Abstract
Decidualisatie een progesteron-afhankelijke differentiatieproces van endometriale stromale cellen en is een voorwaarde voor een succesvolle implantatie embryo. Hoewel veel pogingen zijn gedaan om de onderliggende mechanismen van decidualisatie blijkt, blijft de exacte signalering tussen de epitheliale cellen die in contact met het embryo en de onderliggende stromale cellen slecht begrepen. Daarom bestuderen decidualisatie op een manier die zowel de epitheliale en stromale cellen houdt rekening kon verrij- de moleculaire details van decidualisatie. Daartoe in vivo modellen van kunstmatige decidualisatie fysiologisch het meest relevant; echter manipulatie van intercellulaire communicatie beperkt. Momenteel, in vitro kweken van endometriale stromale cellen worden gebruikt om de modulatie van decidualisatie onderzoeken door verschillende signaalmoleculen. Conventioneel, humane of muizen endometriale stromale cellengebruikt. Echter, de beschikbaarheid van menselijke monsters vaak gering. Bovendien is het gebruik van murine weefsels gepaard met variatie in de wijze van kweken. Deze studie geeft een gevalideerde en gestandaardiseerde methode om pure Endometrial epitheelcellen (EEG) en Stromal Cell (ESC) culturen met behulp van volwassen intact muizen behandeld met oestrogeen gedurende drie opeenvolgende dagen te verkrijgen. Het protocol is geoptimaliseerd om de opbrengst levensvatbaarheid en zuiverheid van de cellen te verbeteren en verder uitgebreid om decidualisatie studeren in een gemengde cultuurmedium van EEG en ESC. Dit model kan geschikt zijn om het belang van beide celtypes in decidualisatie benutten en de bijdrage van belangrijke signaalmoleculen uitgescheiden door EEG of ESC tijdens de intercellulaire communicatie evalueren.
Introduction
De menselijke endometrium is de binnenvoering van de baarmoeder en ondergaat de maandelijkse cyclus van afbraak en reparatie als voorbereiding op mogelijke zwangerschap. Het bestaat uit een enkele laag van epitheelcellen die de baarmoeder lumen en de onderliggende stroma die in dikte varieert afhankelijk van fluctuaties van geslachtshormonen oestrogeen en progesteron. Tijdens de luteale fase zal de postovulatory progesterongolf differentiatie van endometriale stromale cellen in grotere, ronde decidua cellen, een proces genaamd decidualisatie 1, 2 te induceren. Bij de mens komt dit verschijnsel spontaan de predecidua vormen, maar wordt meer uitgesproken bij embryo implantatie. Een functionele consequentie van decidualisatie is dat de baarmoeder ontvankelijk voor innesteling van het embryo wordt kortstondig. Dit interval wordt aangeduid als het "venster van implantatie. Tijdens de vroege periode van embryoimplantatie, de gedecidualiseerde endometrial stromale cellen rondom de implantatie embryo een barrière voor de doorgang van schadelijke stoffen aan het embryo 3 voorkomen. Tijdens de zwangerschap wordt dit decidua nutriënten aan de foetus voordat placentation heeft plaatsgevonden, en zal later vormen de maternale deel van de placenta 4.
Ethische en praktische overwegingen beperken de opzet van humane studies om het proces van decidualisatie onderzoeken en het gebruik van diermodellen hebben geleid. Als lid van de groep hemochorial placenta, zal het endometrium van knaagdieren ook decidualisatie ondergaan vóór 5 placenta. Bij knaagdieren, maar de opening van het decidualisatie is afhankelijk van de aanwezigheid van blastocysten in de baarmoeder lumen, wat aangeeft dat een extra stimulans moeten de deciduale respons 6 veroorzaken. Dit impliceert een ingewikkelde communicatie tussen the endometrium epitheelcellen die direct contact met de blastocyst hebben, en de onderliggende stromale cellen. Niettemin kan decidualisatie kunstmatig worden geïnduceerd middels stimuli mechanische krassen of instillatie olie in een hormonaal geprimede baarmoeder. Hoewel in vivo studies met behulp van kunstmatige decidualisatie modellen ons hebben toegestaan om onze inzichten te verbeteren in het complexe proces van signalering decidualisatie, mechanistische diepgaande studies, bijvoorbeeld, het onderzoek van de onmisbare communicatie tussen epitheliale en stromale cellen, zijn beperkt. Derhalve kunnen in vitro decidualisatie studies worden gebruikt om belangrijke paden manipuleren en bestuderen fundamentele processen. Hiertoe kunnen endometriale stromale primaire celculturen worden opgezet vanuit humane of knaagdier endometrium. Gebruikmakend knaagdieren instemt het gebruik van genetisch gemodificeerde dieren de rol van een specifiek eiwit van belang gedurende het proces decidualisatie onderzoeken. Echter, onvolwassen, prepuberty muizen worden vaak gebruikt om complicaties van de loopsheid voorkomen, terwijl in andere gevallen baarmoeders verzameld bij alle fasen van de loopsheid, waardoor een heterogeniteit in de kweken. Bovendien is het proces van decidualisatie onderzocht bij verschillende protocollen, bijvoorbeeld door (i) vullen hormonen (oestrogeen, progesteron of cyclisch adenosine monofosfaat (cAMP)) naar het kweekmedium, of door (ii) isolatie van decidua cellen uit muizen dag 4,5 van (pseudo) zwangerschap, die extra behoefte aan plug controle en gevasectomiseerde mannetjes te eisen. Deze beperkingen tonen de noodzaak van een gestandaardiseerde methode studie in vitro decidualisatie. In deze studie, een fysiologisch model voor in vitro onderzoeken decidualisatie vanaf volwassene zal niet (pseudo) zwangere muizen worden gepresenteerd. In deze werkwijze dagelijkse injectie van 17β-oestradiol (E2) proliferatie van endometriale cellen induceren, wat resulteert in een verhoogde opbrengst van homogene en pure celpopulaties. Bovendien is het gebruik van een coculturing systeem maakt het onderzoek mogelijk van de epitheliale-stromale overspraak en de mogelijkheid om het proces van decidualisatie manipuleren op verschillende niveaus.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ThinCert Tissue culture insert for 24 well plates; 1 µm pore size; transparant | Greiner Bio-one | 662610 | Inserts are also provided for other multiwell plates and/or other pore sizes. Other suppliers: Merck Millipore. https://shop.gbo.com/en/row/articles/catalogue/article/ 0110_0110_0090_0030/13408/ |
| Nunc Cell culture treated 24 well plates | Thermo Scientific | 142475 | http://www.thermofisher.com/order/catalog/product/142475 |
| 8-Bromoadenosine 3′,5′-cyclic monophosphate sodium salt | Sigma Aldrich | B7880 | Prepare a stock solution of 100 mM in Milli Q water. Store aliquots at -20 °C. http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/b7880?lang=en®ion=BE |
| Medroxyprogesterone 17-acetate | Sigma Aldrich | M1629 | Prepare a stock solution of 250 µM in ethanol. Store aliquots at -20 °C. http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/m1629?lang=en®ion=BE |
| Arachis oil | Supermarket | Standard cooking arachis oil that can be found in every supermarket is used | |
| PrestoBlue cell viability reagent | Thermo Scientific | A13261 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/A13261?ICID=cvc-prestoblue-c1t1 |
| HBSS 1x, no calcium, no magnesium, no phenol red | Gibco | 14175-046 | Store in fridge as long as possible. Use cold HBSS+ during the protocol. https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/14175046 |
| 17-β Estradiol | Sigma Aldrich | E8875 | Prepare a stock solution of 1 mg/mL in EtOH before diluting in arachis oil (1:1,000). http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/e8875?lang=en®ion=BE |
| Cell medium filter Stericup, 0.22 µm, polyethersulfone, 500 mL, radio-sterilized | Merck Millipore | SCGPU05RE | http://www.merckmillipore.com/BE/en/product/Stericup-GP%2C-0.22%C2%A0%C2%B5m%2C-polyethersulfone%2C-500%C2%A0mL%2C-radio-sterilized,MM_NF-SCGPU05RE |
| Penicillin-Streptomycin (5,000 U/mL) | Gibco | 15070-063 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15070063?ICID=search-15070-063 |
| DMEM/F12, phenol red, L-glutamine, HEPES | Gibco | 11330-032 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/11330057?ICID=search-11330-057 |
| Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated, E.U.-approved, South America Origin | Gibco | 10500-056 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10500064?ICID=search-10500-064 |
| Amphotericin B | Gibco | 15290-018 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15290018?ICID=search-15290-018 |
| Gentamicin (50 mg/mL) | Gibco | 15750-037 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15750037?ICID=search-15750-037 |
| DMEM, low glucose, pyruvate, no glutamine, no phenol red | Sigma Aldrich | D5921 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/d5921?lang=en®ion=BE |
| MCDB-105 | Sigma Aldrich | M6395 | Dilute in Milli Q water, adjust pH to 7 with NaOH and filter before use. Store in the dark. http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/m6395?lang=en®ion=BE |
| Insulin from bovine pancreas | Sigma Aldrich | I1882 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/i1882?lang=en®ion=BE |
| Coverslips, glass, 18 mm Ø | Glaswarenfabrik Karl Hecht | 1001/18 | http://www.hecht-assistent.de/187/?L=1&tx_rmproducts_pi1[g]=937 &tx_rmproducts_pi1[p]=3504 &tx_rmproducts_pi1[v]=20088 &cHash=abd12065683fe74b00eaa 5e562824d06 |
| Poly-L-lysine | Sigma Aldrich | P2636 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p2636?lang=en®ion=BE |
| Collagenase type IA from Clostridium histolyticum | Sigma Aldrich | C2674 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/c2674?lang=en®ion=BE |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Gibco | 14190-094 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/14190094?ICID=search-14190-094 |
| Trypsin from bovine pancreas | Sigma Aldrich | T7409 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t7409?lang=en®ion=BE |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Gibco | 25300-054 | Warm to room temperature before use. https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/25300054?ICID=search-25300-054 |
| Cell strainer, 40 µm mesh, disposable | BD Falcon | 352340 | https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-cell-strainers-4/p-48680 |
| Cell strainer, 100 µm mesh, disposable | BD Falcon | 352360 | https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-cell-strainers-4/p-48680 |
| Millex-GP Syringe Filter Unit, 0.22 µm, polyethersulfone, 33 mm, gamma sterilized | Merck Millipore | SLGP033RS | https://www.merckmillipore.com/BE/en/product/Millex-GP-Syringe-Filter-Unit%2C-0.22%C2%A0%C2%B5m%2C-polyethersulfone%2C-33%C2%A0mm%2C-gamma-sterilized,MM_NF-SLGP033RS?bd=1 |
| Acetic acid (glacial) 100% | Merck Millipore | 1.00063 | https://www.merckmillipore.com/BE/en/product/Acetic-acid-%28glacial%29-100%25,MDA_CHEM-100063 |
| Collagen I | Corning | 354236 | From rat tail. https://catalog2.corning.com/LifeSciences/en-BR/Shopping/ProductDetails.aspx?categoryname=& productid=354236%28 Lifesciences%29# |
| Pancreatin from porcine pancreas | Sigma Aldrich | P3292 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p3292?lang=en®ion=BE |
| 35 mm Tissue Culture Dishes, Polystyrene, Sterile | BD Falcon | 353001 | https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?product_id=4675630 |
| Ethanol absolute AnalaR NORMAPUR ACS, Reag. Ph. Eur. analytical reagent | VWR Chemicals | 20821296 | https://uk.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=20821.310DP |
| monoclonal rabbit anti-human vimentin (D21H3) | Cell Signalling Tech | #5741 | Use 1/500. http://www.cellsignal.com/products/primary-antibodies/vimentin-d21h3-xp-rabbit-mab/5741 |
| monoclonal mouse anti-human pan cytokeratin | Sigma Aldrich | C2562 | Use 1/1,000. http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/c2562?lang=en®ion=BE |
| Paraformaldehyde Solution, 4% in PBS | Affymetrix | 19943 | http://www.affymetrix.com/catalog/130621/USB/Paraformaldehyde+Solution+4+percent+in+PBS#1_1 |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/SIAL/X100?lang=en®ion=BE&gclid= Cj0KEQjwhN-6BRCJsePgxru9iIw BEiQAI8rq 879lESeuIU4N4AEQRLNEXj4f 8z65KkD-q8Xr35sQDRgaAp-k 8P8HAQ |
| Goat serum | Sigma Aldrich | G9023 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/g9023?lang=en®ion=BE |
| Goat anti-rabbit Alexa Fluor 488 | Thermo Scientific | A-11034 | http://www.thermofisher.com/order/genome-database/searchResults?query=488& resultPage=1& resultsPerPage=15& autocomplete=& searchMode=keyword& productTypeSelect=antibody& targetTypeSelect =antibody_secondary& species=ltechall&keyword= 488#filters=genericsort2:\%22Capra%20hircus\%22;;generic6:^\%22Oryctolagus%20cuniculus\%22$;;conjugates:^\%22Alexa%20Fluor®%20488\%22$;; |
| Goat anti-mouse Alexa Fluor 594 | Thermo Scientific | A-11032 | http://www.thermofisher.com/order/genome-database/searchResults?query=594& resultPage=1& resultsPerPage=15& autocomplete=& priorSearchTerms=& searchMode=keyword& productTypeSelect=antibody& targetTypeSelect= antibody_secondary& species=ltechall& keyword=594#filters=genericsort2:\%22Capra%20hircus\%22;;generic6:^\%22Mus%20musculus\%22$;; |
| VECTASHIELD mounting medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | http://vectorlabs.com/vectashield-mounting-medium-with-dapi.html |
| DPBS, with calcium and magnesium | Gibco | 14040174 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/14040133 |
References
- Cummings, A. M., Yochim, J. M. Differentiation of the uterus in preparation for gestation: a model for the action of progesterone. J Theor Biol. 106 (3), 353-374 (1984).
- Jabbour, H. N., Kelly, R. W., Fraser, H. M., Critchley, H. O. Endocrine regulation of menstruation. Endocr Rev. 27 (1), 17-46 (2006).
- Wang, X., Matsumoto, H., Zhao, X., Das, S. K., Paria, B. C. Embryonic signals direct the formation of tight junctional permeability barrier in the decidualizing stroma during embryo implantation. J Cell Sci. 117 (Pt 1), 53-62 (2004).
- Zygmunt, M., Herr, F., Munstedt, K., Lang, U., Liang, O. D. Angiogenesis and vasculogenesis in pregnancy. Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol. 110 Suppl 1, S10-S18 (2003).
- Power, M. L., Schulkin, J. The evolution of the human placenta. , Johns Hopkins University Press. (2012).
- Finn, C. A. The initiation of the decidual cell reaction in the uterus of the aged mouse. J Reprod Fertil. 11 (3), 423-428 (1966).
- Grant, K. S., Wira, C. R. Effect of mouse uterine stromal cells on epithelial cell transepithelial resistance (TER) and TNFalpha and TGFbeta release in culture. Biol Reprod. 69 (3), 1091-1098 (2003).
- De Clercq, K., et al. Functional expression of transient receptor potential channels in human endometrial stromal cells during the luteal phase of the menstrual cycle. Hum Reprod. 30 (6), 1421-1436 (2015).
- Pieper, F. R., et al. Regulation of vimentin expression in cultured epithelial cells. Eur J Biochem. 210 (2), 509-519 (1992).
- Greaves, E., et al. A novel mouse model of endometriosis mimics human phenotype and reveals insights into the inflammatory contribution of shed endometrium. Am J Pathol. 184 (7), 1930-1939 (2014).
- Pierro, E., et al. Stromal-epithelial interactions modulate estrogen responsiveness in normal human endometrium. Biol Reprod. 64 (3), 831-838 (2001).
- Kim, M. R., et al. Progesterone-dependent release of transforming growth factor-beta1 from epithelial cells enhances the endometrial decidualization by turning on the Smad signalling in stromal cells. Mol Hum Reprod. 11 (11), 801-808 (2005).
- Chen, J. C., et al. Coculturing human endometrial epithelial cells and stromal fibroblasts alters cell-specific gene expression and cytokine production. Fertil Steril. 100 (4), 1132-1143 (2013).
- Renaud, J., Martinoli, M. G. Development of an Insert Co-culture System of Two Cellular Types in the Absence of Cell-Cell Contact. J Vis Exp. (113), (2016).
- Arnold, J. T., Kaufman, D. G., Seppala, M., Lessey, B. A. Endometrial stromal cells regulate epithelial cell growth in vitro: a new co-culture model. Hum Reprod. 16 (5), 836-845 (2001).
- Park, D. W., et al. A well-defined in vitro three-dimensional culture of human endometrium and its applicability to endometrial cancer invasion. Cancer Lett. 195 (2), 185-192 (2003).
