Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

T7 RNA פולימראז בתיווך Multigene הביטוי מערכת, pMGX

Published: June 27, 2017 doi: 10.3791/55187
Automatic Translation
*1, *1, 2, 1
1Department of Chemistry and Biomolecular Sciences, University of Ottawa, 2School of Biosciences, The University of Nottingham Malaysia Campus
* These authors contributed equally

Summary

מחקר זה מתאר שיטות עבור T7 בתיווך ביטוי משותף של גנים מרובים מ פלסמיד בודד ב Escherichia coli באמצעות מערכת pMGX פלסמיד.

Abstract

ביטוי משותף של חלבונים מרובים הוא חיוני יותר ויותר עבור ביולוגיה סינתטית, חקר קומפלקסים חלבונים חלבון, אפיון ורתום מסלולים biosynthetic. בכתב יד זה, את השימוש של מערכת יעילה מאוד לבניית multonene סינתטי אופרנים תחת שליטה של ​​פולימרז T7 RNA inducable מתואר. מערכת זו מאפשרת גנים רבים להתבטא בו זמנית פלסמיד אחד. הנה, קבוצה של ארבעה וקטורים הקשורים, pMGX-A, pMGX-hea, pMGX-K, ו pMGX-hek, עם או ampicillin או קנמיצין התנגדות סמן לבחירה (A ו K) או גם בעל או חסר N- מסוף hexahistidine התג (שלו) נחשפים. פרוטוקולים מפורטים לבניית אופטונים סינתטיים באמצעות מערכת וקטורית זו מסופקים יחד עם הנתונים המתאימים, מראים כי מערכת pMGX מבוסס המכיל חמישה גנים ניתן לבנות בקלות ומשמש לייצר את כל חמש חלבונים מקודדים ב Escherichia coli . זה systEm ופרוטוקול מאפשר לחוקרים באופן שגרתי להביע מורכבים מרובי רכיב רכיבים ומסלולים ב E. coli .

Introduction

ביטוי משותף של חלבונים מרובים הוא חיוני יותר ויותר, במיוחד ביישומים ביולוגיה סינתטית, שבו מודולים פונקציונליים מרובים חייב לבוא לידי ביטוי 1 ; בחקר חלבונים חלבונים, שבו הביטוי ואת הפונקציה דורשים לעתים קרובות שיתוף ביטוי 2 , 3 ; וכן אפיון ורתום מסלולים ביוסינתטיים, שבו כל גן במסלול חייב לבוא לידי ביטוי 4 , 5 , 6 , 7 , 8 . מספר מערכות פותחו עבור שיתוף ביטוי, במיוחד האורגניזם המארח Escherichia coli , סוס העבודה עבור ביטוי חלבון רקומביננטי מעבדה 9 . לדוגמה, פלסמידים מרובים עם סמנים לבחירה שונים ניתן להשתמש כדי לבטא חלבונים בודדים באמצעות שפע של שונים לשעבר 12 הצ 12 , 12 . מערכות פלסמיד יחיד עבור ביטוי חלבון מרובים השתמשו גם מספר האמרגן לשלוט על הביטוי של כל גן 10 , 12 ; אופטונים סינתטיים, שבהם מקודדים גנים מרובים על תמליל יחיד 2 , 13 ; או, במקרים מסוימים, גן יחיד קידוד פוליפפטיד כי הוא מעובד proteolytically בסופו של דבר, מניב את החלבונים הרצוי של עניין 14 .

איור 1
איור 1: זרימת עבודה pMGX מראה את הבנייה של וקטור polycistronic. מערכת pMGX מספקת אסטרטגיה גמישה וקלה לשימוש לבניית אופרונים סינתטיים בשליטתו של מקדם T7."לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו." Target = "_ blank"

בכתב יד זה, את השימוש של מערכת יעילה מאוד לבניית multonene אופטונים סינתטיים תחת שליטה של ​​פולימרז T7 RNA inducible ( איור 1 ) מתואר. מערכת זו מאפשרת גנים רבים להתבטא בו זמנית פלסמיד אחד. הוא מבוסס על מערכת פלסמיד, שנקרא במקור pKH22, כי כבר בשימוש בהצלחה עבור מספר יישומים שונים 6 , 7 , 8 . הנה, זה להגדיר פלסמיד מורחבת לכלול ארבעה וקטורים הקשורים: pMGX-A, וקטור ביטוי חסר כל C- או N- מסוף תגים עם סמן עמיד ampicillin; PMGX-heA, ביטוי וקטור קידוד תג N- מסוף hexahistidine ועם סמן עמיד ampicillin; PMGX-K, וקטור ביטוי lAcking כל C או N- מסוף תגים עם סמן התנגדות kanamycin; ו pMGX-hek, ביטוי וקטור קידוד N- מסוף hexahistidine תג עם סמן התנגדות kanamycin. במחקר זה, השיטה להפקת וקטור polycistronic המכיל חמישה גנים באמצעות מערכת pMGX, במיוחד pMGX-A, הוא הפגינו יחד עם הייצור המוצלח של כל חלבון הפרט Escherichia coli .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. קבלת גנים של עניין

  1. עיצוב גנים סינתטיים.
    1. ייעל רצף גנים עבור ביטוי E. coli .
    2. הסר את כל אתרי ההגבלות הבעייתיים מהרצף (AvrII, NdeI, EcoRI ו- XbaI).
    3. שילוב אתרי הגבלה לשיבוט; מומלץ לבנות אתר של 5'-NdeI ואתר 3'-EcoRI. ניתן להשתמש באתרים אחרים, במידת הצורך; מתייחסים לאזור multicloning של הפלסמיד הנבחר ( איור S1- S4 ). אם תרצה, הוסף תג קידוד בגודל 5 או 3 עבור זיהוי כתמים מערביים.
    4. באופן מסחרי להזמין את הגן המעוצב.
    5. או בוטה לשכפל את הגן לתוך וקטור קהה באמצעות ערכת שיבוט קהה, בהתאם להוראות היצרן; פריימרים בעיצוב כדי להגביר את הגן (ולאחר מכן להמשיך לשלב 1.2.2); או להוסיף 5 'ו 3' מסתיים נוספים שיבוט ישיר לתוך pMGX פלסמיד ולהמשיך לשלב 2. כאן,התוצאות הייצוגיות הן מתוך שיבוט קהה של הגנים המעניינים.
  2. להגביר את הגן הרצוי (מגן מתוכנן וממוטב של סינתטי או מדגם DNA המכיל את הגן הרצוי).
    1. עיצוב primers עם אתרי הגבלה לשיבוט; מומלץ לבנות אתר של 5'-NdeI ואתר 3'-EcoRI. ניתן להשתמש באתרים אחרים, במידת הצורך; מתייחסים לאזור multicloning של הפלסמיד הנבחר ( איור S1- S4 ). אם תרצה, הוסף תג קידוד של 5 או 3 לזיהוי כתמים מערביים.
    2. PCR להגביר את הגן הרצוי 15 .
    3. ניתוח PCR על ידי agarose ג'ל אלקטרופורזה 16 .
    4. אם יש הגברה unspecification, לנקות את הגן מוגבר על ידי מיצוי ג 'ל. אם לא, השתמש ערכת אנזים ניקוי.
    5. לכמת את ה- DNA באמצעות ספקטרופוטומטר ידי בדיקת absorbancE ב 260 ננומטר; ריק עם חיץ elution 17 .

2. שיבוט גנים של עניין לתוך מערכת ביטוי multigene וקטור, pMGX 18

  1. הגבלת digest הגן שהושג של עניין ואת וקטור הרצוי, pMGX, עם NdeI ו EcoRI.
    הערה: אם כמות גדולה של פלסמידים recircularized מתקבלים, לאפשר תגובה NdeI להמשיך במשך שעה 1 לפני הוספת EcoRI.
    1. השתמש בתגובת 40 לעכל μL המכיל 0.5-1.5 מיקרוגרם של ה- DNA ו 1 μL של אנזים עם 4 μL של חיץ 10x המתאים.
    2. עבור Ndei ו- EcoRI digest, השתמש במאגר EcoRI והוסף תחילה endonuclease NDEI. תקציר עבור 1 שעה ב 37 ° C. לאחר מכן להוסיף endrouclease EcoRI, ולאפשר digest להמשיך במשך שעה נוספת. NdeI הוא רגיש מחשופים קרוב לסוף הדנ"א, ולכן העיכול הראשוני על ידי EcoRI יכול למנוע עיכול יעיל על ידי NdeI.
  2. חשמלOphorese הגבלת digest על agarose ג'ל (עבור גן 1 kb, השתמש ג'ל agarose 0.7% ב 110 V עבור 55 דקות, כדי לבחור את אחוז ג'ל agarose עבור גנים שונים בגן, עיין התייחסות 16 .
  3. הבלו להוסיף להקות וקטור באמצעות אזמל נקי או סכין גילוח ומקום קטע ג'ל שנעלמו לתוך צינור 1.5 מ"ל.
  4. תמצית דנ"א מג'ל agarose באמצעות ערכת מיצוי ג'ל בהתאם לפרוטוקול היצרן.
  5. לקשר את הגן של עניין לתוך וקטור pMGX באמצעות יחס 3: 1 להוסיף וקטור; להקים קשירת שלילי של pMGX מתעכל ללא הכנס.
    1. הגדרת תגובה 20 קשירת μL המכיל 1 μL של ליגז DNA T4, 0.15-0.5 מיקרוגרם של DNA וקטורית (~ 5 μL), ואת הכמות המתאימה של הוספה על בסיס יחס של 3: 1 להוסיף וקטור ואת גודל הגן מוחדר; את pMGX backbones הם בין 5,312 ו 5,504 bp בגודל. כלול תגובה שלילית שליטה המכיל הכל buלא את הגן מוחדר. ודא כי כמות ה- DNA הווקטורית היא המקבילה של קשירת שליטה שלילית ואת וקטור פלוס להוסיף קשירת התגובות.
  6. שינוי תגובות קשירת לתוך XL1 כחול כחול מוכשר כימית תאים E. coli ו ligated פלסמידים pMGX- yfg1 (המכיל גן של עניין 1), pMGX- yfg2 (המכיל גן של עניין 2) ... pMGX- yfgn (המכיל גן של עניין n). השתמש בטכניקה aseptic (בתוך ארון biosafety או תחת להבה).
    1. הפשרה 100 aliquots μL של המוסמכת כימית XL1-Blue E. coli על הקרח במשך 5 דקות ולאחר מכן להוסיף 5 μL של התגובות קשירת. דגירה במשך 30 דקות על הקרח.
    2. מחממים הלם התאים במשך 45 ים באמבט מים שנערך ב 42 מעלות צלזיוס ולאחר מכן להוסיף 200 μL של LB קר. דגירה אותם על הקרח במשך 2 דקות.
    3. לנער את התאים ב 37 מעלות צלזיוס, 220 סל"ד עבור 1 שעות ולאחר מכן להפיץ צלחת 100 μL על צלחת LB אגר המכיל אישורסמן לבחירה (או אמפיצילין או קנמיצין).
  7. מסך שיבוטים עבור transformants חיובי.
    1. השווה את המושבה סופרת על שליטה שלילית צלחות קשירת. יחס ספירת מושבה גדול מ 1: 2 הוא הרצוי. אם יש מספר גדול של מושבות על לוח הבקרה השלילי, לחזור לשלב 2.1 ולסקור את ההערה.
    2. בחר 4-8 מושבות בודדות (בהתאם שליטה שלילי: קשירת יחס) מכל תגובה קשירת כל הגנים השונים שהוכנסו להקרנה (1 n) ו לחסן 4 מ"ל LB ואת התרבות המתאימה אנטיביוטיקה לילה / מושבה אישית. לגדול תרבויות לילה עם רועד על 37 מעלות צלזיוס 220 סל"ד.
    3. בידוד DNA פלסמיד באמצעות ערכת בידוד DNA פלסמיד על פי פרוטוקול של היצרן.
    4. הגדרת 20 NDEI + תגובה EcoRI digest μL המכיל 150-500 ng של DNA ו 1 μL של כל אנזים עם μL 2 של חיץ 10x המתאים. בהוא מקרה, להוסיף NdeI ו EcoRI באותו זמן כי הגן של עניין יהיה בין אתרי הגבלה. שליטה שלילית עם וקטור pMGX ריק מומלץ. תקציר עבור 2 שעות ב 37 מעלות צלזיוס באמבט מים.

3. הוספת ג'ין 2 לתוך pMGX וקטור המכיל את ג 'ין 1, pMGX- yfg1

  1. הגבלת digest pMGX- yfg1 עם AvrII ולטפל עם phosphatase המעי העגל (CIP).
    1. השתמש בתגובת 40-μL digest המכיל 0.5-1.5 מיקרוגרם של DNA וקטורית (~ 5-10 μL של DNA בודד) ו 1 μL של AvrII עם 4 μL של חיץ 10x המתאים. תקציר עבור 1.5 שעות ב 37 ° C ולאחר מכן להוסיף 1.5 μL של CIP. להשאיר אותו על 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות נוספות.
  2. הגבלה digest pMGX- yfg2 עם AvrII ו XbaI לשחרר את הגן של עניין.
    1. השתמש בתגובת 40 לעכל μL המכיל 0.5-1.5 מיקרוגרם של DNA ו 1 μ, L של כל אנזים עם 4 μL של חיץ המתאים 10x. תקציר עבור 2 שעות ב 37 ° C.
  3. הגבלה אלקטרופורזה מתעכל על אחוז המתאים (0.7%) agarose ג'ל ובלו את להקות להוסיף וקטור באמצעות סכין מנתח נקי / סכין גילוח (עיין צעדים 2.2-2.3).
  4. חלץ את ה- DNA באמצעות ערכת מיצוי ג'ל בהתאם לפרוטוקול של היצרן לכמת את ה- DNA 17 .
  5. לקשור גן 2 לתוך pMGX- yfg1 באמצעות יחס 3: 1 להוסיף וקטור. הגדרת קשירת שלילי של מתעכל pMGX- yfg1 ללא הוספה נוספת. הגדר כנ"ל בשלב 2.5.
  6. המרה 5 μL של התגובות קשירת לתוך XL1 כחול כחול מוכשר כימית תאים E. coli , פלסמידים ligated pMGX- yfg1,2 (המכיל גן של עניין 1 ו -2), ושליטה שלילית pMGX- yfg1 , כפי שניתן לראות בשלב 2.6.
  7. השווה את המושבה לספור על שליטה שלילית צלחות קשירת. יחס ספירת מושבות זReater יותר מ 1: 2 הרצוי. אם יש מספר רב של מושבות על לוח הבקרה השלילי, לחזור שלב 3.1 ולסקור את הטיפול CIP.
  8. בחר 4-8 מושבות בודדות (בהתאם שליטה שלילית: יחס קשירת) מן התגובה קשירת לחסן 4 מ"ל של LB בתוספת אנטיביוטיקה המתאימה לכל מושבה הפרט לגדול בן לילה ב 37 מעלות צלזיוס 220 סל"ד.
  9. בידוד DNA פלסמיד באמצעות ערכת בידוד DNA פלסמיד על פי פרוטוקול של היצרן לכמת את ה- DNA 17 .
  10. מסך ההכנסה יעילה של הגן השני על ידי ביצוע digest הגבלה של pMGX- yfg1,2 עם EcoRI.
    1. השתמש בתגובת 20 לעכל μL המכיל 150-500 ng של DNA ו 1 μL של אנזים EcoRI עם μL 2 של חיץ EcoRI 10x. תקציר עבור 2 שעות ב 37 ° C.
  11. Electrophorese הגבלה digest על אחוז המתאים agarose ג'ל; לחפש להקה שמתאימהS לגודל הגן 2) ראה שלב 2.2 (. גן יכול להכניס לתוך הווקטור בכיוון הלא רצוי, הפוכה.

