色体凝縮-2効果的な染色体の絵画のための重要な前提条件を決定コンサートインチ高コルヒチン濃度や長い処理時間は、適切な変性およびハイブリダイゼーションのための互換性のない非常に凝縮した染色体につながります。また、凝縮された染色体で拡散中期細胞における複雑な再配列の正確な識別が達成するために簡単な作業ではありません。 22と26グラムの間の体重を有するマウスで2時間100μL、0.05％コルヒチンの腹腔内投与は、中期細胞の十分な数が適度に凝縮した染色体に広がる生産します。第二の重要なステップは、低張処理です。ボリューム、処理時間、および低張液の影響染色体の形態の温度及びスライドガラス上に染色体の広がり。短時間または準最適温度での低張処理は、適切な染色体重複、染色体との中期細胞の広がり、その結果、拡散を防止することができます。染色体重複はin situハイブリダイゼーション法、蛍光シグナルの特異性、および再配列の適切な識別下流に干渉する。
第三に、後の低張固定は、細胞塊の形成を避けるために重要な工程です。固定液を穏やか定数は、単一細胞懸濁液を得るために振とうしながら遠心管の側下方にゆっくりと添加する必要があります。それ以外の場合は、セルのスプレッドは塊に閉じ込められ、染色体拡散になるであろう中期が損なわれます。しかしながら、拡散染色体tにおける細胞型、温度、および相対湿度に依存しますスライドガラス上に細胞懸濁液を落とすのIME。 Spurbeckによる以前の研究では、リンパ球のために、相対湿度60％と高い中期エリア18で20°Cの温度結果と報告しました。また、乾燥の継続時間はまた、最適な染色体が拡散のために重要なステップです。中期細胞が乾燥していることに広がる壊れ中期染色体18にある間に非常に遅い乾燥結果が速すぎる、多くの重複染色体との緊密なスプレッドを生成します。しかし、鄧小平は、主に拡散染色体が培養細胞19の様々な相対湿度に依存することを示しました。第四の重要なステップは、染色体変性時間を最適化することです。長いと短い変性時間は悪影響プローブハイブリダイゼーションに影響を与えます。短い変性が染色体へのプローブの相互作用を妨げるながら長い変性は、「ふっくら」の染色体が発生します。染色体「むくみ」を削減する別の方法は、室温で一晩年齢のスライドにあること前方変性工程。染色体塗装に使用されていないスライドはすぐに、-20ºCでデシケーター中に無期限に保存することができます。染色体変性時間は、スライド年齢、中期細胞スプレッドの周りの細胞質の量、および細胞がスライド上に落下した時の湿度で標準化する必要があります。プローブの変性およびハイブリダイゼーションは成功した染色体ペインティングのためにも重要です。蛍光シグナルはシグナルの強度を失わないように、明るい光に対するプローブの直接のエクスポージャーは、避けるべきです。
それはmFISHとSKYは、染色体間安定した異常を検出するための強力な技術であることを十分に確立されています。任意の再編成と同様に塗装染色体の損失または利得は、簡単にこれらの2つの方法により同定することができます。しかし、イントラアームおよびインター腕染色体交換の検出は、これらの技術によって可能ではありません。イントラアームおよびインター腕染色体交換の同定が可能になりましBECAになってきました、それぞれ、染色体腕固有の多色FISHプローブとmBANDのFISHプローブの開発を使用します。前者の核労働者に関する以前の研究では、mBAND分析は、放射線損傷20のユニークな署名を識別するための強力なツールであることが示されています。また、姉妹染色分体交換の同定は、放射線損傷21の特徴は、これらの技術によっては不可能です。また、mFISHとSKYの両方が転として二動原体染色体の誤った得点をもたらし得る、染色体の動原体領域をペイントする能力が限られています。技術はまた、転座の正確なブレークポイント局在を同定するのに適していません。さらに、蛍光シグナルが永久的に保存することができない、信号強度が時間とともに減少し、蛍光染色体ペインティングは自動化システムによる分析には適していません。しかし、蛍光シグナル強度はスライド格納することにより、長期間保存することができます冷凍庫でエス。
それぞれ、非蛍光染色体の絵画22とスペクトルカラーバンディング（SCAN）23：染色体の絵画の二つの改良された方法は、mFISHとSKYの限界を克服するために開発されています。 FISH塗装上ペルオキシダーゼ/ジアミノベンジジン（DAB）を用いて、非蛍光染色体ペインティングの利点は、正確な動原体領域を同定する、明視野顕微鏡による染色体再配列の同定、及び非蛍光シグナルが永久的に保存されると、画像解析することができるが含まれます自動化すること。 SCANプローブは、特定の染色体のためのバンド特異的ゲノムDNA配列から調製され、従って、正確な染色体バンドの起源を特定することができるので、一方で、SCANは、SKY上有利です。 SCANはまた、染色体内の交流の識別を容易にします。改善された技法の利点を考慮すると、これらは日常的に使用する私のために考慮されるべきですnは臨床細胞遺伝学的試験。しかし、各染色体対についてバンド特異的ゲノムDNA配列からのプローブの調製は、技術的に困難であり、分子細胞遺伝学におけるその使用を制限します。
処置群間の差は統計的に有意であるか否かを判断することは、分子細胞遺伝学の別の重要な側面です。このような中期細胞の数としてスコア基準は、カウントスプレッドなどの処置群ごとに使用される動物の数、分析中に広がる中期細胞あたりの染色体数、染色体ペインティング後に観察された収差を分類するために使用される命名法は、統計的不確実性を決定する上で重要な役割を果たし処置群の間です。様々な研究所が独自の採点基準、セルは少なくとも3から5匹のマウスで40十分に分離染色体に広がる100中期〜300と20のスコアリングを持っていますが、一般的にmFISHとSKYのアナルに統計的有意性を決定するために推奨されますysis、それぞれ24、25。また、塗装染色体に異常を分類するために使用される命名法の選択は、統計的不確実性を評価するための重要なパラメータです。全染色体ペインティングプローブによって検出された収差を記述するために使用されている2つの一般的な命名法のシステムがあります：（1）S＆Sタッカーらによるサベージとシンプソン26、27、（2）PAINT命名法による分類方法。 28。各システムは、構造的染色体異常の分類のために、異なる前提条件に依存しており、独自の長所と短所があります。 PAINTが異常な塗装パターンの記述を提供しながら、S＆Sシステムは、収差起源の機構的な解釈のために主に適しています。 Knehr らによる研究。 FISH塗装染色体における放射線誘発染色体異常のPAINT方法は、S＆Sシステムのように、また、いくつかのmodificati有する収差起源を決定するために使用することができることを示しています採点基準内に、実用的なアプリケーション29のために最も有用であろう。
両方mFISHとSKYの方法は、自分の限界があります。例えば、mFISHが少ない訓練で迅速な採点が可能になるが、これは収差の周波数を測定するためのすべての染色体をスクリーニングしておらず、試験に使用される塗装染色体の数に応じて、部分的にしか収差周波数を明らかにする。しかし、全染色体ペインティングによって観察された総交換の画分は、もともとルーカスらによって仮定の式で推定することができます。 30、さらにBraselmann らによって修正されました。 31。この数式は、塗装染色体の間で、塗装と対比染色体間の交換を考えています。例えば、F pは塗装染色体によって覆われたゲノムの部分和を表すと1（F 1）、2（F 2）、及び3（F 3）、WHE2 = 0.0649 F 1 = 0.0696、およびf 3 = 0.0570 F再、値が雌マウスにおける個々の染色体のゲノム内容を表します。 （ - F pの1）= 0.808したがって、F pを=（F 1 + F 2 + F 3）= 0.192と対比小数になります。塗装及び対比染色（F P）を含む交換の頻度を容易に二項展開の外積（p + q）個で計算することができる2 = P 2 + 2PQ + Q 2、P = F pおよびQ =（1 - F p）を 。したがって、F P = 2PQ = 2FのP（1 - P F）= 0.310は 、意味する染色体交換の31％は、マウス染色体-1を塗装した後に観察される-2、および-3。したがって、1 / 0.31 = 3.23細胞は1帯状中期細胞または1全ゲノム同等に等しくなるように得点する必要があります。また、mFISHとSKYの両方がspecifする能力が限られています的には収差の形成に関与し、また、小さな重複、逆位、および削除を検出するために、どの遺伝子やブレークポイントを識別します。
mFISHとSKY分析の適用は基礎研究に限定されるものではありません。両方とも、定期的に臨床試験で使用されています。これらの技術はまた、出生前及び出生後の診断、リスク評価、および癌の様々なタイプの同定に適用されています。また、両方の技術は、間期の染色体をペイントするために使用することができます。ソコロワは初めて32間期の染色体をペイントするmFISHを使用しました。これらの技術は、放射線11、33をイオン化し、偶発的または意図的な曝露後のヒトにおける後照射線量推定及びリスク評価のために使用されます。したがって、mFISHまたはSKYによって部分的または全ゲノム解析は、それぞれ、様々な研究のための染色体間安定した異常を検出するための有用なツールです。
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Acknowledgments
この研究は、国立航空宇宙局を通じてアーカンソースペースグラントコンソーシアムと国立宇宙生物医学研究所によってサポートされていました、付与NNX15AK32A（RP）とRE03701（MH-J）、およびP20のGM109005（MH-J）、および米国退役軍人局（ MH-J）。私たちは、原稿の準備で編集の支援のために、クリストファーフェテス、アーカンソー医科大学環境学科や産業衛生プログラム・コーディネーターに感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Formamide | Sigma-Aldrich | 221198-100ML | |
| SSC Buffer 20× Concentrate | Sigma-Aldrich | S6639-1L | |
| SKY Laboratory Reagent for Mouse | Applied Spectral Imaging | FPRPR0030/M40 | |
| CAD - Concentrated Antibody Detection Kit | Applied Spectral Imaging | FPRPR0033 | |
| Single Paints Customized - 3 Colors; Mouse chromosome 1: Red, Mouse chromosome 2: Green, Mouse chromosome 3: Aqua | Applied Spectral Imaging | FPRPR0182/10 | |
| Glass coverslips | Fisher Scientific | 12-545B | |
| Tween 20 | Fisher Scientific | BP337-100 | |
| Hydrochloric acid, 37%, Acros Organics | Fisher Scientific | AC45055-0025 | |
| Fisherbrand Glass Staining Dishes with Screw Cap | Fisher Scientific | 08-816 | |
| KaryoMAX Potassium Chloride Solution | Life Technologies | 10575-090 | |
| Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Colcemid powder | Fisher Scientific | 50-464-757 | |
| Histopaque-1083 | Sigma-Aldrich | 10831 | |
| Shepherd Mark I, model 25 137Cs irradiator | J. L. Shepherd & Associates | Model 484B | |
| Syringe 1 mL | BD Biosciences | 647911 | |
| Ethyl Alcohol, 200 Proof | Fisher Scientific | MEX02761 | |
| PBS, (1x PBS Liq.), w/o Calcium and Magnesium | Fisher Scientific | ICN1860454 | |
| Fetal Bovine Serum | Fisher Scientific | 10-437-010 | |
| Methanol | Fisher Scientific | A454SK-4 | |
| Glacial acetic acid | Fisher Scientific | AC295320010 | |
| Zeiss Microscope | Zeiss | AXIO Imager.Z2 |
References
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