Abstract
Decidualisering är en progesteronberoende differentieringsprocessen av endometrial stromaceller och är en förutsättning för framgångsrik embryoimplantation. Även om många ansträngningar har gjorts för att avslöja den underliggande mekanismerna för decidualisering, förblir den exakta signaleringen mellan epitelcellerna som är i kontakt med embryot och de underliggande stromaceller dåligt kända. Därför studerar decidualisering på ett sätt som tar både epiteliala och stromala celler hänsyn skulle kunna förbättra vår kunskap om de molekylära detaljerna i decidualisering. För detta ändamål in vivo-modeller av konstgjord decidualisering är fysiologiskt de mest relevanta; emellertid är begränsad manipulation av intercellulär kommunikation. Närvarande, in vitro-kulturer av endometrial stromaceller som används för att undersöka modulering av decidualisering av flera signalmolekyler. Konventionellt, människa eller mus endometrial stromaceller ärBegagnade. Emellertid är tillgången på mänskliga prover ofta begränsad. Vidare är användningen av murina vävnader åtföljs med variation i metoden enligt odling. Denna studie presenterar en validerad och standardiserad metod för att få ren Endometrial epitelceller (EEG) och Stromacells- (ESC) kulturer på vuxna intakta möss som behandlats med östrogen under tre dagar i följd. Protokollet är optimerad för att förbättra utbytet, livskraft, och renheten hos cellerna och utvidgas ytterligare för att studera decidualisering i en samodling av EEG och ESC. Denna modell kan vara lämpligt att utnyttja vikten av att båda celltyper i decidualisering och utvärdera bidraget av betydande signalmolekyler som utsöndras av EEG eller ESC under kommunikationen mellan.
Introduction
Den mänskliga livmoderslemhinnan är den inre slemhinnan i livmodern och genomgår månatliga cykler av nedbrytning och reparation som en förberedelse för möjliga graviditeter. Den består av ett enda skikt av epitelceller som bekläder livmodern lumen och underliggande stroma som varierar i tjocklek beroende på variationer i äggstockshormoner östrogen och progesteron. Under lutealfas kommer postovulatory progesteron surge inducera differentiering av endometrial stromaceller till större, runda decidualcell, en process som kallas decidualisering 1, 2. I människa, sker detta fenomen spontant för att bilda predecidua, men blir mer uttalad vid embryo implantation. En funktionell konsekvens av decidualisering är att livmodern övergående blir mottaglig för embryo implantation. Detta intervall är märkt som "fönster implantation". Under den tidiga perioden av embryo implantation, den decidualized endometrial stromaceller som omger implantera embryot kommer att tillhandahålla en barriär för att förhindra passage av skadliga ämnen till embryot 3. Under graviditeten, kommer detta decidua ge näring för det växande fostret innan placentation har skett, och kommer senare att bilda moderns del av moderkakan 4.
Etiska och praktiska överväganden begränsar utformningen av studier på människa för att undersöka processen för decidualisering och har föranlett användningen av djurmodeller. Att vara medlem i hemochorial placentation gruppen, kommer livmoderslemhinnan hos gnagare också genomgå decidualisering före placentation 5. Hos gnagare, men inledningen av decidualisering processen beror på närvaron av blastocyster i livmoder lumen, vilket indikerar att en extra stimulans är nödvändig för att utlösa decidual svar 6. Detta innebär ett intrikat kommunikation mellan the endometriala epitelceller som har direkt kontakt med blastocysten, och underliggande stromala celler. Ändå kan decidualisering vara artificiellt med hjälp av stimuli som mekanisk repor eller instillation av oljan i en hormon primas livmoder. Även in vivo-studier med hjälp av konstgjorda decidualisering modeller har tillåtit oss att förbättra våra insikter i den komplexa processen av decidualisering signalering, mekaniska fördjupade studier, t.ex. undersökning av oumbärlig kommunikation mellan epiteliala och stromala celler, är begränsade. Därför kan decidualisering in vitro-studier kan användas för att manipulera viktiga vägar och studera grundläggande processer. För detta ändamål kan primära endometrial stromal cellkulturer sättas upp från människa eller gnagare endometrium. Anställa gnagare samtycker användningen av genetiskt modifierade djur för att undersöka betydelsen av ett specifikt protein av intresse under decidualisering processen. Emellertid omogna, prepuberty-möss används ofta i syfte att undvika komplikationer av Östrogencykeln, medan i andra fall uteri samlas in från alla faser av Östrogencykeln, som resulterar i en heterogenitet i kulturerna. Dessutom har processen för decidualisering studerats i olika protokoll, till exempel, genom att (i) kompletterar hormoner (östrogen, progesteron eller cykliskt adenosinmonofosfat (cAMP)) till odlingsmediet, eller genom (ii) isolering av decidualcell från möss vid dag 4,5 av (pseudo) graviditet, som kräver ytterligare behov av plug kontroll och vasektomiserade hanar. Dessa begränsningar påvisa behovet av en standardiserad metod för att studera in vitro decidualisering. I denna studie, att en fysiologisk modell undersöka in vitro decidualisering början från vuxen, kommer icke (pseudo) dräktiga möss presenteras. I denna metod, kommer daglig injektion av 17β-östradiol (E2) inducera proliferation av endometriala celler, vilket resulterar i ett ökat utbyte av homogen och pure cellpopulationer. Vidare har användningen av en samodling system tillåter studiet av den epiteliala-stromal överhörning och förmågan att manipulera processen för decidualisering i olika nivåer.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ThinCert Tissue culture insert for 24 well plates; 1 µm pore size; transparant | Greiner Bio-one | 662610 | Inserts are also provided for other multiwell plates and/or other pore sizes. Other suppliers: Merck Millipore. https://shop.gbo.com/en/row/articles/catalogue/article/ 0110_0110_0090_0030/13408/ |
| Nunc Cell culture treated 24 well plates | Thermo Scientific | 142475 | http://www.thermofisher.com/order/catalog/product/142475 |
| 8-Bromoadenosine 3′,5′-cyclic monophosphate sodium salt | Sigma Aldrich | B7880 | Prepare a stock solution of 100 mM in Milli Q water. Store aliquots at -20 °C. http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/b7880?lang=en®ion=BE |
| Medroxyprogesterone 17-acetate | Sigma Aldrich | M1629 | Prepare a stock solution of 250 µM in ethanol. Store aliquots at -20 °C. http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/m1629?lang=en®ion=BE |
| Arachis oil | Supermarket | Standard cooking arachis oil that can be found in every supermarket is used | |
| PrestoBlue cell viability reagent | Thermo Scientific | A13261 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/A13261?ICID=cvc-prestoblue-c1t1 |
| HBSS 1x, no calcium, no magnesium, no phenol red | Gibco | 14175-046 | Store in fridge as long as possible. Use cold HBSS+ during the protocol. https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/14175046 |
| 17-β Estradiol | Sigma Aldrich | E8875 | Prepare a stock solution of 1 mg/mL in EtOH before diluting in arachis oil (1:1,000). http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/e8875?lang=en®ion=BE |
| Cell medium filter Stericup, 0.22 µm, polyethersulfone, 500 mL, radio-sterilized | Merck Millipore | SCGPU05RE | http://www.merckmillipore.com/BE/en/product/Stericup-GP%2C-0.22%C2%A0%C2%B5m%2C-polyethersulfone%2C-500%C2%A0mL%2C-radio-sterilized,MM_NF-SCGPU05RE |
| Penicillin-Streptomycin (5,000 U/mL) | Gibco | 15070-063 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15070063?ICID=search-15070-063 |
| DMEM/F12, phenol red, L-glutamine, HEPES | Gibco | 11330-032 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/11330057?ICID=search-11330-057 |
| Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated, E.U.-approved, South America Origin | Gibco | 10500-056 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10500064?ICID=search-10500-064 |
| Amphotericin B | Gibco | 15290-018 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15290018?ICID=search-15290-018 |
| Gentamicin (50 mg/mL) | Gibco | 15750-037 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15750037?ICID=search-15750-037 |
| DMEM, low glucose, pyruvate, no glutamine, no phenol red | Sigma Aldrich | D5921 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/d5921?lang=en®ion=BE |
| MCDB-105 | Sigma Aldrich | M6395 | Dilute in Milli Q water, adjust pH to 7 with NaOH and filter before use. Store in the dark. http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/m6395?lang=en®ion=BE |
| Insulin from bovine pancreas | Sigma Aldrich | I1882 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/i1882?lang=en®ion=BE |
| Coverslips, glass, 18 mm Ø | Glaswarenfabrik Karl Hecht | 1001/18 | http://www.hecht-assistent.de/187/?L=1&tx_rmproducts_pi1[g]=937 &tx_rmproducts_pi1[p]=3504 &tx_rmproducts_pi1[v]=20088 &cHash=abd12065683fe74b00eaa 5e562824d06 |
| Poly-L-lysine | Sigma Aldrich | P2636 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p2636?lang=en®ion=BE |
| Collagenase type IA from Clostridium histolyticum | Sigma Aldrich | C2674 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/c2674?lang=en®ion=BE |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Gibco | 14190-094 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/14190094?ICID=search-14190-094 |
| Trypsin from bovine pancreas | Sigma Aldrich | T7409 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t7409?lang=en®ion=BE |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Gibco | 25300-054 | Warm to room temperature before use. https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/25300054?ICID=search-25300-054 |
| Cell strainer, 40 µm mesh, disposable | BD Falcon | 352340 | https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-cell-strainers-4/p-48680 |
| Cell strainer, 100 µm mesh, disposable | BD Falcon | 352360 | https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-cell-strainers-4/p-48680 |
| Millex-GP Syringe Filter Unit, 0.22 µm, polyethersulfone, 33 mm, gamma sterilized | Merck Millipore | SLGP033RS | https://www.merckmillipore.com/BE/en/product/Millex-GP-Syringe-Filter-Unit%2C-0.22%C2%A0%C2%B5m%2C-polyethersulfone%2C-33%C2%A0mm%2C-gamma-sterilized,MM_NF-SLGP033RS?bd=1 |
| Acetic acid (glacial) 100% | Merck Millipore | 1.00063 | https://www.merckmillipore.com/BE/en/product/Acetic-acid-%28glacial%29-100%25,MDA_CHEM-100063 |
| Collagen I | Corning | 354236 | From rat tail. https://catalog2.corning.com/LifeSciences/en-BR/Shopping/ProductDetails.aspx?categoryname=& productid=354236%28 Lifesciences%29# |
| Pancreatin from porcine pancreas | Sigma Aldrich | P3292 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p3292?lang=en®ion=BE |
| 35 mm Tissue Culture Dishes, Polystyrene, Sterile | BD Falcon | 353001 | https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?product_id=4675630 |
| Ethanol absolute AnalaR NORMAPUR ACS, Reag. Ph. Eur. analytical reagent | VWR Chemicals | 20821296 | https://uk.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=20821.310DP |
| monoclonal rabbit anti-human vimentin (D21H3) | Cell Signalling Tech | #5741 | Use 1/500. http://www.cellsignal.com/products/primary-antibodies/vimentin-d21h3-xp-rabbit-mab/5741 |
| monoclonal mouse anti-human pan cytokeratin | Sigma Aldrich | C2562 | Use 1/1,000. http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/c2562?lang=en®ion=BE |
| Paraformaldehyde Solution, 4% in PBS | Affymetrix | 19943 | http://www.affymetrix.com/catalog/130621/USB/Paraformaldehyde+Solution+4+percent+in+PBS#1_1 |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/SIAL/X100?lang=en®ion=BE&gclid= Cj0KEQjwhN-6BRCJsePgxru9iIw BEiQAI8rq 879lESeuIU4N4AEQRLNEXj4f 8z65KkD-q8Xr35sQDRgaAp-k 8P8HAQ |
| Goat serum | Sigma Aldrich | G9023 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/g9023?lang=en®ion=BE |
| Goat anti-rabbit Alexa Fluor 488 | Thermo Scientific | A-11034 | http://www.thermofisher.com/order/genome-database/searchResults?query=488& resultPage=1& resultsPerPage=15& autocomplete=& searchMode=keyword& productTypeSelect=antibody& targetTypeSelect =antibody_secondary& species=ltechall&keyword= 488#filters=genericsort2:\%22Capra%20hircus\%22;;generic6:^\%22Oryctolagus%20cuniculus\%22$;;conjugates:^\%22Alexa%20Fluor®%20488\%22$;; |
| Goat anti-mouse Alexa Fluor 594 | Thermo Scientific | A-11032 | http://www.thermofisher.com/order/genome-database/searchResults?query=594& resultPage=1& resultsPerPage=15& autocomplete=& priorSearchTerms=& searchMode=keyword& productTypeSelect=antibody& targetTypeSelect= antibody_secondary& species=ltechall& keyword=594#filters=genericsort2:\%22Capra%20hircus\%22;;generic6:^\%22Mus%20musculus\%22$;; |
| VECTASHIELD mounting medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | http://vectorlabs.com/vectashield-mounting-medium-with-dapi.html |
| DPBS, with calcium and magnesium | Gibco | 14040174 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/14040133 |
References
- Cummings, A. M., Yochim, J. M. Differentiation of the uterus in preparation for gestation: a model for the action of progesterone. J Theor Biol. 106 (3), 353-374 (1984).
- Jabbour, H. N., Kelly, R. W., Fraser, H. M., Critchley, H. O. Endocrine regulation of menstruation. Endocr Rev. 27 (1), 17-46 (2006).
- Wang, X., Matsumoto, H., Zhao, X., Das, S. K., Paria, B. C. Embryonic signals direct the formation of tight junctional permeability barrier in the decidualizing stroma during embryo implantation. J Cell Sci. 117 (Pt 1), 53-62 (2004).
- Zygmunt, M., Herr, F., Munstedt, K., Lang, U., Liang, O. D. Angiogenesis and vasculogenesis in pregnancy. Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol. 110 Suppl 1, S10-S18 (2003).
- Power, M. L., Schulkin, J. The evolution of the human placenta. , Johns Hopkins University Press. (2012).
- Finn, C. A. The initiation of the decidual cell reaction in the uterus of the aged mouse. J Reprod Fertil. 11 (3), 423-428 (1966).
- Grant, K. S., Wira, C. R. Effect of mouse uterine stromal cells on epithelial cell transepithelial resistance (TER) and TNFalpha and TGFbeta release in culture. Biol Reprod. 69 (3), 1091-1098 (2003).
- De Clercq, K., et al. Functional expression of transient receptor potential channels in human endometrial stromal cells during the luteal phase of the menstrual cycle. Hum Reprod. 30 (6), 1421-1436 (2015).
- Pieper, F. R., et al. Regulation of vimentin expression in cultured epithelial cells. Eur J Biochem. 210 (2), 509-519 (1992).
- Greaves, E., et al. A novel mouse model of endometriosis mimics human phenotype and reveals insights into the inflammatory contribution of shed endometrium. Am J Pathol. 184 (7), 1930-1939 (2014).
- Pierro, E., et al. Stromal-epithelial interactions modulate estrogen responsiveness in normal human endometrium. Biol Reprod. 64 (3), 831-838 (2001).
- Kim, M. R., et al. Progesterone-dependent release of transforming growth factor-beta1 from epithelial cells enhances the endometrial decidualization by turning on the Smad signalling in stromal cells. Mol Hum Reprod. 11 (11), 801-808 (2005).
- Chen, J. C., et al. Coculturing human endometrial epithelial cells and stromal fibroblasts alters cell-specific gene expression and cytokine production. Fertil Steril. 100 (4), 1132-1143 (2013).
- Renaud, J., Martinoli, M. G. Development of an Insert Co-culture System of Two Cellular Types in the Absence of Cell-Cell Contact. J Vis Exp. (113), (2016).
- Arnold, J. T., Kaufman, D. G., Seppala, M., Lessey, B. A. Endometrial stromal cells regulate epithelial cell growth in vitro: a new co-culture model. Hum Reprod. 16 (5), 836-845 (2001).
- Park, D. W., et al. A well-defined in vitro three-dimensional culture of human endometrium and its applicability to endometrial cancer invasion. Cancer Lett. 195 (2), 185-192 (2003).