4. הוספת ג 'ין השלישי לתוך וקטור pMGX המכילים גנים 1 ו -2, pMGX- yfg1,2

  1. הגבלה digest pMGX- yfg1,2 עם AvrII ולטפל עם CIP, כפי שניתן לראות בשלב 3.1.
  2. הגבלה digest pMGX- yfg3 עם AvrII ו XbaI, כפי שניתן לראות בשלב 3.2.
  3. Electrophorese הגבלה digests על אחוז המתאים agarose ג'ל ו הבלו להוסיף ווקטור להקות באמצעות סכין מנתח נקי / סכין גילוח; עיין בשלבים 2.2-2.3.
  4. חלץ את ה- DNA מן ג'ל agarose באמצעות ערכת מיצוי ג'ל לכמת את ה- DNA 17 .
  5. לקשור גן 3 לתוך pMGX- yfg1,2 באמצעות יחס 3: 1 להוסיף וקטור ולהגדיר קשירת שלילי של מתעכל pMGX- yfg1,2 ללא הוספה נוספת, כפי שניתן לראות בשלב 3.5.
  6. המרה 5 μL של תגובות קשירת לתוך XL1-כחול מוכשר כימית תאים E. coli , ligated פלסמיד pMGX- yfg1,2,3 (המכיל גנים של עניין 1, 2, ו -3), וכן שלילי pMGX- yfg1,2 שליטה, כפי שניתן לראות בשלב 2.6.
  7. השווה את המושבה לספור על שליטה שלילית צלחות קשירת. אם יש מספר רב של מושבות על לוח הבקרה השלילי, לחזור שלב 4.1 ולסקור את הטיפול CIP.
  8. בחר 4-8 מושבות בודדות (בהתאם שליטה שלילית: יחס קשירת) מן התגובה קשירת לחסן 4 מ"ל של LB בתוספת אנטיביוטיקה המתאימה לכל מושבה הפרט; לגדול בן לילה ב 37 מעלות צלזיוס 220 סל"ד.
  9. לבודד את ה- DNA פלסמיד באמצעות ערכת בידוד DNA פלסמיד על פי פרוטוקול של היצרן.
  10. מסך ההכנסה יעילה של הגן השלישי על ידי ביצוע תקציר digest של pMGX- yfg1,2,3 עם EcoRI, כפי שניתן לראות בשלב 3.10.
  11. Electrophorese הגבלה digest על אחוז המתאים agarose ג'ל; תראהעבור להקות המתאימות לגדלים של גן 2 ו גן 3 (ראה שלב 2.2). הערה: הגן 3 יכול להכניס לתוך הווקטור בכיוון הלא רצוי, הפוכה. אם הגנים 2 ו- 3 הם באותו גודל, יש לבחור אתר אחר של עיכוב הגבלה מתאים להקרנה.
    הערה: חזור על פי הצורך בכל גן חדש.

5. הפקת חלבונים של עניין באמצעות מערכת ביטוי multigene ו הערכת הייצור על ידי סופג המערבי

  1. לשנות את שיבוט חיובי המכיל את כל הגנים של עניין לתוך מוכשר מבחינה כימית, חלבון-ייצור E. coli , כגון BL21- (λDE3).
    1. הפשרה 100 aliquots μL של BL21- מוכשר כימית (λDE3) E. coli על קרח במשך 5 דקות ולאחר מכן להוסיף 1 μL של DNA פלסמיד משובץ חיובי; דגירה במשך 30 דקות על הקרח.
    2. הלם חום התאים במשך 45 ים באמבט מים שנערך ב 42 מעלות צלזיוס ולאחר מכן להוסיף 200 μL של LB קר. דגירה על קרח במשך 2 דקות.
    3. לנער את התאים ב 37 מעלות צלזיוס 220 סל"ד במשך 1 שעות ולאחר מכן להפיץ צלחת 100 μL על צלחת LB אגר המכיל את סמן לבחירה המתאים (או ampicillin או kanamycin).
  2. להביע את החלבון על ידי איזופרופיל-β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) אינדוקציה.
    1. בחר מושבה מבודדת מן B21- (λDE3) שינוי צלחת לחסן 4 מ"ל של LB בתוספת אנטיביוטי מתאים; לגדול בן לילה, רועד על 37 מעלות צלזיוס 220 סל"ד.
    2. לחסן 100 מ"ל LB בתוספת תרבות אנטיביוטי מתאים באמצעות 1 מ"ל של תרבות לילה.
    3. לגדול ב 37 מעלות צלזיוס עם רועד ב 220 סל"ד ל 600 OD של 0.6.
    4. לעורר את התרבות עם 100 מיקרומטר IPTG ולגדול במשך 15 שעות ב 25 ° C ו 220 סל"ד.
    5. הסר 1 מ"ל של התרבות צנטריפוגה זה ב XG 13,000 במשך דקה 1; להשליך את supernatant.
  3. Lyse התאים באמצעות פתרון תמוגה לפי הוראות היצרןו preform כתם המערבי של lysate תא מסיס כדי לקבוע אם כל החלבונים הופקו בהצלחה 19 .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

במחקר זה, המטרה היתה לשיתוף חמישה חלבונים מתוך פלסמיד אחד. חמש קודון אופטימיזציה שברי גנים סינתטיים קידוד או N- או מסוף hexahistidine תגים נרכשו מסחרית. הגנים הסינתטיים היו מוגבר על ידי PCR ו משובטים בנפרד לתוך וקטור PCR-blunt ו sequenced. כדי ליצור את polycistronic פלסמיד, חמשת הגנים של עניין היו משובטים הראשון לתוך pMGX פלסמיד מתאים, pMGX-A. איור 2 מראה את PCRBlunt- yfg1 ו- PCRBlunt- yfg2 בנוסף ל- pMGX-A המעוכל ב- NDRI + EcoRI (ראה שלב 2). כדי לשכפל את שני הגנים הראשונים לתוך pMGX-A, פלסמיד היה מתעכל NDEI + EcoRI ( איור 2 ). עם שיבוט גנים של עניין לתוך pMGX-A, פלסמידים שנבנו לאחרונה, המיועדים pMGX- yfg1 ו pMGX- yfg2 , היו מתעכל עם אברי + XbaI כדי לאשר שיבוטים מוצלחים התקבלו, כמושמוצג ב 1.1 קילו ו 1.3-Kb להקות שהושגו באיור 3 .

