Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Genetics

Påvisning af Inter-kromosomale Stabil Afvigelser fra Multiple Fluorescens doi: 10.3791/55162 Published: January 11, 2017

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Alle dyreforsøg blev udført i nøje overensstemmelse med anbefalingerne i Vejledning for Pleje og anvendelse af forsøgsdyr af National Institutes of Health. Dyret Protokollen blev godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg fra University of Arkansas for Medical Sciences. Alle dyr blev opstaldet under standard aircondition dyr facilitet på 20 ± 2 ° C med 10 - 15 time cykler af frisk luft og fri adgang til standard gnaver mad og vand. Ved ankomsten blev der afholdt musene i karantæne for 1 uge og forudsat certificeret gnaverfoder.

1.Radiation Eksponering og in vivo Anholdelsen af metafasecellerne

  1. Expose un-bedøvet mus til 2 Gy helkrops-stråling i en bestråling kammer. Under bestråling, at placere mus i et godt ventileret beholdning kammer sørg for at de ikke bevæger sig frit og modtage en ensartet dosis.
  2. Injicer 100 pi 0,05% colchicin opløsning (colchicine pulver opløst i calcium og magnesium frit PBS) intraperitonealt under anvendelse af en 25 G nål fastgjort med 1 ml engangssprøjte. Undgå injektion direkte ind i ethvert organ.
  3. Efterlad dyret i buret i 2 timer før knoglemarv cellehøst. Overhold dyret for tegn på smerte eller lidelse.

2. Bone Marrow Cell Harvest og isolering af knoglemarv mononukleære celler ved densitetsgradientcentrifugering

  1. Aflive musen ved CO 2 kvælning.
  2. Spray 70% ethanol på den dorsale og ventrale side.
  3. Foretag en 2 cm snit på den abdominale hud med en skarp saks. Tag fat i huden på hver side af snittet med stumpe pincet og træk forsigtigt åbne mavemusklerne.
  4. Skær begge bagbenene med en saks og straks placere dem i pre-kølet PBS med 4% FBS.
  5. Rengør omhyggeligt alle muskler er knyttet til bagben med en skarp barberblad og bomuld gazebind.
  6. Adskil tibia fra lårbenet. Trim begge spidserne af hver knogle med et barberblad.
  7. Skylle indholdet af knoglemarven med 3 ml PBS (med 4% FBS) med en 23 G nål fastgjort til en 3 ml sprøjte og indsamle indholdet i en 15 ml centrifugerør. Pass cellesuspensionen mindst 10 gange gennem nålen for at gøre en enkelt cellesuspension.
  8. overlay omhyggeligt cellesuspensionen på et tilsvarende volumen af ​​lymfocyt separationsmedium (3 ml) uden at forstyrre grænsefladen mellem cellesuspensionen og lymfocyt separationsmedium. Centrifuger ved 400 x g i 30 minutter ved stuetemperatur.
  9. Opsaml buffy coat omhyggeligt uden at forstyrre de andre lag og overførsel i en ny 15 ml centrifugerør.

3. Udarbejdelse af Metafase Cell Spreads

  1. Tilsæt 10 ml PBS til røret indeholdende buffy coat.
  2. Centrifuger ved 400 x g i 5 minutter ved stuetemperatur.
  3. Fjern forsigtigt supernatanten. Derefter bryde op than cellepelleten med blide aflytning og tilsæt 10 ml PBS.
  4. Centrifuger ved 400 x g i 5 minutter ved stuetemperatur.
  5. Fjern supernatanten uden at forstyrre cellepelleten, bryde op pelleten, og der tilsættes 4 ml foropvarmet hypotonisk 0,075 M kaliumchloridopløsning. Tilføj hypotonisk løsning dråbevis med blid konstant omrystning.
  6. Cellerne inkuberes i 20 minutter ved 37 ° C i et vandbad.
  7. Efter hypotonisk behandling, der tilsættes samme mængde (4 ml) af fiksativ (methanol: iseddikesyre, 3: 1 v / v) i 15 ml rør og blandes forsigtigt ved at vende røret.
  8. Centrifuger ved 400 x g i 5 minutter ved stuetemperatur og kassér supernatanten.
  9. Bryd cellepelleten med afklapning efterfulgt af blid vortex i et par sekunder, og tilsættes 3 ml fikseringsopløsning dråbevis med konstant omrystning.
  10. Inkuber i 30 minutter ved stuetemperatur og centrifugeres ved 400 xg i 5 min.
  11. Fjern supernatanten, bryde op cellepelleten med gentle aflytning, og tilsæt 3 ml frisk fiksativ.
  12. Centrifuger ved 400 x g i 5 min ved stuetemperatur, og supernatanten fjernes. Bryd cellepelleten med bankes let, og tilsæt frisk 3 ml fiksativ.
  13. Gentag trin 3.12 to gange mere.
  14. Centrifuger ved 400 x g i 5 min ved stuetemperatur, og fjern supernatanten uden at forstyrre cellepelleten. Derefter tilsættes 400 til 600 uL fiksativ og bland grundigt med pipettering.
  15. Drop 30 pi fikserede celler på forhånd rengjort og våde objektglas vippes med en 45 ° vinkel og tillade objektglassene lufttørre fuldstændigt natten over.

4. Mus Kromosom Maleri af MFISH

  1. kromosom Denaturering
    1. Anbring objektglas indeholdende metafase celle smørematerialer i 2x SSC i 2 minutter ved stuetemperatur.
    2. Dehydrere objektglasset ved seriel ethanol vask i 2 minutter hver i 70%, 80% og 100%. Inkuber i 60 minutter ved 65 ° C.
    3. Forvarm 40 ml denaturering opløsning (70% formamid / 2 x SSC; pH 7,0) til 70 ° C (± 2 ° C) i et glas Coplin-skål i 30 min. Denaturere kromosomer ved at inkubere objektglasset i foropvarmede denatureringsopløsning til 1 - 1,5 min.
    4. Quench glide straks i iskold 70% ethanol i 2 minutter for at stoppe denaturering proces samt at forhindre de denaturerede kromosomer fra re-annealing. Derefter dehydrere ved vask med 80% ethanol i 2 min. Gentag ethanol vask med 100% ethanol i 2 min. Helt tørre objektglas ved stuetemperatur.
  2. Denaturering og hybridisering af probe Blanding
    1. Kort fortalt centrifugeres probeblandingen leveret af fabrikanten, overføre 10 pi probe blandingen i en 500 pi snap cap centrifugerør, og denaturere ved inkubation ved 80 ° C (± 2 ° C) i et vandbad i 7 min.
    2. Anbring centrifugeglasset med probe blandingen i et vandbad ved 37 ° C i 10 min.
    3. Påfør denatureret sonde blandingen på objektglasset med denatureret chromosomes.
    4. dækker forsigtigt området med en 18 mm x 18 mm dækglas og fjerne eventuelle synlige luftbobler ved at trykke meget forsigtigt dækglasset til at glide. Forsegle alle fire sider af dækglasset med gummi cement og inkuberes i 12 timer til 16 timer i mørke ved 37 ° C i et fugtigt kammer til hybridisering.
  3. Indlæg Hybridisering Vask og Detection
    1. Fjern forsigtigt gummi cement og dækglasset.
    2. Sted slide i forvarmet 0,4x SSC ved 74 ° C (± 2 ° C) i 5 minutter.
    3. Vask dias i vask opløsning II (4x SSC / 0,1% Tween-20) i 2 minutter.
    4. Placer 20 pi anti-fade montering medium med DAPI kontrastfarve (1,5 mikrogram / ml) og tildækkes med et dækglas. Tryk forsigtigt på dækglasset med lab væv for at fjerne luftbobler og overskydende montering opløsning. Seal kanter dækglas med neglelak.
    5. Se dias ved hjælp af et fluorescerende mikroskop udstyret med passende filtre.

    5. Spectral Karyotyping (SKY) af Mouse kromosomer

    1. Kromosom og Probe Denaturering
      1. Ækvilibrer slide i 2 x SSC ved stuetemperatur i 2 minutter, uden omrystning.
      2. Dehydrer dias i en ethanol-serien (70%, 80% og 100% ethanol) i 2 minutter hver ved stuetemperatur. Air-tørre slide for at fjerne ethanol helt.
      3. Varm 40 ml denaturering opløsning (70% formamid / 2 x SSC; pH 7,0) i et glas Coplin-skål i 30 min.
      4. Inkuber dias i forvarmet denaturering løsning til 1 til 1,5 min.
      5. fordybe straks objektglasset i iskold 70% ethanol i 2 minutter for at stoppe denaturering proces samt at forhindre de denaturerede kromosomer fra re-annealing.
      6. Dehydrere objektglasset ved at placere det i 80% ethanol i 2 minutter og derefter i 100% ethanol i 2 minutter ved stuetemperatur.
      7. Denaturere SKY probe (hætteglas # 1 leveret af fabrikanten) i et vandbad indstillet til 80 ° C (± 2 ° C)i 7 minutter, og derefter straks anbringes i en anden vandbad indstillet til 37 ° C i 10 minutter.
    2. probehybridisering
      1. Tilsæt 10 uL denatureret SKY sonde på de denaturerede kromosomer.
      2. Placer forsigtigt en 18 mm x 18 mm dækglas på SKY sonden, så er fanget luftbobler under dækglasset.
      3. Forsegle kanterne af dækglasset med gummi cement.
      4. Placer dias i en befugtet lystæt kammer og inkuber i mørke ved 37 ° C i 24 timer til 36 timer.
    3. Post-hybridisering vask og fluorescensdetektion
      1. Fjern gummi cement meget forsigtigt uden at forstyrre dækglasset.
      2. Placer glider ind foropvarmet hurtig vaskeopløsning (0,4x SSC) ved 72 ° C (± 2 ° C) i 5 minutter under konstant omrystning. Fordybe glider ind vaskeopløsning III (4x SSC / 0,1% Tween 20) og inkuberes i 1 min under omrystning.
      3. Valgfrit: Tilføj 80 uL blokerende reagens(Hætteglas # 2 leveret af fabrikanten) på området for hybridisering, anbringes en 24 mm x 60 mm plast dækglas, og inkuberes i mørke ved 37 ° C i 30 minutter i et fugtigt kammer.
      4. Fjern forsigtigt plastic dækglasset og vask slide med forvarmet (45 ºC) vask løsning III i 5 min.
      5. Påfør 80 pi Cy5 farvning reagens (hætteglas # 3 leveret af fabrikanten), anbringes en 24 mm x 60 mm plast dækglas, og inkuberes ved 37 ° C i mørke i 40 minutter i et fugtigt kammer.
      6. Dyp objektglasset i et glas Coplin-skål indeholdende foropvarmet (45 ºC) vaskeopløsning III (4x SSC / 0,1% Tween 20) og inkuberes ved 45 ° C i et vandbad i 2 minutter under omrystning. Denne vaskeproces gentages trin 3 gange.
      7. Påfør 80 pi Cy5.5 farvning reagens (hætteglas # 4 leveret af fabrikanten), anbringes en 24 mm x 60 mm plast dækglas, og inkuberes ved 37 ° C i mørke i 40 minutter i et fugtigt kammer.
      8. Vask slide 3 gange med forvarmet (45 ºC) vask løsning III.
      9. Hold dias i en skrå stilling mod en papirserviet til at dræne overskydende væske. Tilføj 20 pi anti-fade DAPI reagens (hætteglas # 5 leveret af producenten), og anbring forsigtigt en 24 mm x 60 mm dækglas uden at indføre eventuelle luftbobler. Seal kanter dækglas med neglelak og observere med et epifluorescensmikroskop udstyret til at opfange SKY billeder.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Samlet krop bestråling inducerer adskillige kromosomafvigelser i knoglemarvsceller af bestrålede mus. Den nuværende protokol er optimeret til in vivo mitosestandsning af knoglemarvsceller efter eksponering for stråling, høst af knoglemarvsceller fra bagbenene af bestrålede mus, isoleringen af knoglemarven mononukleære celler ved densitetsgradientcentrifugering, fremstilling af metafase-celle opslag, og efterfølgende påvisning af stråling-induceret stabile kromosomafvigelser ved MFISH og SKY teknikker. Kromosom maleri brug af disse teknikker kan anvendes til at påvise og vurdere risikoen for forskellige patofysiologiske tilstande.

Figur 1 viser repræsentative metafase celle spreder med normale og afvigende mus kromosompar-1, -2 og -3. Figur 2 viser spektral karyotypering af normale og unormale mus metafase kromosomer.Disse resultater viser, at ioniserende stråling inducerer inter-kromosomale stabile afvigelser i de prolifererende murine knoglemarvsceller, som primært består af stamceller og stamceller, der er ansvarlige for selv-fornyelse og differentiering i forskellige celletyper. Cytogenetiske ændringer i stamceller og progenitorceller er blevet vist at associere med forskellige kliniske sygdomme, herunder cancer, og anses for at være de stærkeste prædiktorer for sygdommens sværhedsgrad og samlet overlevelse. Derfor er det logisk at udlede, at ioniserende stråling-induceret stabile inter-kromosomafvigelser kan forårsage øget risiko for udvikling af cancer.

figur 1
Figur 1: Effekt af stråling på knoglemarvsceller af en bestrålet Mouse som påvist ved MFISH. A og B viser en mus metafase celle-spredning med normale par af lmromosome-1 (rød), kromosom-2 (grøn), og kromosom-3 (aqua). Alle andre kromosomer er modfarvet med DAPI (blå). C viser stabil aberration involverer kromosom-1, har en del af kromosom-1 er integreret i en ikke-malet (DAPI) kromosom, mens en anden del er dannet et acentriske fragment. D viser en del af en del af kromosom-2 er blevet integreret i ikke-malet kromosom. E betegner stabil aberration involverer kromosom-3. F viser en stabil aberration involverer alle tre malede kromosomer. Brudpunkter og farve junctions er angivet med pile. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2
Figur 2: Effekt af stråling på Bone MarrOW Celler af bestrålede mus som påvist ved SKY. Det øverste panel viser en normal spektral karyotypebestemmelse (SKY) i C57BL / 6 hunmus. Det midterste panel viser en stabil aberration involverer kromosom-4 og kromosom-12. Det nederste panel viser mus spektral karyotypebestemmelse med en stabil kromosomafvigelser involverer kromosom-7 og kromosom-10. Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Flere kritiske trin bestemme succes MFISH og SKY. Den første og mest kritiske trin er at optimere colchicin behandling til in vivo mitosestandsning af knoglemarven mononukleære celler. Den colchicin koncentration og behandling individuelt eller sammen bestemme mitoseindeks samt kromosom kondens-to vigtige forudsætninger for effektiv kromosom maleri. En høj colchicin koncentration eller længere behandlingstid fører til højt kondenserede kromosomer, inkompatible for korrekt denaturering og hybridisering. Desuden præcis identifikation af komplekse rearrangementer i en metafase celle spredes med kondenserede kromosomer er ikke en let opgave at opnå. Intra-peritoneal administration af 100 pi 0,05% colchicin for 2 timer i en mus med en kropsvægt mellem 22 og 26 g producerer et passende antal metafase celle spreder med moderat kondenserede kromosomer. Det andet kritiske trin er hypotonisk behandling.Volumenet, behandlingstid, og temperaturen af ​​den hypotoniske opløsning indflydelse kromosom morfologi og spredning af kromosomer på objektglasset. En hypotonisk behandling for en kortere periode eller ved en sub-optimale temperatur kan forhindre den relevante kromosom spredning, hvilket resulterer i metafase celle spredes med overlappede kromosomer. Kromosom overlappende forstyrrer nedstrøms in situ hybridisering proces, specificitet fluorescerende signaler, og korrekt identifikation af omlejringer.

For det tredje, den post-hypotonisk fiksering er et vigtigt skridt for at undgå celle klump formation. Fiksativ bør tilsættes langsomt ned langs siden af ​​centrifugerøret med konstant forsigtig omrystning til opnåelse af en enkelt cellesuspension. Ellers vil metafase celle breder blive fanget i klumper og kromosom breder vil blive kompromitteret. Men kromosom spredning afhænger også af celletypen, temperatur og relativ fugtighed ved den time for at tabe cellesuspensionen på objektglas. En tidligere undersøgelse af Spurbeck rapporteret, at for lymfocytter, en 60% relativ fugtighed og en 20 ° C temperatur resulterer i højere metafase område 18. Desuden er varigheden af ​​tørringen er også et kritisk trin for optimal kromosom spredning. Metafase celle spreder at tørre for hurtigt producere stramme spreads med mange overlappende kromosomer, mens meget langsom tørring resulterer i brudte metafasekromosomer 18. Viste imidlertid, Deng, at kromosom spredning primært afhænger af relativ fugtighed i en lang række dyrkede celler 19. Det fjerde vigtige skridt er at optimere kromosom denaturering tid. En længere og kortere denaturering tid påvirke probehybridisering. Længere denaturering forårsager "oppustede" kromosomer, mens kortere denaturering hæmmer interaktion mellem probe til kromosomerne. En anden måde at reducere kromosom "hævelser" er at alder slides natten over ved stuetemperatur væreforgrunden denatureringstrin. Objektglas ikke anvendes til kromosom maleri straks, kan opbevares på ubestemt tid i en ekssikkator ved -20 * C. Kromosom denaturering tid skal standardiseres med glideren alder, mængden af ​​cytoplasmaet omkring metafase celle spreads, og luftfugtigheden, hvor celler blev dryppet på objektglassene. Probe denaturering og hybridisering er også vigtig for en vellykket kromosom maleri. Direkte udsættelse af prober for stærkt lys bør undgås, således at fluorescerende signal ikke mister signalintensitet.

Det er veletableret, at MFISH og SKY er kraftfulde teknikker til påvisning af inter-kromosomale stabile afvigelser. Eventuelle omrokeringer samt tab eller gevinst af malede kromosomer kan nemt identificeres ved disse to metoder. Men påvisning af intra-arm og inter-arm kromosomale udvekslinger er ikke muligt ved disse teknikker. Identifikation af intra-arm og inter-arm kromosomale udvekslinger er nu blevet muligt becabrug af udviklingen af ​​henholdsvis kromosom arm-specifikke flerfarvet FISH prober og mBAND FISH-prober. En tidligere undersøgelse af tidligere nukleare arbejdere har vist, at mBAND analyse er et kraftfuldt værktøj til at identificere unikke signaturer af stråling skader 20. Desuden identifikation af søsterkromatid udveksling, et karakteristisk træk ved stråleskader 21, er ikke mulig ved disse teknikker. Desuden har både MFISH og SKY begrænset evne til at male centromerregionen af ​​kromosomer, hvilket kan resultere i fejlagtig scoring af dicentric kromosom som translokation. Teknikkerne er heller ikke egnet til at identificere den nøjagtige breakpoint lokalisering af translokation. Derudover kan fluorescerende signaler ikke bevares permanent, aftager signalet intensitet med tiden, og fluorescerende kromosom maleri er ikke egnet til analyse af et automatiseret system. Imidlertid kan fluorescerende signal intensitet opbevares i et længere tidsrum ved at lagre gledes i fryseren.

Der er udviklet to forbedrede fremgangsmåder til kromosom maleri at overvinde begrænsningerne ved MFISH og SKY: henholdsvis ikke-fluorescerende kromosom maleri 22 og spektral farve banding (SCAN) 23. Fordelene ved ikke-fluorescerende kromosom maleri ved hjælp af peroxidase / diaminobenzidin (DAB) i løbet af FISH maleri omfatter præcis identifikation af centromerregionen, identifikation af kromosomal omlejring af lysfeltsbillede mikroskop, og at ikke-fluorescerende signal er permanent bevaret og billedet kan analyse automatiseres. På den anden side, SCAN er fordelagtig i forhold SKY fordi SCAN prober fremstilles ud fra band-specifikke genomiske DNA-sekvenser for en specifik kromosom og dermed kan præcist at identificere oprindelsen af ​​et kromosom-bånd. SCAN letter også identifikation af intra-kromosomale udvekslinger. I betragtning af fordelene ved de forbedrede teknikker, bør disse overvejes til rutinemæssig brug in kliniske cytogenetiske test. Men forberedelse af sonder fra band-specifikke genomisk DNA-sekvens for hver kromosompar er teknisk udfordrende og begrænser dens anvendelse i molekylær cytogenetik.

Bestemme, om forskellen mellem behandlingsgrupper er statistisk signifikant eller ikke er et andet vigtigt aspekt af molekylær cytogenetik. Scoring kriterier, såsom antallet af metafase celle spreder talt, antal dyr, der anvendes pr behandlingsgruppe, kromosom count per metafase celle spredes under analysen, nomenklatur, der anvendes til at klassificere aberrationer observeret efter kromosom maleri, etc. spiller en afgørende rolle i fastlæggelsen af den statistiske usikkerhed mellem behandlingsgrupper. Selvom forskellige laboratorier har proprietære scoring kriterier scoring på 100 til 300 og 20 metafase celle spreder med 40 godt adskilte kromosomer i mindst 3 til 5, mus anbefales generelt til bestemmelse af statistisk signifikans i MFISH og SKY analysis henholdsvis 24, 25. Endvidere valget af nomenklatur anvendes til at klassificere aberrationer i malet kromosomer er et vigtigt parameter i vurdering statistisk usikkerhed. Der er to populære nomenklatur systemer i brug til at beskrive afvigelser detekteret af hele kromosom maleri sonder: (1) S & S klassificering metode Savage og Simpson 26, 27 og (2) PAINT nomenklatur af Tucker et al. 28. Hvert system bygger på forskellige forudsætninger for klassificering af strukturelle kromosomforandringer og har sine egne fordele og ulemper. S & S system er primært egnet til mekanistiske fortolkning af aberration oprindelse, mens MALING giver en beskrivelse af unormale maleri mønstre. Undersøgelser foretaget af Knehr et al. på strålingsinducerede kromosomafvigelser i fisk malet kromosomer indikerer, at malingen metode, ligesom S & S-system, kan også anvendes til at bestemme aberration oprindelse med nogle modificatipå i kriterierne scoring og ville være mest nyttig til praktisk anvendelse 29.

Både MFISH og SKY metoder har deres egne begrænsninger. F.eks MFISH tillader hurtig scoring med lidt træning, giver den imidlertid ikke screene alle kromosomerne til måling aberrationshyppighed og afslører kun delvis aberrationshyppighed, afhængigt af antallet af malede kromosomer i undersøgelsen anvendte. Dog kan en brøkdel af de samlede udvekslinger observeret af hele kromosom maleri estimeres ved formlen oprindeligt postulerede af Lucas et al. 30 og yderligere modificeres ved Braselmann et al. 31. Denne matematiske formel anser udveksling mellem malede kromosomer og mellem malede og kontrastfarvet kromosomer. Lad os for eksempel f p repræsenterer fraktioneret summen af genomet er omfattet af de malede kromosomer 1 (f 1), 2 (f 2), 3 (f 3), where f 1 = 0,0696, f2 = 0,0649, og f 3 = 0,0570, værdierne repræsenterer den genomiske indholdet af individuelle kromosomer i hunmus. Derfor f p = (f 1 + f 2 + f 3) = 0,192 og modfarvet fraktion bliver (1 - f p) = 0,808. Hyppigheden af udvekslinger af malet og modfarvet kromosomer (F P) kan let beregnes ved indlægget produkt af binomial ekspansion (p + q) 2 = p 2 + 2PQ + q2, hvor p = f p og q = (1 - f p). Således F P = 2PQ = 2f p (1 - f p) = 0,310, hvilket betyder 31% af udvekslinger kromosomale er observerbare efter maling muse kromosom-1, -2, og -3. Derfor behøver 1 / 0,31 = 3,23 celler, der skal scoret til lige en banded metafase celler eller en hel genom tilsvarende. Desuden er både MFISH og SKY har begrænset evne til at speciftisk identificere, hvilke gener og breakpoints er involveret i aberration dannelse og også at detektere små overlapninger, inversioner og sletninger.

Anvendelsen af ​​MFISH og SKY analyse er ikke begrænset til grundforskning. Begge regelmæssigt anvendes i kliniske undersøgelser. Disse teknikker er også blevet anvendt på prænatal og postnatal diagnose, risikovurdering og identifikation af forskellige former for kræft. Endvidere kan både de teknikker anvendes til at male interfaseceller kromosomer. Sokolova brugte MFISH at male interfaseceller kromosomer for første gang 32. Disse teknikker anvendes også til post-strålingsdosis estimering og risikovurdering hos mennesker efter utilsigtet eller tilsigtet udsættelse for ioniserende stråling 11, 33. Derfor delvis eller hele genomet analyse fra MFISH eller SKY henholdsvis er nyttige værktøjer til påvisning inter-kromosomale stabile afvigelser for forskellige undersøgelser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Denne undersøgelse blev støttet af Arkansas Space Grant Consortium og National Space Biomedical Research Institute gennem National Aeronautics and Space Administration, giver NNX15AK32A (RP) og RE03701 (MH-J), og P20 GM109005 (MH-J), og den amerikanske Veterans Administration ( MH-J). Vi takker Christopher Fettes, Program koordinator for Institut for Miljø- og Arbejdsmedicin Sundhed på University of Arkansas for Medical Sciences, til redaktionel assistance i udarbejdelsen af ​​manuskriptet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Formamide Sigma-Aldrich 221198-100ML
SSC Buffer 20× Concentrate Sigma-Aldrich S6639-1L
SKY Laboratory Reagent for Mouse Applied Spectral Imaging FPRPR0030/M40
CAD - Concentrated Antibody Detection Kit Applied Spectral Imaging FPRPR0033
Single Paints Customized - 3 Colors; Mouse chromosome 1: Red, Mouse chromosome 2: Green, Mouse chromosome 3: Aqua Applied Spectral Imaging FPRPR0182/10
Glass coverslips Fisher Scientific 12-545B
Tween 20 Fisher Scientific BP337-100
Hydrochloric acid, 37%, Acros Organics Fisher Scientific AC45055-0025 
Fisherbrand Glass Staining Dishes  with Screw Cap Fisher Scientific 08-816
KaryoMAX Potassium Chloride Solution  Life Technologies 10575-090
Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides Fisher Scientific 12-550-15
Colcemid powder Fisher Scientific 50-464-757 
Histopaque-1083  Sigma-Aldrich 10831
Shepherd Mark I, model 25 137Cs irradiator J. L. Shepherd & Associates Model 484B
Syringe 1 mL BD Biosciences 647911
Ethyl Alcohol, 200 Proof Fisher Scientific MEX02761
PBS, (1x PBS Liq.), w/o Calcium and Magnesium Fisher Scientific ICN1860454
Fetal Bovine Serum Fisher Scientific 10-437-010
Methanol Fisher Scientific A454SK-4
Glacial acetic acid Fisher Scientific AC295320010
Zeiss Microscope Zeiss AXIO Imager.Z2

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kodama, Y., et al. Stable chromosome aberrations in atomic bomb survivors: results from 25 years of investigation. Radiat Res. 156, 337-346 (2001).
  2. Lucas, J. N. Cytogenetic signature for ionizing radiation. Int J Radiat Biol. 73, 15-20 (1998).
  3. Zaccaria, A., Barbieri, E., Mantovani, W., Tura, S. Chromosome radiation-induced aberrations in patients with Hodgkin's disease. Possible correlation with second malignancy? Boll. Ist. Sieroter. Milan. 57, 76-83 (1978).
  4. Fisher, N. L., Starr, E. D., Greene, T., Hoehn, H. Utility and limitations of chromosome banding in pre- and postnatal service cytogenetics. Am J Med Genet. 5, 285-294 (1980).
  5. Hande, M. P., et al. Complex chromosome aberrations persist in individuals many years after occupational exposure to densely ionizing radiation: an mFISH study. Genes Chromosomes. Cancer. 44, 1-9 (2005).
  6. Gall, J. G., Pardue, M. L. Formation and detection of RNA-DNA hybrid molecules in cytological preparations. Proc Natl Acad Sci U S A. 63, 378-383 (1969).
  7. Bauman, J. G., Wiegant, J., Borst, P., van, D. P. A new method for fluorescence microscopical localization of specific DNA sequences by in situ hybridization of fluorochromelabelled RNA. Exp Cell Res. 128, 485-490 (1980).
  8. Hopman, A. H., et al. Bi-color detection of two target DNAs by non-radioactive in situ hybridization. Histochemistry. 85, 1-4 (1986).
  9. Nederlof, P. M., et al. Three-color fluorescence in situ hybridization for the simultaneous detection of multiple nucleic acid sequences. Cytometry. 10, 20-27 (1989).
  10. Nederlof, P. M., et al. Multiple fluorescence in situ hybridization. Cytometry. 11, 126-131 (1990).
  11. Szeles, A., Joussineau, S., Lewensohn, R., Lagercrantz, S., Larsson, C. Evaluation of spectral karyotyping (SKY) in biodosimetry for the triage situation following gamma irradiation. Int J Radiat Biol. 82, 87-96 (2006).
  12. Camparoto, M. L., Ramalho, A. T., Natarajan, A. T., Curado, M. P., Sakamoto-Hojo, E. T. Translocation analysis by the FISH-painting method for retrospective dose reconstruction in individuals exposed to ionizing radiation 10 years after exposure. Mutat. Res. 530, 1-7 (2003).
  13. Edwards, A. A critique of 'Collaborative exercise on the use of FISH chromosome painting for retrospective biodosimetry of Mayak nuclear-industrial personnel. Int J Radiat Biol. 78, 867-871 (2002).
  14. Bauchinger, M., et al. Collaborative exercise on the use of FISH chromosome painting for retrospective biodosimetry of Mayak nuclear-industrial personnel. Int J Radiat Biol. 77, 259-267 (2001).
  15. Hieber, L., et al. Chromosomal rearrangements in post-Chernobyl papillary thyroid carcinomas: evaluation by spectral karyotyping and automated interphase FISH. J Biomed. Biotechnol. 2011, 693691 (2011).
  16. Cohen, N., et al. detection of chromosome rearrangements in two cases of tMDS with a complex karyotype. Cancer Genet Cytogenet. 138, 128-132 (2002).
  17. Pathak, R., et al. The Vitamin E Analog Gamma-Tocotrienol (GT3) Suppresses Radiation-Induced Cytogenetic Damage. Pharm Res. (2016).
  18. Spurbeck, J. L., Zinsmeister, A. R., Meyer, K. J., Jalal, S. M. Dynamics of chromosome spreading. Am J Med Genet. 61, 387-393 (1996).
  19. Deng, W., Tsao, S. W., Lucas, J. N., Leung, C. S., Cheung, A. L. A new method for improving metaphase chromosome spreading. Cytometry A. 51, 46-51 (2003).
  20. Hande, M. P., et al. Past exposure to densely ionizing radiation leaves a unique permanent signature in the genome. Am J Hum Genet. 72, 1162-1170 (2003).
  21. Tug, E., Kayhan, G., Kan, D., Guntekin, S., Ergun, M. A. The evaluation of long-term effects of ionizing radiation through measurement of current sister chromatid exchange (SCE) rates in radiology technologists, compared with previous SCE values. Mutat. Res. 757, 28-30 (2013).
  22. Kanda, R., et al. Non-fluorescent chromosome painting using the peroxidase/diaminobenzidine (DAB) reaction. Int J Radiat Biol. 73, 529-533 (1998).
  23. Kakazu, N., et al. Development of spectral colour banding in cytogenetic analysis. Lancet. 357, 529-530 (2001).
  24. Rithidech, K. N., Honikel, L., Whorton, E. B. mFISH analysis of chromosomal damage in bone marrow cells collected from CBA/CaJ mice following whole body exposure to heavy ions (56Fe ions). Radiat Environ Biophys. 46, 137-145 (2007).
  25. Abrahams, B. S., et al. Metaphase FISHing of transgenic mice recommended: FISH and SKY define BAC-mediated balanced translocation. Genesis. 36, 134-141 (2003).
  26. Savage, J. R., Simpson, P. On the scoring of FISH-"painted" chromosome-type exchange aberrations. Mutat. Res. 307, 345-353 (1994).
  27. Savage, J. R., Simpson, P. FISH "painting" patterns resulting from complex exchanges. Mutat. Res. 312, 51-60 (1994).
  28. Tucker, J. D., et al. PAINT: a proposed nomenclature for structural aberrations detected by whole chromosome painting. Mutat. Res. 347, 21-24 (1995).
  29. Knehr, S., Zitzelsberger, H., Bauchinger, M. FISH-based analysis of radiation-induced chromosomal aberrations using different nomenclature systems. Int J Radiat Biol. 73, 135-141 (1998).
  30. Lucas, J. N., et al. Rapid translocation frequency analysis in humans decades after exposure to ionizing radiation. Int J Radiat Biol. 62, 53-63 (1992).
  31. Braselmann, H., et al. SKY and FISH analysis of radiation-induced chromosome aberrations: a comparison of whole and partial genome analysis. Mutat. Res. 578, 124-133 (2005).
  32. Sokolova, I. A., et al. The development of a multitarget, multicolor fluorescence in situ hybridization assay for the detection of urothelial carcinoma in urine. J Mol Diagn. 2, 116-123 (2000).
  33. Lindholm, C., et al. Biodosimetry after accidental radiation exposure by conventional chromosome analysis and FISH. Int J Radiat Biol. 70, 647-656 (1996).
Påvisning af Inter-kromosomale Stabil Afvigelser fra Multiple Fluorescens<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisering (MFISH) og Spectral Karyotyping (SKY) i bestrålede mus
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Pathak, R., Koturbash, I., Hauer-Jensen, M. Detection of Inter-chromosomal Stable Aberrations by Multiple Fluorescence In Situ Hybridization (mFISH) and Spectral Karyotyping (SKY) in Irradiated Mice. J. Vis. Exp. (119), e55162, doi:10.3791/55162 (2017).More

Pathak, R., Koturbash, I., Hauer-Jensen, M. Detection of Inter-chromosomal Stable Aberrations by Multiple Fluorescence In Situ Hybridization (mFISH) and Spectral Karyotyping (SKY) in Irradiated Mice. J. Vis. Exp. (119), e55162, doi:10.3791/55162 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter