Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Genetics

Påvisning av Inter-kromosom Stabil Avvik ved Multiple fluorescens doi: 10.3791/55162 Published: January 11, 2017

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Alle dyrestudier ble utført i henhold til anbefalingene i Guide for omsorg og bruk av forsøksdyr av National Institutes of Health. Dyret protokollen ble godkjent av Institutional Animal Care og bruk komité ved University of Arkansas for Medical Sciences. Alle dyr ble holdt under standard aircondition Dyreavdelingen ved 20 ± 2 ° C med 10 - 15 time sykluser av frisk luft og fri tilgang til standard gnager mat og vann. Ved ankomst, ble musene holdt i karantene i en uke og ga sertifisert gnager chow.

1.Radiation Eksponering og in vivo Arrest av meta Cells

  1. Expose un-bedøvet mus til 2 Gy hele kroppen stråling i en bestrålingskammeret. Under bestråling, til sted mus i et godt ventilert holding kammer sørge for at de ikke bevege seg fritt og får en jevn dose.
  2. Injisere 100 ul av 0,05% kolkisin oppløsning (colchicine pulver oppløst i kalsium og magnesium gratis PBS) intraperitonealt ved hjelp av en 25 G nål festet med 1 ml engangssprøyte. Unngå injeksjon direkte inn i ethvert organ.
  3. La dyr i bur i 2 timer før benmargscelle innhøsting. Observere dyret for noen tegn til smerte eller ubehag.

2. Bone Marrow Cell Harvest og Isolering av Bone Marrow mononukleære celler ved Densitetsgradientsentrifugering

  1. Avlive musen ved CO 2 kvelning.
  2. Spray 70% etanol på dorsal og ventral side.
  3. Lag en 2 cm snitt på magehuden med skarp saks. Ta tak i huden på hver side av snittet med butt pinsett og dra forsiktig åpne magemusklene.
  4. Skjær av begge bakbena med saks og umiddelbart plassere dem i pre-kjølt PBS med 4% FBS.
  5. Rengjør forsiktig alle muskler festet til bakben med en skarp barberblad og bomull gasbind bandasje.
  6. Skill tibia fra femur. Trim både tips til hvert bein med et barberblad.
  7. Spyle innholdet i benmargen med 3 ml PBS (med 4% FBS) ved anvendelse av en 23 G nål festet til en 3 ml sprøyte og samle opp innholdet i et 15 ml sentrifugerør. Passere cellesuspensjonen minst 10 ganger gjennom nålen for å lage en enkeltcelle-suspensjon.
  8. overlappe nøye cellesuspensjonen på et like stort volum av lymfocytt-separasjonsmedium (3 ml) uten å forstyrre grenseflaten mellom cellesuspensjonen og lymfocytt separasjonsmedium. Sentrifuger ved 400 xg i 30 min ved romtemperatur.
  9. Samle buffy coat forsiktig uten å forstyrre de andre sjikt og overføring i en ny 15 ml sentrifugerør.

3. Utarbeidelse av meta Cell Spreads

  1. Tilsett 10 mL PBS til røret som inneholder den buffy coat.
  2. Sentrifuger ved 400 xg i 5 minutter ved romtemperatur.
  3. Fjern forsiktig supernatanten. Deretter bryte opp than celle pellet med milde tapping og tilsett 10 ml PBS.
  4. Sentrifuger ved 400 xg i 5 minutter ved romtemperatur.
  5. Fjern supernatanten uten å forstyrre cellepelleten, bryte opp pelleten, og tilsett 4 ml forvarmet hypoton 0,075 M kaliumkloridoppløsning. Legg hypoton løsning dråpe for dråpe med milde konstant risting.
  6. Inkuber cellene i 20 minutter ved 37 ° C i et vannbad.
  7. Etter hypoton behandling, tilsett et likt volum (4 ml) av fikser (metanol: iseddik, 3: 1 v / v) i 15 ml rør og bland forsiktig ved å vende røret.
  8. Sentrifuger ved 400 xg i 5 minutter ved romtemperatur og kast supernatanten.
  9. Bryt opp cellen pellet med tappefulgt av forsiktig vortex i noen sekunder og tilsett 3 ml fiksativ løsning dråpevis med konstant risting.
  10. Inkuber i 30 minutter ved romtemperatur og deretter sentrifuger ved 400 xg i 5 minutter.
  11. Fjern supernatanten, bryte opp celle-pellet med gentle tapping, og tilsett 3 ml frisk fiksativ.
  12. Sentrifuger ved 400 xg i 5 minutter ved romtemperatur og fjern supernatanten. Bryt opp cellen pellet med milde tapping, og legger frisk 3 ml fiksativ.
  13. Gjenta steg 3,12 ganger mer.
  14. Sentrifuger ved 400 xg i 5 minutter ved romtemperatur og fjern supernatanten uten å forstyrre cellepelleten. Deretter legger 400-600 mL fiksativ og bland godt med pipettering.
  15. Drop 30 mL faste celler på pre-renset og våte skred vippet i 45 ° vinkel og la skinnene til luft tørke helt over natten.

4. Mouse Kromosom Maleri av mFISH

  1. Kromosom Denaturering
    1. Plasser lysbildet som inneholder metafase celleutspredninger i 2x SSC i 2 min ved romtemperatur.
    2. Dehydrere sleiden ved serie etanol vasking i 2 minutter hver i 70%, 80% og 100%. Inkuber i 60 min ved 65 ° C.
    3. Forvarm 40 ml denaturering oppløsning (70% formamid / 2x SSC; pH 7,0) til 70 ° C (± 2 ° C) i en glasskrukke Coplin i 30 minutter. Denaturering kromosomer ved å inkubere raset i forvarmet denaturering løsning til 1 - 1,5 min.
    4. Slukke gli umiddelbart i iskald 70% etanol i 2 minutter for å stanse denaturering prosessen så vel som for å forhindre de denaturerte kromosomer fra re-gløding. Deretter dehydrere ved vasking med 80% etanol i 2 min. Gjenta etanol vask med 100% etanol i 2 min. Fullstendig tørke raset ved romtemperatur.
  2. Denaturering og Hybridisering av Probe Blanding
    1. I korthet sentrifuger sonden blanding levert av produsenten, overføre 10 ul av probe blanding i en 500 mL feste lokket sentrifugerør, og denaturere ved inkubasjon ved 80 ° C (± 2 ° C) i et vannbad i 7 min.
    2. Plasser sentrifugerøret med sonde blandingen i et vannbad ved 37 ° C i 10 min.
    3. Påfør denaturert sonden blandingen på lysbildet med denaturert chromosomes.
    4. dekke forsiktig området med en 18 mm x 18 mm glass dekkglass og eliminere eventuelle synlige luftbobler ved meget forsiktig å trykke på dekkglass til å gli. Forsegle alle fire sidene av dekkglass med gummisement og inkuberes i 12 timer til 16 timer i mørke ved 37 ° C i et fuktet kammer for hybridisering.
  3. Post Hybridisering Vasking og Detection
    1. Fjern forsiktig gummi sement og dekkglass.
    2. Plasser lysbilde i forvarmet 0,4x SSC ved 74 ° C (± 2 ° C) i 5 min.
    3. Vask lysbilde i vaskeoppløsning II (4x SSC / 0,1% Tween-20) i 2 min.
    4. Plasser 20 mL av anti-fade monteringsmedium med DAPI counterstain (1,5 mikrogram / ml) og dekk med et glass dekkglass. Trykk forsiktig på dekkglass med lab vev for å fjerne luftbobler og overflødig montering løsning. Forsegle kantene av dekkglass med neglelakk.
    5. Vis lysbilder ved hjelp av et fluorescerende mikroskop utstyrt med passende filtre.

    5. Spectral karyotypering (SKY) av Muse Chromosomes

    1. Kromosom og Probe Denaturering
      1. Ekvilibrere lysbilde i 2 x SSC ved romtemperatur i 2 min, uten risting.
      2. Dehydrere lysbilde i en etanol serie (70%, 80% og 100% etanol) i 2 minutter hver ved romtemperatur. Lufttørk lysbildet for å fjerne etanol helt.
      3. Varm 40 ml denaturering løsning (70% formamid / 2 x SSC, pH 7,0) i en glasskrukke Coplin i 30 minutter.
      4. Inkuber lysbilde i forvarmet denaturering løsning for 1 til 1,5 min.
      5. Umiddelbart dyppe objektglasset i iskald 70% etanol i 2 minutter for å stanse denaturering prosessen så vel som for å forhindre de denaturerte kromosomer fra re-gløding.
      6. Dehydrere lysbildet ved å sette den inn i 80% etanol i 2 minutter og deretter til 100% etanol i 2 minutter ved romtemperatur.
      7. Denaturere SKY sonden (ampulle # 1 levert av produsenten) i et vannbad innstilt på 80 ° C (± 2 ° C)i 7 minutter, og deretter straks sette inn i et annet vannbad innstilt på 37 ° C i 10 min.
    2. probe Hybridisering
      1. Tilsett 10 mL av denaturert SKY sonde på de denaturerte kromosomer.
      2. Plasser forsiktig en 18 mm x 18 mm dekkglass på SKY sonden slik at ingen luftbobler er fanget under dekkglass.
      3. Forsegle kantene av dekkglass med gummisement.
      4. Plasser sleiden i en fuktet lystett kammer og inkuberes i mørke ved 37 ° C i 24 timer til 36 timer.
    3. Post-hybridisering Vasking og Fluorescence Detection
      1. Fjern gummi sement svært nøye uten å forstyrre dekkglass.
      2. Plasser den glir inn forvarmet hurtig vaskeløsning (0,4x SSC) ved 72 ° C (± 2 ° C) i 5 minutter under konstant risting. Dyppe glir inn vaskeløsning III (4x SSC / 0,1% Tween 20) og inkuberes i 1 minutt under rysting.
      3. Valgfritt: Legg 80 mL av blokkering reagens(Hetteglass # 2 som leveres av produsenten) på området for hybridisering, plasserer et 24 mm x 60 mm plastdekkglass, og inkuberes i mørke ved 37 ° C i 30 minutter i et fuktet kammer.
      4. Fjern forsiktig plastglass og vaske lysbilde med forvarmet (45 ° C) vaskeløsning III i 5 min.
      5. Påfør 80 mL av Cy5 flekker reagens (hetteglass # 3 levert av produsent), plasser en 24 mm x 60 mm plastglass, og inkuberes ved 37 ° C i mørket i 40 min i en fuktet kammer.
      6. Dypp sleiden i en glasskrukke som inneholdt Coplin forvarmet (45 ° C) vaskeløsning III (4x SSC / 0,1% Tween 20) og inkuber ved 45 ° C i et vannbad i 2 min med risting. Gjenta dette vasketrinn 3 ganger.
      7. Påfør 80 mL av Cy5.5 flekker reagens (hetteglass # 4 levert av produsent), plasser en 24 mm x 60 mm plastglass, og inkuberes ved 37 ° C i mørket i 40 min i en fuktet kammer.
      8. Vask raset 3 ganger med forvarmet (45 ºC) vaskeløsning III.
      9. Hold raset i tiltet stilling mot et papirhåndkle for å drenere overflødig væske. Tilsett 20 mL anti-fade DAPI reagens (hetteglass # 5 fra produsenten) og sett nøye en 24 mm x 60 mm dekkglass uten å innføre eventuelle luftbobler. Forsegle kantene av dekkglass med neglelakk og observere med en epifluorescence mikroskop utstyrt for å ta SKY bilder.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Helkroppsbestråling induserer mange kromosomavvik i benmargceller av bestrålte mus. Den nåværende protokollen er optimalisert for in vivo mitotisk arrest av benmargceller etter stråling, høsting av benmargceller fra bakbena bestrålte mus, isolering av benmarg mononukleære celler ved densitetsgradientsentrifugering, utarbeidelse av metacelle sprer seg, og etterfølgende deteksjon av stråling-indusert stabile kromosomavvik ved mFISH og SKY teknikker. Kromosom maling ved hjelp av disse teknikkene kan anvendes for å påvise og vurdere risikoen for forskjellige patofysiologiske tilstander.

Figur 1 viser representative metafase-celle spres med normale og avvikende mus kromosomparene-1, -2 og -3. Figur 2 viser spektral karyotypering av normale og unormale mus metafase kromosomer.Disse resultatene viser at ioniserende stråling induserer inter-kromosom stabile avvik i prolifererende murine benmargceller, som i hovedsak består av stamceller og stamceller som er ansvarlig for selvfornyelse og differensiering i ulike celletyper. Cytogenetiske forandringer i stilk og stamceller har vist seg å assosiere med forskjellige kliniske sykdommer, inkludert kreft, og anses å være de sterkeste prediktorer for sykdomsgrad og total overlevelse. Derfor er det logisk å antyde at ioniserende stråling-indusert stabile inter kromosomavvik kan føre til økt risiko for kreftutvikling.

Figur 1
Figur 1: Effekt av stråling på benmargceller av en bestrålt Mouse som oppdaget av mFISH. A og B viser en mus metafase celle spredning med vanlige par av chromosome-en (rød), kromosom-2 (grønn), og kromosom-3 (aqua). Alle andre kromosomene motfarget med DAPI (blå). C viser stabil aberrasjon som involverer kromosom-en, har en del av kromosom-1 blitt integrert i et ikke-malt (DAPI) kromosom, mens en annen del dannet en asentrisk fragment. D viser en del av en del av kromosom-2 har blitt integrert i ikke-malt kromosom. E representerer stabile avvik som involverer kromosom-3. F viser en stabil avvik som involverer alle tre malt kromosomer. Brytepunkter og farge veikryss er indikert med piler. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2
Figur 2: Effekt av stråling på Bone Marrow Celler av bestrålt Mouse som oppdaget av SKY. Den øvre panelet viser en normal spektral karyotypering (SKY) av C57BL / 6 hunnmus. Den midterste panelet viser et stabilt avvik som involverer kromosom-4 og kromosom-12. Den nederste panelet viser mus spektral karyotypering med en stabil kromosomaberrasjon involverer kromosom-7 og kromosom-10. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Flere kritiske trinn avgjør suksessen mFISH og SKY. Den første og mest kritiske trinnet er å optimalisere kolkisinbehandlingen for in vivo mitotisk arrest av benmarg mononukleære celler. Den kolkisin konsentrasjon og behandlingstiden individuelt eller i konsert bestemme mitotisk indeks samt kromosomkondens to viktige forutsetninger for effektiv kromosom maleri. En høy kolkisin konsentrasjon eller lengre behandlingstiden fører til kondenserte kromosomer, inkompatible for riktig denaturering og hybridisering. Dessuten er nøyaktig identifikasjon av komplekse rearrangementer i en metafase celle spres med kondenserte kromosomer ikke en lett oppgave å oppnå. Intra-peritoneal administrering av 100 pl 0,05% kolkisin i 2 timer i en mus med en kroppsvekt mellom 22 og 26 g frembringer et tilstrekkelig antall av metafase-celle sprer seg med moderat kondenserte kromosomer. Den andre kritiske trinn er hypoton behandling.Volumet, behandlingstiden og temperaturen i hypoton løsning innflytelse kromosom morfologi og spredning av kromosomer på glass-slide. En hypoton behandling for en kortere tidsperiode eller ved en sub-optimal temperatur kan hindre riktig kromosomet sprer seg, noe som resulterer i metafase-celle spres med overlappende kromosomer. Kromosom overlapp forstyrrer nedstrøms in situ hybridisering prosess, spesifisiteten av fluorescerende signaler, og riktig identifisering av rearrangements.

For det tredje er etter hypoton fiksering et viktig skritt for å unngå celle klump formasjon. Fiksativ bør tilsettes langsomt ned ved siden av sentrifugerøret under konstant forsiktig risting for å oppnå en enkel cellesuspensjon. Ellers vil metacelle sprer seg fast i klumper og kromosom spredning vil bli kompromittert. Imidlertid kromosom sprer seg også avhengig av celletype, temperatur og relativ fuktighet på time slippe cellesuspensjon på glassplater. En tidligere studie av Spurbeck rapporterte at for lymfocytter, en 60% relativ luftfuktighet og 20 ° C temperatur resultat i høyere meta område 18. I tillegg er varigheten av tørkingen er også et kritisk trinn for optimal kromosom spredning. Metafase celle sprer at tørr for raskt produsere tette spreads med mange overlappende kromosomer, mens svært langsomme tørkeresultat i brutt metafase kromosom 18. Imidlertid Deng viste at kromosom sprer seg først og fremst er avhengig av relativ fuktighet for en rekke dyrkede celler 19. Den fjerde viktig skritt er å optimalisere kromosom denaturering tid. En lengre og kortere denaturering tid påvirke probe hybridisering. Lengre denaturering forårsaker "puffy" kromosomer, mens kortere denaturering hindrer samspill av sonde til kromosomene. En annen måte å redusere kromosom "poser" er alders lysbilder over natten ved romtemperatur væreforgrunnen denaturering trinnet. Slides ikke brukes til kromosom maleri umiddelbart, kan lagres på ubestemt tid i en eksikator ved -20 ºC. Kromosom denaturering tid må være standardisert med sleiden alder, mengden av cytoplasma rundt meta cellen sprer seg, og den fuktighet ved hvilke celler som ble sluppet ned på skinnene. Probe denaturering og hybridisering er også viktig for vellykket kromosom maleri. Direkte eksponering av prober for sterkt lys bør unngås, slik at det fluorescerende signalet ikke miste signalintensitet.

Det er godt etablert at mFISH og SKY er kraftige teknikker for å påvise interkromosom stabile avvik. Eventuelle rearrangements samt tap eller gevinst på malte kromosomer kan lett identifiseres ved disse to metodene. Men påvisning av intra-arm og inter-arm kromosom utveksling er ikke mulig ved disse teknikkene. Identifisering av intra-arm og inter-arm kromosom børser har nå blitt mulig på grunbruk av utviklingen av henholdsvis kromosom arm spesifikke flerfarget FISH prober og mBAND FISH prober. En tidligere studie på tidligere atomarbeidere har vist at mBAND analyse er et kraftig verktøy for å identifisere unike signaturer av stråleskader 20. Videre identifikasjon av søsterkromatidutveksling, et karakteristisk trekk ved stråleskader 21, er ikke mulig ved disse teknikkene. I tillegg har både mFISH og SKY begrenset evne til å male centromeric regionen kromosomer, noe som kan føre til feilaktige scoring av disentrisk kromosom som trans. Teknikkene er heller ikke egnet til å identifisere den nøyaktige stoppunkt lokalisering av translokasjon. I tillegg kan fluorescente signalene ikke kan bevares permanent, signalintensiteten avtar med tiden, og fluorescerende kromosom maling er ikke egnet for analyse av et automatisk system. Imidlertid kan fluorescerende signalintensitet bevares for en lengre tidsperiode ved å lagre skjøvetes i fryseren.

To forbedrede metoder for kromosom maleri er blitt utviklet for å overvinne begrensninger av mFISH og SKY: henholdsvis, ikke-fluorescerende maling kromosom 22 og spektral fargestriper (SCAN) 23. Fordelene med ikke-fluorescerende kromosom maleri ved hjelp av peroksidase / diaminobenzidine (DAB) over FISH maleri inkludere nøyaktig identifikasjon av centromeric regionen, identifisering av kromosom omorganisering av lyse-feltet mikroskop, og at ikke-fluorescerende signal er permanent bevart og bildeanalyse kan være automatisert. På den annen side er fordelaktig i forhold SCAN SKY fordi SCAN-prober fremstilles fra bånd spesifikk genomiske DNA-sekvenser for et bestemt kromosom og dermed kan en nøyaktig identifisere opprinnelsen til en kromosom-bånd. SCAN forenkler også identifisering av intra-kromosomale børser. Tatt i betraktning fordelene av forbedrede teknikker, bør disse vurderes for rutinemessig bruk in klinisk cytogenetisk testing. Imidlertid er fremstillingen av prober fra bandet spesifikk genomisk DNA-sekvens for hver kromosompar teknisk krevende og begrenser dens bruk i molekylær cytogenetics.

Fastsettelse av hvorvidt forskjellen mellom behandlingsgruppene er statistisk signifikant eller ikke er et annet viktig aspekt av molekylære cytogenetikk. Scoring kriterier, for eksempel antall meta celle sprer telles, antall dyr som brukes per behandlingsgruppe, kromosom teller per metafase celle spre under analysen, nomenklatur brukes til å klassifisere avvik observert etter kromosom maleri, etc. spille en avgjørende rolle i å bestemme den statistiske usikkerheten mellom behandlingsgruppene. Selv om ulike laboratorier har proprietære scoring kriterier, scoring på 100 til 300 og 20 metafase celle spres med 40 godt separerte kromosomer i minst 3-5 mus anbefales generelt for å bestemme statistisk signifikans i mFISH og SKY analysis, henholdsvis 24, 25. Dessuten er valg av nomenklaturen som brukes til å klassifisere avvik i malt kromosomer er en viktig parameter for å vurdere statistisk usikkerhet. Det er to populære nomenklatur systemer i bruk for å beskrive avvik oppdages av hele kromosom maleri prober: (1) S & S klassifisering metode Savage og Simpson 26, 27 og (2) MALING nomenklatur av Tucker et al. 28. Hvert system er avhengig av ulike forutsetninger for klassifisering av strukturelle kromosomavvik og har sine egne fordeler og ulemper. S & S-systemet er først og fremst egnet for mekanistisk tolkning av aberrasjon opprinnelse, mens MALING gir en beskrivelse av unormale maleri mønstre. Studier av Knehr et al. på strålingsinduserte kromosomale avvik i fisk males kromosomer indikerer at malingen metode, i likhet med S & S-system, kan også brukes til å bestemme avvik opprinnelse med noen modificatipå i scoring kriterier og vil være mest nyttig for praktisk anvendelse 29.

Begge mFISH og SKY metodene har sine egne begrensninger. For eksempel, tillater mFISH hurtig scoring med liten opplæring, men betyr det ikke skjerme alle kromosomene for måling av avvik frekvens og viser bare delvis aberrasjon frekvens, avhengig av antallet av malt kromosomer brukt i undersøkelsen. Imidlertid kan en brøkdel av det totale børser observert av hele kromosom maleri estimeres ved formelen opprinnelig postulert av Lucas et al. 30 og ytterligere modifisert ved Braselmann et al. 31. Denne matematiske formelen vurderer utveksling blant malt kromosomer og mellom malt og kontra kromosomer. For eksempel, la f p representerer brøk summen av genomet som dekkes av de malte kromosomer 1 (f 1), 2 (f 2), og 3 (f 3), where f 1 = 0,0696, f 2 = 0,0649, og f 3 = 0,0570, verdiene representerer genomisk innholdet av enkelte kromosomer i hunnmus. Derfor blir f p = (1 + f f 2 + f 3) = 0,192 og motfarget fraksjon (1 - f p) = 0,808. Hyppigheten av utvekslinger som omfatter malt og motfarget kromosomer (F-P) kan lett beregnes av kryssproduktet av binomutvidelse (p + q) 2 = p 2 + 2PQ + q 2, hvor p = f p og q = (1 - f p). Således F P = 2PQ = 2f p (1 - f p) = 0,310, noe som betyr at 31% av kromosomale utvekslinger er observerbar etter male mus kromosom-1, -2 og -3. Derfor 1 / 0,31 = 3,23 celler må være avsluttet til tilsvarer én banded metafase celler eller en hel genom tilsvarende. Videre både mFISH og SKY har begrenset evne til å specifmatisk identifisere hvilke gener og stoppunkter er involvert i aberrasjon dannelse og også å oppdage små duplikasjoner, inversjoner og slettinger.

Anvendelsen av mFISH og SKY analyse er ikke begrenset til grunnleggende forskning. Begge er regelmessig brukt i kliniske studier. Disse teknikkene har også blitt brukt til prenatal og postnatal diagnose, risikovurdering og identifisering av ulike typer kreft. Dessuten kan begge teknikker anvendes for å male interfasekromosomer. Sokolova brukes mFISH å male interfase kromosomer for første gang 32. Disse teknikkene er også brukt for post-bestråling dose estimering og risikovurdering hos mennesker etter utilsiktet eller tilsiktet eksponering for ioniserende stråling 11, 33. Derfor delvis eller hel genom analyse av mFISH eller SKY, henholdsvis, er nyttige verktøy for å oppdage inter-kromosom stabile avvik for ulike studier.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Denne studien ble støttet av Arkansas Space Grant Consortium og National Space Biomedical Research Institute gjennom National Aeronautics and Space Administration, gir NNX15AK32A (RP) og RE03701 (MH-J), og P20 GM109005 (MH-J), og den amerikanske Veterans Administration ( MH-J). Vi takker Christopher Fettes, programkoordinator for Institutt for miljø og helse ved Universitetet i Arkansas for Medical Sciences, for redaksjonell bistand i utarbeidelse av manuskriptet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Formamide Sigma-Aldrich 221198-100ML
SSC Buffer 20× Concentrate Sigma-Aldrich S6639-1L
SKY Laboratory Reagent for Mouse Applied Spectral Imaging FPRPR0030/M40
CAD - Concentrated Antibody Detection Kit Applied Spectral Imaging FPRPR0033
Single Paints Customized - 3 Colors; Mouse chromosome 1: Red, Mouse chromosome 2: Green, Mouse chromosome 3: Aqua Applied Spectral Imaging FPRPR0182/10
Glass coverslips Fisher Scientific 12-545B
Tween 20 Fisher Scientific BP337-100
Hydrochloric acid, 37%, Acros Organics Fisher Scientific AC45055-0025 
Fisherbrand Glass Staining Dishes  with Screw Cap Fisher Scientific 08-816
KaryoMAX Potassium Chloride Solution  Life Technologies 10575-090
Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides Fisher Scientific 12-550-15
Colcemid powder Fisher Scientific 50-464-757 
Histopaque-1083  Sigma-Aldrich 10831
Shepherd Mark I, model 25 137Cs irradiator J. L. Shepherd & Associates Model 484B
Syringe 1 mL BD Biosciences 647911
Ethyl Alcohol, 200 Proof Fisher Scientific MEX02761
PBS, (1x PBS Liq.), w/o Calcium and Magnesium Fisher Scientific ICN1860454
Fetal Bovine Serum Fisher Scientific 10-437-010
Methanol Fisher Scientific A454SK-4
Glacial acetic acid Fisher Scientific AC295320010
Zeiss Microscope Zeiss AXIO Imager.Z2

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kodama, Y., et al. Stable chromosome aberrations in atomic bomb survivors: results from 25 years of investigation. Radiat Res. 156, 337-346 (2001).
  2. Lucas, J. N. Cytogenetic signature for ionizing radiation. Int J Radiat Biol. 73, 15-20 (1998).
  3. Zaccaria, A., Barbieri, E., Mantovani, W., Tura, S. Chromosome radiation-induced aberrations in patients with Hodgkin's disease. Possible correlation with second malignancy? Boll. Ist. Sieroter. Milan. 57, 76-83 (1978).
  4. Fisher, N. L., Starr, E. D., Greene, T., Hoehn, H. Utility and limitations of chromosome banding in pre- and postnatal service cytogenetics. Am J Med Genet. 5, 285-294 (1980).
  5. Hande, M. P., et al. Complex chromosome aberrations persist in individuals many years after occupational exposure to densely ionizing radiation: an mFISH study. Genes Chromosomes. Cancer. 44, 1-9 (2005).
  6. Gall, J. G., Pardue, M. L. Formation and detection of RNA-DNA hybrid molecules in cytological preparations. Proc Natl Acad Sci U S A. 63, 378-383 (1969).
  7. Bauman, J. G., Wiegant, J., Borst, P., van, D. P. A new method for fluorescence microscopical localization of specific DNA sequences by in situ hybridization of fluorochromelabelled RNA. Exp Cell Res. 128, 485-490 (1980).
  8. Hopman, A. H., et al. Bi-color detection of two target DNAs by non-radioactive in situ hybridization. Histochemistry. 85, 1-4 (1986).
  9. Nederlof, P. M., et al. Three-color fluorescence in situ hybridization for the simultaneous detection of multiple nucleic acid sequences. Cytometry. 10, 20-27 (1989).
  10. Nederlof, P. M., et al. Multiple fluorescence in situ hybridization. Cytometry. 11, 126-131 (1990).
  11. Szeles, A., Joussineau, S., Lewensohn, R., Lagercrantz, S., Larsson, C. Evaluation of spectral karyotyping (SKY) in biodosimetry for the triage situation following gamma irradiation. Int J Radiat Biol. 82, 87-96 (2006).
  12. Camparoto, M. L., Ramalho, A. T., Natarajan, A. T., Curado, M. P., Sakamoto-Hojo, E. T. Translocation analysis by the FISH-painting method for retrospective dose reconstruction in individuals exposed to ionizing radiation 10 years after exposure. Mutat. Res. 530, 1-7 (2003).
  13. Edwards, A. A critique of 'Collaborative exercise on the use of FISH chromosome painting for retrospective biodosimetry of Mayak nuclear-industrial personnel. Int J Radiat Biol. 78, 867-871 (2002).
  14. Bauchinger, M., et al. Collaborative exercise on the use of FISH chromosome painting for retrospective biodosimetry of Mayak nuclear-industrial personnel. Int J Radiat Biol. 77, 259-267 (2001).
  15. Hieber, L., et al. Chromosomal rearrangements in post-Chernobyl papillary thyroid carcinomas: evaluation by spectral karyotyping and automated interphase FISH. J Biomed. Biotechnol. 2011, 693691 (2011).
  16. Cohen, N., et al. detection of chromosome rearrangements in two cases of tMDS with a complex karyotype. Cancer Genet Cytogenet. 138, 128-132 (2002).
  17. Pathak, R., et al. The Vitamin E Analog Gamma-Tocotrienol (GT3) Suppresses Radiation-Induced Cytogenetic Damage. Pharm Res. (2016).
  18. Spurbeck, J. L., Zinsmeister, A. R., Meyer, K. J., Jalal, S. M. Dynamics of chromosome spreading. Am J Med Genet. 61, 387-393 (1996).
  19. Deng, W., Tsao, S. W., Lucas, J. N., Leung, C. S., Cheung, A. L. A new method for improving metaphase chromosome spreading. Cytometry A. 51, 46-51 (2003).
  20. Hande, M. P., et al. Past exposure to densely ionizing radiation leaves a unique permanent signature in the genome. Am J Hum Genet. 72, 1162-1170 (2003).
  21. Tug, E., Kayhan, G., Kan, D., Guntekin, S., Ergun, M. A. The evaluation of long-term effects of ionizing radiation through measurement of current sister chromatid exchange (SCE) rates in radiology technologists, compared with previous SCE values. Mutat. Res. 757, 28-30 (2013).
  22. Kanda, R., et al. Non-fluorescent chromosome painting using the peroxidase/diaminobenzidine (DAB) reaction. Int J Radiat Biol. 73, 529-533 (1998).
  23. Kakazu, N., et al. Development of spectral colour banding in cytogenetic analysis. Lancet. 357, 529-530 (2001).
  24. Rithidech, K. N., Honikel, L., Whorton, E. B. mFISH analysis of chromosomal damage in bone marrow cells collected from CBA/CaJ mice following whole body exposure to heavy ions (56Fe ions). Radiat Environ Biophys. 46, 137-145 (2007).
  25. Abrahams, B. S., et al. Metaphase FISHing of transgenic mice recommended: FISH and SKY define BAC-mediated balanced translocation. Genesis. 36, 134-141 (2003).
  26. Savage, J. R., Simpson, P. On the scoring of FISH-"painted" chromosome-type exchange aberrations. Mutat. Res. 307, 345-353 (1994).
  27. Savage, J. R., Simpson, P. FISH "painting" patterns resulting from complex exchanges. Mutat. Res. 312, 51-60 (1994).
  28. Tucker, J. D., et al. PAINT: a proposed nomenclature for structural aberrations detected by whole chromosome painting. Mutat. Res. 347, 21-24 (1995).
  29. Knehr, S., Zitzelsberger, H., Bauchinger, M. FISH-based analysis of radiation-induced chromosomal aberrations using different nomenclature systems. Int J Radiat Biol. 73, 135-141 (1998).
  30. Lucas, J. N., et al. Rapid translocation frequency analysis in humans decades after exposure to ionizing radiation. Int J Radiat Biol. 62, 53-63 (1992).
  31. Braselmann, H., et al. SKY and FISH analysis of radiation-induced chromosome aberrations: a comparison of whole and partial genome analysis. Mutat. Res. 578, 124-133 (2005).
  32. Sokolova, I. A., et al. The development of a multitarget, multicolor fluorescence in situ hybridization assay for the detection of urothelial carcinoma in urine. J Mol Diagn. 2, 116-123 (2000).
  33. Lindholm, C., et al. Biodosimetry after accidental radiation exposure by conventional chromosome analysis and FISH. Int J Radiat Biol. 70, 647-656 (1996).
Påvisning av Inter-kromosom Stabil Avvik ved Multiple fluorescens<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisering (mFISH) og Spectral karyotypering (SKY) i Bestrålet Mus
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Pathak, R., Koturbash, I., Hauer-Jensen, M. Detection of Inter-chromosomal Stable Aberrations by Multiple Fluorescence In Situ Hybridization (mFISH) and Spectral Karyotyping (SKY) in Irradiated Mice. J. Vis. Exp. (119), e55162, doi:10.3791/55162 (2017).More

Pathak, R., Koturbash, I., Hauer-Jensen, M. Detection of Inter-chromosomal Stable Aberrations by Multiple Fluorescence In Situ Hybridization (mFISH) and Spectral Karyotyping (SKY) in Irradiated Mice. J. Vis. Exp. (119), e55162, doi:10.3791/55162 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter