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JoVE Journal Genetics
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Genetics

Rilevazione di Inter-aberrazioni cromosomiche stabili per fluorescenza multipla Published: January 11, 2017 doi: 10.3791/55162
Automatic Translation
1, 2, 1,3
1Division of Radiation Health, Department of Pharmaceutical Sciences, College of Pharmacy, University of Arkansas for Medical Sciences, 2Department of Environmental Health, Fay W. Boozman School of Public Health, University of Arkansas for Medical Sciences, 3Surgical Service, Central Arkansas Veterans Healthcare System

Protocol

Tutti gli studi sugli animali sono state eseguite in stretta conformità con le raccomandazioni contenute nella Guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio del National Institutes of Health. Il protocollo animale è stato approvato dal Comitato Istituzionale cura e l'uso degli animali della University of Arkansas per le scienze mediche. Tutti gli animali sono stati alloggiati sotto stabulario di aria condizionata di serie a 20 ± 2 ° C con 10 - 15 cicli orarie di aria fresca e di libero accesso al cibo roditori standard ed acqua. All'arrivo, i topi sono stati tenuti in quarantena per 1 settimana e fornito certificato Chow roditore.

1.Radiation esposizione e in vivo Arresto di cellule in metafase

  1. Esporre i topi non-anestetizzato a 2 Gy di radiazione di tutto il corpo in una camera di irradiazione. Durante l'irradiazione, luogo topi in una camera di contenimento ben ventilata per assicurarsi che essi non si muovono liberamente e ricevono una dose uniforme.
  2. Iniettare 100 ml di soluzione di colchicina 0,05% (cPolvere olchicine sciolto in calcio e magnesio libero PBS) per via intraperitoneale con un ago da 25 G allegato con 1 ml siringa monouso. Evitare l'iniezione direttamente in qualsiasi organo.
  3. Lasciare l'animale nella gabbia per 2 h prima della raccolta di cellule di midollo osseo. Osservare l'animale per eventuali segni di dolore o disagio.

2. midollo osseo cellule Raccolta e Isolamento di cellule del midollo osseo mononucleate dal gradiente di densità centrifugazione

  1. Eutanasia il mouse da CO 2 asfissia.
  2. Spray etanolo al 70% sul dorsale e lato ventrale.
  3. Effettuare una incisione 2 centimetri sulla cute addominale con forbici affilate. Afferrare la pelle su entrambi i lati dell'incisione con pinzetta smussata e tirare delicatamente aprire i muscoli addominali.
  4. Tagliare entrambe le zampe posteriori con le forbici e subito metterli in pre-refrigerata PBS con il 4% FBS.
  5. Pulire accuratamente tutti i muscoli collegati al arto posteriore con un forte lametta e garza di cotone benda.
  6. Separare la tibia dal femore. Tagliare entrambe le punte di ogni osso con una lametta.
  7. Lavare il contenuto del midollo osseo con 3 ml di PBS (con 4% FBS) usando un ago 23 G attaccato ad una siringa da 3 mL e raccogliere il contenuto in una provetta da centrifuga 15. Passare la sospensione cellulare almeno 10 volte attraverso l'ago per fare una sospensione di cellule singole.
  8. sovrapporre cautela la sospensione cellulare in un uguale volume di mezzo di separazione dei linfociti (3 mL) senza disturbare l'interfaccia tra la sospensione cellulare e mezzo di separazione dei linfociti. Centrifugare a 400 xg per 30 min a temperatura ambiente.
  9. Raccogliere accuratamente il buffy coat senza disturbare gli altri livelli e il trasferimento in una nuova 15 mL provetta.

3. Preparazione del Metaphase spread cellulari

  1. Aggiungere 10 ml di PBS per il tubo contenente il buffy coat.
  2. Centrifugare a 400 xg per 5 min a temperatura ambiente.
  3. rimuovere con attenzione il surnatante. Poi rompere tegli cella pellet con lievi colpetti e aggiungere 10 ml di PBS.
  4. Centrifugare a 400 xg per 5 min a temperatura ambiente.
  5. Rimuovere il surnatante senza disturbare il pellet cellulare, rompere il pellet, e aggiungere 4 ml di soluzione di cloruro di potassio 0,075 M ipotonici pre-riscaldato. Aggiungere ipotonica goccia a goccia soluzione agitando delicatamente costante.
  6. Incubare le cellule per 20 minuti a 37 ° C in un bagno d'acqua.
  7. Dopo il trattamento ipotonico, aggiungere un volume uguale (4 mL) di fissativo (metanolo: acido acetico glaciale, 3: 1 v / v) nel tubo 15 mL e mescolare delicatamente per inversione.
  8. Centrifugare a 400 xg per 5 min a temperatura ambiente e scartare il surnatante.
  9. Suddividere il pellet cellulare con intercettazioni seguito da dolce vortex per alcuni secondi e aggiungere 3 ml di fissativo goccia a goccia soluzione con costante agitazione.
  10. Incubare per 30 minuti a temperatura ambiente, quindi si centrifuga a 400 xg per 5 min.
  11. Rimuovere il surnatante, rompere il pellet cellulare con gentLe intercettazioni, e aggiungere 3 ml di fissativo fresco.
  12. Centrifugare a 400 xg per 5 min a temperatura ambiente, e rimuovere il surnatante. Suddividere il pellet cellulare con dolce intercettazioni, e aggiungere fresco 3 ml di fissativo.
  13. Ripetere il punto 3.12 altre due volte.
  14. Centrifugare a 400 xg per 5 min a temperatura ambiente, e rimuovere il surnatante senza disturbare il pellet. Quindi aggiungere 400 a 600 microlitri fissativo e miscelare bene con pipettaggio.
  15. Calo del 30 microlitri cellule fissate su vetrini pre-puliti e bagnati inclinato ad un angolo di 45 ° e consentire le diapositive asciugare completamente durante la notte.

4. topo cromosoma Dipinto di mFISH

  1. cromosoma denaturazione
    1. Posizionare la diapositiva contenente spread cellulari metafase in 2x SSC per 2 minuti a temperatura ambiente.
    2. Disidratare il vetrino mediante lavaggio etanolo seriale per 2 minuti ogni a 70%, 80% e 100%. Incubare per 60 min a 65 ° C.
    3. Preriscaldare 40 ml soluzione di denaturazione (70% formammide / 2x SSC; pH 7,0) a 70 ° C (± 2 ° C) in una vaschetta Coplin di vetro per 30 min. Denaturare cromosomi incubando il vetrino in soluzione denaturazione pre-riscaldato per 1-1,5 min.
    4. Quench scorrere immediatamente ghiacciata etanolo al 70% per 2 minuti per fermare il processo di denaturazione, nonché per prevenire i cromosomi denaturati da re-ricottura. Poi disidratano mediante lavaggio con etanolo 80% per 2 min. Ripetere il lavaggio con etanolo 100% di etanolo per 2 min. Completamente asciugare il vetrino a temperatura ambiente.
  2. Denaturazione e ibridazione di sonda Miscela
    1. centrifugare brevemente la miscela di sonda in dotazione dal costruttore, trasferire 10 ml di miscela della sonda in un 500 microlitri scatto provetta tappo, e denaturate mediante incubazione a 80 ° C (± 2 ° C) in un bagno d'acqua per 7 min.
    2. Posizionare il tubo da centrifuga con miscela di sonda in un bagno d'acqua a 37 ° C per 10 min.
    3. Applicare la miscela sonda denaturata sul vetrino con chromoso denaturatomes.
    4. coprire con cura la zona con una x 18 mm copertura in vetro antiscivolo 18 mm e di eliminare eventuali bolle d'aria visibili premendo molto delicatamente il vetrino a scivolare. Sigillare tutti i quattro lati del vetrino con cemento di gomma e incubare per 12 ore a 16 h al buio a 37 ° C in una camera umidificata per l'ibridazione.
  3. Messaggio ibridazione di lavaggio e di rilevamento
    1. Rimuovere con cura il mastice e la polizza di copertura.
    2. Porre il vetrino in pre-riscaldato 0.4x SSC a 74 ° C (± 2 ° C) per 5 min.
    3. Lavare il vetrino in soluzione di lavaggio II (4x SSC / 0.1% Tween-20) per 2 min.
    4. Mettere 20 ml di anti-sbiadimento mezzo di montaggio con DAPI di contrasto (1,5 mg / ml) e coprire con un coprioggetto di vetro. Premere delicatamente sul vetrino con il tessuto di laboratorio per rimuovere le bolle d'aria e soluzione di montaggio in eccesso. Sigillare i bordi del coprioggetto con smalto.
    5. Vedi diapositive utilizzando un microscopio a fluorescenza dotato di filtri appropriati.

    5. spettrale cariotipo (SKY) del mouse cromosomi

    1. Cromosoma e denaturazione della sonda
      1. Equilibrare diapositiva in 2x SSC a temperatura ambiente per 2 minuti, senza agitare.
      2. Disidratare presentazione in un serie di etanolo (70%, 80% e 100% etanolo) per 2 minuti ciascuna a temperatura ambiente. Far asciugare il vetrino per rimuovere completamente l'etanolo.
      3. Warm 40 mL di soluzione di denaturazione (70% formammide / 2x SSC; pH 7,0) in una vaschetta Coplin di vetro per 30 min.
      4. Incubare il vetrino in soluzione denaturazione pre-riscaldato per 1 a 1,5 min.
      5. immergere immediatamente il vetrino in ghiacciata etanolo al 70% per 2 min per arrestare il processo di denaturazione e per evitare che i cromosomi denaturati da re-ricottura.
      6. Disidratare il vetrino mettendolo in 80% etanolo per 2 minuti e poi in 100% di etanolo per 2 minuti a temperatura ambiente.
      7. Denaturare la sonda SKY (vial # 1 fornito dal produttore) in un bagnomaria regolato a 80 ° C (± 2 ° C)per 7 minuti, e poi immediatamente posto in una diversa bagnomaria a 37 ° C per 10 min.
    2. sonda ibridazione
      1. Aggiungere 10 ml di sonda SKY denaturato sui cromosomi denaturati.
      2. Posizionare con cura un vetrino di vetro 18 millimetri x 18 mm sulla sonda SKY in modo che non bolle d'aria intrappolate sotto il vetrino.
      3. Sigillare i bordi del vetrino con mastice.
      4. Posizionare il vetrino in una camera a tenuta di luce umidificata e incubare al buio a 37 ° C per 24 ore a 36 h.
    3. Post-ibridazione Lavaggio e rivelazione a fluorescenza
      1. Rimuovere il cemento di gomma con molta attenzione senza disturbare il vetrino.
      2. Posizionare la diapositiva in pre-riscaldato soluzione di lavaggio rapido (0.4x SSC) a 72 ° C (± 2 ° C) per 5 minuti con costante agitazione. Immergere vetrino nella soluzione di lavaggio III (4x SSC / 0.1% Tween 20) e incubare per 1 min agitando.
      3. Opzionale: Aggiungere 80 ml di reagente di bloccaggio(Fiala # 2 fornito dal produttore) sulla zona di ibridazione, posizionare 24 mm coprioggetto plastica x 60 mm, e incubare al buio a 37 ° C per 30 minuti in una camera umidificata.
      4. Rimuovere delicatamente il vetrino di plastica e lavare la slitta con pre-riscaldato (45 ° C) soluzione di lavaggio III per 5 min.
      5. Applicare 80 ml di Cy5 colorazione reagente (vial # 3 fornito dal produttore), posizionare un 24 millimetri coprioggetto in plastica x 60 mm, e incubare a 37 ° C al buio per 40 minuti in una camera umidificata.
      6. Immergere il vetrino in un barattolo di vetro Coplin contenente pre-riscaldato (45 ° C) soluzione di lavaggio III (4x SSC / 0.1% Tween 20) e incubare a 45 ° C in un bagno d'acqua per 2 minuti con agitazione. Ripetere questa operazione di lavaggio per 3 volte.
      7. Applicare 80 ml di Cy5.5 colorazione reagente (vial # 4 fornito dal produttore), posizionare un 24 millimetri coprioggetto in plastica x 60 mm, e incubare a 37 ° C al buio per 40 minuti in una camera umidificata.
      8. Lavare il vetrino 3 volte con pre-riscaldato (45 ºC) soluzione di lavaggio III.
      9. Tenere il vetrino in posizione inclinata contro un tovagliolo di carta per drenare i liquidi in eccesso. Aggiungere 20 ml anti-sbiadimento DAPI reagente (vial # 5 fornito dal produttore) e con attenzione inserire un vetrino di vetro 24 millimetri x 60 mm senza introdurre bolle d'aria. Sigillare i bordi del coprioggetto con smalto e osservare con un microscopio a epifluorescenza dotato per catturare le immagini SKY.

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Representative Results

Irradiazione corporea totale induce numerose aberrazioni cromosomiche nelle cellule del midollo osseo di topi irradiati. L'attuale protocollo è ottimizzato per l'arresto mitotico in vivo di cellule del midollo osseo dopo l'esposizione alle radiazioni, la raccolta di cellule del midollo osseo dalle zampe posteriori di topi irradiati, isolamento di cellule del midollo osseo mononucleari mediante centrifugazione in gradiente di densità, la preparazione degli spread cellulari metafase, e la successiva rilevamento di radiazioni indotto aberrazioni cromosomiche stabili mediante tecniche mFISH e SKY. Cromosoma pittura utilizzando queste tecniche possono essere utilizzate per rilevare e valutare il rischio di diverse condizioni fisiopatologiche.

La figura 1 mostra cella rappresentante metafase si diffonde con le normali e aberranti topo cromosoma coppie-1, -2, -3 e. La figura 2 mostra cariotipo spettrale di cromosomi normali e anormali del mouse metafase.Questi risultati dimostrano che le radiazioni ionizzanti induce inter-aberrazioni cromosomiche stabili nelle cellule proliferanti murino del midollo osseo, che è principalmente composti da cellule staminali e progenitrici che sono responsabili per l'auto-rinnovamento e la differenziazione in tipi di cellule diverse. alterazioni citogenetiche nelle cellule staminali e progenitrici hanno dimostrato di associarsi con varie malattie cliniche, tra cui il cancro, e sono considerati i predittori più forti per la gravità della malattia e la sopravvivenza globale. Pertanto, è logico dedurre che ionizzanti stabili aberrazioni cromosomiche inter-indotte da radiazioni può causare un aumento del rischio di sviluppo del cancro.

Figura 1
Figura 1: effetto delle radiazioni sul midollo osseo cellule di un topo irradiato come rilevato dal mFISH. A e B mostrano una diffusione del mouse cella di metafase con normali coppie di chromosome-1 (rossa), il cromosoma-2 (verde), e cromosoma 3 (acqua). Tutti gli altri cromosomi sono di contrasto con DAPI (blu). C mostra aberrazione stabile coinvolge cromosoma 1, una parte del cromosoma-1 è stato integrato in un (DAPI) cromosoma non verniciato, mentre un'altra parte è formata una frammento acentrico. D mostra una parte di una parte del cromosoma-2 è stato integrato nel cromosoma non dipinta. E rappresenta aberrazione stabile coinvolge il cromosoma 3. F mostra una aberrazione stabile che coinvolge tutti e tre i cromosomi dipinte. punti di rottura e svincoli colore sono indicati da frecce. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

figura 2
Figura 2: effetto delle radiazioni su Bone MarrCellule ow del combustibile irraggiato Mouse come rilevato da SKY. Il pannello superiore mostra un normale cariotipo spettrale (SKY) di C57BL / 6 topo femmina. Il pannello centrale mostra una aberrazione stabile coinvolge il cromosoma 4 e cromosoma 12. Il pannello inferiore mostra il mouse cariotipo spettrale con una aberrazione cromosomica stabile che coinvolgono il cromosoma 7 e cromosoma 10. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

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Discussion

Diversi passaggi critici determinano il successo di mFISH e SKY. Il primo e più importante passo è quello di ottimizzare il trattamento colchicina per l'arresto in vivo mitotico delle cellule mononucleate del midollo osseo. Il tempo di concentrazione di colchicina e il trattamento individualmente o in concerto determinare l'indice mitotico e condensazione cromosomica-due importanti presupposti per un efficace pittura cromosoma. Un tempo di trattamento ad alta concentrazione di colchicina o più porta a cromosomi altamente condensati, incompatibili per una corretta denaturazione e l'ibridazione. Inoltre, precisa identificazione di riarrangiamenti complessi in una cella metafase diffondere con cromosomi condensati non è un compito facile da raggiungere. somministrazione intra-peritoneale di 100 microlitri 0,05% colchicina per 2 h in un topo con un peso corporeo compreso tra 22 e 26 g produce un numero sufficiente di cellule metafase diffonde con cromosomi moderatamente condensati. Il secondo passo fondamentale è il trattamento ipotonico.Il volume, tempo di trattamento, e la temperatura della soluzione ipotonica influenza cromosoma morfologia e diffusione dei cromosomi sul vetrino. Un trattamento ipotonico per un periodo di tempo più o ad una temperatura non ottimale può impedire il cromosoma appropriata diffusione, con conseguente cellule metafase diffondere con cromosomi sovrapposti. Cromosoma sovrapposizione interferisce con il processo a valle in situ, la specificità dei segnali fluorescenti, e la corretta identificazione di riarrangiamenti.

In terzo luogo, la fissazione post-ipotonica è un passo importante per evitare la formazione di cellule ciuffo. Il fissativo deve essere aggiunto lentamente lungo la parete della provetta con costante agitando delicatamente per ottenere una sospensione di cellule singole. In caso contrario, gli spread delle cellule in metafase diventeranno intrappolata nei ciuffi e cromosoma diffusione saranno compromessi. Tuttavia, cromosoma diffusione dipende anche dal tipo di cellula, temperatura e umidità relativa al time di far cadere la sospensione cellulare su vetrini. Un precedente studio da Spurbeck ha riferito che per i linfociti, un'umidità relativa del 60% e un 20 ° C di temperatura risultato nella più alta zona metafase 18. Inoltre, la durata di asciugatura è anche un punto critico per la diffusione cromosoma ottimale. Cell metafase diffonde che secca produce troppo velocemente spread stretti con molti cromosomi sovrapposti, mentre i risultati molto lenta essiccazione in metafase rotto cromosoma 18. Tuttavia, Deng ha mostrato che cromosoma diffusione dipende prevalentemente umidità relativa per una varietà di cellule in coltura 19. Il quarto passo importante è quello di ottimizzare il tempo cromosoma denaturazione. Un tempo di denaturazione più lungo e più corto influisca negativamente sonda di ibridazione. Più denaturazione provoca cromosomi "gonfi", mentre più breve denaturazione impedisce l'interazione di sonda per i cromosomi. Un altro modo per ridurre il cromosoma "gonfiore" è quello di diapositive età notte a temperatura ambiente siafase di denaturazione ribalta. I vetrini non utilizzati per la pittura cromosoma immediatamente, possono essere conservati a tempo indeterminato in un essiccatore a -20 ° C. tempo Chromosome denaturazione deve essere standardizzata con l'età scivolo, la quantità di citoplasma intorno spread cellulari metafase, e l'umidità in cui le cellule sono state cadute sui vetrini. Sonda denaturazione e l'ibridazione è importante anche per la pittura cromosoma successo. L'esposizione diretta di sonde a luce dovrebbe essere evitata, in modo che il segnale fluorescente non perde intensità di segnale.

E 'ben noto, che mFISH e SKY sono potenti tecniche per la rilevazione tra le aberrazioni cromosomiche stabili. Eventuali riarrangiamenti così come la perdita o il guadagno di cromosomi dipinti possono essere facilmente identificati da questi due metodi. Tuttavia, l'individuazione di intra-braccio e inter-braccio scambi cromosomiche non sono possibili con queste tecniche. Identificazione di intra-braccio e inter-braccio scambi cromosomiche sono ora diventato possibile becal'uso dello sviluppo di, rispettivamente, cromosomiche sonde pesci multicolore specifiche del braccio e sonde FISH mBAND. Un precedente studio sulla ex lavoratori nucleari ha dimostrato che l'analisi mBAND è un potente strumento per identificare le firme uniche di danni da radiazioni 20. Inoltre, l'identificazione di scambio di cromatidi fratelli, un tratto caratteristico di danni da radiazioni 21, non è possibile con queste tecniche. Inoltre, sia mFISH e SKY hanno limitato la capacità di dipingere la regione centromerica dei cromosomi, che può provocare nel punteggio erronea del cromosoma dicentrici come traslocazione. Le tecniche non sono adatti anche per identificare l'esatta localizzazione breakpoint di traslocazione. Inoltre, i segnali fluorescenti non possono essere conservati in modo permanente, l'intensità del segnale diminuisce con il tempo, e pittura cromosoma fluorescente non è adatto per l'analisi da un sistema automatico. Tuttavia, l'intensità del segnale fluorescente può essere conservato per un periodo di tempo più lungo memorizzando scivolareES nel congelatore.

Due miglioramento dei metodi di pittura cromosoma sono stati sviluppati per superare i limiti di mFISH e SKY: rispettivamente, non fluorescente cromosoma pittura 22 e il colore spettrale strisce (SCAN) 23. I vantaggi della pittura cromosoma non fluorescente utilizzando la perossidasi / diaminobenzidina (DAB) su pittura FISH includono l'identificazione accurata della regione centromerica, identificazione di riarrangiamento cromosomico dal campo chiaro microscopio, e che il segnale non fluorescente è permanentemente conservata e l'analisi delle immagini può essere automatizzato. D'altra parte, la SCAN è vantaggioso nel cielo perché sonde SCAN sono preparati da sequenze di DNA genomico specifica banda per un cromosoma specifica e quindi, possono identificare esattamente l'origine di un cromosoma-band. SCAN facilita anche l'identificazione di scambi intra-cromosomiche. Considerando i benefici delle tecniche migliorate, questi dovrebbero essere presi in considerazione per l'uso di routine in clinica test citogenetici. Tuttavia, la preparazione di sonde dalla sequenza di DNA genomico specifiche bande per ogni coppie di cromosomi è tecnicamente impegnativo e ne limita l'uso in citogenetica molecolare.

Determinare se la differenza tra i gruppi di trattamento è statisticamente significativo o non è un altro aspetto importante della citogenetica molecolare. Criteri di valutazione, quali il numero di cellulare metafase spread contati, il numero di animali utilizzati per gruppo di trattamento, numero di cromosomi per cella metafase diffuso durante l'analisi, la nomenclatura utilizzata per classificare le aberrazioni osservata dopo la verniciatura cromosoma, ecc svolgere un ruolo fondamentale nel determinare l'incertezza statistica tra i gruppi di trattamento. Anche se vari laboratori hanno criteri di valutazione di proprietà, punteggio di 100 a 300 e 20 metafase cellule si diffonde con 40 cromosomi ben separati in almeno 3-5 topi è generalmente consigliato per determinare la significatività statistica in mFISH e SKY analeYsis rispettivamente 24, 25. Inoltre, la scelta di nomenclatura utilizzata per classificare aberrazioni nei cromosomi dipinte è un parametro importante per valutare statisticamente incertezza. Ci sono due sistemi di nomenclatura popolari in uso per descrivere le aberrazioni rilevati dalle sonde interi painting cromosoma: (1) S & S metodo di classificazione da Savage e Simpson 26, 27 e (2) la nomenclatura PAINT da Tucker et al. 28. Ogni sistema si basa su diversi presupposti per la classificazione di aberrazioni cromosomiche strutturali e ha i suoi vantaggi e svantaggi. Il sistema S & S è in primo luogo adatto per l'interpretazione meccanicistica di origine aberrazione, mentre PAINT fornisce una descrizione dei modelli di pittura anomali. Studi di Knehr et al. on indotte da radiazioni aberrazioni cromosomiche nel pesce dipinto cromosomi indicano che il metodo paint, come il sistema di S & S, può essere utilizzato anche per determinare l'origine aberrazione con alcuni Modificatisulle nei criteri di punteggio e sarebbe più utile per l'applicazione pratica 29.

Entrambi i metodi mFISH e SKY hanno i loro limiti. Ad esempio, mFISH permette un rapido marcature con poca formazione, tuttavia, non protegge tutti i cromosomi per la misurazione della frequenza aberrazione e rivela solo la frequenza aberrazione parziali, a seconda del numero di cromosomi dipinte utilizzati nello studio. Tuttavia, una frazione di scambi totali osservati da tutto il dipinto cromosoma può essere stimata con la formula originariamente postulata da Lucas et al. 30 e ulteriormente modificato dalla Braselmann et al. 31. Questa formula matematica considera lo scambio tra cromosomi dipinte e dipinti tra i cromosomi e controcolorate. Ad esempio, sia f p rappresentano la somma frazionaria del genoma coperto dai cromosomi dipinte 1 (1 f), 2 (f 2) e 3 (f 3), where f 1 = 0,0696, f 2 = 0,0649, e f 3 = 0,0570, i valori rappresentano il contenuto genomico dei singoli cromosomi nei topi femmina. Pertanto, f p = (f 1 + f 2 f + 3) = 0,192 e la frazione counterstained diventa (1 - F p) = 0.808. La frequenza degli scambi coinvolgono cromosomi dipinti e controcolorate (F P) può essere facilmente calcolato dal prodotto vettoriale di espansione binomiale (p + q) 2 = p 2 + 2pq + q 2, dove p = f p e q = (1 - f p). Quindi, F P = 2pq = 2f p (1 - F p) = 0,310, il che significa che il 31% degli scambi cromosomiche sono osservabili dopo la pittura topo cromosoma-1, -2, e -3. Pertanto, 1 / 0.31 = 3.23 celle devono essere segnato per eguagliare uno cellule in metafase bande o di un intero genoma equivalente. Inoltre, sia mFISH e SKY hanno limitato la capacità di SPECIFcamente identificare quali geni e punti di interruzione sono coinvolti nella formazione aberrazione e anche per rilevare piccole duplicazioni, inversioni, e le eliminazioni.

L'applicazione di mFISH e analisi SKY non si limita alla ricerca di base. Entrambi sono regolarmente in uso negli studi clinici. Queste tecniche sono state applicate anche per prenatale e postnatale diagnosi, valutazione del rischio, e l'individuazione di vari tipi di cancro. Inoltre, entrambe le tecniche possono essere utilizzate per dipingere cromosomi in interfase. Sokolova utilizzato mFISH per dipingere i cromosomi in interfase per la prima volta 32. Queste tecniche sono utilizzate anche per la post-irraggiamento stima della dose e la valutazione del rischio negli esseri umani dopo l'esposizione accidentale o intenzionale a radiazioni 11, 33 ionizzanti. Pertanto, l'analisi parziale o intero genoma da mFISH o SKY rispettivamente, sono strumenti utili per rilevare inter-aberrazioni cromosomiche stabili per vari studi.

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Acknowledgments

Questo studio è stato sostenuto da Arkansas spazio di Grant Consortium and Space Biomedical Istituto Nazionale di Ricerca attraverso National Aeronautics and Space Administration, concede NNX15AK32A (RP) e RE03701 (MH-J), e P20 GM109005 (MH-J), e gli Stati Uniti Veterans Administration ( MH-J). Ringraziamo Christopher Fettes, Coordinatore del Programma per il Dipartimento di Ambiente e Salute del Lavoro presso l'Università di Arkansas per le scienze mediche, per l'assistenza editoriale in preparazione del manoscritto.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Formamide Sigma-Aldrich 221198-100ML
SSC Buffer 20× Concentrate Sigma-Aldrich S6639-1L
SKY Laboratory Reagent for Mouse Applied Spectral Imaging FPRPR0030/M40
CAD - Concentrated Antibody Detection Kit Applied Spectral Imaging FPRPR0033
Single Paints Customized - 3 Colors; Mouse chromosome 1: Red, Mouse chromosome 2: Green, Mouse chromosome 3: Aqua Applied Spectral Imaging FPRPR0182/10
Glass coverslips Fisher Scientific 12-545B
Tween 20 Fisher Scientific BP337-100
Hydrochloric acid, 37%, Acros Organics Fisher Scientific AC45055-0025 
Fisherbrand Glass Staining Dishes  with Screw Cap Fisher Scientific 08-816
KaryoMAX Potassium Chloride Solution  Life Technologies 10575-090
Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides Fisher Scientific 12-550-15
Colcemid powder Fisher Scientific 50-464-757 
Histopaque-1083  Sigma-Aldrich 10831
Shepherd Mark I, model 25 137Cs irradiator J. L. Shepherd & Associates Model 484B
Syringe 1 mL BD Biosciences 647911
Ethyl Alcohol, 200 Proof Fisher Scientific MEX02761
PBS, (1x PBS Liq.), w/o Calcium and Magnesium Fisher Scientific ICN1860454
Fetal Bovine Serum Fisher Scientific 10-437-010
Methanol Fisher Scientific A454SK-4
Glacial acetic acid Fisher Scientific AC295320010
Zeiss Microscope Zeiss AXIO Imager.Z2

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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  3. Zaccaria, A., Barbieri, E., Mantovani, W., Tura, S. Chromosome radiation-induced aberrations in patients with Hodgkin's disease. Possible correlation with second malignancy? Boll. Ist. Sieroter. Milan. 57, 76-83 (1978).
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Genetica aberrazioni cromosomiche cariotipo spettrale fluorescenza multipla le radiazioni studio citogenetica le cellule del midollo osseo di topo pittura cromosoma
Rilevazione di Inter-aberrazioni cromosomiche stabili per fluorescenza multipla<em&gt; In Situ</em&gt; Ibridazione (mFISH) e spettrale cariotipo (SKY) in topi irradiati
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Pathak, R., Koturbash, I.,… More

Pathak, R., Koturbash, I., Hauer-Jensen, M. Detection of Inter-chromosomal Stable Aberrations by Multiple Fluorescence In Situ Hybridization (mFISH) and Spectral Karyotyping (SKY) in Irradiated Mice. J. Vis. Exp. (119), e55162, doi:10.3791/55162 (2017).

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