Summary
Denne undersøgelse beskriver metoder til T7-medieret co-ekspression af multiple gener fra et enkelt plasmid i Escherichia coli ved anvendelse af pMGX-plasmidsystemet.
Abstract
Co-ekspression af multiple proteiner er i stigende grad afgørende for syntetisk biologi, undersøgelse af protein-proteinkomplekser og karakterisering og udnyttelse af biosyntetiske veje. I dette manuskript beskrives anvendelsen af et yderst effektivt system til konstruktion af multigen-syntetiske operoner under kontrol af en inducerbar T7-RNA-polymerase. Dette system tillader mange gener at udtrykkes samtidigt fra et plasmid. Her er et sæt af fire beslægtede vektorer, pMGX-A, pMGX-hisA, pMGX-K og pMGX-hisK, med enten ampicillin eller kanamycinresistens selekterbar markør (A og K) og enten besidder eller mangler en N-terminale hexahistidin Tag (hans) er beskrevet. Detaljerede protokoller til konstruktionen af syntetiske operoner under anvendelse af dette vektorsystem tilvejebringes sammen med de tilsvarende data, hvilket viser, at et pMGX-baseret system indeholdende fem gener let kan konstrueres og anvendes til fremstilling af alle fem kodede proteiner i Escherichia coli . Denne systEm og protokol gør det muligt for forskere rutinemæssigt at udtrykke komplekse multikomponentmoduler og veje i E. coli .
Introduction
Samekspression af flere proteiner bliver stadig vigtigere, især i syntetiske biologiske applikationer, hvor flere funktionelle moduler skal udtrykkes 1 ; Ved undersøgelse af protein-proteinkomplekser, hvor udtryk og funktion ofte kræver coexpression 2 , 3 ; Og ved at karakterisere og udnytte biosyntetiske veje, hvor hvert gen i vejen skal udtrykkes 4 , 5 , 6 , 7 , 8 . Et antal systemer er blevet udviklet til co-ekspression, især i værtsorganismen Escherichia coli , arbejdshesten til rekombinant proteinekspression 9 . For eksempel kan multiple plasmider med forskellige selekterbare markører anvendes til at udtrykke individuelle proteiner ved anvendelse af et væld af forskellige ex Pressionsvektorer 10 , 11 . Enkelte plasmidsystemer til multipel proteinekspression har anvendt enten multiple promotorer til at styre ekspressionen af hvert gen 10 , 12 ; Syntetiske operoner, hvor flere gener kodes på et enkelt transkript 2 , 13 ; Eller i nogle tilfælde et enkelt gen kodende for et polypeptid, der i sidste ende behandles proteolytisk, hvilket giver de ønskede proteiner af interesse 14 .
Figur 1: pMGX-arbejdsgang viser konstruktionen af en polykistronisk vektor. PMGX-systemet giver en fleksibel, nem at bruge strategi til konstruktion af syntetiske operoner under kontrol af en inducerbar T7-promotor.E.com/files/ftp_upload/55187/55187fig1large.jpg "target =" _ blank "> Venligst klik her for at se en større version af denne figur.
I dette manuskript beskrives brugen af et yderst effektivt system til konstruktion af multigen-syntetiske operoner under kontrol af en inducerbar T7-RNA-polymerase ( figur 1 ). Dette system tillader mange gener at udtrykkes samtidigt fra et plasmid. Det er baseret på et plasmidsystem, oprindeligt kaldet pKH22, der er blevet anvendt succesfuldt til en række forskellige applikationer 6 , 7 , 8 . Her ekspanderes dette plasmidsæt for at indbefatte fire beslægtede vektorer: pMGX-A, en ekspressionsvektor, der mangler nogen C- eller N-terminale mærker og med ampicillinresistensmarkøren; PMGX-hisA, en ekspressionsvektor, som koder for et N-terminalt hexahistidintag og med ampicillinresistensmarkøren; PMGX-K, en ekspressionsvektor lAkkingerer nogen C- eller N-terminale mærker og med kanamycinresistensmarkøren; Og pMGX-hisK, en ekspressionsvektor, som koder for et N-terminalt hexahistidintag og med kanamycinresistensmarkøren. I dette studie demonstreres fremgangsmåden til generering af en polykistronisk vektor indeholdende fem gener ved anvendelse af pMGX-systemet, specifikt pMGX-A, sammen med den succesrige produktion af hvert enkelt protein i Escherichia coli .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Opnåelse af interesser
- Design syntetiske gener.
- Optimer en gensekvens for E. coli ekspression.
- Fjern eventuelle problematiske restriktionssteder fra sekvensen (AvrII, NdeI, EcoRI og XbaI).
- Indarbejde restriktionssteder for kloning; Et 5'-NdeI site og et 3'-EcoRI site anbefales. Andre steder kan bruges, hvis det er nødvendigt; Henviser til multikloningsområdet for det valgte plasmid ( figur S1- S4 ). Om ønsket, inkludere et 5 'eller 3' kodende mærke til Western blot detektion.
- Kommercielt bestille det konstruerede gen.
- Enten blunt klon genet til en stump vektor ved hjælp af et stump kloning kit, som ifølge producentens instruktioner; Design primere for at amplificere genet (derefter fortsæt til trin 1.2.2); Eller tilsæt yderligere 5'- og 3'-ender til direkte kloning i et pMGX-plasmid og fortsæt til trin 2. Her, thE repræsentative resultater er fra stump kloning af genene af interesse.
- Amplify det ønskede gen (fra et designet og optimeret syntetisk gen eller fra template DNA indeholdende det ønskede gen) 15 .
- Design primere med restriktionssteder til kloning; Et 5'-NdeI site og et 3'-EcoRI site anbefales. Andre steder kan bruges, hvis det er nødvendigt; Henviser til multikloningsområdet for det valgte plasmid ( figur S1- S4 ). Om ønsket, inkludere enten et 5'- eller 3'-kodende mærke til Western blot-detektion.
- PCR amplificerer det ønskede gen 15 .
- Analyser PCR'et ved hjælp af agarosegelelektroforese 16 .
- Hvis der er uspecifik amplifikation, ryd det amplificerede gen op ved hjælp af gelekstraktion. Hvis ikke, brug et enzymoprydningssæt.
- Kvantificer DNA'et ved hjælp af et spektrofotometer ved at kontrollere absorbancenE ved 260 nm; Blankt med elueringsbuffer 17 .
2. Kloning af interessegrupper i et multigenet ekspressionssystem Vector, pMGX 18
- Restriktion fordøjer det opnåede gen af interesse og den ønskede vektor, pMGX, med Ndel og EcoRI.
BEMÆRK: Hvis en stor mængde recirkulæriserede plasmider opnås, tillades NdeI-reaktionen at fortsætte i 1 time før tilsætning af EcoRI.- Brug en 40 μL fordøjelsesreaktion indeholdende 0,5-1,5 μg DNA og 1 μl af hvert enzym med 4 μl af den passende 10x buffer.
- For en NdeI- og EcoRI-fordøjelse skal du bruge EcoRI-buffer og først tilføje NdeI-endonuclease. Fordøjes i 1 time ved 37 ° C. Derefter tilsættes EcoRI endonuclease, og lad fordøjelsen fortsætte i yderligere en time. NdeI er følsom over for spaltninger tæt på DNA-enden, så indledende fordøjelse ved EcoRI kan forhindre effektiv fordøjelse af NdeI.
- elektrOphorese restriktionsfordøjelsen på agarosegel (for et 1 kb-gen anvender en 0,7% agarosegel ved 110 V i 55 minutter; for at udvælge procenten af agarosegel til forskellige genstørrelser henvises til reference 16 .
- Punktafgift og vektorbånd ved hjælp af et rent skalpels- eller barberblad og sæt det udskårne gelegment i et 1,5 ml rør.
- Ekstraher DNA fra agarosegelen ved hjælp af et gelekstraktionskit ifølge producentens protokol.
- Ligér genet af interesse i pMGX-vektoren under anvendelse af et 3: 1-insert-til-vektor-forhold; Oprette en negativ ligering af fordøjet pMGX uden indsatsen.
- Opsæt en 20 μl ligeringsreaktion indeholdende 1 μl T4 DNA ligase, 0,15-0,5 μg vektor DNA (~ 5 μl) og en passende mængde insert baseret på et 3: 1 insert-til-vektor-forhold og størrelsen af Genet er indsat PMGX backbones er mellem 5,312 og 5,504 bp i størrelse. Inkluder en negativ kontrolreaktion, der indeholder alt buT genet er indsat. Sørg for, at mængden af vektor-DNA er ækvivalent i den negative kontrolligation og vektor plus insert-ligeringsreaktionerne.
- Transformere ligeringsreaktioner til XL1-Blå kemisk kompetente E. coli- celler og ligerede plasmider pMGX- yfg1 (indeholdende gen af interesse 1), pMGX- yfg2 (indeholdende gen af interesse 2) ... pMGX- yfgn (indeholdende gen af interesse n). Brug aseptisk teknik (inde i et biosikkerhedsskabe eller under en flamme).
- Optø 100 μl alikvoter af kemisk kompetent XL1-Blå E. coli på is i 5 minutter og tilsæt derefter 5 μl af ligeringsreaktionerne. Inkubér i 30 minutter på is.
- Varm chok cellerne i 45 s i et vandbad holdt ved 42 ° C og derefter tilsæt 200 μL kold LB. Inkubér dem på is i 2 minutter.
- Ryst cellerne ved 37 ° C, 220 omdr./min. I 1 time og spred pladen 100 μl på en LB-agarplade indeholdende en passendePriat selekterbar markør (enten ampicillin eller kanamycin).
- Screen klonerne for positive transformanter.
- Sammenlign kolonitællingerne på de negative kontrol- og ligeringsplader. Et koloniantalforhold større end 1: 2 er ønsket. Hvis der er et stort antal kolonier på den negative kontrolplade, skal du gå tilbage til trin 2.1 og gennemse noten.
- Vælg 4-8 individuelle kolonier (afhængig af negativ kontrol: ligeringsforhold) fra hver ligeringsreaktion af de forskellige gener indsat til screening (1 n) og inokulere et 4 ml LB og den passende antibiotikum over natten kultur / individuel koloni. Voks kulturer natten over med omrystning ved 37 ° C og 220 omdr./min.
- Isolér plasmid-DNA ved anvendelse af et plasmid-DNA-isolationssæt ifølge producentens protokol.
- Opsæt en 20 μL NdeI + EcoRI-fordøjelsesreaktion indeholdende 150-500 ng DNA og 1 μl af hvert enzym med 2 μl af den passende 10x buffer. I thEr tilfældet, tilføj NdeI og EcoRI samtidig med at genet af interesse vil være mellem restriktionsstederne. En negativ kontrol med den tomme pMGX-vektor anbefales. Fordøj i 2 timer ved 37 ° C i et vandbad.
3. Sætning af gen 2 i pMGX-vektorindholdende gen 1, pMGX- yfg1
- Restriktion fordøjes pMGX- yfg1 med AvrII og behandles med kalveintestinal phosphatase (CIP).
- Brug en 40 μl fordøjelsesreaktion indeholdende 0,5-1,5 μg vektor DNA (~ 5-10 μl isoleret DNA) og 1 μl AvrII med 4 μl af den passende 10x buffer. Fordøjes i 1,5 timer ved 37 ° C og tilsæt derefter 1,5 μl CIP. Lad det være ved 37 ° C i yderligere 30 minutter.
- Begrænsning fordøjes pMGX- yfg2 med AvrII og XbaI for at befri genet af interesse.
- Brug en 40 μl fordøjelsesreaktion indeholdende 0,5-1,5 μg DNA og 1 μL af hvert enzym med 4 μl af den passende 10x buffer. Fordøjes i 2 timer ved 37 ° C.
- Elektroforese restriktioner fordøjes på en passende procent (0,7%) agarosegel og punkter indsatsen og vektorbåndene ved hjælp af et rent skalpels / barberblad (se trin 2.2-2.3).
- Ekstraher DNA'et ved anvendelse af et gelekstraktionskit ifølge producentens protokol og kvantificer DNA 17 .
- Ligér gen 2 i pMGX- yfg1 ved anvendelse af et 3: 1 insert-til-vektor-forhold. Opsæt en negativ ligering af fordøjet pMGX- yfg1 uden yderligere indsatsen. Opsæt som ovenfor i Trin 2.5.
- Transformér 5 μl ligeringsreaktionerne til XL1-Blue kemisk kompetente E. coli- celler, ligerede plasmider pMGX- yfg1,2 (indeholdende gen af interesse 1 og 2) og negativ pMGX- yfg1- kontrol, som det ses i Trin 2.6.
- Sammenlign kolonitællingen på de negative kontrol- og ligeringsplader. Et koloniantalforhold gReater end 1: 2 er ønsket. Hvis der er et stort antal kolonier på den negative kontrolplade, skal du gå tilbage til trin 3.1 og gennemgå CIP-behandlingen.
- Vælg 4-8 individuelle kolonier (afhængig af negativ kontrol: ligeringsforhold) fra ligeringsreaktionen og inokuler 4 ml LB plus det passende antibiotikum pr. Individuelle koloni og dyrk natten over ved 37 ° C og 220 omdrejninger pr. Minut.
- Isoler plasmid-DNA ved anvendelse af et plasmid-DNA-isolationskit ifølge producentens protokol og kvantificer DNA'et 17 .
- Skær den effektive indsættelse af det andet gen ved at udføre en restriktionsfordøjelse af pMGX- yfg1,2 med EcoRI.
- Brug en 20 μl fordøjelsesreaktion indeholdende 150-500 ng DNA og 1 μl EcoRI enzym med 2 μl EcoRI 10x buffer. Fordøjes i 2 timer ved 37 ° C.
- Elektroforese restriktionsfordøjelsen på en passende procent agarosegel; Se efter et band der svarer tilS til størrelsen af gen 2 (se trin 2.2). Et gen kan indsætte i vektoren i den uønskede, omvendte orientering.
4. Tilsætning af et tredje gen i pMGX-vektorindholdende gener 1 og 2, pMGX- yfg1,2
- Restriktion fordøjes pMGX- yfg1,2 med AvrII og behandles med CIP, som det ses i trin 3.1.
- Begrænsning fordøjes pMGX- yfg3 med AvrII og XbaI, som set i Trin 3.2.
- Elektroforese restriktionsfordøjelserne på en passende procent agarosegel og punktafgiftsindsats og vektorbånd ved anvendelse af et rent skalpel / barberblad; Se trin 2.2-2.3.
- Ekstraher DNA'et fra agarosegelen ved hjælp af et gelekstraktionskit og kvantificer DNA'et 17 .
- Ligér gen 3 i pMGX- yfg1,2 ved anvendelse af et 3: 1 insert-til-vektor-forhold og oprettet en negativ ligering af fordøjet pMGX- yfg1,2 uden en yderligere indsats som set i trin 3.5.
- Transform 5 μL ligeringsreaktionerne ind i XL1-Blå kemisk kompetente E. coli- celler, ligeret plasmid pMGX- yfg1,2,3 (indeholdende gener af interesse 1, 2 og 3) og negativ pMGX- yfg1,2 kontrol, som det ses i Trin 2.6.
- Sammenlign kolonitællingen på de negative kontrol- og ligeringsplader. Hvis der er et stort antal kolonier på den negative kontrolplade, skal du gå tilbage til trin 4.1 og gennemgå CIP-behandlingen.
- Vælg 4-8 individuelle kolonier (afhængig af negativ kontrol: ligeringsforhold) fra ligeringsreaktionen og inokuler 4 ml LB plus det passende antibiotikum pr. Individuelle koloni; Vokse natten over ved 37 ° C og 220 omdr./min.
- Isoler plasmid-DNA'et under anvendelse af et plasmid-DNA-isolationskit ifølge producentens protokol.
- Skær den effektive indsættelse af det tredje gen ved at udføre en restriktionsfordøjelse af pMGX- yfg1,2,3 med EcoRI som set i trin 3.10.
- Elektroforese restriktionsfordøjelsen på en passende procent agarosegel; seFor bånd, der svarer til størrelserne af gen 2 og gen 3 (se trin 2.2). Bemærk: gen 3 kan indsætte i vektoren i den uønskede, omvendte orientering. Hvis gener 2 og 3 er af samme størrelse, skal der vælges et andet passende restriktionsfordøjelsessted for screening.
BEMÆRK: Gentag efter behov for hvert nyt gen.
5. Produktion af interessante proteiner ved anvendelse af et multigenet ekspressionssystem og vurdering af produktion ved Western Blotting
- Transformér den positive klon indeholdende alle gener af interesse i kemisk kompetent proteinproduktion E. coli , såsom BL21- (λDE3).
- Optø 100 μl alikvoter af kemisk kompetent BL21- (XDE3) E. coli på is i 5 minutter og tilsæt derefter 1 μL af det positive klonede plasmid DNA; Inkuber i 30 minutter på is.
- Varme choker cellerne i 45 s i et vandbad holdt ved 42 ° C og derefter tilsæt 200 μL kold LB. Inkubér på is i 2 min.
- Ryst cellerne ved 37 ° C og 220 rpm i 1 time og spred pladen 100 μL på en LB-agarplade indeholdende den passende selekterbare markør (enten ampicillin eller kanamycin).
- Udtrykket proteinet ved isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranosid (IPTG) induktion.
- Vælg en isoleret koloni fra transformationspladen B21- (λDE3) og inokuler 4 ml LB plus det passende antibiotikum; Vokse natten over, rystes ved 37 ° C og 220 omdr./min.
- Inokulere en 100 ml LB plus den passende antibiotiske kultur ved anvendelse af 1 ml overnight kultur.
- Voks ved 37 ° C under omrystning ved 220 omdr./min. Til en OD 600 på 0,6.
- Inducer kulturen med 100 μM IPTG og dyrk i 15 timer ved 25 ° C og 220 omdr./min.
- Fjern 1 ml af kulturen og centrifuger den ved 13.000 xg i 1 min; Kassere supernatanten.
- Lyse cellerne ved hjælp af lysisopløsning i henhold til producentens anvisningerOg præforme en Western blot af det opløselige cellelysat for at bestemme, om alle proteiner blev produceret med succes 19 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I dette forsøg var målet at co-udtrykke fem proteiner fra et enkelt plasmid. De fem-kodonoptimerede syntetiske genfragmenter, der koder for enten N- eller C-terminale hexahistidinmærker, blev købt kommercielt. De syntetiske gener blev amplificeret ved PCR og individuelt klonet i en PCR-stump vektor og sekventeret. For at generere det polykistroniske plasmid klonedes de fem interesserede gener først i et egnet pMGX plasmid, pMGX-A. Figur 2 viser PCRBlunt- yfg1 og PCRBlunt- yfg2 ud over pMGX-A fordøjet med Ndel + EcoRI (se trin 2). For at klone de to første gener til pMGX-A blev plasmidet fordøjet med NdeI + EcoRI ( Figur 2 ). Efter kloning af genene af interesse i pMGX-A blev de nyoprettede plasmider, betegnet pMGX- yfg1 og pMGX- yfg2 , fordøjet med AvrII + XbaI for at bekræfte, at succesfulde kloner blev opnået somVist i 1,1 kb og 1,3 kb bånd opnået i figur 3 .
Figur 2: Kloning af pMGX-plasmider. De forventede resultater af PCR-blunt plasmider indeholdende yfg1 og yfg2 efter fordøjelse med NdeI + EcoRI er vist på en 0,7% agarosegel (110 V, 55 min). Bane 1, 1 kb DNA-stige; Bane 2, PCRBlunt- yfg1 ; Bane 3, PCRBlunt- yfg2 ; Bane 4, pMGX-A kontrol. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Screening af pMGX- yfg1 og pMGX- yfg2. 0,7% agarosegelen (110 V, 55 min) viser De to bånd, der genereres af både pMGX- yfg1 og pMGX- yfg2 efter fordøjelsen med AvrII + XbaI. Lane 1, 1-kb DNA-stige; Bane 2, pMGX- yfg1 ; Bane 3, pMGX- yfg2 ; Bane 4, pMGX-A kontrol. Klik her for at se en større version af denne figur.
Med begge gener i den passende pMGX-vektor blev det polykistroniske plasmid konstrueret. For at generere plasmidet pMGX- yfg1,2 blev pMGX- yfg1 fordøjet med AvrII, som vist i figur 4 . PMGX- yfg2 blev fordøjet med AvrII + XbaI, og 1,3-kb-genet indeholdende fragmentet blev ligeret i AvrII-stedet af lineariseret pMGX- yfg1 , der genererede pMGX- yfg1,2 . Fordøjelse af pMGX- yfg1,2 med EcoRI bekræftede den vellykkede kloning af det ønskede plasmid og er vist i> Figur 5.
Figur 4: Frembringelse af det bicistroniske plasmid pMGX- yfg1,2. Resultaterne af 0,7% agarosegelelektroforese (110 V, 55 min) pMGX- yfg1 fordøjet med AvrII og pMGX- yfg2 fordøjet med AvrII + XbaI. Lane 1, 1-kb DNA-stige; Bane 2, pMGX- yfg1 fordøjet med AvrII; Bane 3, pMGX- yfg2 fordøjet med AvrII + XbaI; Bane 4, pMGX-A kontrol. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Screening af pMGX- yfg1,2 kloner . Den resulterende 0,7% agarosegel (110 V, 55 min) pMGX-yfG1,2 kloner fordøjet med EcoRI er vist. Succesfulde kloner genererer to bånd, en for det indsatte gen yfg2 og den anden svarende til backbone + yfg1 ( pMGX-yfg1 ). Bane 1, 1 kb DNA-stige; Bane 2, pMGX- yfg1,2 fordøjet med EcoRI, klon 1; Bane 3, pMGX- yfg1,2 fordøjet med EcoRI, klon 2; Bane 4, pMGX-A kontrol. Klik her for at se en større version af denne figur.
Når der dannes et polykistronisk plasmid indeholdende to eller flere gener, kan man støde på en uønsket reverseret insertion af genet klonet i AvrII-stedet. Figur 6 er en gel, der fremhæver forskellen mellem resultaterne af et fordøjet plasmid med et gen indsat i den korrekte orientering i modsætning til et gen, der indsættes i den omvendte orientering. Hvis genet erLigeret og klonet i den uønskede orientering, vil EcoRI-stedet ved enden af genet blive indsat lige ved siden af EcoRI-stedet i det foregående gen. Dette ville give en fragmentstørrelse, som er næsten uopdagelig ved DNA-gelelektroforese (mindre end 50 bp). Derudover vil det sidst indsatte gen forekomme i rygraden, som let kan identificeres på grund af, at rygradstørrelsen er større end forventet. Forskellen i rygradenes størrelse fra den forventede størrelse angiver størrelsen af det sidst indsatte gen.
Figur 6: Screening af pMGX- yfg1-5 kloner . En 1,3% agarosegel (110 V, 65 min), der viser resultaterne af pMGX- yfg1-5 fordøjet med EcoRI, er vist. Succesfulde kloner (bane 2) vil danne et bånd svarende til det sidst indsatte gen ( yfg5 i dette tilfælde, 1,1 kb). LanE 1, 1-kb DNA stige; Bane 2, positiv klon af pMGX- yfg1-5, fordøjet med EcoRI; Bane 3, negativ klon af pMGX- yfg1-5, fordøjet med EcoRI; Bane 4, pMGX- yfg1-4 kontrol. Klik her for at se en større version af denne figur.
For at fuldføre den fem-gen polykistroniske ekspressionsvektor klones de resterende tre gener efter hinanden i pMGX- yfg1,2 for at danne pMGX- yfg1-5 (se trin 5). Dette plasmid blev derefter transformeret til BL21- (XDE3), og ekspression af proteinerne blev induceret i en mid-log-fase kultur ved tilsætning af IPTG. Figur 7 er et Western blot af cellelysater, der bekræfter at alle fem proteiner fra et enkelt plasmid indeholdende multiple gener i en enkelt operon kan udtrykkes. Udtrykket af pMGX- yfg1 (indeholdende 1 gen),PMGX- yfg1,2 (indeholdende 2 gener) og pMGX- yfg1-5 (indeholdende 5 gener) er vist.
Figur 7: Western blot-analyse af multi-genekspression ved anvendelse af pMGX-systemet. Inkorporering af enten N- eller C-terminale hexahistidinmærker muliggjorde Western blot-detektion af proteinekspression. Prøver blev adskilt på forstøbte 4-20% gradientfri fri acrylamidgeler (200 V, 35 min, 10 cm x 8,5 cm) og derefter en overførsel (40 V, 90 min) på en nitrocellulosemembran (0,45 um, 10 cm x 7 cm) blev udført. HRP-konjugeret anti-His monoklonalt antistof, som ikke kræver et sekundært antistof, blev anvendt. Blokerings-, overførings- og antistofffortyndingsbuffere blev fremstillet som anbefalet af antistofproducenten. Detektion blev udført med Western Chemiluminescent HRP-substrat efter producentens instructions. Den resulterende membran blev visualiseret under anvendelse af en billeddannelse uden et filter. Bane 1, dobbelt farve standard overført til membranen (ikke kemiluminescerende); Bane 2, His6pMGX- yfg1 ; Bane 3, His6pMGX- yfg1,2 ; Bane 4, His6pMGX- yfg1-5. Bemærk: Protein produceret af yfg5 er den samme størrelse som proteinet produceret af yfg1 (begge er 36 kDa) og kan ikke separeres på gelen. Klik her for at se en større version af denne figur.
Supplerende figurer: Klik her for at downloade denne fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Co-ekspression af flere gener er i stigende grad afgørende, især ved karakterisering og rekonstituering af komplekse, multigen metabolske veje 3 , 4 , 5 . PMGX-systemet gør multigen co-ekspression i E. coli rutine 6 , 7 , 8 og tilgængelig for forskellige forskere. I denne undersøgelse viste fem proteiner af interesse, at de blev produceret samtidigt fra et enkelt plasmidsystem ved anvendelse af pMGX-A. Mange samtidige ekspressionssystemer tillader kun indføring af to gener, der genererer bicistroniske plasmider, såsom pET Duet-vektorer 12 . Hvis man kræver tilsætning af flere gener, kræves flere bicistroniske vektorer med forskellige selekterbare markører. I modsætning til andre multigen-ekspressionssystemer muliggør pMGX-systemet den klare kloningAf flere gener i et plasmid med evnen til at genbruge restriktionssteder uden behovet for forskellige donorplasmider eller til fjernelse af multiple restriktionsenzymsteder fra generne 13 , 14 . Kritiske trin i denne protokol indbefatter gendesign, forebyggelse af baggrundsrecirkularisering af enkeltfordøjede pMGX-vektorer og skærme af de polykistroniske vektorer for korrekt orientering af det indsatte gen.
Ved planlægningen af kloningsstrategien for at konstruere et polykistronisk system er det vigtigt at sikre, at de interesserede gener ikke indeholder restriktionssteder, der kræves til nedstrøms kloning. Disse omfatter især XbaI og AvrII, som er nødvendige for indsættelsen af det andet og efterfølgende gener i pMGX-vektoren indeholdende det første gen af interesse (trin 3 og 4). Derudover er det vigtigt at eliminere restriktionssteder, som vil blive brugt til den oprindelige kloning af gInteresser i pMGX (trin 2). Typisk indbefatter disse NdeI eller NheI ved 5'-enden af genet og BamHI eller EcoRI ved 3'-enden af genet, skønt andre restriktionssteder også kan anvendes til dette trin, om nødvendigt. Eliminering af ekstra uønskede restriktionssteder kan let udføres ved gensyntesetrinnet eller i tilfælde af gener klonet fra andre kilder ved synonyme nukleotidsubstitutioner via stedrettet mutagenese 20 .
Tilsætningen af efterfølgende gener af interesse for pMGX indeholdende det første gen af interesse kræver linearisering af pMGX- yfg1 med AvrII (trin 3.1, bemærk at det også kan lineariseres med XbaI). Denne lineariserede vektor vil hurtigt religere under indsættelsen af det andet gen af interesse (trin 3.5), hvilket fører til et ekstremt højt antal baggrundskloner. For at undgå dette er det vigtigt at behandle den lineariserede vektor med en phosphatase for at dephosphorylere 52; Enderne af den lineariserede vektor. Typisk anvendes CIP, selvom andre er tilgængelige. Optimalisering af både enhederne af phosphatase og inkubationstiden kan være nødvendig for at optimere ligationerne af efterfølgende gener af interesse i den lineariserede vektor.
Til sidst udskæres genet af interesse ved spaltning med XbaI og AvrII, når der dannes komplementære kohæsive ender ved 5'- og 3'-enderne af genet (trin 3.2 og 4.2) ved dannelse af et polykistronisk system. Denne indsats kan ligeres i den lineariserede vektor i fremadrettet eller baglæns retning. Da alle de sammenhængende ender er identiske, håndhæves ingen retningsstyrke gennem komplementær glødning af de sammenhængende ender. Det er således nødvendigt at screene de resulterende kloner for den korrekte indsættelsesretning af genet af interesse. Dette kan let gøres ved at screene kloner med et af restriktionsstederne, der anvendes til at klone det oprindelige gen af interesse for pMGX (trin 2). typisk,EcoRI anvendes, da restriktionsstedet er ved 3'-enden af genet, og det er således hensigtsmæssigt at screene for retningsretning, som vist i figur 6 . I de fleste tilfælde har 50% af klonerne indeholdende genet af interesse genet i den korrekte orientering, og 50% har genet i modsat orientering.
Sjældent (~ 10% af ligationer) kan alle klonerne fra en bestemt ligation have genet af interesse indsat i kun én retning. Dette resultat synes at være sekvensafhængigt, da det er meget reproducerbart i disse specifikke tilfælde. Hvis dette sker, og genet af interesse kontinuerligt indsættes i omvendt orientering, kan den ønskede vektor sædvanligvis nås ved at skifte retning af kloning. For eksempel kan i stedet for kloning af yfg2 i AvrII-stedet af pMGX- yfg1 klones yfg1 i Xbal-stedet af pMGX- yfg2 . Bemærk at dette giver den samme endelige vektorsystem. Denne ekstra fleksibilitet, der gør det muligt at få adgang til det samme system fra forskellige kloningsstrategier, er meget fordelagtigt.
En vigtig begrænsning af denne metode er, at proteinerne kodet ved 3'-enden af det polykistroniske transkript typisk udtrykkes ved lavere niveauer end proteinerne kodet ved 5'-enden af transkriptet, og denne virkning er mere udtalt, desto længere er transkriptionen . Dette betyder, at ændring af rækkefølgen af genene af interesse i den syntetiske operon kan påvirke de relative ekspressionsniveauer af proteinerne, som de koder, hvilket giver en mekanisme til finjustering af relative ekspressionsniveauer.
Sammenfattende tilvejebringer pMGX-systemet en pålidelig metode til co-ekspression af multiple proteiner fra et enkelt plasmid i E. coli , som kan anvendes til en række anvendelser af syntetisk biologi og til karakterisering af biokemiske pathways.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af Canadas naturvidenskabelige og tekniske forskningsråd.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Enzymes | |||
| Alkaline Phosphatase, Calf Intestinal (CIP) | New England Biolabs | M0290S | |
| AvrII | New England Biolabs | R0174S | |
| EcoRI | New England Biolabs | R0101S | |
| NdeI | New England Biolabs | R0111S | |
| XbaI | New England Biolabs | R0145S | |
| Herculase II Fusion DNA Polymerase | Agilent Technologies | 600677 | |
| T4 DNA Ligase | New England Biolabs | M0202S | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| 1 kb DNA ladder | New England Biolabs | N3232L | |
| 4-20% Mini-PROTEAN TGX Stain-Free Protein Gels | Bio-Rad | 456-8095 | |
| 50x TAE | Fisher Thermo Scientific | BP1332-4 | |
| Agar | Fisher Thermo Scientific | BP1423-500 | |
| Agarose | Fisher Thermo Scientific | BP160-500 | |
| Ampicilin | Sigma-Alrich | A9518-5G | |
| BL21 (DE3) chemically comeptent cells | Comeptent cell prepared in house | ||
| B-PER Bacterial Protein Extraction Reagent | Fisher Thermo Scientific | PI78243 | |
| dNTP mix | Agilent Technologies | Supplied with polymerase | |
| Gel Extraction Kit | Omega | D2500-02 | E.Z.N.A Gel Extraction, supplied by VWR Cat 3: CA101318-972 |
| Glycine | Fisher Thermo Scientific | BP381-1 | |
| His Tag Antibody [HRP], mAb, Mouse | GenScript | A00612 | |
| Immobilon Western Chemiluminescent HRP Substrate | EMD Millipore | WBKLS0100 | |
| IPTG | Sigma-Alrich | 15502-10G | |
| LB | Fisher Thermo Scientific | BP1426-500 | |
| Methanol | Fisher Thermo Scientific | A411-20 | |
| Pasteurized instant skim milk powder | Local grocery store | No-name grocery store milk is adequate | |
| Nitrocellulose membrane | Amersham Protran (GE Healthcare Life Sciences) | 10600007 | Membrane PT 0.45 µm 200 mm x 4 m, supplied by VWR Cat #: CA10061-086 |
| Plasmid DNA Isolation Kit | Omega | D6943-02 | E.Z.N.A Plasmid DNA MiniKit I, supplied by VWR Cat #: CA101318-898 |
| pMGX | Boddy Lab | Request from the Boddy Lab Contact cboddy@uottawa.ca | |
| Primers | Intergrated DNA Technologies | Design primers as needed for desired gene | |
| Synthetic Gene | Life Technologies | Design and optimize as needed | |
| Thick Blot Filter Paper | Bio-Rad | 1703932 | |
| Tris base | BioShop | TRS001.1 | |
| Tween-20 | Sigma-Alrich | P9416-50ML | |
| XL1-Blue chemically competent cells | Comeptent cell prepared in house | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| BioSpectrometer | Eppendorf | RK-83600-07 | |
| Gel box - PAGE | Bio-Rad | 1658005 | Mini-PROTEIN Tetra Vertical Electrophoresis Cell |
| Gel Imager | Alpha Innotech | AlphaImager EC | |
| Incubator-oven | Fisher Thermo Scientific | 11-690-650D | Isotemp |
| Incubator-shaker | Fisher Thermo Scientific | SHKE6000-7 | MaxQ 6000 |
| Personna Razors | Fisher Thermo Scientific | S04615 | |
| Power Pack | Bio-Rad | S65533Q | FB300 |
| Transilluminator | VWR International | M-10E,6W | |
| Thermocylcer | Eppendorf | Z316091 | Mastercycler Personal, supplied by Sigma |
| UV Face-Shield | 18-999-4542 | ||
| Waterbath | Fisher Thermo Scientific | 15-460-2SQ | |
| Western Transfer Apparatus | Bio-Rad | 1703935 | Mini-Trans Blot Cell |
References
- Purnick, P. E. M., Weiss, R. The second wave of synthetic biology: from modules to systems. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10 (6), 410-422 (2009).
- Bieniossek, C., et al. Automated unrestricted multigene recombineering for multiprotein complex production. Nat. Methods. 6 (6), 447-450 (2009).
- Jochimsen, B., et al. Five phosphonate operon gene products as components of a multi-subunit complex of the carbon-phosphorus lyase pathway. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 108 (28), 11393-11398 (2011).
- Martin, V. J. J., Pitera, D. J., Withers, S. T., Newman, J. D., Keasling, J. D. Engineering a mevalonate pathway in Escherichia coli for production of terpenoids. Nat. Biotechnol. 21 (7), 796-802 (2003).
- Ajikumar, P. K., et al. Isoprenoid pathway optimization for Taxol precursor overproduction in Escherichia coli. Science. 330 (6000), 70-74 (2010).
- Boddy, C. N., Hotta, K., Tse, M. L., Watts, R. E., Khosla, C. Precursor-directed biosynthesis of epothilone in Escherichia coli. J. Am. Chem. Soc. 126 (24), 7436-7437 (2004).
- Lundgren, B. R., Boddy, C. N. Sialic acid and N-acyl sialic acid analog production by fermentation of metabolically and genetically engineered Escherichia coli. Org. Biomol. Chem. 5 (12), 1903-1909 (2007).
- Horsman, M. E., Lundgren, B. R., Boddy, C. N. N-Acetylneuraminic Acid Production in Escherichia coli Lacking N-Acetylglucosamine Catabolic Machinery. Chem. Eng. Commun. 203 (10), 1326-1335 (2016).
- Romier, C., et al. Co-expression of protein complexes in prokaryotic and eukaryotic hosts: experimental procedures, database tracking and case studies. Acta Crystallogr. D, Biol. Crystallogr. 62 (Pt 10), 1232-1242 (2006).
- Tolia, N. H., Joshua-Tor, L. Strategies for protein coexpression in Escherichia coli. Nat. Methods. 3 (1), 55-64 (2006).
- Chanda, P. K., Edris, W. A., Kennedy, J. D. A set of ligation-independent expression vectors for co-expression of proteins in Escherichia coli. Protein Expr. Purif. 47 (1), 217-224 (2006).
- Kim, K. -J., et al. Two-promoter vector is highly efficient for overproduction of protein complexes. Protein Sci. 13 (6), 1698-1703 (2004).
- Tan, S., Kern, R. C., Selleck, W. The pST44 polycistronic expression system for producing protein complexes in Escherichia coli. Protein Expr. Purif. 40 (2), 385-395 (2005).
- Chen, X., Pham, E., Truong, K. TEV protease-facilitated stoichiometric delivery of multiple genes using a single expression vector. Protein Sci. 19 (12), 2379-2388 (2010).
- Lorenz, T. C. Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. J. Vis. Exp. (63), e3998 (2012).
- Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. -Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. J. Vis. Exp. (62), (2012).
- Sukumaran, S. Concentration determination of nucleic acids and proteins using the micro-volume BioSpec-nano-spectrophotometer. J. Vis. Exp. (48), (2011).
- JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Molecular Cloning. J. Vis. Exp. , Available from: https://www.jove.com/science-education/5074/molecular-cloning (2016).
- JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. The Western Blot. J. Vis. Exp. , Available from: https://www.jove.com/science-education/5065/the-western-blot (2016).
- Laible, M., Boonrod, K. Homemade site directed mutagenesis of whole plasmids. J. Vis. Exp. (27), (2009).