איור 2
איור 2: שיבוט של פלסמידים pMGX. התוצאות הצפויות של PCR- blunt פלסמידים המכילים yfg1 ו yfg2 לאחר עיכול עם NdeI + EcoRI מוצגים על ג'ל agarose 0.7% (110 V, 55 דקות). נתיב 1, 1 kb סולם DNA; נתיב 2, PCRBlunt- yfg1 ; נתיב 3, PCRBlunt- yfg2 ; נתיב 4, pMGX-A שליטה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3
איור 3: הקרנה של pMGX- yfg1 ו- pMGX- yfg2. ג 'ל agarose 0.7% (110 V, 55 דקות) מראה שתי להקות שנוצרו על ידי שניהם pMGX- yfg1 ו pMGX- yfg2 לאחר עיכול עם AvrII + XbaI. נתיב 1, 1-kb סולם DNA; נתיב 2, pMGX- yfg1 ; נתיב 3, pMGX- yfg2 ; נתיב 4, pMGX-A שליטה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

עם שני הגנים של וקטור pMGX המתאים, הפלסמיד polycistronic נבנה. כדי ליצור את פלסמיד pMGX- yfg1,2 , pMGX- yfg1 היה מתעכל עם AvrII, כפי שמוצג באיור 4 . PMGX- yfg2 היה מתעכל עם אברי + XbaI, ואת 1.3-Kb גן המכיל את השבר היה ligated לתוך האתר AvrII של ליניארי pMGX- yfg1 , הפקת pMGX- yfg1,2 . עיכול של pMGX- yfg1,2 עם EcoRI אישר שיבוט מוצלח של פלסמיד הרצוי והוא מוצג ב> איור 5.

איור 4
איור 4: יצירת picistronic פלסמיד pMGX- yfg1,2. 0.7% agarose ג'ל אלקטרופורזה תוצאות (110 V, 55 דקות) של pMGX- yfg1 מתעכל עם AvrII ו pMGX- yfg2 מתעכל עם אברי + XbaI. נתיב 1, 1-kb סולם DNA; נתיב 2, pMGX- yfg1 מתעכל עם AvrII; נתיב 3, pMGX- yfg2 מתעכל עם AvrII + XbaI; נתיב 4, pMGX-A שליטה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 5
איור 5: הקרנת pMGX- yfg1,2 שיבוטים . וכתוצאה מכך ג'ל agarose 0.7% (110 V, 55 דקות) של pMGX- yfG1,2 שיבוטים מתעכל עם EcoRI מוצג. שיבוטים מוצלחים יפיק שתי להקות, אחת עבור yfg2 הגן שהוכנס והשני המתאים עמוד השדרה + yfg1 ( pMGX-yfg1 ). נתיב 1, 1 kb סולם DNA; נתיב 2, pMGX- yfg1,2 מתעכל עם EcoRI, שיבוט 1; נתיב 3, pMGX- yfg1,2 מתעכל עם EcoRI, clone 2; נתיב 4, pMGX-A שליטה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

כאשר מייצרים פלסמיד polycistronic המכיל שני גנים או יותר, אפשר להיתקל החדרת הפוך רצוי של הגן משובטים לאתר AvrII. איור 6 הוא ג'ל המדגיש את ההבדל בין התוצאות של פלסמיד מתעכל עם גן מוכנס בכיוון הנכון לעומת הגן מוכנס בכיוון בכיוון הפוך. אם הגן הואLigated ו משובטים באוריינטציה לא רצויה, האתר EcoRI בסוף הגן יוכנס ממש ליד האתר EcoRI של הגן הקודם. זה יניב גודל שבר, כי הוא כמעט בלתי ניתן לגילוי על ידי ג'ל אלקטרופורזה ג'ל (פחות מ 50 BP). בנוסף, הגן האחרון שהוכנס יופיע בעמוד השדרה, אשר ניתן לזהות בקלות בגלל גודל עמוד השדרה להיות גדול מהצפוי. ההבדל בגודל עמוד השדרה מהגודל הצפוי יציין את גודלו של הגן האחרון שהוכנס.

איור 6
איור 6: הקרנה של שיבוטים pMGX- yfg1-5 . ג'ל agarose 1.3% (110 V, 65 דקות) המתארים את התוצאות של pMGX- yfg1-5 מתעכל עם EcoRI מוצג. שיבוטים מוצלחים (נתיב 2) יפיק להקה המתאימה לגן שהוכנס לאחרונה ( yfg5 במקרה זה, 1.1 kb). לאןE 1, 1-kb סולם DNA; נתיב 2, שיבוט חיובי של pMGX- yfg1-5, מתעכל עם EcoRI; מסלול 3, שיבוט שלילי של pMGX- yfg1-5, מתעכל עם EcoRI; נתיב 4, pMGX- yfg1-4 שליטה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

כדי להשלים את חמשת גנים ביטוי polycistronic וקטור, שלושת הגנים הנותרים היו משובטים בזה אחר זה לתוך pMGX- yfg1,2 כדי ליצור pMGX- yfg1-5 (ראה שלב 5). פלסמיד זה הפך לאחר מכן לתוך BL21- (λDE3), ואת הביטוי של החלבונים היה המושרה בתרבות שלב באמצע יומן על ידי תוספת של IPTG. איור 7 הוא כתם המערבי של lysates התא, המאשר כי כל חמש חלבונים מ פלסמיד יחיד המכיל גנים מרובים אופרון אחד יכול לבוא לידי ביטוי. הביטוי של pMGX- yfg1 (המכיל 1 גן),PmGX- yfg1,2 (המכיל 2 גנים), ו- pMGX- yfg1-5 (המכיל 5 גנים) מוצגים.

איור 7
איור 7: ניתוח כתם המערבי של ביטוי רב גנים באמצעות מערכת pMGX. שילוב של N או C- מסוף hexahistidine תגים מופעלת איתור כתם המערבי של ביטוי חלבון. הדגימות הופרדו על טרום יצוק 4-20% מדורג נטול זן acrylamide זן (200 V, 35 דקות, 10 ס"מ x 8.5 ס"מ), ולאחר מכן העברה (40 V, 90 דקות) על קרום nitrocellulose (0.45 מיקרומטר, 10 ס"מ x 7 ס"מ). נוגדן חד-נוגדני של HRP-מצומדות, שאינו דורש נוגדנים משניים, נמצא בשימוש. חסימה, העברה, דילול נוגדנים הוכנו כפי שהומלץ על ידי היצרן נוגדנים. גילוי בוצע עם המצע המערבי Chemiluminescent HRP בעקבות של היצרןמבנים. הקרום שהתקבל היה דמיינו באמצעות imager ללא מסנן. נתיב 1, תקן צבע כפול הועבר על הממברנה (לא chemiluminescent); נתיב 2, His6pMGX- yfg1 ; מסלול 3, His6pMGX- yfg1,2 ; ליין 4, His6pMGX- yfg1-5. הערה: חלבון המיוצר על ידי yfg5 הוא באותו גודל כמו חלבון המיוצר על ידי yfg1 (שניהם 36 kDa) ולא ניתן להפריד על הג'ל. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

נתונים משלימים: אנא לחץ כאן להורדת הקובץ.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

ביטוי משותף של גנים מרובים הוא חיוני יותר ויותר, במיוחד באפיון מחדש מסלולים מורכבים, multigene מטבולי 3 , 4 , 5 . מערכת pMGX עושה ביטוי multigene שיתוף ב E. קולי שגרת 6 , 7 , 8 ונגיש לחוקרים מגוונים. במחקר זה, חמישה חלבונים של עניין הוצגו להיות מופק בו זמנית ממערכת פלסמידית אחת באמצעות pMGX-A. הרבה מערכות ביטוי ביטוי זמין כרגע רק לאפשר החדרת שני גנים, יצירת פלסמידים bicistronic כגון וקטורים PET Duet 12 . אם אחד דורש תוספת של גנים נוספים, וקטורים bicistronic מרובים עם סמנים לבחירה שונים נדרשים. בניגוד למערכות ביטוי multigene אחרות, מערכת pMGX מאפשרת שיבוט פייסילישל מספר גנים לתוך פלסמיד אחד, עם היכולת לעשות שימוש חוזר באתרי הגבלה ללא צורך פלסמידים התורם שונים או להסרת מספר רב של אתרי אנזים הגבלה מן הגנים 13 , 14 . צעדים קריטיים בפרוטוקול זה כוללים תכנון גנים, מניעת recircularization רקע של וקטורים pMGX מתעכל יחיד, ומסכים של וקטורים polycistronic עבור כיוון הנכון של הגן מוכנס.

בתכנון אסטרטגיית שיבוט לבניית מערכת polycistronic, זה חיוני כדי להבטיח כי הגנים של עניין אינם מכילים אתרי הגבלה הנדרשים שיבוט במורד הזרם. בפרט, אלה כוללים XbaI ו AvrII, אשר נדרשים להחדרת גנים השני ואחריו לתוך וקטור pMGX המכיל את הגן הראשון של עניין (שלבים 3 ו -4). בנוסף, חיוני לחסל אתרי הגבלה שישמשו לשיבוט הראשוני של gEnes של עניין לתוך pMGX (שלב 2). בדרך כלל, אלה כוללים NdeI או NheI בסוף 5 'של הגן BamHI או EcoRI בסוף 3' של הגן, אם כי אתרי הגבלה אחרים יכולים לשמש גם בשלב זה, במידת הצורך. חיסול של אתרי הגבלה נוספים, לא רצויים ניתן לבצע בקלות בשלב סינתזה הגן או, במקרה של גנים משובטים ממקורות אחרים, על ידי תחליפים נוקליאוטידים נרדף באמצעות mutagenesis מכוונת האתר 20 .

תוספת של גנים הבאים של עניין לתוך pMGX המכיל את הגן הראשון של עניין דורש linearization של pMGX- yfg1 עם AvrII (שלב 3.1, שים לב כי זה יכול להיות גם linearized עם XbaI). זה וקטור לינארית יהיה במהירות religate במהלך החדרת הגן השני של עניין (שלב 3.5), המוביל למספר גבוה מאוד של שיבוטים ברקע. כדי למנוע זאת, חשוב לטפל וקטור לינארית עם phosphatase כדי dephosphorylate 52; הקצוות של וקטור לינארי. בדרך כלל, CIP משמש, אם כי אחרים זמינים. אופטימיזציה של שתי יחידות phosphatase ואת זמן הדגירה עשוי להיות נחוץ כדי לייעל את ligations של גנים הבאים של עניין לתוך וקטור לינארי.

לבסוף, בעת יצירת מערכת polycistronic, הגן של העניין הוא נכרת בתחילה על ידי עיכול עם XbaI ו AvrII, יצירת הקצוות מלוכדות משלימה על 5 'ו' 3 'הקצוות של הגן (שלבים 3.2 ו 4.2). זה יכול להיות ligated ligated לתוך וקטור ליניארי בכיוון קדימה או לאחור. כמו כל הקצוות מלוכדות זהים, אין כיווניות נאכף באמצעות חישול משלים של הקצוות מלוכדת. לכן יש צורך לסנן את שיבוטים וכתוצאה מכך בכיוון ההכנסה הנכון של הגן המעניין. זה יכול להיעשות בקלות על ידי שיבוטים הקרנה עם אחד האתרים הגבלה המשמש לשכפל את הגן המקורי של עניין לתוך pMGX (שלב 2). בדרך כלל,EcoRI משמש, כמו אתר ההגבלה הוא בקצה 3 'של הגן, ולכן הוא מתאים המסך עבור כיווניות, כפי שמוצג באיור 6 . ברוב המקרים, 50% של שיבוטים המכילים את הגן של עניין יש הגן בכיוון הנכון ו 50% יש את הגן בכיוון ההפוך.

לעתים רחוקות (~ 10% של ligations), כל שיבוטים מן קשירת מסוים עשוי להיות הגן של עניין מוכנס רק בכיוון אחד. תוצאה זו נראה תלוי רצף, שכן הוא לשחזור מאוד במקרים ספציפיים אלה. אם זה קורה, ואת הגן של עניין הוא מוסיף ברציפות בכיוון ההפוך, וקטור הרצוי בדרך כלל ניתן לגשת על ידי החלפת כיוון שיבוט. לדוגמה, במקום שיבוט yfg2 לתוך האתר AvrII של pMGX- yfg1 , yfg1 ניתן לשכפל לתוך האתר XbaI של pMGX- yfg2 . שים לב כי זה נותן את הקטור הסופי זההמערכת. גמישות נוספת זו המאפשרת גישה לאותה מערכת משיטות שיבוט שונות היא יתרון רב.

מגבלה חשובה של מתודולוגיה זו היא כי החלבונים המקודדים בקצה 3 'של התעתיק polycistronic בדרך כלל באים לידי ביטוי ברמות נמוכות יותר מאשר חלבונים מקודדים בסוף 5' של תמליל, ואת האפקט הזה בולט עוד את התעתיק הוא יותר . משמעות הדבר היא ששינוי סדר הגנים של עניין באופרון הסינתטי עלול להשפיע על רמות הביטוי היחסי של החלבונים שהם מקודדים, ומספקים מנגנון לכוונון עדין של רמות הביטוי היחסי.

לסיכום, מערכת pMGX מספק שיטה אמינה עבור ביטוי משותף של חלבונים מרובים מ פלסמיד בודד ב E. coli , אשר ניתן להשתמש עבור מגוון רחב של יישומים ביולוגיה סינתטית לאפיון מסלול ביוכימי.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין מה לגלות.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי מדעי הטבע והנדסה מועצת המחקר של קנדה.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Enzymes
Alkaline Phosphatase, Calf Intestinal (CIP) New England Biolabs M0290S
AvrII New England Biolabs R0174S
EcoRI New England Biolabs R0101S
NdeI New England Biolabs R0111S
XbaI New England Biolabs R0145S
Herculase II Fusion DNA Polymerase Agilent Technologies 600677
T4 DNA Ligase New England Biolabs M0202S
Name Company Catalog Number Comments
Reagents
1 kb DNA ladder New England Biolabs N3232L
4-20% Mini-PROTEAN TGX Stain-Free Protein Gels Bio-Rad 456-8095
50x TAE Fisher Thermo Scientific BP1332-4
Agar Fisher Thermo Scientific BP1423-500
Agarose Fisher Thermo Scientific BP160-500
Ampicilin Sigma-Alrich A9518-5G
BL21 (DE3) chemically comeptent cells Comeptent cell prepared in house
B-PER Bacterial Protein Extraction Reagent Fisher Thermo Scientific PI78243
dNTP mix Agilent Technologies Supplied with polymerase
Gel Extraction Kit Omega D2500-02 E.Z.N.A Gel Extraction, supplied by VWR Cat 3: CA101318-972
Glycine Fisher Thermo Scientific BP381-1
His Tag Antibody [HRP], mAb, Mouse GenScript A00612
Immobilon Western Chemiluminescent HRP Substrate EMD Millipore WBKLS0100
IPTG Sigma-Alrich 15502-10G
LB Fisher Thermo Scientific BP1426-500
Methanol Fisher Thermo Scientific A411-20
Pasteurized instant skim milk powder Local grocery store No-name grocery store milk is adequate
Nitrocellulose membrane Amersham Protran (GE Healthcare Life Sciences) 10600007 Membrane PT 0.45 µm 200 mm x 4 m, supplied by VWR Cat #: CA10061-086
Plasmid DNA Isolation Kit Omega D6943-02 E.Z.N.A Plasmid DNA MiniKit I, supplied by VWR Cat #: CA101318-898
pMGX Boddy Lab Request from the Boddy Lab Contact cboddy@uottawa.ca
Primers Intergrated DNA Technologies Design primers as needed for desired gene
Synthetic Gene Life Technologies Design and optimize as needed
Thick Blot Filter Paper Bio-Rad 1703932
Tris base BioShop TRS001.1
Tween-20 Sigma-Alrich P9416-50ML
XL1-Blue chemically competent cells Comeptent cell prepared in house
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
BioSpectrometer Eppendorf RK-83600-07
Gel box - PAGE Bio-Rad 1658005 Mini-PROTEIN Tetra Vertical Electrophoresis Cell
Gel Imager Alpha Innotech AlphaImager EC
Incubator-oven Fisher Thermo Scientific 11-690-650D Isotemp
Incubator-shaker Fisher Thermo Scientific SHKE6000-7 MaxQ 6000
Personna Razors Fisher Thermo Scientific S04615
Power Pack Bio-Rad S65533Q FB300
Transilluminator VWR International M-10E,6W
Thermocylcer Eppendorf Z316091 Mastercycler Personal, supplied by Sigma
UV Face-Shield 18-999-4542
Waterbath Fisher Thermo Scientific 15-460-2SQ
Western Transfer Apparatus Bio-Rad 1703935 Mini-Trans Blot Cell

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Purnick, P. E. M., Weiss, R. The second wave of synthetic biology: from modules to systems. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10 (6), 410-422 (2009).
  2. Bieniossek, C., et al. Automated unrestricted multigene recombineering for multiprotein complex production. Nat. Methods. 6 (6), 447-450 (2009).
  3. Jochimsen, B., et al. Five phosphonate operon gene products as components of a multi-subunit complex of the carbon-phosphorus lyase pathway. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 108 (28), 11393-11398 (2011).
  4. Martin, V. J. J., Pitera, D. J., Withers, S. T., Newman, J. D., Keasling, J. D. Engineering a mevalonate pathway in Escherichia coli for production of terpenoids. Nat. Biotechnol. 21 (7), 796-802 (2003).
  5. Ajikumar, P. K., et al. Isoprenoid pathway optimization for Taxol precursor overproduction in Escherichia coli. Science. 330 (6000), 70-74 (2010).
  6. Boddy, C. N., Hotta, K., Tse, M. L., Watts, R. E., Khosla, C. Precursor-directed biosynthesis of epothilone in Escherichia coli. J. Am. Chem. Soc. 126 (24), 7436-7437 (2004).
  7. Lundgren, B. R., Boddy, C. N. Sialic acid and N-acyl sialic acid analog production by fermentation of metabolically and genetically engineered Escherichia coli. Org. Biomol. Chem. 5 (12), 1903-1909 (2007).
  8. Horsman, M. E., Lundgren, B. R., Boddy, C. N. N-Acetylneuraminic Acid Production in Escherichia coli Lacking N-Acetylglucosamine Catabolic Machinery. Chem. Eng. Commun. 203 (10), 1326-1335 (2016).
  9. Romier, C., et al. Co-expression of protein complexes in prokaryotic and eukaryotic hosts: experimental procedures, database tracking and case studies. Acta Crystallogr. D, Biol. Crystallogr. 62 (Pt 10), 1232-1242 (2006).
  10. Tolia, N. H., Joshua-Tor, L. Strategies for protein coexpression in Escherichia coli. Nat. Methods. 3 (1), 55-64 (2006).
  11. Chanda, P. K., Edris, W. A., Kennedy, J. D. A set of ligation-independent expression vectors for co-expression of proteins in Escherichia coli. Protein Expr. Purif. 47 (1), 217-224 (2006).
  12. Kim, K. -J., et al. Two-promoter vector is highly efficient for overproduction of protein complexes. Protein Sci. 13 (6), 1698-1703 (2004).
  13. Tan, S., Kern, R. C., Selleck, W. The pST44 polycistronic expression system for producing protein complexes in Escherichia coli. Protein Expr. Purif. 40 (2), 385-395 (2005).
  14. Chen, X., Pham, E., Truong, K. TEV protease-facilitated stoichiometric delivery of multiple genes using a single expression vector. Protein Sci. 19 (12), 2379-2388 (2010).
  15. Lorenz, T. C. Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. J. Vis. Exp. (63), e3998 (2012).
  16. Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. -Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. J. Vis. Exp. (62), (2012).
  17. Sukumaran, S. Concentration determination of nucleic acids and proteins using the micro-volume BioSpec-nano-spectrophotometer. J. Vis. Exp. (48), (2011).
  18. JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Molecular Cloning. J. Vis. Exp. , Available from: https://www.jove.com/science-education/5074/molecular-cloning (2016).
  19. JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. The Western Blot. J. Vis. Exp. , Available from: https://www.jove.com/science-education/5065/the-western-blot (2016).
  20. Laible, M., Boonrod, K. Homemade site directed mutagenesis of whole plasmids. J. Vis. Exp. (27), (2009).

Tags

גנטיקה גיליון 124 ביולוגיה סינתטית ביוכימיה ביטוי multigene אופטון סינתטי polycistronic פולימרז T7 RNA DNA פלסמיד.
T7 RNA פולימראז בתיווך Multigene הביטוי מערכת, pMGX
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hassan, M. I., McSorley, F. R.,… More

Hassan, M. I., McSorley, F. R., Hotta, K., Boddy, C. N. Inducible T7 RNA Polymerase-mediated Multigene Expression System, pMGX. J. Vis. Exp. (124), e55187, doi:10.3791/55187 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter