Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Genetics

الكشف عن المشترك بين الكروموسومات الزيغ مستقرة من قبل الإسفار متعددة doi: 10.3791/55162 Published: January 11, 2017

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

أجريت جميع الدراسات على الحيوانات وفقا صارم مع التوصيات الواردة في دليل لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية من المعاهد الوطنية للصحة. وتمت الموافقة على بروتوكول الحيوان من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسي من جامعة أركنساس للعلوم الطبية. تم إيواء جميع الحيوانات تحت منشأة الحيوان القياسية مكيفة الهواء في 20 ± 2 درجة مئوية مع 10-15 دورات ساعة من الهواء النقي وحرية الوصول إلى المواد الغذائية القوارض القياسية والمياه. ولدى وصوله، عقدت الفئران في الحجر الصحي لمدة 1 أسبوع، وقدم شهادة طعام القوارض.

التعرض 1.Radiation وفي فيفو اعتقال خلايا الطورية

  1. الفئران فضح برنامج الأمم المتحدة للتخدير إلى 2 غراي إشعاع كامل الجسم في غرفة التشعيع. خلال التشعيع والفئران مكان في الغرفة عقد جيد التهوية للتأكد من أنها لا تتحرك بحرية والحصول على جرعة موحدة.
  2. ضخ 100 ميكرولتر من 0.05٪ محلول الكولشيسين (جمسحوق olchicine الذائبة في الكالسيوم والمغنيسيوم خالية PBS) البريتونى باستخدام إبرة 25 G المرفقة مع 1 مل حقنة واحدة. تجنب حقن مباشرة في أي جهاز.
  3. ترك الحيوان في قفص لمدة 2 ساعة قبل الحصاد خلية نخاع العظام. مراقبة الحيوانات لأي علامات الألم أو الضيق.

2. نخاع العظم خلية الحصاد وعزل خلايا نخاع العظم وحيدات النوى التي كتبها التدرج الكثافة الطرد المركزي

  1. الموت ببطء الماوس عن طريق CO 2 الخنق.
  2. رذاذ الايثانول 70٪ على ظهري وبطني الجانب.
  3. جعل شق 2 سم على جلد البطن مع مقص حاد. فهم الجلد على جانبي الشق مع ملاقط حادة وسحب بلطف فتح عضلات البطن.
  4. قطع كل من رجليه الخلفيتين مع مقص والمكان على الفور لهم في قبل المبردة برنامج تلفزيوني مع 4٪ FBS.
  5. بعناية تنظيف جميع العضلات التي تعلق على أطرافه الخلفية مع حادة razorblade والشاش والقطن ضمادة.
  6. فصل الساق من عظم الفخذ. تقليم كل من النصائح من كل العظام مع razorblade.
  7. مسح محتويات نخاع العظام مع 3 مل برنامج تلفزيوني (مع 4٪ FBS) باستخدام إبرة 23 G تعلق على حقنة مل 3 وجمع المحتوى في أنبوب الطرد المركزي 15 مل. تمرير تعليق الخلية لا يقل عن 10 مرات من خلال إبرة لجعل التعليق خلية واحدة.
  8. بعناية تراكب تعليق الخلية على حجم مساو من متوسطة فصل الخلايا اللمفاوية (3 مل) من دون إزعاج واجهة بين تعليق خلية والمتوسطة فصل الخلايا اللمفاوية. أجهزة الطرد المركزي في 400 x ج لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  9. جمع معطف الشهباء بعناية من دون إزعاج طبقات ونقل أخرى في 15 أنبوب جديد للطرد المركزي مل.

3. إعداد ينتشر خلية الطورية

  1. إضافة 10 مل PBS إلى الأنبوب الذي يحتوي على معطف الشهباء.
  2. أجهزة الطرد المركزي في 400 x ج لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  3. إزالة بعناية طاف. ثم تفريق رانه الخلية بيليه مع التنصت لطيف وإضافة 10 مل برنامج تلفزيوني.
  4. أجهزة الطرد المركزي في 400 x ج لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  5. إزالة طاف دون الإخلال بيليه الخلية، تفريق بيليه، وإضافة 4 مل من محلول كلوريد البوتاسيوم 0.075 M منخفض التوتر قبل تحسنت. إضافة قطرة محلول منخفض التوتر قطرة مع الهز المستمر لطيف.
  6. احتضان الخلايا لمدة 20 دقيقة عند 37 درجة مئوية في حمام مائي.
  7. بعد العلاج ناقص التوتر، إضافة حجم مساو (4 مل) من تثبيتي (الميثانول: حمض الخليك الجليدي، 3: 1 ت / ت) في أنبوب 15 مل وتخلط بلطف بواسطة أنبوب للقلب.
  8. أجهزة الطرد المركزي في 400 x ج لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة، وتجاهل طاف.
  9. تفريق بيليه الخلية مع البزل تليها دوامة طيف لبضع ثوان، وإضافة 3 مل من تثبيتي انخفاض حل قطرة مع الهز المستمر.
  10. احتضان لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ثم الطرد المركزي في 400 x ج لمدة 5 دقائق.
  11. إزالة طاف وتفتيت الخلية بيليه مع جنتلو التنصت، وإضافة 3 مل مثبت الطازجة.
  12. أجهزة الطرد المركزي في 400 x ج لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة، وإزالة طاف. تفريق بيليه الخلية مع التنصت لطيف، وإضافة جديدة 3 مل مثبت.
  13. كرر الخطوة 3.12 مرتين أكثر.
  14. أجهزة الطرد المركزي في 400 x ج لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة، وإزالة طاف دون الإخلال بيليه الخلية. ثم إضافة 400-600 ميكرولتر تثبيتي، وتخلط جيدا مع pipetting ل.
  15. إسقاط 30 ميكرولتر خلايا ثابتة على الشرائح قبل تنظيفها والرطب يميل بزاوية 45 درجة، والسماح للشرائح في الهواء الجاف تماما بين عشية وضحاها.

4. ماوس كروموسوم الطلاء بواسطة mFISH

  1. كروموسوم تمسخ
    1. ضع الشريحة التي تحتوي على هوامش خلية الطورية في 2X SSC لمدة 2 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
    2. يذوى الشرائح عن طريق غسل الايثانول التسلسلي لمدة 2 دقيقة لكل منهما في 70٪، 80٪، و 100٪. احتضان لمدة 60 دقيقة عند 65 درجة مئوية.
    3. سخن 40 مل تمسخ الحل (70٪ الفورماميد / 2X SSجيم؛ درجة الحموضة 7.0) إلى 70 درجة مئوية (± 2 درجة مئوية) في جرة Coplin زجاج لمدة 30 دقيقة. تفسد الكروموسومات التي يحتضنها الشريحة في حل تمسخ قبل تحسنت 1 - 1.5 دقيقة.
    4. إخماد الانزلاق على الفور في الجليد الباردة الايثانول 70٪ لمدة 2 دقيقة لوقف عملية تمسخ، وكذلك لمنع الكروموسومات التشويه والتحريف من إعادة الصلب. ثم جفف عن طريق الغسيل مع 80٪ من الإيثانول لمدة 2 دقيقة. تكرار غسل الإيثانول مع الإيثانول بنسبة 100٪ لمدة 2 دقيقة. تماما تجف الشريحة في درجة حرارة الغرفة.
  2. تمسخ وتهجين دقق خليط
    1. أجهزة الطرد المركزي لفترة وجيزة الخليط التحقيق الموردة من قبل الشركة المصنعة، ونقل 10 ميكرولتر من خليط التحقيق في 500 ميكرولتر المفاجئة غطاء أنبوب الطرد المركزي، وتفسد من الحضانة عند 80 درجة مئوية (± 2 درجة مئوية) في حمام مائي لمدة 7 دقائق.
    2. وضع أنبوب الطرد المركزي مع خليط التحقيق في حمام مائي عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة.
    3. ضعي الخليط التحقيق التشويه والتحريف على الشريحة مع chromoso التشويه والتحريفزارة التربية والعلم.
    4. تغطية بعناية المنطقة مع 18 مم × 18 مم غطاء زجاجي زلة والقضاء على أي فقاعات الهواء مرئية عن طريق الضغط بلطف جدا زلة غطاء على الشريحة. اغلاق جميع الجوانب الأربعة من زلة غطاء مع الاسمنت والمطاط واحتضان لمدة 12 ساعة إلى 16 ساعة في الظلام عند 37 درجة مئوية في غرفة ترطيب لتهجين.
  3. آخر التهجين الغسيل وكشف
    1. إزالة بعناية الاسمنت والمطاط وانزلاق الغطاء.
    2. الشرائح مكان في SSC 0.4x قبل تحسنت في 74 درجة مئوية (± 2 درجة مئوية) لمدة 5 دقائق.
    3. غسل الشريحة في غسل حل ثانيا (4X SSC / 0.1٪ توين 20) لمدة 2 دقيقة.
    4. ضع 20 ميكرولتر من مكافحة تتلاشى المتوسطة المتزايدة مع دابي مباين (1.5 ميكروغرام / مل)، وتغطي مع ساترة الزجاج. اضغط برفق على ساترة مع الأنسجة مختبر لإزالة فقاعات الهواء وحل تصاعد الزائد. ختم حواف ساترة مع طلاء الأظافر.
    5. عرض الشرائح باستخدام المجهر الفلورسنت مزودة بمرشحات المناسبة.

    5. الطيفي تنميط نووي (سكاى) من الكروموسومات ماوس

    1. كروموسوم والتحقيق تمسخ
      1. يوازن الشرائح في 2X SSC في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 دقيقة، دون أن تهتز.
      2. يذوى الشرائح في سلسلة الايثانول (70٪، 80٪، والإيثانول بنسبة 100٪) لمدة 2 دقيقة لكل منهما في درجة حرارة الغرفة. الهواء الجاف الشريحة لإزالة الايثانول تماما.
      3. دافئ 40 مل من محلول تمسخ (70٪ الفورماميد / 2X SSC، 7.0 درجة الحموضة) في جرة Coplin زجاج لمدة 30 دقيقة.
      4. احتضان الشريحة في حل تمسخ قبل تحسنت ل 1 إلى 1.5 دقيقة.
      5. على الفور تزج الشريحة في الجليد الباردة الايثانول 70٪ لمدة 2 دقيقة لوقف عملية تمسخ، وكذلك لمنع الكروموسومات التشويه والتحريف من إعادة الصلب.
      6. يذوى الشرائح عن طريق وضعها في 80٪ من الإيثانول لمدة 2 دقيقة ثم إلى 100٪ من الإيثانول لمدة 2 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
      7. تفسد التحقيق SKY (قارورة رقم 1 التي توفرها الشركة المصنعة) في حمام مائي تعيين إلى 80 درجة مئوية (± 2 درجة مئوية)لمدة 7 دقائق، ثم وضع على الفور في حمام مائي مجموعة مختلفة إلى 37 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة.
    2. مسبار التهجين
      1. إضافة 10 ميكرولتر من التحقيق SKY التشويه والتحريف على الكروموسومات التشويه والتحريف.
      2. وضع بعناية على 18 ملم × 18 ملم ساترة الزجاج على التحقيق SKY بحيث محاصرون جود فقاعات الهواء تحت ساترة.
      3. ختم حواف ساترة مع الاسمنت والمطاط.
      4. ضع الشريحة في غرفة lightproof ترطيب واحتضان في الظلام عند 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة إلى 36 ساعة.
    3. الغسل بعد التهجين وكشف الإسفار
      1. إزالة الاسمنت والمطاط بعناية فائقة من دون إزعاج ساترة.
      2. ضع الشريحة في قبل تحسنت حل الغسيل السريع (0.4x SSC) عند 72 درجة مئوية (± 2 درجة مئوية) لمدة 5 دقائق مع الهز المستمر. تزج الشريحة في غسل حل ثالثا (4X SSC / 0.1٪ توين 20)، واحتضان لمدة 1 دقيقة في حين تهتز.
      3. اختياري: إضافة 80 ميكرولتر من عرقلة كاشف(قارورة رقم 2 التي توفرها الشركة المصنعة) على مجال التهجين، ووضع 24 ملم × 60 ملم ساترة البلاستيك، واحتضان في الظلام عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة في غرفة ترطيب.
      4. إزالة بلطف ساترة البلاستيك وغسل الشريحة مع ما قبل تحسنت (45 درجة مئوية) حل غسل الثالث لمدة 5 دقائق.
      5. تطبيق 80 ميكرولتر من Cy5 تلطيخ كاشف (قارورة رقم 3 التي توفرها الشركة المصنعة)، وضع 24 ملم × 60 ملم ساترة البلاستيك، واحتضان عند 37 درجة مئوية في الظلام لمدة 40 دقيقة في غرفة ترطيب.
      6. تراجع الشريحة في وعاء زجاجي Coplin يحتوي قبل حرارة (45 درجة مئوية) غسل حل ثالثا (4X SSC / 0.1٪ توين 20)، واحتضان عند 45 درجة مئوية في حمام مائي لمدة 2 دقيقة مع اهتزاز. كرر هذه الخطوة غسل 3 مرات.
      7. تطبيق 80 ميكرولتر من Cy5.5 تلطيخ كاشف (قارورة رقم 4 التي توفرها الشركة المصنعة)، وضع 24 ملم × 60 ملم ساترة البلاستيك، واحتضان عند 37 درجة مئوية في الظلام لمدة 40 دقيقة في غرفة ترطيب.
      8. غسل الشريحة 3 مرات مع قبل حرارة (45 درجة مئوية) حل غسل الثالث.
      9. عقد الشريحة في موقف يميل ضد منشفة ورقية لتجفيف السوائل الزائدة. إضافة 20 ميكرولتر مكافحة تتلاشى دابي كاشف (قارورة رقم 5 المقدمة من قبل الشركة المصنعة) ووضع بعناية 24 ملم × 60 ملم ساترة الزجاج دون إدخال أي فقاعات الهواء. ختم حواف ساترة مع طلاء الأظافر ونلاحظ مع المجهر epifluorescence مجهزة لالتقاط الصور SKY.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

إجمالي إشعاع الجسم يدفع العديد من الانحرافات الكروموسومية في خلايا نخاع العظام من الفئران المعرضة للإشعاع. تم تحسين البروتوكول الحالي في الجسم الحي اعتقال الإنقسامية من خلايا نخاع العظام بعد التعرض للإشعاع، والحصاد من خلايا نخاع العظام من رجليه الخلفيتين من الفئران المعرضة للإشعاع وعزل خلايا نخاع العظام وحيدات النوى بواسطة الطرد المركزي كثافة التدرج، وإعداد ينتشر خلية الطورية، وبعدها الكشف عن التشوهات الكروموسومية مستقرة الإشعاع الناجم بواسطة تقنيات mFISH وSKY. كروموسوم اللوحة باستخدام هذه التقنيات يمكن أن تستخدم لكشف وتقييم مخاطر مختلف الظروف المرضية.

ويبين الشكل 1 ينتشر خلية الطورية التمثيلية العادية والشاذة كروموسوم الماوس أزواج-1، -2، و -3. ويبين الشكل 2 تنميط نووي الطيفي من الكروموسومات الماوس الطورية العادية وغير العادية.وتشير هذه النتائج إلى أن الإشعاع المؤين يدفع بين الكروموسومات الانحرافات مستقرة في الخلايا المتكاثرة الفئران نخاع العظام، والتي تتألف أساسا من الجذعية والسلف الخلايا التي هي المسؤولة عن تجديد الذات والتمايز إلى أنواع الخلايا المختلفة. وقد ثبت أن التعديلات الوراثية الخلوية في الخلايا الجذعية والسلف لربط مع مختلف الأمراض السريرية، بما في ذلك السرطان، وتعتبر أن تكون أقوى تنبئ عن خطورة المرض والبقاء على قيد الحياة. ولذلك، فمن المنطقي أن نستنتج أن المؤينة مستقرة الانحرافات الناجمة عن الإشعاع بين الكروموسومات قد يسبب زيادة خطر تطور مرض السرطان.

شكل 1
الشكل 1: تأثير الإشعاع على الخلايا نخاع العظم من الفأر المشع كما كشفتها mFISH. A و B تظهر انتشار الماوس خلية الطورية مع أزواج طبيعية من الفصلromosome-1 (الحمراء)، كروموسوم 2 (الأخضر)، وكروموسوم 3 (أكوا). وcounterstained جميع الكروموسومات الأخرى مع دابي (الأزرق). C يدل على انحراف مستقرة تنطوي على كروموسوم-1، وقد تم دمج جزء من كروموسوم-1 في (دابي) كروموسوم غير رسمها، في حين أن جزءا آخر قد شكلت جزء لامركزي. يظهر D تم دمج جزء من جزء من الكروموسوم-2 في كروموسوم غير رسمها. يمثل E انحراف مستقرة تنطوي على كروموسوم 3. يظهر F انحراف مستقرة تضم جميع الكروموسومات ثلاثة رسمها. يشار إلى نقاط لكسر الارسال وتقاطعات اللون عن طريق الأسهم. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2
الشكل 2: تأثير الإشعاع على العظام مارخلايا آه من المشع ماوس كما كشفتها SKY. تظهر لوحة العليا لتنميط نووي الطيفي العادي (سكاى) من C57BL / 6 الماوس الإناث. تظهر لوحة المتوسطة انحراف مستقرة تنطوي على كروموسوم-4 و كروموسوم 12. وتظهر اللوحة السفلى الماوس تنميط نووي الطيفي مع انحراف الكروموسومات مستقرة تنطوي على كروموسوم 7 وكروموسوم 10. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

العديد من الخطوات الهامة التي تحدد نجاح mFISH وSKY. الخطوة الأولى والأكثر أهمية هو لتحسين معاملة الكولشيسين في الجسم الحي اعتقال الإنقسامية من الخلايا وحيدة النواة نخاع العظام. تركيز الكولشيسين والعلاج الوقت بمفرده أو بالتنسيق تحديد مؤشر الإنقسامية وكذلك كروموسوم التكثيف اثنين من أهم الشروط الأساسية لوحة كروموسوم فعالة. وتركيز عال الكولشيسين أو أطول وقت العلاج يؤدي إلى الكروموسومات مكثفة للغاية، والتي تتنافى لتمسخ السليم والتهجين. وعلاوة على ذلك، وتحديد دقيق لإعادة ترتيب معقدة في خلية الطورية مع انتشار الصبغيات المختصرة ليست مهمة سهلة لتحقيقه. إدارة داخل الصفاق من 100 ميكرولتر 0.05٪ الكولشيسين لمدة 2 ساعة في الفأر مع وزن الجسم بين 22 و 26 ز تنتج عدد كاف من الخلايا الطورية ينتشر مع الكروموسومات مكثفة باعتدال. الخطوة الثانية الحاسمة هي العلاج ناقص التوتر.وحدة التخزين، وقت العلاج، ودرجة حرارة ناقص التوتر الحل تأثير كروموسوم التشكل وانتشار الصبغيات على شريحة زجاجية. علاج ناقص التوتر لفترة زمنية أقصر أو في درجة حرارة دون المستوى الأمثل يمكن أن يمنع الكروموسوم المناسب الانتشار، مما أدى إلى خلية الطورية مع انتشار الصبغيات المتراكبة. كروموسوم تداخل يتداخل مع المصب في عملية التهجين الموقع، خصوصية إشارات الفلورسنت، وتحديد السليم لإعادة ترتيب.

وثالثا، تثبيت بعد ناقص التوتر هو خطوة هامة لتجنب تشكيل خلية أجمة. وينبغي أن يضاف تثبيتي ببطء أسفل الجانب من أنبوب الطرد المركزي مع ثابت لطيف تهتز للحصول على تعليق خلية واحدة. خلاف ذلك، سوف ينتشر خلية الطورية تصبح المحاصرين في كتل وستتعرض للخطر كروموسوم ينتشر. ومع ذلك، كروموسوم نشر يعتمد أيضا على نوع من الخلايا، ودرجة الحرارة، والرطوبة النسبية في رIME إسقاط تعليق الخلية على الشرائح الزجاجية. وأفادت دراسة سابقة أجراها Spurbeck أن لالخلايا الليمفاوية، والرطوبة النسبية 60٪ و 20 درجة مئوية درجة حرارة نتيجة في أعلى منطقة الطورية 18. وبالإضافة إلى ذلك، ومدة التجفيف هو أيضا خطوة حاسمة لينتشر كروموسوم الأمثل. تنتشر الخلايا الطورية أن يجف بسرعة كبيرة جدا تنتج هوامش ضيقة مع العديد من الكروموسومات متداخلة، في حين أن النتائج تجفيف بطيئة جدا في الطورية كسر الكروموسومات 18. ومع ذلك، أظهرت دنغ أن كروموسوم نشر في المقام الأول يعتمد على الرطوبة النسبية لمجموعة متنوعة من الخلايا المستزرعة 19. في خطوة هامة الرابعة هي لتحسين كروموسوم الوقت تمسخ. وقتا أطول وأقصر تمسخ تؤثر سلبا على التحقيق التهجين. أطول تمسخ يسبب الكروموسومات "منتفخ"، في حين يعوق أقصر تمسخ التفاعل من التحقيق الى الكروموسومات. وهناك طريقة أخرى للحد من كروموسوم "الانتفاخ" هي الشرائح العمرية بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة تكونخطوة تمسخ الصدارة. الشرائح لا تستخدم لطلاء كروموسوم على الفور، ويمكن تخزين إلى أجل غير مسمى في مجفف عند درجة حرارة -20 درجة مئوية. يحتاج الى وقت كروموسوم تمسخ لتكون موحدة مع سن الشرائح، وكمية السيتوبلازم حول ينتشر خلية الطورية، والرطوبة التي أسقطت الخلايا على الشرائح. التحقيق تمسخ وتهجين مهم لنجاح اللوحة كروموسوم أيضا. وينبغي تجنب التعرض المباشر للتحقيقات للضوء الساطع، بحيث إشارة الفلورسنت لا يفقد كثافة الإشارة.

وراسخة أن mFISH وSKY هي تقنيات قوية للكشف عن بين الكروموسومات الانحرافات مستقرة. يمكن بسهولة أي إعادة ترتيب وكذلك الخسارة أو الربح من الكروموسومات رسمت تحديدها من قبل هاتين الطريقتين. ومع ذلك، والكشف عن ذراع داخل وبين الذراع التبادل الكروموسومات ليست ممكنة من هذه التقنيات. أصبحت التعرف على ذراع داخل وبين الذراع التبادل الكروموسومات الممكن الآن BECAاستخدام وتطوير، على التوالي، كروموسوم الذراع محددة تحقيقات متعدد الألوان الأسماك وmBAND تحقيقات الأسماك. وقد أظهرت دراسة سابقة على العمال نووي سابق هذا التحليل mBAND هو أداة قوية لتحديد التوقيعات فريدة من أضرار الإشعاع 20. وعلاوة على ذلك، وتحديد تبادل chromatid الشقيقة، وهي سمة مميزة من أضرار الإشعاع 21، ليس من الممكن عن طريق هذه التقنيات. وبالإضافة إلى ذلك، على حد سواء mFISH وSKY لها قدرة محدودة على رسم منطقة القسيم المركزي من الكروموسومات، مما قد يؤدي في التهديف الخاطئ للكروموسوم ثنائي القسيم المركزي كما النبات. التقنيات هي أيضا ليست مناسبة لتحديد توطين نقطة توقف المحدد من النبات. بالإضافة إلى ذلك، إشارات الفلورسنت لا يمكن الحفاظ عليها بشكل دائم، تنخفض كثافة إشارة مع مرور الوقت، والفلورسنت اللوحة كروموسوم غير مناسب لتحليلها من قبل نظام آلي. ومع ذلك، شدة إشارة الفلورسنت يمكن الحفاظ عليه لفترة أطول من الوقت عن طريق تخزين انزلقوفاق في الثلاجة.

وقد وضعت اثنين من أساليب محسنة من اللوحة الصبغي للتغلب على القيود المفروضة على mFISH وSKY: على التوالي، غير الفلورسنت كروموسوم اللوحة 22 و اللون الطيفي النطاقات (SCAN) 23. وتشمل مزايا اللوحة كروموسوم غير الفلورسنت باستخدام البيروكسيديز / diaminobenzidine (DAB) على اللوحة FISH التحديد الدقيق للمنطقة القسيم المركزي، وتحديد إعادة ترتيب الكروموسومات التي كتبها المجهر مشرق الميدان، وذلك إشارة غير الفلورسنت هو الحفاظ بشكل دائم وتحليل الصور يمكن أن يكون آليا. من ناحية أخرى، فإن SCAN هو مفيد أكثر من سكاي ليتم إعداد تحقيقات SCAN من الموجات محددة تسلسل الحمض النووي الجيني لكروموسوم معين وبالتالي، يمكن أن تحدد بدقة منشأ الفرقة كروموسوم. كما يسهل SCAN تحديد المبادلات البينية الكروموسومات. النظر في فوائد تقنيات محسنة، وهذه ينبغي أن ينظر للاستخدام الروتيني طالاختبار الوراثي الخلوي ن السريري. ومع ذلك، وإعداد تحقيقات عن تسلسل الحمض النووي الجيني الموجات محددة لكل زوج الكروموسوم يمثل تحديا تقنيا ويحد من استخدامه في علم الوراثة الخلوية الجزيئية.

تحديد ما إذا كان الفرق بين مجموعات العلاج هو ذات دلالة إحصائية أم لا هو جانب هام آخر من علم الوراثة الخلوية الجزيئية. سجل المعايير، مثل عدد من الخلايا الطورية ينتشر تحصى، وعدد من الحيوانات المستخدمة في مجموعة العلاج، عدد الكروموسومات في كل خلية الطورية ينتشر خلال التحليل والتسميات المستخدمة لتصنيف الانحرافات لوحظ بعد اللوحة كروموسوم، وما إلى ذلك لعب دورا حاسما في تحديد حالة عدم اليقين الإحصائي بين مجموعات العلاج. على الرغم من المختبرات المختلفة لها معايير تسجيل الملكية، وسجل من 100-300 و 20 الطورية خلية ينتشر مع 40 الكروموسومات فصل جيدا في ما لا يقل عن 3-5 الفئران ويوصى عموما لتحديد الدلالة الإحصائية في mFISH والشرج SKYيسيس، على التوالي 24 و 25. وعلاوة على ذلك، فإن اختيار التسميات المستخدمة لتصنيف الانحرافات في الكروموسومات رسمت هو معيار مهم لتقييم إحصائيا عدم اليقين. هناك نوعان من أنظمة التسميات الشعبية في استخدامها لوصف الانحرافات الكشف عنها بواسطة بأكملها تحقيقات كروموسوم اللوحة: (1) S & S طريقة التصنيف من قبل سافاج وسيمبسون 26 و 27 و (2) التسميات البويات تكر وآخرون. 28. يعتمد كل نظام على متطلبات مختلفة لتصنيف التشوهات الكروموسومية الهيكلية ومزاياه وعيوبه. مؤشر S & S نظام مناسب في المقام الأول لتفسير الآلية من أصل انحراف، بينما يوفر البويات وصفا للأنماط اللوحة غير طبيعية. الدراسات التي Knehr وآخرون. على التشوهات الكروموسومية التي يسببها الإشعاع في الأسماك رسمت الكروموسومات تشير إلى أن طريقة البويات، مثل نظام S & S، ويمكن أيضا أن تستخدم لتحديد أصل انحراف مع بعض modificatiعلى في معايير التسجيل وسيكون أكثر فائدة للتطبيق العملي 29.

كلتا الطريقتين mFISH وSKY لها حدودها الخاصة. على سبيل المثال، يسمح mFISH التهديف السريع مع قليل من التدريب، ومع ذلك، فإنه لا يحجب كل الكروموسومات لقياس تردد انحراف ويكشف فقط جزئي تردد انحراف، وهذا يتوقف على عدد الكروموسومات رسمت المستخدمة في الدراسة. ومع ذلك، جزء من إجمالي التبادل التي لاحظها كروموسوم اللوحة كلها يمكن تقدير الصيغة المفترضة في الأصل لوكاس وآخرون. 30 وكذلك تعديلها من قبل Braselmann وآخرون. 31. وتعتبر هذه الصيغة الرياضية التبادل بين الكروموسومات رسمت وبين الكروموسومات رسمت و counterstained. على سبيل المثال، دعونا و ص تمثل مجموع كسور من الجينوم من الكروموسومات رسمت مغطاة 1 1) (2)، و (2) و 3 3)، عرجإعادة و 1 = 0.0696، و 2 = 0.0649، وو 3 = 0.0570، وتمثل القيم المحتوى الجيني من الكروموسومات الفردية في إناث الفئران. وبالتالي، يصبح و ص = (و 1 + و 2 + و 3) = 0.192 وجزء counterstained (1 - و ص) = 0.808. يمكن بسهولة أن تحسب وتيرة التبادل التي تنطوي رسمت و counterstained الكروموسومات (F P) من قبل المنتج عبر التوسع ذي الحدين (ع + ف) 2 = ص 2 + 2PQ + ف حيث ص = و ص و q = (1 - ع و). وهكذا، F P = 2PQ = 2F ص (1 - و ص) = 0.310، وهو ما يعني 31٪ من التبادل الكروموسومات يمكن ملاحظتها بعد اللوحة كروموسوم الماوس-1، -2، و -3. لذلك، لا بد من سجل لتعادل واحد الخلايا الطورية النطاقات أو أحد الجينوم يعادل كله 1 / 0.31 = 3.23 الخلايا. وعلاوة على ذلك، على حد سواء mFISH وSKY والقدرة على specif محدودةتحديد ically الجينات التي ونقاط التوقف وتشارك في تشكيل انحراف وأيضا للكشف عن الازدواجية صغيرة، العكس، والحذف.

تطبيق mFISH وتحليل السماء لا يقتصر على البحوث الأساسية. بشكل منتظم يجري استخدامها على حد سواء في الدراسات السريرية. كما تم تطبيق هذه التقنيات لمرحلة ما قبل الولادة وبعد الولادة تشخيص وتقييم المخاطر، وتحديد أنواع مختلفة من السرطان. وعلاوة على ذلك، فإن كلا من التقنيات يمكن أن تستخدم لطلاء الكروموسومات البيني. تستخدم سوكولوفا mFISH لرسم الصبغيات البيني لأول مرة 32. وتستخدم هذه التقنيات أيضا لتقدير الجرعة بعد التشعيع وتقييم المخاطر في البشر بعد التعرض العرضي أو المتعمد للإشعاع 11، 33 المؤينة. لذلك، تحليل الجينوم جزئي أو كامل من قبل mFISH أو SKY، على التوالي، هي أدوات مفيدة لكشف ما بين الكروموسومات الانحرافات مستقرة للدراسات مختلفة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

وأيد هذه الدراسة من قبل أركنساس الفضاء منح اتحاد والمعهد القومي للبحوث الفضاء الطبية الحيوية من خلال الإدارة الوطنية للملاحة الجوية والفضاء، يمنح NNX15AK32A (RP) وRE03701 (MH-J)، وP20 GM109005 (MH-J)، وإدارة المحاربين القدامى في الولايات المتحدة ( MH-J). نشكر كريستوفر Fettes، منسق برنامج لإدارة البيئة والصحة المهنية في جامعة أركنساس للعلوم الطبية، للمساعدة التحريرية في إعداد المخطوطة.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Formamide Sigma-Aldrich 221198-100ML
SSC Buffer 20× Concentrate Sigma-Aldrich S6639-1L
SKY Laboratory Reagent for Mouse Applied Spectral Imaging FPRPR0030/M40
CAD - Concentrated Antibody Detection Kit Applied Spectral Imaging FPRPR0033
Single Paints Customized - 3 Colors; Mouse chromosome 1: Red, Mouse chromosome 2: Green, Mouse chromosome 3: Aqua Applied Spectral Imaging FPRPR0182/10
Glass coverslips Fisher Scientific 12-545B
Tween 20 Fisher Scientific BP337-100
Hydrochloric acid, 37%, Acros Organics Fisher Scientific AC45055-0025 
Fisherbrand Glass Staining Dishes  with Screw Cap Fisher Scientific 08-816
KaryoMAX Potassium Chloride Solution  Life Technologies 10575-090
Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides Fisher Scientific 12-550-15
Colcemid powder Fisher Scientific 50-464-757 
Histopaque-1083  Sigma-Aldrich 10831
Shepherd Mark I, model 25 137Cs irradiator J. L. Shepherd & Associates Model 484B
Syringe 1 mL BD Biosciences 647911
Ethyl Alcohol, 200 Proof Fisher Scientific MEX02761
PBS, (1x PBS Liq.), w/o Calcium and Magnesium Fisher Scientific ICN1860454
Fetal Bovine Serum Fisher Scientific 10-437-010
Methanol Fisher Scientific A454SK-4
Glacial acetic acid Fisher Scientific AC295320010
Zeiss Microscope Zeiss AXIO Imager.Z2

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kodama, Y., et al. Stable chromosome aberrations in atomic bomb survivors: results from 25 years of investigation. Radiat Res. 156, 337-346 (2001).
  2. Lucas, J. N. Cytogenetic signature for ionizing radiation. Int J Radiat Biol. 73, 15-20 (1998).
  3. Zaccaria, A., Barbieri, E., Mantovani, W., Tura, S. Chromosome radiation-induced aberrations in patients with Hodgkin's disease. Possible correlation with second malignancy? Boll. Ist. Sieroter. Milan. 57, 76-83 (1978).
  4. Fisher, N. L., Starr, E. D., Greene, T., Hoehn, H. Utility and limitations of chromosome banding in pre- and postnatal service cytogenetics. Am J Med Genet. 5, 285-294 (1980).
  5. Hande, M. P., et al. Complex chromosome aberrations persist in individuals many years after occupational exposure to densely ionizing radiation: an mFISH study. Genes Chromosomes. Cancer. 44, 1-9 (2005).
  6. Gall, J. G., Pardue, M. L. Formation and detection of RNA-DNA hybrid molecules in cytological preparations. Proc Natl Acad Sci U S A. 63, 378-383 (1969).
  7. Bauman, J. G., Wiegant, J., Borst, P., van, D. P. A new method for fluorescence microscopical localization of specific DNA sequences by in situ hybridization of fluorochromelabelled RNA. Exp Cell Res. 128, 485-490 (1980).
  8. Hopman, A. H., et al. Bi-color detection of two target DNAs by non-radioactive in situ hybridization. Histochemistry. 85, 1-4 (1986).
  9. Nederlof, P. M., et al. Three-color fluorescence in situ hybridization for the simultaneous detection of multiple nucleic acid sequences. Cytometry. 10, 20-27 (1989).
  10. Nederlof, P. M., et al. Multiple fluorescence in situ hybridization. Cytometry. 11, 126-131 (1990).
  11. Szeles, A., Joussineau, S., Lewensohn, R., Lagercrantz, S., Larsson, C. Evaluation of spectral karyotyping (SKY) in biodosimetry for the triage situation following gamma irradiation. Int J Radiat Biol. 82, 87-96 (2006).
  12. Camparoto, M. L., Ramalho, A. T., Natarajan, A. T., Curado, M. P., Sakamoto-Hojo, E. T. Translocation analysis by the FISH-painting method for retrospective dose reconstruction in individuals exposed to ionizing radiation 10 years after exposure. Mutat. Res. 530, 1-7 (2003).
  13. Edwards, A. A critique of 'Collaborative exercise on the use of FISH chromosome painting for retrospective biodosimetry of Mayak nuclear-industrial personnel. Int J Radiat Biol. 78, 867-871 (2002).
  14. Bauchinger, M., et al. Collaborative exercise on the use of FISH chromosome painting for retrospective biodosimetry of Mayak nuclear-industrial personnel. Int J Radiat Biol. 77, 259-267 (2001).
  15. Hieber, L., et al. Chromosomal rearrangements in post-Chernobyl papillary thyroid carcinomas: evaluation by spectral karyotyping and automated interphase FISH. J Biomed. Biotechnol. 2011, 693691 (2011).
  16. Cohen, N., et al. detection of chromosome rearrangements in two cases of tMDS with a complex karyotype. Cancer Genet Cytogenet. 138, 128-132 (2002).
  17. Pathak, R., et al. The Vitamin E Analog Gamma-Tocotrienol (GT3) Suppresses Radiation-Induced Cytogenetic Damage. Pharm Res. (2016).
  18. Spurbeck, J. L., Zinsmeister, A. R., Meyer, K. J., Jalal, S. M. Dynamics of chromosome spreading. Am J Med Genet. 61, 387-393 (1996).
  19. Deng, W., Tsao, S. W., Lucas, J. N., Leung, C. S., Cheung, A. L. A new method for improving metaphase chromosome spreading. Cytometry A. 51, 46-51 (2003).
  20. Hande, M. P., et al. Past exposure to densely ionizing radiation leaves a unique permanent signature in the genome. Am J Hum Genet. 72, 1162-1170 (2003).
  21. Tug, E., Kayhan, G., Kan, D., Guntekin, S., Ergun, M. A. The evaluation of long-term effects of ionizing radiation through measurement of current sister chromatid exchange (SCE) rates in radiology technologists, compared with previous SCE values. Mutat. Res. 757, 28-30 (2013).
  22. Kanda, R., et al. Non-fluorescent chromosome painting using the peroxidase/diaminobenzidine (DAB) reaction. Int J Radiat Biol. 73, 529-533 (1998).
  23. Kakazu, N., et al. Development of spectral colour banding in cytogenetic analysis. Lancet. 357, 529-530 (2001).
  24. Rithidech, K. N., Honikel, L., Whorton, E. B. mFISH analysis of chromosomal damage in bone marrow cells collected from CBA/CaJ mice following whole body exposure to heavy ions (56Fe ions). Radiat Environ Biophys. 46, 137-145 (2007).
  25. Abrahams, B. S., et al. Metaphase FISHing of transgenic mice recommended: FISH and SKY define BAC-mediated balanced translocation. Genesis. 36, 134-141 (2003).
  26. Savage, J. R., Simpson, P. On the scoring of FISH-"painted" chromosome-type exchange aberrations. Mutat. Res. 307, 345-353 (1994).
  27. Savage, J. R., Simpson, P. FISH "painting" patterns resulting from complex exchanges. Mutat. Res. 312, 51-60 (1994).
  28. Tucker, J. D., et al. PAINT: a proposed nomenclature for structural aberrations detected by whole chromosome painting. Mutat. Res. 347, 21-24 (1995).
  29. Knehr, S., Zitzelsberger, H., Bauchinger, M. FISH-based analysis of radiation-induced chromosomal aberrations using different nomenclature systems. Int J Radiat Biol. 73, 135-141 (1998).
  30. Lucas, J. N., et al. Rapid translocation frequency analysis in humans decades after exposure to ionizing radiation. Int J Radiat Biol. 62, 53-63 (1992).
  31. Braselmann, H., et al. SKY and FISH analysis of radiation-induced chromosome aberrations: a comparison of whole and partial genome analysis. Mutat. Res. 578, 124-133 (2005).
  32. Sokolova, I. A., et al. The development of a multitarget, multicolor fluorescence in situ hybridization assay for the detection of urothelial carcinoma in urine. J Mol Diagn. 2, 116-123 (2000).
  33. Lindholm, C., et al. Biodosimetry after accidental radiation exposure by conventional chromosome analysis and FISH. Int J Radiat Biol. 70, 647-656 (1996).
الكشف عن المشترك بين الكروموسومات الزيغ مستقرة من قبل الإسفار متعددة<em&gt; في الموقع</em&gt; التهجين (mFISH) والطيفية تنميط نووي (سكاى) في الفئران المشعع
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Pathak, R., Koturbash, I., Hauer-Jensen, M. Detection of Inter-chromosomal Stable Aberrations by Multiple Fluorescence In Situ Hybridization (mFISH) and Spectral Karyotyping (SKY) in Irradiated Mice. J. Vis. Exp. (119), e55162, doi:10.3791/55162 (2017).More

Pathak, R., Koturbash, I., Hauer-Jensen, M. Detection of Inter-chromosomal Stable Aberrations by Multiple Fluorescence In Situ Hybridization (mFISH) and Spectral Karyotyping (SKY) in Irradiated Mice. J. Vis. Exp. (119), e55162, doi:10.3791/55162 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter