Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Genetics

Обнаружение Inter-хромосомных аберраций Стабильные многократными флюоресценции doi: 10.3791/55162 Published: January 11, 2017

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Все исследования на животных проводились в строгом соответствии с рекомендациями, приведенными в Руководстве по уходу и использованию лабораторных животных Национальных институтов здравоохранения. Протокол животных был одобрен Institutional Animal Care и использование комитета Университета Арканзаса для медицинских наук по. Все животные были размещены под стандартным кондиционированном вивария при температуре 20 ± 2 ° С с 10 - 15 часовых циклов свежего воздуха и свободный доступ к стандартной пище с грызунами и воды. По прибытии, были проведены мышей в карантине в течение 1 недели и при условии, сертифицированный корм для грызунов.

1.Radiation экспозиции и в естественных условиях Арест метафазных клеток

  1. Expose ун-наркозом мышей до 2 Гр излучения всего тела в камере облучения. При облучении мышей место в хорошо вентилируемом удерживающую камеру, чтобы убедиться, что они не двигаются свободно и получать равномерную дозу.
  2. Вводят 100 мкл 0,05% -ного раствора колхицина (сolchicine порошок растворяется в кальция и магния свободный PBS) внутрибрюшинно с помощью иглы 25 G прикрепленную с 1 мл одноразового шприца. Избегайте инъекции непосредственно в любой орган.
  3. Оставьте животное в клетке в течение 2-х часов до сбора клеток костного мозга. Обратите внимание на животное для каких-либо признаков боли или страданий.

2. клеток костного мозга для уборки урожая и выделение костного мозга мононуклеарных клеток путем центрифугирования в градиенте плотности

  1. Эвтаназии мышь СО 2 удушья.
  2. Спрей 70% этанола на спинной и брюшной стороне.
  3. Сделайте 2 см разрез на коже живота с острыми ножницами. Захватите кожу с обеих сторон разреза с тупыми пинцетом и аккуратно отогните мышцы живота.
  4. Отрезать обе задние ноги с ножницами и сразу же поместить их в предварительно охлажденный PBS с 4% FBS.
  5. Тщательно очистить все мышцы, прикрепленные к задней конечности с резким бритву и хлопка марлевую повязку.
  6. Отделите часть большеберцовой кости от бедренной кости. Обрежьте оба кончики каждой кости с бритву.
  7. Очистить содержимое костного мозга с 3 мл PBS (с 4% FBS) с помощью иглы 23 G, прикрепленную к 3 мл шприца и собирают содержимое в 15 мл центрифужную пробирку. Pass клеточной суспензии, по меньшей мере в 10 раз через иглу, чтобы сделать одну клеточную суспензию.
  8. Аккуратно наложения клеточной суспензии на равном объеме разделения лимфоцитами среды (3 мл), не нарушая границу раздела между клеточной суспензии и среды для разделения лимфоцитов. Центрифуга при 400 х г в течение 30 мин при комнатной температуре.
  9. Соберите поглощающее покрытие тщательно, не нарушая другие слои и передачи в новом 15 мл центрифужную пробирку.

3. Получение метафазе клеточных Спреды

  1. Добавьте 10 мл PBS на пробирку, содержащую поглощающее покрытие.
  2. Центрифуга при 400 х г в течение 5 мин при комнатной температуре.
  3. Осторожно удалите супернатант. Затем распадаются тон клеточный осадок с нежным постукивания и добавляют 10 мл PBS.
  4. Центрифуга при 400 х г в течение 5 мин при комнатной температуре.
  5. Удалить супернатант, не нарушая клеточный осадок, разбейте осадок, и добавить 4 мл подогретого гипотонического раствора хлорида 0,075 М калия. Добавить гипотонический каплю раствора по каплям при осторожном постоянном встряхивании.
  6. Инкубируйте клетки в течение 20 мин при 37 ° С в водяной бане.
  7. После гипотонической обработки, добавляют равный объем (4 мл) фиксирующих (метанол: лед ную уксусную кислоту, 3: 1 об / об) в 15 мл пробирку и осторожно перемешивают путем переворачивания пробирки.
  8. Центрифуга при 400 мкг в течение 5 мин при комнатной температуре и отбросить супернатант.
  9. Перерыв осадок клеток с последующим нарезания резьбы нежном вихре в течение нескольких секунд и добавьте 3 мл раствора закрепителя капли по капле с постоянным встряхиванием.
  10. Инкубировать в течение 30 мин при комнатной температуре, а затем центрифуге при 400 мкг в течение 5 мин.
  11. Удалить супернатант, разбейте осадок клеток с джентльменомле постукивание, и добавьте 3 мл свежей закрепитель.
  12. Центрифуга при 400 мкг в течение 5 мин при комнатной температуре, и удалить супернатант. Разбейте осадок клеток с нежным постукивания, и добавить свежий 3 мл закрепитель.
  13. Повторите шаг 3.12 раза больше.
  14. Центрифуга при 400 х г в течение 5 мин при комнатной температуре, и удаления надосадочной жидкости, не нарушая клеточный осадок. Затем добавьте 400 до 600 мкл закрепителя и тщательно перемешать с пипеткой.
  15. Отбросьте 30 мкл фиксированных клеток на предварительно очищенную и влажных горками, наклоненными под углом 45 ° и позволяют слайды высохнуть на воздухе полностью в течение ночи.

4. Мышь Хромосома Картина mFISH

  1. Хромосома Денатурация
    1. Поместите слайд, содержащий метафазных клеток спреды в 2х SSC в течение 2 мин при комнатной температуре.
    2. Обезвоживают слайде последовательного промывания этанолом в течение 2 мин, каждый в 70%, 80% и 100%. Инкубировать в течение 60 мин при 65 ° С.
    3. Разогреть 40 мл раствора денатурации (70% формамид / 2х ССC; рН 7,0) до 70 ° С (± 2 ° С) в стеклянной Коплин банку в течение 30 мин. Денатурации хромосом путем инкубирования слайд в подогретого раствора денатурации в течение 1 - 1,5 мин.
    4. Угашайте скользить сразу в охлажденном льдом 70% этаноле в течение 2 мин, чтобы остановить процесс денатурации, а также, чтобы предотвратить денатурированный хромосомами от повторного отжига. Затем обезвоживают путем промывки 80% -ным этанолом в течение 2 мин. Повторите промывку этанол с 100% -ным этанолом в течение 2 мин. Полностью высушите скольжение при комнатной температуре.
  2. Денатурация и Гибридизация Probe смеси
    1. Кратко центрифугировать смесь зонд, поставляемый изготовителем, передача 10 мкл зонда смеси в 500 мкл оснастки колпачок центрифужную пробирку, и денатурируют путем инкубирования при 80 ° С (± 2 ° С) на водяной бане в течение 7 мин.
    2. Поместите центрифужную пробирку с зондом смеси в водяной бане при температуре 37 ° С в течение 10 мин.
    3. Нанесите смесь денатурированного зонда на слайд с денатурированным chromosoтез.
    4. Тщательно покрывают область с х 18 мм скольжением стеклянной крышкой 18 мм и устранить любые видимые пузырьки воздуха очень осторожно нажимая на крышку скольжения скользить. Уплотнение все четыре стороны крышки скольжением с резиновым клеем и инкубировать в течение 12 ч до 16 ч в темноте при 37 ° С в увлажненной камере для гибридизации.
  3. Сообщение Гибридизация стирке и обнаружения
    1. Осторожно снимите резиновый клей и покровное.
    2. Поместите слайд в подогретого 0.4x SSC при 74 ° С (± 2 ° С) в течение 5 мин.
    3. Вымойте слайд в моющем растворе II (4x SSC / 0,1% твин-20) в течение 2 мин.
    4. Поместите 20 мкл анти-выцветанию монтажной среде с DAPI контрастирующая (1,5 мкг / мл) и покрывают покровным стеклом. Осторожно нажмите на покровное с лабораторной тканью, чтобы удалить пузырьки воздуха и излишки раствора монтажа. Печать края покровного с лаком для ногтей.
    5. Просмотр слайдов с помощью флуоресцентного микроскопа, оборудованного соответствующими фильтрами.

    5. Спектральный кариотипирование (SKY) мышиных хромосомах

    1. Хромосома и зонд денатурации
      1. Равновесие слайд в 2х SSC при комнатной температуре в течение 2 мин, без встряхивания.
      2. Высушить слайд в качестве серии этанола (70%, 80% и 100% этанола) в течение 2 мин каждый при комнатной температуре. Высушите слайд, чтобы полностью удалить этанол.
      3. Теплый 40 мл раствора денатурация (70% формамид / 2х SSC, рН 7,0) в стеклянной Коплин банку в течение 30 мин.
      4. Инкубировать слайд в предварительно нагреваемый денатурации в течение 1 мин до 1,5.
      5. Немедленно погрузить сползание в охлажденную льдом 70% этаноле в течение 2 мин, чтобы остановить процесс денатурации, а также, чтобы предотвратить денатурированный хромосомами от повторного отжига.
      6. Обезвоживают слайд, поместив его в 80% этаноле в течение 2 мин, а затем в 100% этаноле в течение 2 мин при комнатной температуре.
      7. Денатурации SKY зонда (пробирка # 1 поставляется производителем) на водяной бане до 80 ° С (± 2 ° C)в течение 7 минут, а затем сразу же поместить в другую ванну воды, установленной на 37 ° С в течение 10 мин.
    2. зонд гибридизация
      1. Добавьте 10 мкл денатурированного SKY зонда на денатурированных хромосом.
      2. Аккуратно поместите 18 мм х 18 мм покровного стекла на SKY зонда так, чтобы пузырьки воздуха не попали под покровное.
      3. Печать края покровного стекла с резиновым клеем.
      4. Поместите слайд в увлажненной светонепроницаемой камере и инкубировать в темноте при температуре 37 ° С в течение 24 ч до 36 ч.
    3. Пост-гибридизация стирке и флуоресцентным детектированием
      1. Удалите резиновый клей очень осторожно, не нарушая покровное.
      2. Поместите слайд в подогретого быстрого промывочного раствора (0.4x SSC) при 72 ° С (± 2 ° С) в течение 5 мин при постоянном встряхивании. Погрузите слайд в моющем растворе III (4x SSC / 0,1% Tween 20) и инкубировать в течение 1 мин при встряхивании.
      3. Необязательно: Добавьте 80 мкл блокирующего реагента(Пробирка # 2 поставляется производителем) на область гибридизации, место 24 мм х 60 мм пластиковой покровное и инкубировать в темноте при температуре 37 ° С в течение 30 мин в увлажненной камере.
      4. Аккуратно удалите пластиковую покровное и промойте слайд с предварительно нагретом (45 ° C) промывочного раствора III в течение 5 мин.
      5. Нанесите 80 мкл Cy5 окрашивания реагента (флакон # 3 поставляется производителем), место 24 мм х 60 мм пластиковой покровное и инкубировать при 37 ° С в темноте в течение 40 мин в увлажненной камере.
      6. Погрузите слайд в стеклянный сосуд, содержащий Коплин предварительно нагретом (45 ° С) промывочного раствора III (4x SSC / 0,1% твин-20) и инкубируют при 45 ° С в водяной бане в течение 2 мин при встряхивании. Повторите эту стадию промывки 3 раза.
      7. Нанесите 80 мкл Cy5.5 окрашивающего реагента (пробирка # 4 поставляется производителем), место 24 мм х 60 мм пластиковой покровное и инкубировать при 37 ° С в темноте в течение 40 мин в увлажненной камере.
      8. Вымойте слайд 3 раза с предварительно нагретом (45 ºC) моющий раствор III.
      9. Держите слайд в наклонном положении с бумажным полотенцем, чтобы слить лишнюю жидкость. Добавьте 20 мкл анти-выцветанию DAPI реагента (флакон № 5, поставляемый изготовителем) и аккуратно разместить 24 мм х 60 мм покровного стекла без введения каких-либо воздушных пузырьков. Печать края покровного с лаком для ногтей и наблюдать с эпифлуоресцентной микроскопа, снабженного для захвата изображений SKY.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Общее облучение тела вызывает многочисленные хромосомных аберраций в клетках костного мозга облученных мышей. Текущий протокол оптимизирован для в естественных условиях митоза клеток костного мозга после радиационного облучения, урожай клеток костного мозга от задних ног облученных мышей, выделения мононуклеарных клеток костного мозга путем центрифугирования в градиенте плотности, подготовка метафазы клеток спредов и последующего обнаружение радиационно-индуцированных стабильных хромосомных аберраций с помощью методов mFISH и SKY. Хромосома картина с помощью этих методов могут быть использованы для обнаружения и оценки риска различных патофизиологических условиях.

На рисунке 1 показана представитель метафазных клеток распространяется с нормальным и аномальным мыши хромосомных пар-1, -2, и -3. На рисунке 2 показан спектральный кариотипирование нормальных и ненормальных метафазных хромосом мыши.Эти результаты показывают, что ионизирующее излучение вызывает между хромосомных аберраций стабильных в пролиферирующих клетках мышиного костного мозга, который в основном состоит из стволовых клеток и клеток-предшественников, которые ответственны за самообновлению и дифференцировке в различные типы клеток. Цитогенетические изменения в стволовых и прогениторных клеток было показано, что ассоциируют с различными клиническими заболеваниями, включая рак, и считаются самыми сильными прогностическими тяжести заболевания и общей выживаемости. Поэтому, вполне логично предположить, что ионизирующее излучение индуцированное стабильные между хромосомных аберраций может вызвать повышенный риск развития рака.

Рисунок 1
Рисунок 1: Влияние радиации на клетки костного мозга мышей облученного , как Обнаружил mFISH. А и В показывают распространение мыши метафазных клеток с нормальными парами чromosome-1 (красный), хромосома-2 (зеленый), и хромосома-3 (аква). Все остальные хромосомы контрастно с DAPI (синий). C показывает стабильную аберрацию с участием хромосомы-1, часть хромосомы-1 была интегрирована в не окрашена (DAPI) хромосомы, в то время как другая часть сформировала периферический фрагмент. D показывает часть части хромосомы-2 была интегрирована в не окрашенные хромосомы. Е представляет собой стабильную аберрацию с участием хромосомы-3. F показывает стабильную аберрацию с участием всех трех окрашенными хромосомами. Перерыв точки и цветовые переходы обозначены стрелками. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

фигура 2
Рисунок 2: Влияние радиации на костный МарраOW клетки облученного мышей, как детектируется SKY. Верхняя панель показывает нормальный спектральный кариотипирование (SKY) из C57BL / 6 самки мыши. Средняя панель показывает устойчивую аберрацию с участием хромосомы-4 и хромосома-12. Нижняя панель показывает спектральный кариотипирование мыши со стабильным хромосомных аберраций с участием хромосомы-7 и хромосомный-10. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Несколько важных шагов определяют успех mFISH и SKY. Первый и самый важный шаг заключается в оптимизации лечения Колхицин в естественных условиях для митоза из мононуклеарных клеток костного мозга. Концентрация и лечение колхицином время индивидуально или совместно определяют митотический индекс, а также конденсации хромосом-два важных предпосылок для эффективного хромосомной живописи. Высокая концентрация колхицин или более длительное время обработка приводит к весьма кариосферы, несовместимыми для правильной денатурации и гибридизации. Кроме того, точная идентификация сложных перестроек в метафазе клетки распространяются с конденсированными хромосомами не является легкой задачей для достижения. Intra-перитонеального введение 100 мкл 0,05% колхицина в течение 2 ч в мыши с массой тела от 22 до 26 г производит достаточное количество метафазе клетки распространяется с умеренно кариосферы. Вторым важным шагом является гипотонический лечение.Объем, продолжительность обработки, и температура гипотонического раствора влияния хромосом морфологии и распространение хромосом на предметное стекло. Гипотоническому лечение в течение более короткого периода времени или при субоптимальной температуре может предотвратить соответствующую хромосому распространение, в результате чего клетки метафазы распространения с перекрывающихся хромосом. Хромосома перекрытие препятствует вниз по течению на месте процесса гибридизации, специфичности флуоресцентных сигналов, а также правильной идентификации перестроек в.

В-третьих, после гипотонического фиксации является важным шагом, чтобы избежать образования клеток комок. Закрепляющего следует добавить медленно вниз в сторону трубки центрифуги с постоянным осторожном встряхивании для получения суспензии отдельных клеток. В противном случае метафазных клеток будет защемлен в комки и хромосома распространения будут поставлены под угрозу. Тем не менее, хромосома распространение также зависит от типа клеток, температуры и относительной влажности при ТIME уронить суспензии клеток на стеклянные слайды. Предыдущее исследование Spurbeck сообщил , что для лимфоцитов, относительной влажности воздуха 60% и температура результат C 20 ° в большей площади метафазы 18. Кроме того, продолжительность сушки также является важным шагом для обеспечения оптимальной хромосома распространения. Метафаза клетка распространяется , что сухой слишком быстро производить узкие спреды с большим количеством перекрывающихся хромосом, в то время как очень медленные результаты сушки на ломаном метафазных хромосом 18. Тем не менее, Дэн показал , что хромосома распространение , прежде всего , зависит от относительной влажности для различных культивируемых клеток 19. Четвертый важный шаг заключается в оптимизации хромосом время денатурации. Более длинный и более короткое время денатурации отрицательно влияют на гибридизацию зонда. Более денатурации вызывает "пухлые" хромосомы, а короче денатурации затрудняет взаимодействие зонда с хромосомами. Другой способ уменьшить хромосомный "отечность" является возрастным слайдах в течение ночи при комнатной температуре будетпередняя стадия денатурации. Слайды не используются для хромосомной живописи сразу, можно хранить неопределенно долго в эксикаторе при -20 ° С. Время Хромосома денатурация должен быть стандартизирован с слайд возрастом количество цитоплазмы вокруг метафазных клеток разворотов, а также от влажности, при которой клетки капают на слайдах. Зонд денатурации и гибридизацию также имеет важное значение для успешной хромосомной живописи. Прямое воздействие зондов яркого света следует избегать, так что флуоресцентный сигнал не теряет интенсивности сигнала.

Это хорошо установлено, что mFISH и SKY являются мощные методы для обнаружения между хромосомные стабильных аберраций. Любые перестановки, а также потери или усиление окрашенных хромосом могут быть легко идентифицированы с помощью этих двух методов. Однако, обнаружение внутри руки и между рычажных хромосомных обменов не представляется возможным с помощью этих методов. Идентификация внутри руки и между рычажных хромосомных обменов теперь стало возможным БекаИспользование развития, соответственно, хромосомных руки конкретных многоцветной FISH зондов и mBAND FISH зондов. Предыдущее исследование на бывших атомщиков показал , что анализ mBAND является мощным инструментом для идентификации уникальных подписей радиационных повреждений 20. Кроме того, идентификация обмена сестринских хроматид, характерной особенностью радиационного повреждения 21, не представляется возможным с помощью этих методов. Кроме того, оба mFISH и SKY имеют ограниченную способность рисовать центромерной области хромосом, что может привести к ошибочным озвучивание дицентриков хромосомы как транслокации. Эти методы также не пригодны для выявления точного останова локализации транслокации. Кроме того, флуоресцентные сигналы не могут быть сохранены на постоянной основе, интенсивность сигнала уменьшается с течением времени, и флуоресцентный хромосома картина не подходит для анализа с помощью автоматизированной системы. Тем не менее, интенсивность флуоресцентный сигнал может сохраняться в течение более длительного периода времени путем сохранения скользилиэс в морозильную камеру.

Два улучшенных методов хромосомного живописи были разработаны , чтобы преодолеть ограничения mFISH и SKY: соответственно, нефлуоресцирующего хромосома картина 22 и спектральный цвет полосы (SCAN) 23. Преимущества нефлуоресцентной хромосомной живописи с использованием пероксидазы / диаминобензидин (DAB) над FISH живописи включают в себя точную идентификацию центромерной региона, определение хромосомной перестройкой ярко-поле микроскопа, а не-флуоресцентный сигнал постоянно сохранившийся и анализ изображения может автоматизировать. С другой стороны, сканирование преимущественный над SKY, поскольку SCAN-зонды готовили из последовательностей геномной ДНК группы специфических для конкретной хромосомы и, таким образом, может точно определить происхождение хромосомного-диапазона. SCAN также облегчает идентификацию внутри хромосомных обменов. Учитывая преимущества усовершенствованных методов, их следует рассматривать для повседневного использования Iп клиническая цитогенетического тестирования. Тем не менее, подготовка проб из последовательности геномной ДНК группы специфичные для каждой пары хромосом является технически сложным и ограничивает его применение в молекулярной цитогенетики.

Определение того, является ли статистически значимая разница между группами лечения или не является еще одним важным аспектом молекулярной цитогенетики. Скоринг критерии, такие как количество метафазе клетки спреды подсчитывали, количество животных , используемых в группе лечения, числа хромосом в метафазе клетки распространяются в ходе анализа, номенклатура используется для классификации аберраций хромосом наблюдается после того, как картины и т.д. играют решающую роль в определении статистической неопределенности между группами лечения. Хотя различные лаборатории имеют запатентованные критерии подсчета очков, забив от 100 до 300 и 20 метафазных клеток распространяется с 40 хорошо разделенных хромосом по крайней мере, от 3 до 5 мышей, как правило, рекомендуется для определения статистической значимости в mFISH и SKY анальнымлиз, соответственно 24, 25. Кроме того, выбор номенклатуры, используемые для классификации аберраций в окрашенных хромосом является важным параметром для оценки статистически неопределенности. Есть два популярных систем номенклатуры в использовании для описания аберраций , обнаруженные целой хромосомы окрасочных зондов: (1) S & S метод классификации по Savage и Симпсон 26, 27 и (2) PAINT номенклатуре Такером и др. 28. Каждая система опирается на различные предпосылки для классификации структурных хромосомных аберраций и имеет свои преимущества и недостатки. Система S & S в первую очередь подходит для механистической интерпретации аберраций происхождения, в то время как PAINT содержит описание аномальных образцов живописи. Исследования Knehr и соавт. на радиационно-индуцированных хромосомных аберраций в рыбьем окрашенные хромосомы указывают, что метод КРАСКА, как система S & S, также могут быть использованы для определения аберраций происхождения с некоторыми modificatiна в критериях подсчета очков и будут наиболее полезны для практического применения 29.

Оба метода mFISH и SKY имеют свои собственные ограничения. Например, mFISH позволяет быстро скоринг с небольшим обучением, однако, он не экранирует все хромосомы для измерения частоты аберраций и обнаруживает лишь частичную частоту аберраций, в зависимости от количества окрашенных хромосом, используемых в исследовании. Тем не менее, часть общих обменов , наблюдаемых всей хромосомной картина может быть оценена по формуле первоначально постулированному Лукаса и др. 30 и дополнительно модифицированы Braselmann и соавт. 31. Эта математическая формула учитывает обмен между нарисованными хромосом и между окрашенными и контрастному хромосом. Например, пусть F р представляют собой дробную сумму генома охваченного окрашенными хромосомами 1 (F 1), 2 (F 2), и 3 3), WheRe F 1 = 0,0696, F 2 = 0,0649, и F 3 = 0.0570, значения представляют собой геномную содержание отдельных хромосом у самок мышей. Следовательно, ф р = (F 1 + F 2 + F 3) = 0,192 и контрастному фракция будет (1 - е р) = 0,808. Частота обменов с участием окрашенными и контрастному хромосом (F P) можно легко вычислить по поперечному произведению биномиального разложения (р + д) 2 = р 2 + 2pq + Q 2, где р = е р и д = (1 - ф р). Таким образом, F P = 2pq = 2F р (1 - е р) = 0,310, что означает 31% хромосомных обменов наблюдаются после окраски мыши хромосома-1, -2, и -3. Таким образом, 1 / 0,31 = 3,23 клетки должны быть засчитан равным одному полосчатых метафазных клеток или одного целого генома эквивалент. К тому же, как mFISH и SKY имеют ограниченную способность к specifчески определить, какие гены и контрольные точки участвуют в формировании аберраций, а также обнаружить небольшие дупликации, инверсии и делеции.

Применение mFISH и анализа SKY не ограничивается фундаментальными исследованиями. Оба регулярно используются в клинических исследованиях. Эти методы также были применены к дородовой и послеродовой диагностики, оценки риска и идентификации различных видов рака. Кроме того, оба эти методы могут быть использованы для рисования интерфазных хромосом. Соколова используется mFISH расписывать интерфазных хромосом в первый раз 32. Эти методы также используются для оценки дозы после облучения и оценки риска в организме человека после случайного или преднамеренного воздействия ионизирующего излучения 11, 33. Таким образом, частичное или весь анализ генома с помощью mFISH или SKY, соответственно, являются полезными инструментами для выявления между хромосомные стабильных аберраций для различных исследований.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Это исследование было поддержано Арканзас космических грантов консорциума и Национального института космических исследований биомедицинской через Национальное управление по аэронавтике и исследованию космического пространства, предоставляет NNX15AK32A (RP) и RE03701 (MH-J), и P20 GM109005 (MH-J), и администрация США ветеранов ( MH-J). Мы благодарим Кристофера Fettes, координатора программы Департамента охраны окружающей среды и гигиены труда в университете Арканзаса для медицинских наук, за редакционную помощь в подготовке рукописи.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Formamide Sigma-Aldrich 221198-100ML
SSC Buffer 20× Concentrate Sigma-Aldrich S6639-1L
SKY Laboratory Reagent for Mouse Applied Spectral Imaging FPRPR0030/M40
CAD - Concentrated Antibody Detection Kit Applied Spectral Imaging FPRPR0033
Single Paints Customized - 3 Colors; Mouse chromosome 1: Red, Mouse chromosome 2: Green, Mouse chromosome 3: Aqua Applied Spectral Imaging FPRPR0182/10
Glass coverslips Fisher Scientific 12-545B
Tween 20 Fisher Scientific BP337-100
Hydrochloric acid, 37%, Acros Organics Fisher Scientific AC45055-0025 
Fisherbrand Glass Staining Dishes  with Screw Cap Fisher Scientific 08-816
KaryoMAX Potassium Chloride Solution  Life Technologies 10575-090
Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides Fisher Scientific 12-550-15
Colcemid powder Fisher Scientific 50-464-757 
Histopaque-1083  Sigma-Aldrich 10831
Shepherd Mark I, model 25 137Cs irradiator J. L. Shepherd & Associates Model 484B
Syringe 1 mL BD Biosciences 647911
Ethyl Alcohol, 200 Proof Fisher Scientific MEX02761
PBS, (1x PBS Liq.), w/o Calcium and Magnesium Fisher Scientific ICN1860454
Fetal Bovine Serum Fisher Scientific 10-437-010
Methanol Fisher Scientific A454SK-4
Glacial acetic acid Fisher Scientific AC295320010
Zeiss Microscope Zeiss AXIO Imager.Z2

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kodama, Y., et al. Stable chromosome aberrations in atomic bomb survivors: results from 25 years of investigation. Radiat Res. 156, 337-346 (2001).
  2. Lucas, J. N. Cytogenetic signature for ionizing radiation. Int J Radiat Biol. 73, 15-20 (1998).
  3. Zaccaria, A., Barbieri, E., Mantovani, W., Tura, S. Chromosome radiation-induced aberrations in patients with Hodgkin's disease. Possible correlation with second malignancy? Boll. Ist. Sieroter. Milan. 57, 76-83 (1978).
  4. Fisher, N. L., Starr, E. D., Greene, T., Hoehn, H. Utility and limitations of chromosome banding in pre- and postnatal service cytogenetics. Am J Med Genet. 5, 285-294 (1980).
  5. Hande, M. P., et al. Complex chromosome aberrations persist in individuals many years after occupational exposure to densely ionizing radiation: an mFISH study. Genes Chromosomes. Cancer. 44, 1-9 (2005).
  6. Gall, J. G., Pardue, M. L. Formation and detection of RNA-DNA hybrid molecules in cytological preparations. Proc Natl Acad Sci U S A. 63, 378-383 (1969).
  7. Bauman, J. G., Wiegant, J., Borst, P., van, D. P. A new method for fluorescence microscopical localization of specific DNA sequences by in situ hybridization of fluorochromelabelled RNA. Exp Cell Res. 128, 485-490 (1980).
  8. Hopman, A. H., et al. Bi-color detection of two target DNAs by non-radioactive in situ hybridization. Histochemistry. 85, 1-4 (1986).
  9. Nederlof, P. M., et al. Three-color fluorescence in situ hybridization for the simultaneous detection of multiple nucleic acid sequences. Cytometry. 10, 20-27 (1989).
  10. Nederlof, P. M., et al. Multiple fluorescence in situ hybridization. Cytometry. 11, 126-131 (1990).
  11. Szeles, A., Joussineau, S., Lewensohn, R., Lagercrantz, S., Larsson, C. Evaluation of spectral karyotyping (SKY) in biodosimetry for the triage situation following gamma irradiation. Int J Radiat Biol. 82, 87-96 (2006).
  12. Camparoto, M. L., Ramalho, A. T., Natarajan, A. T., Curado, M. P., Sakamoto-Hojo, E. T. Translocation analysis by the FISH-painting method for retrospective dose reconstruction in individuals exposed to ionizing radiation 10 years after exposure. Mutat. Res. 530, 1-7 (2003).
  13. Edwards, A. A critique of 'Collaborative exercise on the use of FISH chromosome painting for retrospective biodosimetry of Mayak nuclear-industrial personnel. Int J Radiat Biol. 78, 867-871 (2002).
  14. Bauchinger, M., et al. Collaborative exercise on the use of FISH chromosome painting for retrospective biodosimetry of Mayak nuclear-industrial personnel. Int J Radiat Biol. 77, 259-267 (2001).
  15. Hieber, L., et al. Chromosomal rearrangements in post-Chernobyl papillary thyroid carcinomas: evaluation by spectral karyotyping and automated interphase FISH. J Biomed. Biotechnol. 2011, 693691 (2011).
  16. Cohen, N., et al. detection of chromosome rearrangements in two cases of tMDS with a complex karyotype. Cancer Genet Cytogenet. 138, 128-132 (2002).
  17. Pathak, R., et al. The Vitamin E Analog Gamma-Tocotrienol (GT3) Suppresses Radiation-Induced Cytogenetic Damage. Pharm Res. (2016).
  18. Spurbeck, J. L., Zinsmeister, A. R., Meyer, K. J., Jalal, S. M. Dynamics of chromosome spreading. Am J Med Genet. 61, 387-393 (1996).
  19. Deng, W., Tsao, S. W., Lucas, J. N., Leung, C. S., Cheung, A. L. A new method for improving metaphase chromosome spreading. Cytometry A. 51, 46-51 (2003).
  20. Hande, M. P., et al. Past exposure to densely ionizing radiation leaves a unique permanent signature in the genome. Am J Hum Genet. 72, 1162-1170 (2003).
  21. Tug, E., Kayhan, G., Kan, D., Guntekin, S., Ergun, M. A. The evaluation of long-term effects of ionizing radiation through measurement of current sister chromatid exchange (SCE) rates in radiology technologists, compared with previous SCE values. Mutat. Res. 757, 28-30 (2013).
  22. Kanda, R., et al. Non-fluorescent chromosome painting using the peroxidase/diaminobenzidine (DAB) reaction. Int J Radiat Biol. 73, 529-533 (1998).
  23. Kakazu, N., et al. Development of spectral colour banding in cytogenetic analysis. Lancet. 357, 529-530 (2001).
  24. Rithidech, K. N., Honikel, L., Whorton, E. B. mFISH analysis of chromosomal damage in bone marrow cells collected from CBA/CaJ mice following whole body exposure to heavy ions (56Fe ions). Radiat Environ Biophys. 46, 137-145 (2007).
  25. Abrahams, B. S., et al. Metaphase FISHing of transgenic mice recommended: FISH and SKY define BAC-mediated balanced translocation. Genesis. 36, 134-141 (2003).
  26. Savage, J. R., Simpson, P. On the scoring of FISH-"painted" chromosome-type exchange aberrations. Mutat. Res. 307, 345-353 (1994).
  27. Savage, J. R., Simpson, P. FISH "painting" patterns resulting from complex exchanges. Mutat. Res. 312, 51-60 (1994).
  28. Tucker, J. D., et al. PAINT: a proposed nomenclature for structural aberrations detected by whole chromosome painting. Mutat. Res. 347, 21-24 (1995).
  29. Knehr, S., Zitzelsberger, H., Bauchinger, M. FISH-based analysis of radiation-induced chromosomal aberrations using different nomenclature systems. Int J Radiat Biol. 73, 135-141 (1998).
  30. Lucas, J. N., et al. Rapid translocation frequency analysis in humans decades after exposure to ionizing radiation. Int J Radiat Biol. 62, 53-63 (1992).
  31. Braselmann, H., et al. SKY and FISH analysis of radiation-induced chromosome aberrations: a comparison of whole and partial genome analysis. Mutat. Res. 578, 124-133 (2005).
  32. Sokolova, I. A., et al. The development of a multitarget, multicolor fluorescence in situ hybridization assay for the detection of urothelial carcinoma in urine. J Mol Diagn. 2, 116-123 (2000).
  33. Lindholm, C., et al. Biodosimetry after accidental radiation exposure by conventional chromosome analysis and FISH. Int J Radiat Biol. 70, 647-656 (1996).
Обнаружение Inter-хромосомных аберраций Стабильные многократными флюоресценции<em&gt; В Ситу</em&gt; Гибридизация (mFISH) и спектральное кариотипирование (SKY) в облученных мышей
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Pathak, R., Koturbash, I., Hauer-Jensen, M. Detection of Inter-chromosomal Stable Aberrations by Multiple Fluorescence In Situ Hybridization (mFISH) and Spectral Karyotyping (SKY) in Irradiated Mice. J. Vis. Exp. (119), e55162, doi:10.3791/55162 (2017).More

Pathak, R., Koturbash, I., Hauer-Jensen, M. Detection of Inter-chromosomal Stable Aberrations by Multiple Fluorescence In Situ Hybridization (mFISH) and Spectral Karyotyping (SKY) in Irradiated Mice. J. Vis. Exp. (119), e55162, doi:10.3791/55162 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter