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Genetics

Detecção de Inter-aberrações cromossômicas estáveis ​​por fluorescência múltipla doi: 10.3791/55162 Published: January 11, 2017

Protocol

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Todos os estudos com animais foram realizados em estrita conformidade com as recomendações do Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório do National Institutes of Health. O protocolo animal foi aprovado pelo Comitê de Cuidado e Uso Institucional Animal da Universidade de Arkansas para Ciências Médicas. Todos os animais foram alojados em instalações para animais com ar condicionado padrão a 20 ± 2 ° C com 10 - 15 ciclos de uma hora de ar fresco e livre acesso à alimentação padrão para roedores e água. Após a chegada, os ratos foram mantidos em quarentena por uma semana e desde ração para roedores certificado.

Exposição 1.Radiation e In Vivo Detenção de células em metafase

  1. ratos expor un-anestesiados com 2 Gy de radiação de corpo inteiro em uma câmara de irradiação. Durante a irradiação, colocar ratos em uma câmara de retenção bem ventilado para garantir que eles não se movem livremente e receber uma dose uniforme.
  2. Injectar 100 ul de solução de colchicina a 0,05% (Cpó olchicine dissolvido em cálcio e magnésio livre PBS) por via intraperitoneal usando uma agulha 25 G anexo com 1 mL seringa descartável. Evitar a injeção diretamente em qualquer órgão.
  3. Deixar o animal na gaiola durante 2 h antes da colheita de células de medula óssea. Observar o animal para detectar quaisquer sinais de dor ou sofrimento.

2. Colheita da medula celular e Isolamento de células mononucleares de medula óssea por centrifugação em gradiente de densidade

  1. Euthanize o mouse por asfixia com CO2.
  2. Spray de etanol a 70% sobre o lado ventral e dorsal.
  3. Adicione de 2 cm da incisão na pele abdominal com uma tesoura afiada. Segure a pele em ambos os lados da incisão com uma pinça sem corte e puxe abrir os músculos abdominais.
  4. Cortar ambas as patas traseiras com uma tesoura e coloque-os imediatamente na pré-refrigerados PBS com 4% de FBS.
  5. Limpe cuidadosamente todos os músculos ligados à pata traseira com uma lâmina de barbear e gaze de algodão bandage afiada.
  6. Separe a tíbia do fêmur. Apare as duas pontas de cada osso com uma lâmina de barbear.
  7. Lavar o conteúdo da medula óssea com 3 mL de PBS (com 4% de FBS), utilizando uma agulha de 23 G ligada a uma seringa de 3 ml e recolher o conteúdo num tubo de centrífuga de 15 mL. Passar a suspensão de células, pelo menos, 10 vezes, através da agulha para fazer uma suspensão de células individuais.
  8. Cuidadosamente sobrepor a suspensão de células em um volume igual de meio de separação de linfócitos (3 mL), sem perturbar a interface entre a suspensão de células e meio de separação de linfócitos. Centrifugar a 400 xg durante 30 min à temperatura ambiente.
  9. Recolher o creme leucocitário cuidadosamente, sem perturbar as outras camadas e transferência em um novo tubo de centrífuga de 15 mL.

3. Preparação de Spreads celular Metaphase

  1. Adicionar 10 ml de PBS ao tubo contendo o buffy coat.
  2. Centrifugar a 400 xg durante 5 min à temperatura ambiente.
  3. Remova cuidadosamente o sobrenadante. Em seguida, quebrar-se tele célula pellet com toque suave e adicionar 10 mL PBS.
  4. Centrifugar a 400 xg durante 5 min à temperatura ambiente.
  5. Remover o sobrenadante sem perturbar o sedimento celular, quebrar-se o sedimento, e adicionar 4 ml de solução de cloreto de potássio 0,075 M hipotónica pré-aquecido. Adicionar gota solução hipotônica a gota, com agitação constante suave.
  6. Incubar as células durante 20 min a 37 ° C num banho de água.
  7. Após o tratamento hipotónico, adicionar um volume igual (4 ml) do fixador (metanol: ácido acético glacial, 3: 1 v / v) no tubo de 15 mL e misturar suavemente por inversão do tubo.
  8. Centrifugar a 400 xg durante 5 min à temperatura ambiente e desprezar o sobrenadante.
  9. Quebra-se o agregado de células com batimento seguido de vortex suave durante alguns segundos e adicionar 3 mL de gota solução fixadora a gota, com agitação constante.
  10. Incubar durante 30 minutos à temperatura ambiente e depois centrifugar a 400 xg durante 5 min.
  11. Remover o sobrenadante, romper o pellet celular com gentle tocando, e adicionar 3 ml de fixador fresco.
  12. Centrifugar a 400 xg durante 5 min à temperatura ambiente, e remover o sobrenadante. Quebra-se o pellet celular com toque suave, e adicionar fresco 3 ml de fixador.
  13. Repita o passo 3.12 mais duas vezes.
  14. Centrifugar a 400 xg durante 5 min à temperatura ambiente, e remover o sobrenadante sem perturbar o sedimento celular. Em seguida, adicione 400 a 600 mL fixador e misturar completamente com pipetagem.
  15. Queda de 30 mL células fixadas em lâminas pré-limpas e molhadas inclinado em um ângulo de 45 ° e permitir que as lâminas para o ar seco completamente durante a noite.

4. mouse pintura cromossômica por mFISH

  1. A desnaturação cromossomo
    1. Colocar a lâmina contendo diferenciais de células em metafase 2x SSC durante 2 minutos à temperatura ambiente.
    2. Desidratar a corrediça por lavagem etanol série durante 2 minutos cada em 70%, 80%, e 100%. Incubar durante 60 minutos a 65 ° C.
    3. Pré-aqueça solução de desnaturação de 40 mL (70% de formamida / 2x SSC; pH 7,0) a 70 ° C (± 2 ° C) num frasco Coplin vidro durante 30 min. Desnaturar cromossomos incubando o slide na solução de desnaturação pré-aquecido para 1-1,5 min.
    4. Extingue-se deslizar imediatamente em gelo-etanol frio a 70% durante 2 minutos para interromper o processo de desnaturação, bem como para prevenir os cromossomas desnaturadas a partir de re-hibridação. Em seguida, desidrata por lavagem com etanol a 80% durante 2 min. Repetir a lavagem de etanol com 100% de etanol por 2 min. Completamente secar o slide à temperatura ambiente.
  2. Desnaturação e Hibridação da sonda Mistura
    1. Resumidamente, centrifugar a mistura de sonda fornecido pelo fabricante, transferir 10 ul de mistura de sonda para um encaixe 500 uL tampão tubo de centrífuga, e desnaturadas por incubação a 80 ° C (± 2 ° C) em banho de água durante 7 minutos.
    2. Colocar o tubo de centrifugação com a mistura de sonda num banho de água a 37 ° C durante 10 min.
    3. Aplique a mistura sonda desnaturada para o slide com chromoso desnaturadomes.
    4. cobrir cuidadosamente a área com um x 18 mm lamela de vidro 18 mm e eliminar as bolhas de ar visíveis, pressionando muito suavemente a lamínula a deslizar. Selar todos os quatro lados da lamela de cobertura com cimento de borracha e incubar durante 12 h a 16 h no escuro a 37 ° C numa câmara humidificada para hibridação.
  3. Pós Hibridização de lavar roupa e Detecção
    1. Retire cuidadosamente o cimento de borracha ea lamela.
    2. Colocar a lâmina em SSC 0,4x pré-aquecido a 74 ° C (± 2 ° C) durante 5 min.
    3. Lavar corrediça na solução de lavagem II (4x SSC / 0,1% de Tween-20) durante 2 min.
    4. Coloque 20 mL de anti-fade meio de montagem com DAPI contracoloração (1,5 mg / mL) e cobrir com uma lamela de vidro. Pressione suavemente lamela com o tecido laboratório para remover as bolhas de ar e solução de montagem excesso. Selar as bordas da lamela com unha polonês.
    5. Visualização de slides usando um microscópio de fluorescência equipado com filtros adequados.

    5. Spectral Cariotipagem (SKY) do mouse Cromossomos

    1. Cromossomos e Probe desnaturação
      1. Equilibrar corrediça em 2x SSC à temperatura ambiente durante 2 minutos, sem agitação.
      2. Desidratar diapositivos numa série de etanol (70%, 80%, e 100% de etanol) durante 2 minutos cada, à temperatura ambiente. Ar seco a corrediça para remover o etanol completamente.
      3. solução quente de 40 ml de desnaturação (70% formamida / 2x SSC; pH 7,0) em um frasco Coplin vidro durante 30 min.
      4. Incubar corrediça na solução de desnaturação pré-aquecido durante 1 a 1,5 minutos.
      5. mergulhar imediatamente a deslizar para gelada etanol a 70% durante 2 minutos para interromper o processo de desnaturação, bem como para prevenir os cromossomas desnaturadas a partir de re-hibridação.
      6. Desidratar a corrediça, colocando-o em etanol a 80% durante 2 min e em seguida em etanol a 100% durante 2 min à temperatura ambiente.
      7. Desnaturar a sonda CÉU (frasco n ° 1 fornecido pelo fabricante) num banho de água regulado para 80 ° C (± 2 ° C)durante 7 minutos, e, em seguida, colocar imediatamente em um banho de água diferente definido como 37 ° C durante 10 min.
    2. sonda de hibridação
      1. Adicionar 10 ul de sonda desnaturada CÉU para os cromossomas desnaturadas.
      2. Com cuidado, coloque um x 18 mm lamela de vidro 18 mm sobre a sonda SKY modo que não há bolhas de ar presas sob a lamela.
      3. Selar as bordas da lamela com cimento de borracha.
      4. Colocar a lâmina numa câmara humidificada à prova de luz e incubar no escuro a 37 ° C durante 24 h a 36 h.
    3. Lavagem pós-hibridação e detecção de fluorescência
      1. Remover o cimento de borracha com muito cuidado, sem perturbar a lamela.
      2. Colocar a lâmina em pré-aquecido a solução de lavagem rápida (SSC 0,4x) a 72 ° C (± 2 ° C) durante 5 min com agitação constante. Imergir corrediça em solução de lavagem III (4x SSC / 0,1% de Tween 20) e incubar durante 1 minuto, agitando.
      3. Opcional: adicionar 80 ul de reagente de bloqueio(Frasco n ° 2 fornecido pelo fabricante) para a área de hibridação, coloque um x 60 milímetros lamela de plástico 24 mm, e incuba-se no escuro a 37 ° C durante 30 minutos numa câmara humidificada.
      4. Suavemente remover a lamela de plástico e lava-se a corrediça com pré-aquecido (45 ° C) uma solução de lavagem III durante 5 min.
      5. Aplicar 80? L de reagente de coloração com Cy5 (frasco n ° 3 fornecido pelo fabricante), coloque um x 60 milímetros lamela de plástico 24 mm, e incuba-se a 37 ° C no escuro durante 40 minutos numa câmara humidificada.
      6. Dip slide num frasco Coplin contendo vidro pré-aquecido (45 ° C) uma solução de lavagem III (4x SSC / 0,1% de Tween 20) e incubar a 45 ° C num banho de água durante 2 min com agitação. Repita este passo de lavagem 3 vezes.
      7. Aplicar 80? L de reagente de coloração Cy5.5 (frasco n ° 4 fornecido pelo fabricante), coloque um x 60 milímetros lamela de plástico 24 mm, e incuba-se a 37 ° C no escuro durante 40 minutos numa câmara humidificada.
      8. Lave o slide 3 vezes com pré-aquecido (45 ° C) uma solução de lavagem III.
      9. Segure o slide em uma posição inclinada contra uma toalha de papel para drenar o excesso de líquido. Adicionar 20 ul anti-fade reagente DAPI (frasco # 5 fornecido pelo fabricante) e coloque cuidadosamente um x 60 milímetros lamela de vidro 24 mm sem introduzir quaisquer bolhas de ar. Selar as bordas da lamela com unha polonês e observar com um microscópio de epifluorescência equipado para capturar imagens do céu.

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Representative Results

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irradiação total do corpo induz inúmeras aberrações cromossómicas em células da medula óssea de ratos irradiados. O actual protocolo foi optimizado para a paragem da mitose in vivo de células de medula óssea após a exposição à radiação, a colheita de células de medula óssea a partir das patas traseiras de ratos irradiados, o isolamento de células mononucleares de medula óssea por centrifugação em gradiente de densidade, a preparação dos diferenciais de células da metafase, e subsequente detecção de radiação induzida por aberrações cromossômicas estáveis ​​por técnicas mFISH e SKY. Cromossoma pintura utilizando estas técnicas podem ser usadas para detectar e avaliar o risco de várias condições fisiopatológicas.

A Figura 1 mostra células metaphase representante espalha com pares-1 normais e aberrantes do mouse cromossoma, -2 e -3. A Figura 2 mostra cariotipagem espectral de cromossomos normais e anormais do mouse em metafase.Estes resultados mostram que a radiação ionizante induz aberrações cromossómicas estáveis ​​inter-proliferantes nas células da medula óssea murina, que é composta principalmente de estaminais e progenitoras de células que são responsáveis ​​pela auto-renovação e diferenciação em diversos tipos de células. alterações citogenéticas em células estaminais e progenitoras foram mostrados para associar com várias doenças clínicas, incluindo o cancro, e são considerados como sendo os preditores mais fortes para a gravidade da doença e sobrevivência global. Portanto, é lógico inferir que estáveis ​​aberrações cromossómicas inter-induzida por radiação ionizante pode causar aumento do risco de desenvolvimento de câncer.

figura 1
Figura 1: Efeito da radiação no Células de Medula Óssea de um rato irradiado como detectado por mFISH. A e B mostram uma disseminação de células metaphase rato com pares normais de chromosome-1 (vermelho), cromossomo-2 (verde), e cromossomo-3 (aqua). Todos os outros cromossomos são contrastadas com DAPI (azul). C mostra a aberração estável envolvendo o cromossomo-1, uma parte do cromossomo-1 foi integrado num (DAPI) cromossomo não-pintado, enquanto a outra parte formou um fragmento acentric. D mostra uma parte de uma parte do cromossomo-2 foi integrado no cromossomo não-pintada. E representa aberração estável envolvendo o cromossomo-3. F mostra uma aberração estável envolvendo os três cromossomos pintadas. break points e junções de cores são indicados por setas. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2
Figura 2: Efeito da radiação no osso MarrCélulas ow de irradiado mouse conforme detectado pelo céu. O painel superior mostra uma cariotipagem espectral normal (SKY) de C57BL / 6 do rato fêmea. O painel do meio mostra uma aberração estável envolvendo o cromossomo-4 e cromossomo 12. O painel inferior mostra rato cariotipagem espectral com uma aberração cromossômica estável envolvendo o cromossomo-7 e cromossomo 10. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

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Vários passos críticos determinar o sucesso de mFISH e SKY. O primeiro e mais importante passo é para optimizar o tratamento com colchicina para paragem da mitose in vivo das células mononucleares de medula óssea. A concentração de colchicina e tempo de tratamento individual ou em concertação determinar o índice mitótico, bem como de cromossomos de condensação de dois pré-requisitos importantes para a pintura cromossomo eficaz. Uma alta concentração de colchicina ou um tempo mais longo de tratamento conduz a cromossomas altamente condensados, incompatíveis para a desnaturação e hibridação adequada. Além disso, a identificação precisa de rearranjos complexos em uma célula com cromossomas da metafase espalhar condensados ​​não é uma tarefa fácil de conseguir. administração intra-peritoneal de 100 mL de 0,05% colchicina durante 2 h, em um mouse com um peso corporal entre 22 e 26 g produz um número adequado de células metaphase se espalha com cromossomos moderadamente condensadas. O segundo passo essencial é a tratamento hipotónico.O volume, tempo de tratamento, e a temperatura da morfologia cromossoma influência solução hipotónica e propagação de cromossomas para a lâmina de vidro. Um tratamento hipotónico para um período de tempo mais curto ou a uma temperatura sub-óptima pode impedir o espalhamento apropriado cromossoma, o que resulta em células com cromossomas da metafase espalhar sobrepostas. Cromossoma sobreposição interfere com o processo a jusante em hibridização in situ, a especificidade de sinais fluorescentes, e a identificação correcta de rearranjos.

Em terceiro lugar, a fixação pós-hipotônica é um passo importante para evitar a formação de aglomerado de células. O fixador deve ser adicionado lentamente para o lado do tubo de centrifugação com constante agitação suave para se obter uma suspensão de célula única. Caso contrário, os spreads de células em metafase ficará preso no aglomerados e cromossomo espalhando será comprometida. No entanto, cromossoma espalhando também depende do tipo de células, a temperatura e humidade relativa no time de deixar cair a suspensão de células em lâminas de vidro. Um estudo anterior por Spurbeck relatou que para os linfócitos, uma humidade relativa de 60% e um resultado C de temperatura de 20 ° em maior área metaphase 18. Além disso, a duração da secagem é também um passo fundamental para uma óptima propagação cromossoma. Celular Metaphase espalha que seca produzir muito rapidamente spreads apertados com muitos cromossomos que se sobrepõem, embora muito lentas secagem resulta em metáfase quebrado cromossoma 18. No entanto, mostrou que Deng cromossoma espalhando primeiramente depende de humidade relativa durante uma variedade de células cultivadas 19. O quarto passo é importante para optimizar o tempo de desnaturação cromossoma. Um tempo de desnaturação mais curtos e afectar adversamente a hibridação de sondas. Mais desnaturação provoca cromossomos "inchado", enquanto o menor desnaturação impede interação da sonda para os cromossomas. Outra maneira de reduzir cromossoma "inchaço" é a slides em geral durante a noite à temperatura ambiente serpasso de desnaturação tona. Slides não utilizados para a pintura cromossômica imediatamente, podem ser armazenados indefinidamente em um dessecador a -20 ºC. tempo cromossomo desnaturação precisa ser padronizado com a idade slide, a quantidade de citoplasma em torno dos spreads de celulares metaphase, ea umidade em que as células foram retiradas para os slides. Sonda de desnaturação e hibridação também é importante para a pintura cromossoma bem sucedida. A exposição directa das sondas a luz brilhante deve ser evitado, de modo a que o sinal fluorescente não perde intensidade de sinal.

está bem estabelecido que mFISH e SKY são técnicas poderosas para a detecção de aberrações estáveis ​​inter-cromossômicas. Quaisquer rearranjos, bem como a perda ou ganho de cromossomas pintados pode ser facilmente identificada por estes dois métodos. No entanto, a detecção de intra-braço e inter-braço trocas cromossômicas não são possíveis por estas técnicas. Identificação de intra-braço e inter-braço trocas cromossômicas tornaram-se agora possível becauso do desenvolvimento de, respectivamente, cromossoma sondas multicolor PEIXES específicas do braço e sondas FISH mBAND. Um estudo anterior sobre os trabalhadores antigas centrais nucleares tem mostrado que a análise mBAND é uma ferramenta poderosa para identificar assinaturas únicas de danos da radiação 20. Além disso, a identificação de permuta de cromatídeos irmã, um traço característico de danos de radiação 21, não é possível por estas técnicas. Além disso, tanto mFISH e SKY têm capacidade de pintar a região de cromossomos, o que pode resultar em pontuação errada do cromossomo dicêntrico como translocação limitada. As técnicas também não são adequados para identificar a localização exacta do ponto de interrupção de translocação. Além disso, os sinais fluorescentes não pode ser preservada de forma permanente, a intensidade do sinal diminui com o tempo, e pintura cromossoma fluorescente não é adequado para análise através de um sistema automatizado. No entanto, a intensidade de sinal fluorescente pode ser conservado por um longo período de tempo, armazenando deslizoues no congelador.

Dois métodos aperfeiçoados de pintura cromossômica foram desenvolvidos para superar as limitações de mFISH e SKY: respectivamente, pintura cromossômica não fluorescente 22 e cor espectral faixas (SCAN) 23. As vantagens de pintura cromossoma não-fluorescente utilizando a peroxidase / diaminobenzidina (DAB) ao longo de pintura dos peixes incluem a identificação precisa da região centromérico, identificação de rearranjo cromossómico por microscópio de campo claro, e que o sinal não fluorescente é permanentemente preservada e análise de imagem pode ser automatizado. Por outro lado, o SCAN é vantajoso sobre o céu, porque as sondas de verificação são preparados a partir de sequências de DNA genômico específico de banda para um cromossomo específico e, portanto, pode identificar com precisão a origem de uma banda cromossomo. SCAN também facilita a identificação de trocas intra-cromossômicas. Considerando os benefícios das técnicas melhoradas, estes devem ser considerados para uso i rotinateste citogenético N clínica. No entanto, a preparação de sondas da sequência de DNA genômico de banda específica para cada pares de cromossomos é tecnicamente desafiador e limita sua utilização em citogenética molecular.

Determinar se a diferença entre os grupos de tratamento é estatisticamente significativo ou não é outro aspecto importante da citogenética molecular. Critérios de pontuação, tais como o número de células contadas metáfase barrar, número de animais utilizados em cada grupo de tratamento, a contagem de cromossomas por célula metáfase espalhar durante a análise, a nomenclatura utilizada para classificar as aberrações observada após a pintura cromossoma, etc desempenhar um papel crítico na determinação da incerteza estatística entre os grupos de tratamento. Embora vários laboratórios têm critérios de pontuação proprietárias, pontuação de 100 a 300 e 20 metáfase celular espalha com 40 cromossomos bem separados em pelo menos 3 a 5 ratos é geralmente recomendado para determinar a significância estatística na mFISH e anal SKYysis, respectivamente 24, 25. Além disso, a escolha da nomenclatura utilizada para classificar as aberrações em cromossomas pintados é um parâmetro importante para avaliar estatisticamente incerteza. Existem dois sistemas de nomenclatura populares em uso para descrever aberrações detectadas por sondas de pintura cromossomo inteiro: (1) S & S método de classificação por Savage e Simpson 26, 27 e (2) Nomenclatura PINTURA por Tucker et al. 28. Cada sistema se baseia em diferentes pré-requisitos para a classificação de aberrações cromossómicas estruturais e tem suas próprias vantagens e desvantagens. O sistema S & S é principalmente adequada para interpretação mecanicista de origem aberração, enquanto PINTURA fornece uma descrição de padrões anormais de pintura. Estudos realizados por Knehr et al. em aberrações cromossômicas induzidas por radiação em peixes pintado cromossomos indicam que o método PAINT, como o sistema de S & S, também pode ser usado para determinar a origem aberração com alguns modificatiem nos critérios de pontuação e seria mais útil para a aplicação prática 29.

Ambos os métodos mFISH e céu têm as suas próprias limitações. Por exemplo, mFISH permite marcar rápida com pouca formação, no entanto, não tela todos os cromossomas para a medição de frequência aberração e revela única frequência aberração parcial, dependendo do número de cromossomas pintados utilizados no estudo. No entanto, uma fracção do total de trocas observados por pintura cromossoma inteiro pode ser estimada pela fórmula inicialmente postulado por Lucas et al. 30 e ainda modificado por Braselmann et ai. 31. Esta fórmula matemática considera o intercâmbio entre cromossomos pintadas e entre os cromossomos pintadas e contra. Por exemplo, seja f p representam a soma fraccionada do genoma coberto pelos cromossomas pintados 1 (f 1), 2 (f 2), e 3 (f 3), where f 1 = 0,0696, F 2 = 0,0649, e f = 0,0570 3, os valores representam o conteúdo genómico de cromossomas individuais em ratos fêmeas. Portanto, f p = (f 1 + f 2 + f 3) fração contrastadas = 0,192 e torna-se (1 - f p) = 0,808. A frequência das trocas envolvendo os cromossomos pintadas e contra (F P) pode ser facilmente calculado pelo produto cruzado da expansão binomial (p + q) 2 = p 2 + 2pq + q 2, onde p = f p e q = (1 - p f). Deste modo, F = P = 2f 2pq p (1 - f P) = 0,310, o que significa que 31% das trocas cromossómicas são observáveis após a pintura rato cromossoma-1, -2, e -3. Portanto, 1 / 0,31 = 3,23 células precisam ser marcados para igualar um células em metafase faixas ou um genoma inteiro equivalente. Além disso, tanto mFISH e SKY têm capacidade de SPECIF limitadocamente identificar quais os genes e os pontos de interrupção estão envolvidos na formação aberração e também para detectar pequenas duplicações, inversões, e deleções.

A aplicação de mFISH e análise céu não está limitado a investigação básica. Ambos são regularmente usados ​​em estudos clínicos. Estas técnicas também foram aplicados ao pré-natal e pós-natal diagnóstico, avaliação do risco, e a identificação de vários tipos de cancro. Além disso, ambas as técnicas podem ser utilizadas para pintar cromossomas interfase. Sokolova usado mFISH para pintar cromossomos interfásicos pela primeira vez 32. Essas técnicas também são usadas para estimar a dose pós-irradiação e avaliação de risco em seres humanos após a exposição acidental ou intencional à radiação 11, 33 ionizante. Portanto, a análise do genoma parcial ou total por mFISH ou SKY, respectivamente, são ferramentas úteis para detectar aberrações estáveis ​​inter-cromossômicas em vários estudos.

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Acknowledgments

Este estudo foi apoiado por Arkansas Espaço Grant Consortium e do Instituto Nacional de Pesquisas Espaciais biomédica através de National Aeronautics and Space Administration, concede NNX15AK32A (RP) e RE03701 (MH-J), e P20 GM109005 (MH-J), e da Administração de Veteranos dos EUA ( MH-J). Agradecemos a Christopher Fettes, Coordenador do Programa para o Departamento de Saúde Ambiental e Ocupacional da Universidade de Arkansas para Ciências Médicas, pela assistência editorial na preparação do manuscrito.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Formamide Sigma-Aldrich 221198-100ML
SSC Buffer 20× Concentrate Sigma-Aldrich S6639-1L
SKY Laboratory Reagent for Mouse Applied Spectral Imaging FPRPR0030/M40
CAD - Concentrated Antibody Detection Kit Applied Spectral Imaging FPRPR0033
Single Paints Customized - 3 Colors; Mouse chromosome 1: Red, Mouse chromosome 2: Green, Mouse chromosome 3: Aqua Applied Spectral Imaging FPRPR0182/10
Glass coverslips Fisher Scientific 12-545B
Tween 20 Fisher Scientific BP337-100
Hydrochloric acid, 37%, Acros Organics Fisher Scientific AC45055-0025 
Fisherbrand Glass Staining Dishes  with Screw Cap Fisher Scientific 08-816
KaryoMAX Potassium Chloride Solution  Life Technologies 10575-090
Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides Fisher Scientific 12-550-15
Colcemid powder Fisher Scientific 50-464-757 
Histopaque-1083  Sigma-Aldrich 10831
Shepherd Mark I, model 25 137Cs irradiator J. L. Shepherd & Associates Model 484B
Syringe 1 mL BD Biosciences 647911
Ethyl Alcohol, 200 Proof Fisher Scientific MEX02761
PBS, (1x PBS Liq.), w/o Calcium and Magnesium Fisher Scientific ICN1860454
Fetal Bovine Serum Fisher Scientific 10-437-010
Methanol Fisher Scientific A454SK-4
Glacial acetic acid Fisher Scientific AC295320010
Zeiss Microscope Zeiss AXIO Imager.Z2

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Detecção de Inter-aberrações cromossômicas estáveis ​​por fluorescência múltipla<em&gt; In Situ</em&gt; Hibridização (mFISH) e Spectral Cariotipagem (SKY) em ratos irradiados
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Pathak, R., Koturbash, I., Hauer-Jensen, M. Detection of Inter-chromosomal Stable Aberrations by Multiple Fluorescence In Situ Hybridization (mFISH) and Spectral Karyotyping (SKY) in Irradiated Mice. J. Vis. Exp. (119), e55162, doi:10.3791/55162 (2017).More

Pathak, R., Koturbash, I., Hauer-Jensen, M. Detection of Inter-chromosomal Stable Aberrations by Multiple Fluorescence In Situ Hybridization (mFISH) and Spectral Karyotyping (SKY) in Irradiated Mice. J. Vis. Exp. (119), e55162, doi:10.3791/55162 (2017).

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