Summary
Deze studie beschrijft methoden voor de T7-gemedieerde co-expressie van meerdere genen uit een enkel plasmide in Escherichia coli met behulp van het pMGX plasmide systeem.
Abstract
Co-expressie van meerdere eiwitten is steeds meer essentieel voor synthetische biologie, het bestuderen van proteïne-eiwit complexen en het karakteriseren en toepassen van biosynthetische pathways. In dit manuscript wordt het gebruik van een zeer effectief systeem voor de constructie van multigene synthetische operonen onder de controle van een induceerbaar T7-RNA-polymerase beschreven. Met dit systeem kunnen veel genen tegelijkertijd uit één plasmide worden uitgedrukt. Hierin is een reeks van vier gerelateerde vectoren, pMGX-A, pMGX-hisA, pMGX-K en pMGX-hisK, met ofwel de ampicilline of kanamycine resistentie selecteerbare merker (A en K) en ofwel een N-terminale hexahistidine Tag (zijn) worden bekendgemaakt. Gedetailleerde protocollen voor de constructie van synthetische operonen die dit vectorsysteem gebruiken, worden samen met de bijbehorende gegevens verschaft, waaruit blijkt dat een pMGX-gebaseerd systeem dat vijf genen bevat, gemakkelijk kan worden geconstrueerd en gebruikt om alle vijf gecodeerde eiwitten in Escherichia coli te produceren. Deze systEm en protocol kunnen onderzoekers routinematig complexe multifunctionele modules en pathways uitdrukken in E. coli .
Introduction
Co-expressie van meerdere eiwitten is steeds belangrijker, met name bij toepassingen in synthetische biologie, waar meerdere functionele modules uitgedrukt moeten worden 1 ; Bij het bestuderen van eiwit-eiwit complexen, waarbij expressie en functie vaak co-expressie 2 , 3 vereisen; En bij het karakteriseren en gebruik maken van biosynthetische trajecten, waarbij elk gen in het traject 4 , 5 , 6 , 7 , 8 moet worden uitgedrukt. Er zijn een aantal systemen ontwikkeld voor co-expressie, in het bijzonder in het gastheerorganisme Escherichia coli , het werkpaard voor recombinant eiwituitdrukking 9 van het laboratorium. Bijvoorbeeld, meerdere plasmiden met verschillende selecteerbare markers kunnen worden gebruikt om individuele eiwitten uit te drukken met behulp van een rijkdom van verschillende ex Drukvectoren 10 , 11 . Enkele plasmidesystemen voor meerdere eiwituitdrukking hebben ofwel meerdere promotors gebruikt om de expressie van elk gen 10 , 12 te regelen; Synthetische operonen, waarbij meerdere genen gecodeerd zijn op een enkel transcript 2 , 13 ; Of in sommige gevallen een enkel gen dat codeert voor een polypeptide dat uiteindelijk proteolytisch wordt verwerkt, waardoor de gewenste eiwitten van belang 14 worden verkregen .
Figuur 1: pMGX workflow met de constructie van een polycistrische vector. Het pMGX systeem biedt een flexibele, makkelijk te gebruiken strategie voor de constructie van synthetische operonen onder controle van een induceerbare T7 promotor.E.com/files/ftp_upload/55187/55187fig1large.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een grotere versie van deze figuur te zien.
In dit manuscript wordt het gebruik van een zeer effectief systeem voor de constructie van multigeen synthetische operonen onder de controle van een induceerbaar T7 RNA polymerase ( Figuur 1 ) beschreven. Met dit systeem kunnen veel genen tegelijkertijd uit één plasmide worden uitgedrukt. Het is gebaseerd op een plasmide systeem, oorspronkelijk genaamd pKH22, die succesvol is gebruikt voor een aantal verschillende toepassingen 6 , 7 , 8 . Hier wordt deze plasmide set uitgebreid om vier gerelateerde vectoren te omvatten: pMGX-A, een expressievector die geen C- of N-terminale labels en met de ampicilline resistentie merker ontbreekt; PMGX-hisA, een expressievector die codeert voor een N-terminale hexahistidine tag en met de ampicilline resistentie marker; PMGX-K, een expressievector lC-of N-terminale tags en met de kanamycine resistentie marker; En pMGX-hisK, een expressievector die codeert voor een N-terminale hexahistidine tag en met de kanamycine resistentie marker. In deze studie wordt de werkwijze voor het genereren van een polycistrische vector die vijf genen bevat die het pMGX-systeem gebruiken, in het bijzonder pMGX-A, aangetoond, samen met de succesvolle productie van elk afzonderlijk eiwit in Escherichia coli .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Het verkrijgen van genen van belangstelling
- Ontwerp synthetische genen.
- Optimaliseer een gensequentie voor E. coli expressie.
- Verwijder eventuele problematische restrictieplaatsen uit de sequentie (AvrII, Ndel, EcoRI en XbaI).
- Inclusief beperkingsplaatsen voor klonen; Een 5'-NdeI-plaats en een 3'-EcoRI-plaats worden aanbevolen. Andere plaatsen kunnen eventueel gebruikt worden; Verwijzen naar het multicloninggebied van het geselecteerde plasmide ( Figuur S1- S4 ). Indien gewenst, voeg een 5 'of 3' coderingscode in voor Western blot detectie.
- Commercieel bestel het ontworpen gen.
- Ofwel klont het gen in een stompe vector met een stompe kloneringsset, volgens de instructies van de fabrikant; Ontwerp primers om het gen te amplificeren (ga dan verder met stap 1.2.2); Of voeg extra 5'- en 3'-uiteinden toe voor directe klonen in een pMGX-plasmide en ga verder naar stap 2. Hier, thE representatieve resultaten zijn van stompe cloning van de genen van belang.
- Versterk het gewenste gen (uit een ontworpen en geoptimaliseerd synthetisch gen of uit sjabloon DNA dat het gewenste gen bevat) 15 .
- Ontwerp primers met restrictieplaatsen voor klonen; Een 5'-NdeI-plaats en een 3'-EcoRI-plaats worden aanbevolen. Andere plaatsen kunnen eventueel gebruikt worden; Verwijzen naar het multicloninggebied van het geselecteerde plasmide ( Figuur S1- S4 ). Voeg desgewenst een 5 'of 3' coderingscode toe voor Western blot detectie.
- PCR amplificeer het gewenste gen 15 .
- Analyseer de PCR met agarosegel-elektroforese 16 .
- Als er geen specifieke amplificatie is, reinig het geamplificeerde gen door gel-extractie. Zo niet, gebruik een schoonmaakpakket voor enzymen.
- Kwantificeer het DNA met behulp van een spectrofotometer door de absorptie te controlerenE bij 260 nm; Leeg met elutiebuffer 17 .
2. Klonen van geïnteresseerden in een multigene expressiesysteem Vector, pMGX 18
- Beperking verteert het verkregen gen van belang en de gewenste vector, pMGX, met Ndel en EcoRI.
OPMERKING: Als een grote hoeveelheid recircularized plasmiden verkregen worden, laat de Ndel-reactie toe gedurende 1 uur voordat EcoRI wordt toegevoegd.- Gebruik een 40 μL digest reactie die 0,5-1,5 μg DNA en 1 μl van elk enzym bevat met 4 μl van de geschikte 10x buffer.
- Voor een NdeI- en EcoRI-digestie, gebruik EcoRI-buffer en voeg eerst NdeI-endonuclease toe. Verteer gedurende 1 uur bij 37 ° C. Voeg dan EcoRI endonuclease toe, en laat het verteren doorgaan voor een extra uur. NdeI is gevoelig voor splitsingen dicht bij het einde van DNA, dus de eerste vertering door EcoRI kan effectieve vertering door NdeI voorkomen.
- electrOphorese de restrictie verteren op agarosegel (voor een 1 kb gen, gebruik een 0,7% agarosegel bij 110 V gedurende 55 minuten; selecteer het percentage agarosegel voor verschillende gengroottes, zie verwijzing 16 .
- Accijnsinzet en vectorbanden met een schoon scalpel of scheermesje en plaats het gesneden gelegment in een 1,5 ml buis.
- Extract DNA uit de agarosegel met behulp van een gel-extractie kit volgens het protocol van de fabrikant.
- Lig het gen van belang in de pMGX vector met behulp van een 3: 1 insert-to-vector ratio; Opzetten van een negatieve ligatie van verteerde pMGX zonder de insert.
- Stel een 20 μl ligeringsreactie op die 1 μl T4 DNA-ligase bevat, 0,15-0,5 μg vector DNA (~ 5 μl) en een geschikte hoeveelheid insert gebaseerd op een 3: 1 insert-to-vector verhouding en de grootte van Het gen wordt ingevoegd; De pMGX backbones zijn tussen 5,312 en 5,504 bp in grootte. Inclusief een negatieve controle reactie die alles bu bevatHet gen wordt ingebracht. Zorg ervoor dat de hoeveelheid vector DNA equivalent is in de negatieve controle ligatie en de vector plus insert ligatie reacties.
- Transformeer ligatie reacties in XL1-Blauwe chemisch bevoegde E. coli cellen en geligeerde plasmiden pMGX- yfg1 (bevattende gen van belang 1), pMGX- yfg2 (bevattende gen van belang 2) ... pMGX- yfgn (bevattende gen van belang n). Gebruik aseptische techniek (in een bioveiligheidskast of onder een vlam).
- Gooi 100 μl alikvoten van chemisch bevoegde XL1-Blue E. coli op ijs gedurende 5 minuten en voeg vervolgens 5 μl van de ligatie-reacties toe. Incubeer gedurende 30 minuten op ijs.
- Verwarm de cellen gedurende 45 seconden in een waterbad dat bij 42 ° C wordt gehouden en voeg vervolgens 200 μL koud LB toe. Incubeer ze gedurende 2 minuten op ijs.
- Schud de cellen bij 37 ° C, 220 rpm gedurende 1 uur en verspreid vervolgens plaat 100 μL op een LB-agarplaat die een passendePriate selecteerbare marker (ofwel ampicilline of kanamycine).
- Scherm de klonen voor positieve transformanten.
- Vergelijk de kolonietellingen op de negatieve controle- en ligatieplaten. Een kolonietellingverhouding groter dan 1: 2 is gewenst. Als er een groot aantal kolonies op het negatieve controleplaatje is, ga terug naar stap 2.1 en controleer de notitie.
- Selecteer 4-8 afzonderlijke kolonies (afhankelijk van de negatieve controle: ligatieverhouding) van elke ligatie-reactie van de verschillende genen die voor screening worden geïntroduceerd (1 n) en een 4 ml LB en de passende antibiotica overnightkweek / individuele kolonie inoculeren. Kweek culturen 's nachts met schudden bij 37 ° C en 220 rpm.
- Isolatie van plasmide-DNA met behulp van een plasmide-DNA-isolatie kit volgens het protocol van de fabrikant.
- Stel een 20 μL NdeI + EcoRI digestreactie op die 150-500 ng DNA en 1 μl van elk enzym bevat met 2 μl van de geschikte 10x buffer. In thIs het geval, voeg NdeI en EcoRI toe op hetzelfde moment dat het gen van belang tussen de restrictieplaatsen zal zijn. Een negatieve controle met de lege pMGX vector wordt aanbevolen. Verteer gedurende 2 uur bij 37 ° C in een waterbad.
3. Genen 2 inbrengen in het pMGX vectorbevattende gen 1, pMGX- yfg1
- Beperking verteren pMGX- yfg1 met AvrII en behandelt met kalfdarmfosfatase (CIP).
- Gebruik een 40 μL digest reactie die 0,5-1,5 μg vector DNA bevat (~ 5-10 μl geïsoleerd DNA) en 1 μl AvrII met 4 μl van de geschikte 10x buffer. Verteer gedurende 1,5 uur bij 37 ° C en voeg vervolgens 1,5 μl CIP toe. Laat het nog eens 30 minuten bij 37 ° C liggen.
- Beperking verteren pMGX- yfg2 met AvrII en XbaI om het gen van belang te bevrijden.
- Gebruik een 40 μL digest reactie die 0,5-1,5 μg DNA en 1 μ bevat; L van elk enzym met 4 μl van de passende 10x buffer Verteer gedurende 2 uur bij 37 ° C.
- Elektroforese beperking verteert op een geschikte procent (0,7%) agarosegel en accijnst de inzet- en vectorbanden met behulp van een schoon scalpel / scheermesje (zie stap 2.2-2.3).
- Extract het DNA met behulp van een gel-extractie kit volgens het protocol van de fabrikant en kwantificeer het DNA 17 .
- Ligeer gen 2 in pMGX- yfg1 met behulp van een 3: 1 insert-to-vector ratio. Stel een negatieve ligatie van verteerde pMGX- yfg1 op zonder de aanvullende insert. Installeer zoals hierboven in stap 2.5.
- Transformeer 5 μL van de ligatie reacties in XL1-Blue chemisch bevoegde E. coli cellen, geligeerde plasmiden pMGX- yfg1,2 (bevattende gen van belang 1 en 2) en negatieve pMGX- yfg1 controle, zoals gezien in stap 2.6.
- Vergelijk de kolonietelling op de negatieve controle- en ligatieplaten. Een kolonie telling ratio gReater dan 1: 2 is gewenst. Als er een groot aantal kolonies op het negatieve controleplaatje is, ga terug naar stap 3.1 en controleer de CIP-behandeling.
- Selecteer 4-8 afzonderlijke kolonies (afhankelijk van de negatieve controle: ligatieverhouding) van de ligatie-reactie en inoculeer 4 ml LB plus het geschikte antibiotica per individuele kolonie en groei overnacht bij 37 ° C en 220 rpm.
- Isolatie van plasmide-DNA met behulp van een plasmide-DNA-isolatie kit volgens het protocol van de fabrikant en het DNA 17 kwantificeren.
- Scherm de effectieve invoeging van het tweede gen door een restrictie vertering van pMGX- yfg1,2 met EcoRI uit te voeren.
- Gebruik een 20 μL digest reactie die 150-500 ng DNA en 1 μl EcoRI enzym bevat met 2 μL EcoRI 10x buffer. Verteer gedurende 2 uur bij 37 ° C.
- Elektroforese de restrictie verteren op een geschikte procent agarosegel; Zoek een band die overeenkomtS aan de grootte van gen 2 (zie stap 2.2). Een gen kan in de ongewenste, omgekeerde oriëntatie in de vector invoegen.
4. Het toevoegen van een derde gen in de pMGX vector bevattende genen 1 en 2, pMGX- yfg1,2
- Beperking verteren pMGX- yfg1,2 met AvrII en behandel met CIP, zoals gezien in stap 3.1.
- Beperking verteren pMGX- yfg3 met AvrII en XbaI, zoals gezien in stap 3.2.
- Elektroforese verdeelt de restrictie op een geschikte percentage agarosegel en accijnsinzet en vectorbanden met behulp van een schoon scalpel / scheermesje; Verwijzen naar stappen 2.2-2.3.
- Extract het DNA uit de agarosegel met behulp van een gel-extractie kit en kwantificeer het DNA 17 .
- Ligeer gen 3 in pMGX- yfg1,2 met behulp van een 3: 1 insert-to-vector ratio en stel een negatieve ligatie van verteerde pMGX- yfg1,2 in zonder een extra insert, zoals gezien in stap 3.5.
- Transformeer 5 μL van de ligatie reacties in XL1-Blauwe chemisch bevoegde E. coli cellen, geligeerde plasmide pMGX- yfg1,2,3 (bevattende genen van interest 1, 2 en 3) en negatieve pMGX- yfg1,2 controle, zoals gezien in stap 2.6.
- Vergelijk de kolonietelling op de negatieve controle- en ligatieplaten. Als er een groot aantal kolonies op het negatieve controleplaatje is, ga terug naar stap 4.1 en controleer de CIP-behandeling.
- Selecteer 4-8 individuele kolonies (afhankelijk van de negatieve controle: ligatieverhouding) van de ligatie-reactie en inoculeer 4 ml LB plus het geschikte antibiotica per individuele kolonie; Groeien overnacht bij 37 ° C en 220 rpm.
- Isolatie van het plasmide-DNA met behulp van een plasmide-DNA isolatie kit volgens het protocol van de fabrikant.
- Scherm de effectieve invoeging van het derde gen door het uitvoeren van een restrictie vertering van pMGX- yfg1,2,3 met EcoRI, zoals gezien in stap 3.10.
- Elektroforese de restrictie verteren op een geschikte procent agarosegel; kijkenVoor banden die overeenkomen met de maten van gen 2 en gen 3 (zie stap 2.2). Opmerking: gen 3 kan in de vector in de ongewenste omgekeerde oriëntatie invoegen. Als genen 2 en 3 dezelfde grootte hebben, moet een andere geschikte restrictie verteerplaats geselecteerd worden voor screening.
OPMERKING: Herhaal als nodig voor elk nieuw gen.
5. Het produceren van eiwitten van belang met behulp van een multigene expressiesysteem en het beoordelen van productie door Western Blotting
- Transformeer de positieve kloon die alle genen van belang bevat in chemisch bevoegde eiwitproductie E. coli , zoals BL21- (DEDE3).
- Doe 100 μl alikvoten van chemisch bevoegde BL21- (DEDE3) E. coli op ijs gedurende 5 minuten en voeg vervolgens 1 μL van het positief gekloneerde plasmide-DNA toe; Incubeer gedurende 30 minuten op ijs.
- Warmte schok de cellen gedurende 45 seconden in een waterbad dat bij 42 ° C wordt gehouden en voeg vervolgens 200 μL koude LB toe. Incubeer op ijs gedurende 2 minuten.
- Schud de cellen bij 37 ° C en 220 rpm gedurende 1 uur en verspreid vervolgens plaat 100 μL op een LB-agarplaat die de geschikte selecteerbare marker bevat (ofwel ampicilline of kanamycine).
- Express het eiwit door isopropyl-ß-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) inductie.
- Selecteer een geïsoleerde kolonie uit de transformatorplaat B21- (λDE3) en geef 4 ml LB plus het juiste antibioticum in inoculatie; Groeien overnacht, schudden bij 37 ° C en 220 rpm.
- Inoculeer een 100 ml LB plus de geschikte antibiotica kweek door gebruik te maken van 1 ml nachtcultuur.
- Groeien bij 37 ° C met schudden bij 220 rpm tot een OD 600 van 0,6.
- Inducteer de cultuur met 100 μM IPTG en groei gedurende 15 uur bij 25 ° C en 220 rpm.
- Verwijder 1 ml van de kweek en centrifugeer deze gedurende 1 min bij 13.000 xg; Weggooi de supernatant.
- Licht de cellen volgens lysisoplossing volgens de instructies van de fabrikantEn preform een Western blot van het oplosbare cellysaat om te bepalen of alle eiwitten succesvol zijn geproduceerd 19 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
In deze studie was het doel om vijf eiwitten uit één enkel plasmide te co-expresseren. De vijf-codon geoptimaliseerde synthetische genfragmenten die coderen voor N- of C-terminale hexahistidine tags werden commercieel gekocht. De synthetische genen werden geamplificeerd door PCR en individueel gekloneerd in een PCR-stompe vector en sequenced. Om het polycistronische plasmide te genereren werden de vijf genen die van belang zijn eerst gekloneerd in een geschikt pMGX plasmide, pMGX-A. Figuur 2 toont PCRBlunt- yfg1 en PCRBlunt- yfg2 in aanvulling op pMGX-A gedigereerd met NdeI + EcoRI (zie stap 2). Om de eerste twee genen te klooneren in pMGX-A, werd het plasmide verteerd met NdeI + EcoRI ( Figuur 2 ). Bij het klonen van de genen van belang in pMGX-A werden de nieuw geconstrueerde plasmiden, aangeduid als pMGX- yfg1 en pMGX- yfg2 , verteerd met AvrII + XbaI om te bevestigen dat succesvolle klonen werden verkregen, zoalsGetoond in de 1,1-kb en 1,3 kb bands verkregen in Figuur 3 .
Figuur 2: Klonen van pMGX plasmiden. De verwachte resultaten van PCR-stompe plasmiden die yfg1 en yfg2 bevatten na spijsvertering met NdeI + EcoRI worden getoond op een 0,7% agarosegel (110 V, 55 min). Baan 1, 1 kb DNA ladder; Laan 2, PCRBlunt- yfg1 ; Laan 3, PCRBlunt- yfg2 ; Laan 4, pMGX-A controle. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Screening van pMGX- yfg1 en pMGX- yfg2. De 0,7% agarosegel (110 V, 55 min) toont De twee bands die gegenereerd worden door zowel pMGX- yfg1 als pMGX- yfg2 na spijsvertering met AvrII + XbaI. Lane 1, 1-kb DNA ladder; Laan 2, pMGX- yfg1 ; Laan 3, pMGX- yfg2 ; Laan 4, pMGX-A controle. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Met beide genen in de passende pMGX-vector werd het polycistronische plasmide geconstrueerd. Om het plasmide pMGX- yfg1,2 te genereren, werd pMGX- yfg1 gedigereerd met AvrII, zoals getoond in Figuur 4 . PMGX- yfg2 werd verteerd met AvrII + XbaI en het 1,3-kb gen dat het fragment bevatte werd geligeerd in de AvrII-plaats van gelineariseerde pMGX- yfg1 , waardoor pMGX- yfg1,2 werd opgewekt . Digestie van pMGX- yfg1,2 met EcoRI bevestigde het succesvolle klonen van het gewenste plasmide en wordt getoond in> Figuur 5.
Figuur 4: Het genereren van het bicistronische plasmide pMGX- yfg1,2. De resultaten van 0,7% agarosegel-elektroforese (110 V, 55 min) pMGX- yfg1 gedigereerd met AvrII en pMGX- yfg2 gedigereerd met AvrII + XbaI. Lane 1, 1-kb DNA ladder; Laan 2, pMGX- yfg1 gedigereerd met AvrII; Laan 3, pMGX- yfg2 gedigereerd met AvrII + XbaI; Laan 4, pMGX-A controle. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Screening van pMGX- yfg1,2 klonen . De verkregen 0,7% agarosegel (110 V, 55 min) van pMGX- yfG1,2 klonen die gedigereerd zijn met EcoRI wordt getoond. Succesvolle klonen zullen twee bands genereren, één voor het ingevoegd gen yfg2 en de andere die overeenkomen met de ruggengraat + yfg1 ( pMGX-yfg1 ). Baan 1, 1 kb DNA ladder; Laan 2, pMGX- yfg1,2 gedigereerd met EcoRI, kloon 1; Laan 3, pMGX- yfg1,2 gedigereerd met EcoRI, kloon 2; Laan 4, pMGX-A controle. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Bij het genereren van een polycistronisch plasmide dat twee of meer genen bevat, kan men een ongewenste omgekeerde insertie van het gen gekloneerd in de AvrII-plaats tegenkomen. Figuur 6 is een gel die het verschil tussen de resultaten van een verteerd plasmide met een gen insitueert in de juiste oriëntatie, in tegenstelling tot een gen dat in de omgekeerde oriëntatie wordt ingevoegd, onderstreept. Als het gen isGeligeerd en gekloneerd in de ongewenste oriëntatie, zal de EcoRI-plaats aan het einde van het gen direct naast de EcoRI-plaats van het vorige gen geplaatst worden. Dit zou een fragmentgrootte opleveren die vrijwel onopspoorbaar is door DNA-gelelektroforese (minder dan 50 bp). Bovendien zou het laatste ingevoegde gen in de ruggengraat verschijnen, die gemakkelijk te herkennen is doordat de ruggengraat groter is dan verwacht. Het verschil in de grootte van de ruggengraat uit de verwachte grootte geeft de grootte van het laatst ingevoegde gen aan.
Figuur 6: Screening van pMGX- yfg1-5 klonen . Een 1,3% agarosegel (110 V, 65 min) die de resultaten van pMGX- yfg1-5 verteert met EcoRI, wordt afgebeeld. Succesvolle klonen (baan 2) zullen een band genereren die overeenkomt met het laatst ingevoegd gen ( yfg5 in dit geval, 1,1 kb). LanE 1, 1-kb DNA ladder; Laan 2, positieve kloon van pMGX- yfg1-5, gedigereerd met EcoRI; Laan 3, negatieve kloon van pMGX- yfg1-5, gedigereerd met EcoRI; Laan 4, pMGX- yfg1-4 controle. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Om de vijf-gen polycistronische expressievector te voltooien werden de overige drie genen één na elkaar gekloneerd in pMGX- yfg1,2 om pMGX- yfg1-5 te genereren (zie stap 5). Dit plasmide werd vervolgens getransformeerd in BL21- (XDE3) en expressie van de eiwitten werd geïnduceerd in een mid-log fase kweek door toevoeging van IPTG. Figuur 7 is een Western blot van cellysaten, waarin wordt bevestigd dat alle vijf eiwitten uit een enkel plasmide dat meerdere genen in een enkele operon bevat, uitgedrukt kunnen worden. De expressie van pMGX- yfg1 (bevattende 1 gen),PMGX- yfg1,2 (bevattende 2 genen) en pMGX- yfg1-5 (bevattende 5 genen) worden getoond.
Figuur 7: Western blot analyse van multi-gene expressie met behulp van het pMGX systeem. Incorporatie van N- of C-terminale hexahistidine tags zorgde voor de Western blot detectie van eiwit expressie. Monsters werden gescheiden op voorgevormde 4-20% gradiëntvrije acrylamidegelen (200 V, 35 min, 10 cm x 8,5 cm) en vervolgens een overdracht (40 V, 90 min) op een nitrocellulosemembraan (0,45 um, 10 cm x 7 cm) werd uitgevoerd. HRP-geconjugeerd anti-His monoklonaal antilichaam, dat geen secundair antilichaam nodig heeft, werd gebruikt. Blokkering-, overdrachts- en antilichaamverdunningsbuffers werden bereid zoals aanbevolen door de antilichamenfabrikant. Detectie werd uitgevoerd met Western Chemiluminescent HRP substraat volgens de insulant van de fabrikanttructions. Het resulterende membraan werd gevisualiseerd onder gebruikmaking van een beeldscherm zonder filter. Baan 1, dubbelkleurige standaard overgebracht op het membraan (niet chemiluminescerend); Laan 2, His6pMGX- yfg1 ; Laan 3, His6pMGX- yfg1,2 ; Laan 4, His6pMGX- yfg1-5. Opmerking: Proteïne geproduceerd door yfg5 is dezelfde grootte als het eiwit dat wordt geproduceerd door yfg1 (beide zijn 36 kDa) en kunnen niet op de gel worden gescheiden. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Aanvullende cijfers: Klik hier om dit bestand te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Co-expressie van meerdere genen is steeds belangrijker, met name bij het karakteriseren en reconstituteren van complexe, multigene metabolische pathways 3 , 4 , 5 . Het pMGX-systeem maakt multigene co-expressie in E. coli routine 6 , 7 , 8 en toegankelijk voor diverse onderzoekers. In deze studie bleek dat vijf eiwitten van belang werden gelijktijdig geproduceerd uit een enkel plasmide systeem met behulp van pMGX-A. Veel co-expressiesystemen die momenteel beschikbaar zijn, staan alleen in staat voor het inbrengen van twee genen, die bicistronische plasmiden genereren, zoals pET Duet-vectoren 12 . Als men meer genen nodig heeft, zijn meerdere bicistronische vectoren met verschillende selecteerbare markers nodig. In tegenstelling tot andere multigeen expressiesystemen maakt het pMGX-systeem de mogelijkheid om de klonteren te klonenVan meerdere genen in één plasmide, met de mogelijkheid om restrictieplaatsen te hergebruiken zonder de noodzaak van verschillende donorplasmiden of voor het verwijderen van meerdere restrictie-enzymplaatsen uit de genen 13 , 14 . Kritieke stappen in dit protocol omvatten genontwerp, preventie van achtergrondrecircularisatie van enkel verteerde pMGX-vectoren en schermen van de polycistronische vectoren voor de juiste oriëntatie van het ingevoegde gen.
Bij het plannen van de kloneringsstrategie om een polycistronisch systeem te bouwen, is het essentieel om ervoor te zorgen dat de genen van belang geen restrictieplaatsen bevatten die nodig zijn voor de downstream-kloning. In het bijzonder omvatten deze XbaI en AvrII die nodig zijn voor het inbrengen van de tweede en volgende genen in de pMGX-vector die het eerste gen van belang bevat (stappen 3 en 4). Bovendien is het essentieel om beperkingsplaatsen te elimineren die gebruikt worden voor de initiële kloning van het gInteresses van pMGX (stap 2). Typisch omvatten deze NdeI of NheI bij het 5'-uiteinde van het gen en BamHI of EcoRI bij het 3'-uiteinde van het gen, hoewel andere restrictieplaatsen ook voor deze stap kunnen worden gebruikt, indien nodig. Eliminatie van extra, ongewenste restrictieplaatsen kan gemakkelijk worden uitgevoerd bij de gensynthese fase of, in het geval van genen die uit andere bronnen zijn gekloneerd, door synonieme nucleotide substituties via plaatsgerichte mutagenese 20 .
De toevoeging van volgende genen die van belang zijn voor pMGX die het eerste gen van belang bevat, vereist linearisatie van pMGX- yfg1 met AvrII (stap 3.1, let op dat het ook gelineariseerd kan worden met XbaI). Deze gelineariseerde vector zal snel religeren tijdens de invoeging van het tweede gen van belang (stap 3.5), wat leidt tot een extreem hoog aantal achtergrondklonen. Om dit te vermijden is het essentieel om de gelineariseerde vector met een fosfatase te behandelen om de 5 te fosforyleren2; Einden van de gelineariseerde vector. Typisch wordt CIP gebruikt, hoewel anderen beschikbaar zijn. Optimalisatie van zowel de eenheden van fosfatase als de incubatietijd kan nodig zijn om de ligaties van volgende genen van belang te optimaliseren in de gelineariseerde vector.
Ten slotte, bij het opwekken van een polycistronisch systeem, wordt het gen van belang aanvankelijk gesneden door spijsvertering met XbaI en AvrII, die complementaire cohesieve uiteinden opwekken bij de 5'- en 3'-uiteinden van het gen (stappen 3.2 en 4.2). Deze insert kan in de voorwaartse of omgekeerde richting in de gelineariseerde vector geligeerd worden. Aangezien alle samenhangende uiteinden identiek zijn, wordt geen richtheid afgedwongen door middel van complementaire ontgloeiing van de samenhangende uiteinden. Het is dus noodzakelijk om de resulterende klonen voor de juiste inbrengrichting van het gen van belang te screenen. Dit kan gemakkelijk gedaan worden door clones te screenen met een van de restrictieplaatsen die gebruikt worden om het oorspronkelijke gen van belang in pMGX (stap 2) te klooneren. Typisch,EcoRI wordt gebruikt, aangezien de restrictieplaats bij het 3'-uiteinde van het gen is en het is derhalve passend om te screenen op directionaliteit, zoals getoond in Figuur 6 . In de meeste gevallen hebben 50% van de klonen die het gen van belang bevatten het gen in de juiste oriëntatie en 50% hebben het gen in de tegengestelde oriëntatie.
Zelden (10% van de ligaties) kunnen alle klonen uit een bepaalde ligatie het gen van belang in slechts één richting hebben ingevoegd. Dit resultaat lijkt sequentieafhankelijk te zijn, aangezien het in deze specifieke gevallen zeer reproduceerbaar is. Als dit gebeurt en het gen van belang continu in de omgekeerde oriëntatie invoegt, kan de gewenste vector meestal toegankelijk worden door de richting van klonen te veranderen. In plaats van bijvoorbeeld yfg2 in de AvrII-plaats van pMGX- yfg1 te klonen , kan yfg1 in de XbaI-plaats van pMGX- yfg2 worden gekloneerd. Merk op dat dit de identieke eindvector geeftsysteem. Deze extra flexibiliteit die toegang tot hetzelfde systeem van verschillende kloneringsstrategieën mogelijk maakt, is zeer voordelig.
Een belangrijke beperking van deze methodologie is dat de eiwitten die zijn gecodeerd bij het 3'-uiteinde van het polycistronische transcript, typisch uitgedrukt worden op lagere niveaus dan de eiwitten die zijn gecodeerd bij het 5'-uiteinde van het transcript en dit effect is meer uitgesproken hoe langer het transcript is . Dit betekent dat het veranderen van de volgorde van de genen die van belang zijn voor de synthetische operon, invloed kunnen hebben op de relatieve expressieniveaus van de eiwitten die zij coderen, waardoor een mechanisme wordt verkregen om de relatieve expressieniveaus te verfijnen.
Samengevat levert het pMGX-systeem een betrouwbare methode voor de co-expressie van meerdere eiwitten uit een enkel plasmide in E. coli , die kan worden gebruikt voor een verscheidenheid aan toepassingen op het gebied van synthetische biologie en voor karakterisatie van biochemische pathways.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door de Raad voor Natuurwetenschappen en Engineering van Canada.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Enzymes | |||
| Alkaline Phosphatase, Calf Intestinal (CIP) | New England Biolabs | M0290S | |
| AvrII | New England Biolabs | R0174S | |
| EcoRI | New England Biolabs | R0101S | |
| NdeI | New England Biolabs | R0111S | |
| XbaI | New England Biolabs | R0145S | |
| Herculase II Fusion DNA Polymerase | Agilent Technologies | 600677 | |
| T4 DNA Ligase | New England Biolabs | M0202S | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| 1 kb DNA ladder | New England Biolabs | N3232L | |
| 4-20% Mini-PROTEAN TGX Stain-Free Protein Gels | Bio-Rad | 456-8095 | |
| 50x TAE | Fisher Thermo Scientific | BP1332-4 | |
| Agar | Fisher Thermo Scientific | BP1423-500 | |
| Agarose | Fisher Thermo Scientific | BP160-500 | |
| Ampicilin | Sigma-Alrich | A9518-5G | |
| BL21 (DE3) chemically comeptent cells | Comeptent cell prepared in house | ||
| B-PER Bacterial Protein Extraction Reagent | Fisher Thermo Scientific | PI78243 | |
| dNTP mix | Agilent Technologies | Supplied with polymerase | |
| Gel Extraction Kit | Omega | D2500-02 | E.Z.N.A Gel Extraction, supplied by VWR Cat 3: CA101318-972 |
| Glycine | Fisher Thermo Scientific | BP381-1 | |
| His Tag Antibody [HRP], mAb, Mouse | GenScript | A00612 | |
| Immobilon Western Chemiluminescent HRP Substrate | EMD Millipore | WBKLS0100 | |
| IPTG | Sigma-Alrich | 15502-10G | |
| LB | Fisher Thermo Scientific | BP1426-500 | |
| Methanol | Fisher Thermo Scientific | A411-20 | |
| Pasteurized instant skim milk powder | Local grocery store | No-name grocery store milk is adequate | |
| Nitrocellulose membrane | Amersham Protran (GE Healthcare Life Sciences) | 10600007 | Membrane PT 0.45 µm 200 mm x 4 m, supplied by VWR Cat #: CA10061-086 |
| Plasmid DNA Isolation Kit | Omega | D6943-02 | E.Z.N.A Plasmid DNA MiniKit I, supplied by VWR Cat #: CA101318-898 |
| pMGX | Boddy Lab | Request from the Boddy Lab Contact cboddy@uottawa.ca | |
| Primers | Intergrated DNA Technologies | Design primers as needed for desired gene | |
| Synthetic Gene | Life Technologies | Design and optimize as needed | |
| Thick Blot Filter Paper | Bio-Rad | 1703932 | |
| Tris base | BioShop | TRS001.1 | |
| Tween-20 | Sigma-Alrich | P9416-50ML | |
| XL1-Blue chemically competent cells | Comeptent cell prepared in house | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| BioSpectrometer | Eppendorf | RK-83600-07 | |
| Gel box - PAGE | Bio-Rad | 1658005 | Mini-PROTEIN Tetra Vertical Electrophoresis Cell |
| Gel Imager | Alpha Innotech | AlphaImager EC | |
| Incubator-oven | Fisher Thermo Scientific | 11-690-650D | Isotemp |
| Incubator-shaker | Fisher Thermo Scientific | SHKE6000-7 | MaxQ 6000 |
| Personna Razors | Fisher Thermo Scientific | S04615 | |
| Power Pack | Bio-Rad | S65533Q | FB300 |
| Transilluminator | VWR International | M-10E,6W | |
| Thermocylcer | Eppendorf | Z316091 | Mastercycler Personal, supplied by Sigma |
| UV Face-Shield | 18-999-4542 | ||
| Waterbath | Fisher Thermo Scientific | 15-460-2SQ | |
| Western Transfer Apparatus | Bio-Rad | 1703935 | Mini-Trans Blot Cell |
References
- Purnick, P. E. M., Weiss, R. The second wave of synthetic biology: from modules to systems. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10 (6), 410-422 (2009).
- Bieniossek, C., et al. Automated unrestricted multigene recombineering for multiprotein complex production. Nat. Methods. 6 (6), 447-450 (2009).
- Jochimsen, B., et al. Five phosphonate operon gene products as components of a multi-subunit complex of the carbon-phosphorus lyase pathway. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 108 (28), 11393-11398 (2011).
- Martin, V. J. J., Pitera, D. J., Withers, S. T., Newman, J. D., Keasling, J. D. Engineering a mevalonate pathway in Escherichia coli for production of terpenoids. Nat. Biotechnol. 21 (7), 796-802 (2003).
- Ajikumar, P. K., et al. Isoprenoid pathway optimization for Taxol precursor overproduction in Escherichia coli. Science. 330 (6000), 70-74 (2010).
- Boddy, C. N., Hotta, K., Tse, M. L., Watts, R. E., Khosla, C. Precursor-directed biosynthesis of epothilone in Escherichia coli. J. Am. Chem. Soc. 126 (24), 7436-7437 (2004).
- Lundgren, B. R., Boddy, C. N. Sialic acid and N-acyl sialic acid analog production by fermentation of metabolically and genetically engineered Escherichia coli. Org. Biomol. Chem. 5 (12), 1903-1909 (2007).
- Horsman, M. E., Lundgren, B. R., Boddy, C. N. N-Acetylneuraminic Acid Production in Escherichia coli Lacking N-Acetylglucosamine Catabolic Machinery. Chem. Eng. Commun. 203 (10), 1326-1335 (2016).
- Romier, C., et al. Co-expression of protein complexes in prokaryotic and eukaryotic hosts: experimental procedures, database tracking and case studies. Acta Crystallogr. D, Biol. Crystallogr. 62 (Pt 10), 1232-1242 (2006).
- Tolia, N. H., Joshua-Tor, L. Strategies for protein coexpression in Escherichia coli. Nat. Methods. 3 (1), 55-64 (2006).
- Chanda, P. K., Edris, W. A., Kennedy, J. D. A set of ligation-independent expression vectors for co-expression of proteins in Escherichia coli. Protein Expr. Purif. 47 (1), 217-224 (2006).
- Kim, K. -J., et al. Two-promoter vector is highly efficient for overproduction of protein complexes. Protein Sci. 13 (6), 1698-1703 (2004).
- Tan, S., Kern, R. C., Selleck, W. The pST44 polycistronic expression system for producing protein complexes in Escherichia coli. Protein Expr. Purif. 40 (2), 385-395 (2005).
- Chen, X., Pham, E., Truong, K. TEV protease-facilitated stoichiometric delivery of multiple genes using a single expression vector. Protein Sci. 19 (12), 2379-2388 (2010).
- Lorenz, T. C. Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. J. Vis. Exp. (63), e3998 (2012).
- Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. -Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. J. Vis. Exp. (62), (2012).
- Sukumaran, S. Concentration determination of nucleic acids and proteins using the micro-volume BioSpec-nano-spectrophotometer. J. Vis. Exp. (48), (2011).
- JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Molecular Cloning. J. Vis. Exp. , Available from: https://www.jove.com/science-education/5074/molecular-cloning (2016).
- JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. The Western Blot. J. Vis. Exp. , Available from: https://www.jove.com/science-education/5065/the-western-blot (2016).
- Laible, M., Boonrod, K. Homemade site directed mutagenesis of whole plasmids. J. Vis. Exp. (27), (2009).
