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Genetics

Inducible T7 आरएनए पोलीमरेज़ मध्यस्थता बहुउद्देशीय अभिव्यक्ति प्रणाली, पीएमजीएक्स

Published: June 27, 2017 doi: 10.3791/55187
Automatic Translation
*1, *1, 2, 1
1Department of Chemistry and Biomolecular Sciences, University of Ottawa, 2School of Biosciences, The University of Nottingham Malaysia Campus
* These authors contributed equally

Summary

यह अध्ययन पीएमजीएक्स प्लाज्मिड सिस्टम का उपयोग कर एस्चेरिशिया कोली में एक प्लाज्मिड से कई जीनों की टी 7-मध्यस्थता सह-अभिव्यक्ति के तरीकों का अध्ययन करता है।

Abstract

प्रोटीन-प्रोटीन परिसरों का अध्ययन करते हुए, और बायोसिंथेटिक मार्गों को चित्रित करने और उनका उपयोग करने के लिए सिंथेटिक जीव विज्ञान के लिए कई प्रोटीनों की सह-अभिव्यक्ति बढ़ती जा रही है। इस पांडुलिपि में, एक inducible T7 आरएनए पोलीमरेज़ के नियंत्रण के तहत multigene सिंथेटिक ऑपरेशन के निर्माण के लिए एक अत्यधिक प्रभावी प्रणाली का उपयोग किया गया है। यह प्रणाली कई जीनों को एक प्लाज्मिड से एक साथ व्यक्त करने की अनुमति देती है। यहां, चार संबंधित वैक्टरों, पीएमजीएक्स-ए, पीएमजीएक्स-एएमए, पीएमजीएक्स-के, और पीएमजीएक्स-एचके, का एक समूह एम्पीसिलिन या कनामीसिन प्रतिरोध चयन चिह्नक (ए और के) के साथ और एन-टर्मिनल हेक्साइस्टिडाइन टैग (उसका) खुलासा कर रहे हैं। इस सदिश प्रणाली का उपयोग करने वाले सिंथेटिक ऑपरेशन के निर्माण के लिए विस्तृत प्रोटोकॉल इसी डेटा के साथ उपलब्ध कराए जाते हैं, यह दर्शाता है कि एक पीएमजीएक्स आधारित प्रणाली जिसमें पांच जीनों का निर्माण किया जा सकता है, आसानी से बनाया जा सकता है और एस्चेरिशिया कोली में सभी पांच एन्कोडेड प्रोटीनों का उत्पादन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। यह सिस्टEm और प्रोटोकॉल में शोधकर्ताओं को नियमित रूप से ई। कोलाई में जटिल बहु-घटक मॉड्यूल और मार्गों को व्यक्त करने के लिए सक्षम बनाता है।

Introduction

कई प्रोटीनों की सह-अभिव्यक्ति अत्यधिक आवश्यक है, विशेष रूप से सिंथेटिक जीव विज्ञान के अनुप्रयोगों में, जहां कई कार्यात्मक मॉड्यूल 1 व्यक्त किए जाने चाहिए; प्रोटीन-प्रोटीन परिसरों का अध्ययन करने में, जहां अभिव्यक्ति और फ़ंक्शन को अक्सर सह अभिव्यक्ति की आवश्यकता होती है 2 , 3 ; और बायोसिंथेटिक मार्गों को वर्णित और दोहन में, जहां मार्ग में प्रत्येक जीन 4 , 5 , 6 , 7 , 8 व्यक्त की जानी चाहिए। सह-अभिव्यक्ति के लिए कई प्रणालियां विकसित की गई हैं, खासकर मेजबान जीव Escherichia कोली में , प्रयोगशाला पुनः संयोजक प्रोटीन अभिव्यक्ति 9 के लिए कार्य घोड़ा उदाहरण के लिए, अलग-अलग चयनकर्ता मार्करों के साथ कई प्लास्मिड को अलग-अलग एक्स के धन का प्रयोग करने के लिए व्यक्तिगत प्रोटीनों को व्यक्त करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है प्रेस वैक्टर 10 , 11 कई प्रोटीन की अभिव्यक्ति के लिए सिंगल प्लाज्मिड सिस्टम ने प्रत्येक जीन 10 , 12 की अभिव्यक्ति को नियंत्रित करने के लिए कई प्रमोटरों का उपयोग किया है; सिंथेटिक ऑप्टोन्स, जहां कई जीनों को एकल ट्रांसक्रिप्ट 2 , 13 पर एन्कोड किया गया है; या, कुछ मामलों में, एक एकल जीन एक पॉलीपेप्टाइड एन्कोडिंग जो अंततः प्रोटीयोलाइटिक रूप से संसाधित होता है, ब्याज की वांछित प्रोटीन 14 देता है ।

आकृति 1
चित्रा 1: पीएमजीएक्स वर्कफ़्लो एक पॉलीसिस्टोनिक वेक्टर का निर्माण दिखा रहा है। पीएमजीएक्स प्रणाली एक अनुमोदित T7 प्रमोटर के नियंत्रण में सिंथेटिक ऑपरेशन के निर्माण के लिए एक लचीली, आसान उपयोग वाली रणनीति प्रदान करती है।E.com/files/ftp_upload/55187/55187fig1large.jpg "target =" _ blank "> कृपया इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए यहां क्लिक करें।

इस पांडुलिपि में, एक inducible T7 आरएनए पोलीमरेज़ ( चित्रा 1 ) के नियंत्रण के तहत multigene सिंथेटिक ऑपरेशन के निर्माण के लिए एक अत्यधिक प्रभावी प्रणाली का उपयोग वर्णित है। यह प्रणाली कई जीनों को एक प्लाज्मिड से एक साथ व्यक्त करने की अनुमति देती है। यह एक प्लाज्मिड प्रणाली पर आधारित है, मूल रूप से pKH22 कहा जाता है, जो कई अलग-अलग 6 , 7 , 8 अनुप्रयोगों के लिए सफलतापूर्वक उपयोग किया गया है। यहां, इस प्लाज्मिड सेट को चार संबंधित वैक्टरों में शामिल करने के लिए विस्तारित किया गया है: पीएमजीएक्स-ए, एक अभिव्यक्ति वेक्टर जिसमें सी- या एन-टर्मिनल टैग की कमी है और एम्पीसिलीन प्रतिरोध मार्कर; पीएमजीएक्स-एचआईए, एक अभिव्यक्ति वेक्टर एन-टर्मिनल हेक्साहिस्टिडाइन टैग एन्कोडिंग और ampicillin प्रतिरोध मार्कर के साथ; पीएमजीएक्स-के, एक अभिव्यक्ति वेक्टर एलकिसी भी सी- या एन टर्मिनल टैग और कनामीसिन प्रतिरोध मार्कर के साथ; और पीएमजीएक्स-एचके, एक अभिव्यक्ति वेक्टर एन-टर्मिनल हेक्साहिस्टिडाइन टैग एन्कोडिंग और कनामीसिन प्रतिरोध मार्कर के साथ। इस अध्ययन में, पीएमजीएक्स प्रणाली का इस्तेमाल करते हुए पांच जीन वाला पॉलीसिस्टोनिक वेक्टर पैदा करने की विधि, विशेष रूप से पीएमजीएक्स-ए, एस्चेरिशिया कोली में प्रत्येक व्यक्ति के प्रोटीन के सफल उत्पादन के साथ प्रदर्शित होती है।

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Protocol

1. ब्याज की जीन प्राप्त करना

  1. डिजाइन सिंथेटिक जीन
    1. ई। कोली अभिव्यक्ति के लिए एक जीन अनुक्रम को ऑप्टिमाइज़ करें।
    2. अनुक्रम (एआरआरआईआई, एनडीआई, इकोआरआई, और एक्सबीआई) से किसी भी समस्याग्रस्त प्रतिबंध साइटों को निकालें।
    3. क्लोनिंग के लिए प्रतिबंध साइट शामिल करना; एक 5'-एनडीआई साइट और एक 3'-ईकोआरआई साइट की सिफारिश की जाती है। अन्य साइटों का उपयोग किया जा सकता है, यदि आवश्यक हो; चयनित प्लाज्मिड ( चित्रा S1 -S4 ) के multicloning क्षेत्र को देखें यदि वांछित है, तो पश्चिमी ब्लॉट पहचान के लिए 5 'या 3' एन्कोडिंग टैग शामिल करें।
    4. व्यावसायिक रूप से डिज़ाइन किए गए जीन को ऑर्डर करें
    5. निर्माता के निर्देशों के मुताबिक, एक कुंद क्लोनिंग किट का उपयोग करके एक कुंद सदिश में जीन क्लोन को क्लोन बनाता है; जीन को बढ़ाने के लिए डिजाइन प्राइमरों (फिर चरण 1.2.2 पर आगे बढ़ें); या पीएमजीएक्स प्लाज्मिड में सीधा क्लोनिंग के लिए अतिरिक्त 5 'और 3' समाप्त होता है और चरण 2 पर आगे बढ़ें। यहां, वेंई प्रतिनिधि परिणाम हित के जीनों को क्लोनिंग से कुंद करना है।
  2. वांछित जीन को बढ़ाना (इच्छित और आनुपातिक सिंथेटिक जीन से या इच्छित जीन युक्त टेम्पलेट डीएनए से) 15 ।
    1. क्लोनिंग के लिए प्रतिबंध साइटों के साथ डिजाइन प्राइमरों; एक 5'-एनडीआई साइट और एक 3'-ईकोआरआई साइट की सिफारिश की जाती है। अन्य साइटों का उपयोग किया जा सकता है, यदि आवश्यक हो; चयनित प्लाज्मिड ( चित्रा S1 -S4 ) के multicloning क्षेत्र को देखें यदि वांछित है, तो पश्चिमी ब्लॉट पहचान के लिए 5 'या 3' एन्कोडिंग टैग शामिल करें।
    2. पीसीआर वांछित जीन 15 को बढ़ाना
    3. Agarose जेल वैद्युतकणसंचलन 16 द्वारा पीसीआर का विश्लेषण
    4. अगर अनिश्चित प्रवर्धन होता है, तो जेल निष्कर्षण द्वारा प्रवर्धित जीन को साफ करें। यदि नहीं, तो एंजाइम क्लीन अप किट का उपयोग करें
    5. शोषक जांच करके स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करके डीएनए को बढ़ाएंई पर 260 एनएम; अलौकिक बफर 17 के साथ रिक्त

2. मल्टीजीन एक्सप्रेशन सिस्टम वेक्टर में पीएमजीएक्स 18 में ब्याज की क्लोनिंग जीन

  1. प्रतिबंध एनडीआई और इकोआरआई के साथ ब्याज की प्राप्त जीन और वांछित वेक्टर, पीएमजीएक्स को पचाने के लिए।
    नोट: यदि पुनर्जन्मित प्लास्मिड की एक बड़ी मात्रा प्राप्त की जाती है, तो एनडीआई प्रतिक्रिया को इकोआरआई जोड़ने से पहले 1 घंटे के लिए आगे बढ़ने की अनुमति दें।
    1. उचित 10x बफर के 4 μL के साथ प्रत्येक एंजाइम के 0.5-1.5 माइक्रोग्राम डीएनए और 1 μL युक्त 40 μL डाइजेस्ट प्रतिक्रिया का प्रयोग करें।
    2. एक एनडीआई और इकोआरआई डाइजेस्ट के लिए, इकोआरआई बफर का इस्तेमाल करें और पहले एनडीआई एंडोन्यूक्लेज़ जोड़ें। डाइजेस्ट के लिए 1 घंटे 37 डिग्री सेल्सियस फिर EcoRI endonuclease जोड़ें, और डाइजेस्ट को एक अतिरिक्त घंटे के लिए आगे बढ़ने की अनुमति दें एनडीआई डीएनए की समाप्ति के करीब स्थित दरारों के प्रति संवेदनशील है, इसलिए इकोआरआई द्वारा प्रारंभिक पाचन एनडीआई द्वारा प्रभावी पाचन को रोका जा सकता है।
  2. electrAgarose जेल (1 केबी जीन के लिए) पर प्रतिबंध डाइजेस्ट का पर्दाफाश, जीन के आकार के लिए agarose जेल का प्रतिशत चुनने के लिए, 110 मिनट के लिए 55 मिनट में 0.7% agarose जेल का उपयोग करें, संदर्भ 16 का संदर्भ लें।
  3. एक्साइज डाइक्ट और वेक्टर बैंड, जो एक क्लीन स्केलपेल या रेजर ब्लेड का उपयोग करते हैं और एक्ज़िटेड जेल सेगमेंट को 1.5 एमएल ट्यूब में रखें।
  4. निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार जेल निष्कर्षण किट का उपयोग कर agarose जेल से डीएनए निकालें।
  5. 3: 1 डाइक्ट-टू-वेक्टर अनुपात का उपयोग करके पीएमजीएक्स वेक्टर में ब्याज की जीन को लगीं; डालने के बिना पचा पीएमजीएक्स की एक नकारात्मक बाघ स्थापित करें
    1. टी 4 डीएनए लैगेज के 1 μL, वेक्टर डीएनए (~ 5 μL) का 0.15-0.5 माइक्रोग्राम, और 3: 1 डाइक्ट-टू-वेक्टर अनुपात और आकार के आधार पर एक उचित मात्रा में 20 μL बंधात्मक प्रतिक्रिया सेट करें जीन डाला जा रहा है; पीएमजीएक्स के सीधा आकार 5,312 और 5,504 बीपी आकार के बीच हैं। एक नकारात्मक नियंत्रण प्रतिक्रिया शामिल करें जिसमें सब कुछ बू शामिल होटी जीन डाला जा रहा है। सुनिश्चित करें कि वेक्टर डीएनए की मात्रा नकारात्मक नियंत्रण ligation और वेक्टर प्लस डालने ligation प्रतिक्रियाओं में बराबर है।
  6. एक्सएल 1-ब्लू के रासायनिक रूप से सक्षम ई। कोलाई कोशिकाओं और ligated plasmids pMGX- yfg1 (ब्याज 1 के जीन युक्त), पीएमजीएक्स- yfg2 (ब्याज 2 के जीन युक्त) में ligation प्रतिक्रियाओं को बदलें ... पीएमजीएक्स- वाईफग्न (ब्याज एन के जीन युक्त)। सड़न रोकनेवाला तकनीक का उपयोग करें (एक जैव सुरक्षा कैबिनेट के अंदर या एक लौ के नीचे)
    1. 5 मिनट के लिए कृत्रिम सक्षम एक्सएल 1-ब्लू ई। कोली के 100 μL अल्कोट्स को पिघलते हैं और फिर 5 μL लगीकरण प्रतिक्रियाओं को जोड़ें। बर्फ पर 30 मिनट के लिए सेते हैं।
    2. 42 डिग्री सेल्सियस पर आयोजित जल स्नान में 45 सेकंड के लिए कोशिकाओं को गर्मी-झटका और 200 μL ठंडा एलबी। उन्हें 2 मिनट के लिए बर्फ पर सेते हैं
    3. 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को हिलाएं, 1 घंटे के लिए 220 आरपीएम और फिर एक एलबी-एगर प्लेट में फैल प्लेट 100 μL तक पहुंचें जिसमें एपीप्राचीन चयनकर्ता मार्कर (या तो एम्पीसिलीन या कनामाईसीन)।
  7. सकारात्मक ट्रांसफॉर्मेंट के लिए क्लोन को स्क्रीन करें
    1. नकारात्मक नियंत्रण और लगीकरण प्लेटों पर कॉलोनी की संख्या की तुलना करें। 1: 2 से अधिक का कॉलोनी गिनती अनुपात वांछित है यदि नकारात्मक नियंत्रण प्लेट पर बड़ी संख्या में कॉलोनियां हैं, तो चरण 2.1 पर वापस जाएं और नोट की समीक्षा करें।
    2. स्क्रीनिंग (1 एन) के लिए डाली जाने वाली विभिन्न जीन की प्रत्येक ligation प्रतिक्रिया से 4-8 अलग-अलग कॉलोनियों (नकारात्मक नियंत्रण के आधार पर) का चयन करें और 4 एमएल एलबी और उचित एंटीबायोटिक रातोंरात संस्कृति / व्यक्तिगत कॉलोनी टीका लगाना। 37 डिग्री सेल्सियस और 220 आरपीएम पर झटकों के साथ रात भर संस्कृतियां बढ़ाएं।
    3. निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार एक प्लाज्मिड डीएनए अलगाव किट का उपयोग करके प्लाज्मिड डीएनए को अलग करें।
    4. उचित 10x बफर के 2 μL के साथ 20 μL एनडीआई + ईकोआरआई डाइजेस्ट रिएक्शन, जिसमें 150-500 एनजी डीएनए और प्रत्येक एंजाइम के 1 μL युक्त सेट करें। वें मेंमामला है, एक ही समय में एनडीआई और इकोआरआरआई को जोड़ दें कि प्रतिबंध साइटों के बीच ब्याज की जीन होगी। खाली pMGX वेक्टर के साथ एक नकारात्मक नियंत्रण की सिफारिश की है। पानी के स्नान में 37 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे के लिए डाइजेस्ट

3. पीएमजीएक्स वेक्टर युक्त जीन 1 में जीन 2 डालने, पीएमजीएक्स- वाईफग 1

  1. प्रतिबंध डाइजेस्ट पीएमजीएक्स- वाईफग 1 एआरआरआईआई के साथ और बछड़ा आंत्र फास्फेटेज (सीआईपी) के साथ इलाज।
    1. उचित 10x बफर के 4 μL के साथ वेक्टर डीएनए (पृथक डीएनए के ~ 5-10 μL) और 1 μ एल एआरआरआई के 0.5-1.5 माइक्रोग्राम युक्त 40-μL पचाने वाली प्रतिक्रिया का प्रयोग करें। डाइजेस्ट 1.5 एच पर 37 डिग्री सेल्सियस और फिर 1.5 μL सीआईपी जोड़ें। इसे एक अतिरिक्त 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर छोड़ दें
  2. ब्याज की जीन को आजाद कराने के लिए एआरआरआईआई और एक्सबाआई के साथ प्रतिबंध डाइजेस्ट पीएमजीएक्स- वाईफजी 2।
    1. डीएनए के 0.5-1.5 माइक्रोग्राम और 1 μ युक्त 40 μL डाइजेस्ट प्रतिक्रिया का प्रयोग करें; उपयुक्त 10x बफर के 4 μL के साथ प्रत्येक एंजाइम का एल डाइजेस्ट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे
  3. इलैक्ट्रोप्रोसेस प्रतिबंध एक उपयुक्त प्रतिशत (0.7%) agarose जेल पर पंसद और एक साफ स्केलपेल / रेजर ब्लेड का उपयोग करके डालें और वेक्टर बैंड का आबकारी (चरण 2.2-2.3 देखें)।
  4. निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार एक जेल निष्कर्षण किट का उपयोग करके डीएनए निकालें और डीएनए 17 का मात्रा निर्धारित करें।
  5. लीगेट जीन 2 को पीएमजीएक्स- वाईफजी 1 में 3: 1 डाइक्ट -टू-वेक्टर अनुपात का उपयोग कर। अतिरिक्त डालने के बिना डाइजेस्टेड पीएमजीएक्स- yfg1 की एक नकारात्मक बाघ स्थापित करें । ऊपर चरण 2.5 में ऊपर सेट करें।
  6. एक्सएल 1-ब्लू रासायनिक रूप से सक्षम ई। कोलाई कोशिकाओं, ligated plasmids pMGX- yfg1,2 (ब्याज 1 और 2 की जीन युक्त), और नकारात्मक पीएमजीएक्स- yfg1 नियंत्रण में चरण 2.6 में देखा के रूप में ligation प्रतिक्रियाओं के 5 μL रूपांतरण।
  7. नकारात्मक नियंत्रण और बंधन प्लेटों पर कॉलोनी की गणना की तुलना करें। एक कॉलोनी गिनती अनुपात जी1: 2 से अधिक पानी का छींटा वांछित है यदि नकारात्मक नियंत्रण प्लेट पर बड़ी संख्या में कॉलोनियां हैं, तो चरण 3.1 पर वापस जाएं और सीआईपी उपचार की समीक्षा करें।
  8. लघुकिया की प्रतिक्रिया से 4-8 अलग-अलग कॉलोनियों (नकारात्मक नियंत्रण के आधार पर): एलजी के 4 एमएल प्लस टीका लगाना और प्रति व्यक्ति उपयुक्त एंटीबायोटिक प्रतिदिन 37 डिग्री सेल्सियस और 220 आरपीएम पर बढ़ोतरी करें।
  9. निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार एक प्लाज्मिड डीएनए अलगाव किट का उपयोग करके प्लाज्मिड डीएनए को अलग करना और डीएनए 17 मात्रा निर्धारित करना।
  10. इकोआरआई के साथ पीएमजीएक्स- वाईफ़ा 21,2 के प्रतिबंध डाइजेस्ट द्वारा दूसरे जीन के प्रभावी सम्मिलन को स्क्रीन करें।
    1. 20 μL डाइजेस्ट की प्रतिक्रिया का उपयोग करें जिसमें 150-500 एनजी डीएनए और 1 μ एल ईकोआरआई एंजाइम के साथ 2 μL ईकोआरआई 10x बफर होता है। डाइजेस्ट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे
  11. एक उपयुक्त प्रतिशत agarose जेल पर प्रतिबंध electrophorese; उस बैंड की तलाश करें जो अनुरूप होजीन 2 के आकार के लिए (चरण 2.2 देखें)। एक जीन अवांछित, उलट उन्मुखीकरण में वेक्टर में डालें।

4. पीएमजीएक्स वेक्टर युक्त जीन 1 और 2 में एक तीसरी जीन को जोड़ना, पीएमजीएक्स- वाईफ़ग -1,2

  1. एआरआरआईआई के साथ प्रतिबंध डाइजेस्ट पीएमजीएक्स-वाईफ जी .1,2 और सीआईपी के साथ व्यवहार, जैसा कि चरण 3.1 में देखा गया है।
  2. एग्री और एक्सबाआई के साथ प्रतिबंध डाइजेस्ट पीएमजीएक्स- वाईफजी 3 , जैसा कि चरण 3.2 में देखा गया है।
  3. इलेक्ट्रोफोरेसी प्रतिबंध एक उपयुक्त प्रतिशत agarose जेल और उत्पाद डालने और एक साफ स्केलपेल / रेजर ब्लेड का उपयोग कर वेक्टर बैंड पर digests; चरण 2.2-2.3 का संदर्भ लें
  4. एक जेल निकालना किट का उपयोग कर एगरोस जेल से डीएनए निकालें और डीएनए 17 मात्रा निर्धारित करें।
  5. लीगेट जीन 3 में पीएमजीएक्स-वाईफजी -2,2 में 3: 1 डाइक्ट -टू-वेक्टर अनुपात का उपयोग करके और पचाने वाले पीएमजीएक्स- वाईफजी -212 के एक नकारात्मक डाट के बिना एक अतिरिक्त डालें, जैसा कि चरण 3.5 में देखा गया है।
  6. एक्स्ट्रा लार्ज में बंधन प्रतिक्रियाओं के 5 μL को ट्रांसफ़ॉर्म करें1-ब्लू कृत्रिम सक्षम ई। कोलाई कोशिकाओं, ligated प्लाज्मिड पीएमजीएक्स- yfg1,2,3 (हित 1, 2, और 3 की जीन युक्त), और नकारात्मक पीएमजीएक्स- yfg1,2 नियंत्रण, जैसा चरण 2.6 में देखा गया है।
  7. नकारात्मक नियंत्रण और बंधन प्लेटों पर कॉलोनी की गणना की तुलना करें। यदि नकारात्मक नियंत्रण प्लेट पर बड़ी संख्या में कॉलोनियां हैं, तो चरण 4.1 पर वापस जाएं और सीआईपी उपचार की समीक्षा करें।
  8. बंधाव प्रतिक्रिया से 4-8 अलग-अलग कॉलोनियों (नकारात्मक नियंत्रण के आधार पर): एलजी के 4 एमएल प्लस और प्रत्येक प्रति व्यक्ति उपयुक्त एंटीबायोटिक टीका लगाना; 37 डिग्री सेल्सियस और 220 आरपीएम पर रात भर बढ़ो।
  9. निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार प्लाज्मिड डीएनए अलगाव किट का उपयोग करके प्लाज्मिड डीएनए को अलग करें।
  10. चरण 3.10 में दिखाए गए अनुसार इकोआरआई के साथ पीएमजीएक्स- yfg1,2,3 के प्रतिबंध डाइजेस्ट द्वारा तीसरे जीन के प्रभावी सम्मिलन को स्क्रीन करें।
  11. एक उपयुक्त प्रतिशत agarose जेल पर प्रतिबंध electrophorese; देखनाबैंड के लिए जो जीन 2 और जीन 3 के आकार के अनुरूप हैं (चरण 2.2 देखें)। नोट: जीन 3 अवांछित, उलट स्थिति में वेक्टर में डालें। अगर जीन 2 और 3 समान आकार होते हैं, तो स्क्रीनिंग के लिए एक अन्य उपयुक्त प्रतिबंध डाइजेस्ट साइट का चयन होना चाहिए।
    नोट: प्रत्येक नए जीन के लिए आवश्यकतानुसार दोहराएं।

5. पश्चिमी ब्लॉटिंग द्वारा बहुजिने अभिव्यक्ति प्रणाली और आकलन के उत्पादन के जरिए ब्याज के प्रोटीन का निर्माण

  1. रासायनिक रूप से सक्षम प्रोटीन उत्पादन ई। कोली , जैसे कि बीएल 21- (λDE3) में रुचि के सभी जीन युक्त सकारात्मक क्लोन को बदलना।
    1. 5 मिनट के लिए बर्फ पर रासायनिक सक्षम BL21- (λDE3) ई। कोलाई के 100 μL aliquots और फिर सकारात्मक क्लोन प्लाज्मिड डीएनए के 1 μL जोड़ें; बर्फ पर 30 मिनट के लिए सेते हैं।
    2. 42 डिग्री सेल्सियस पर आयोजित जल स्नान में 45 सेकंड के लिए कोशिकाओं को हिट झटका और 200 μL ठंडा एलबी। 2 मिनट के लिए बर्फ पर सेते हैं
    3. 37 डिग्री सेल्सियस और 1 घंटे के लिए 220 आरपीएम पर कोशिकाओं को हिलाएं और फिर उचित चयन वाले मार्कर (एम्पीसिलीन या कनामीस्किन) युक्त एलबी-एगर प्लेट पर प्लेट 100 μL में फैलाएं।
  2. Isopropyl -β-D-1-thiogalactopyranoside (आईपीटीजी) प्रेरण द्वारा प्रोटीन व्यक्त करें।
    1. बी 21- (λDE3) परिवर्तन प्लेट से एक अलग कॉलोनी का चयन करें और एलएल के 4 एमएल प्लस उचित एंटीबायोटिक निषेध करें; 37 डिग्री सेल्सियस और 220 आरपीएम पर मिलाते हुए रातोंरात बढ़ो।
    2. रात भर की संस्कृति के 1 एमएल का उपयोग करके 100 एमएल एलबी प्लस उचित एंटीबायोटिक संस्कृति का टीका करें।
    3. 37 डिग्री सेल्सियस पर 220 आरपीएम में मिलाकर ओडी 600 के 0.6 में बढ़ोतरी करें।
    4. 100 μM आईपीटीजी के साथ संस्कृति को प्रेरित करें और 25 डिग्री सेल्सियस और 220 आरपीएम पर 15 घंटे के लिए बढ़ोतरी करें।
    5. संस्कृति के 1 एमएल को निकालें और इसे 1 मिनट के लिए 13,000 XG पर अपकेंद्रित करें; सतह पर तैरनेवाला त्यागें
  3. निर्माता के निर्देशों के अनुसार कोशिकाओं का उपयोग करके लिक्सेस समाधान का प्रयोग करेंऔर यह निर्धारित करने के लिए कि क्या सभी प्रोटीन सफलतापूर्वक 1 9 उत्पादन किया गया था, घुलनशील सेल lysate के एक पश्चिमी धब्बा तैयार करते हैं।

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Representative Results

इस अध्ययन में, लक्ष्य एक एकल प्लाज्मिड से पांच प्रोटीन को सह-अभिव्यक्त करना था। पांच-कोडोन अनुकूलित सिंथेटिक जीन के टुकड़े एनकोडिंग या एन-सी-टर्मिनल हेक्साइस्टिडाइन टैग व्यावसायिक रूप से खरीदे गए थे। सिंथेटिक जीन को पीसीआर द्वारा प्रवर्धित किया गया और व्यक्तिगत रूप से पीसीआर-कुंद सदिश में क्लोन किया गया और अनुक्रमित किया गया। पॉलीकसिस्टोनिक प्लाज्मिड उत्पन्न करने के लिए, ब्याज के पांच जीन पहले एक उपयुक्त पीएमजीएक्स प्लाज्मिड, पीएमजीएक्स-ए में क्लोन किया गया था। चित्रा 2 में पीसीआर-ब्लांट- yfg1 और पीसीआर-ब्लांट- yfg2 दिखाता है जिसमें पीएमजीएक्स -ए के अलावा एनडीआई + इकोआरआई के साथ पच जाता है (चरण 2 देखें)। पीएमजीएक्स-ए में पहले दो जीनों को क्लोन करने के लिए, प्लाज्मिड को एनडीआई + इकोआरआई ( चित्रा 2 ) के साथ पच किया गया था। पीएमजीएक्स-ए में रुचि के जीनों की क्लोनिंग करने पर, पीएमजीएक्स-वाईफग 1 और पीएमजीएक्स- वाईफग 2 के रूप में नामित नवनिर्मित प्लास्मिड को एआरआरआईआई + एक्सबीआई के साथ पचाने के लिए कहा गया था कि सफल क्लोन प्राप्त किए गए थेचित्रा 3 में प्राप्त 1.1-केबी और 1.3-केबी बैंड में दिखाया गया है।

चित्र 2
चित्रा 2: पीएमजीएक्स प्लास्मिड का क्लोनिंग एनडीआई + इकोआरआई के साथ पाचन के बाद पीसीआर-कुंद प्लास्मिड के अपेक्षित परिणाम yfg1 और yfg2 युक्त होते हैं जो 0.7% agarose gel (110 वी, 55 मिनट) पर दिखाए जाते हैं। लेन 1, 1 केबी डीएनए सीढ़ी; लेन 2, पीसीआरब्लंट- yfg1 ; लेन 3, पीसीआरब्लंट- yfg2 ; लेन 4, पीएमजीएक्स-ए कंट्रोल इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

चित्र तीन
चित्रा 3: पीएमजीएक्स- वाईफग 1 और पीएमजीएक्स- वाईफग 2 की स्क्रीनिंग । 0.7% agarose जेल (110 वी, 55 मिनट) से पता चलता है एआरआरआईआई + एक्सबाआई के साथ पाचन के बाद दोनों पीएमजीएक्स - वाईफग 1 और पीएमजीएक्स - वाईफग 2 द्वारा उत्पन्न किए गए दो बैंड लेन 1, 1-केबी डीएनए सीढ़ी; लेन 2, पीएमजीएक्स- वाईफ़ग 1 ; लेन 3, पीएमजीएक्स- वाईफग 2 ; लेन 4, पीएमजीएक्स-ए कंट्रोल इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

उपयुक्त पीएमजीएक्स वेक्टर में दोनों जीनों के साथ, पॉलीसिस्टोनिन प्लास्मिड का निर्माण किया गया था। प्लास्मिड पीएमजीएक्स- वाईफजी -1.2 जेनरेट करने के लिए, पीएमजीएक्स- वाईफजी 1 को एविआरआई के साथ पच किया गया था, जैसा कि चित्रा 4 में दिखाया गया है। पीएमजीएक्स- वाईफजी 2 को एविरा + एक्सबाआई के साथ पचाया गया था, और खंड के 1.3-केबी जीन को पीआरजीजीएक्स- वाईफजी 1 जी बनाने के लिए लाइनरीकृत पीएमजीएक्स- वाईफजी 1 के एविआरआई साइट में लगी थी । इकोआरआई के साथ पीएमजीएक्स- वाईफजी -1,2 के पाचन ने वांछित प्लाज्मिड के सफल क्लोनिंग की पुष्टि की है और इसमें दिखाया गया है> चित्रा 5

चित्रा 4
चित्रा 4: बायिसिस्टोनिन प्लास्मिड पीएमजीएक्स- वाईफ़ग -1,2 उत्पन्न करना 0.7% agarose जेल वैद्युतकणसंचलन परिणाम (110 वी, 55 मिनट) पीएमजीएक्स- yfg1 एआरआरआईआई और पीएमजीएक्स- yfg2 के साथ पचाने से एआरआरआईआई + एक्सबाआई के साथ पच जाता है लेन 1, 1-केबी डीएनए सीढ़ी; लेन 2, पीएमजीएक्स- वाईफग 1 एआरआरआईआई के साथ पचा; लेन 3, पीएमजीएक्स- वाईफग 2 एआरआरआईआई + एक्सबाआई के साथ पचा; लेन 4, पीएमजीएक्स-ए कंट्रोल इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

चित्रा 5
चित्रा 5: पीएमजीएक्स- वाईफग -1,2 क्लोन की स्क्रीनिंग परिणामी 0.7% agarose gel (110 वी, 55 मिनट) पीएमजीएक्स- वाईएफ काइकोआरआई के साथ पचाने वाला जी -1,2 क्लोन दिखाया गया है। सफल क्लोन दो बैंड उत्पन्न करेंगे, एक डाला जीन yfg2 के लिए और अन्य रीढ़ की हड्डी + yfg1 ( पीएमजीएक्स-वाईफजी 1 ) के लिए होगा। लेन 1, 1 केबी डीएनए सीढ़ी; लेन 2, पीएमजीएक्स- वाईफग 1, इकोआरआई के साथ पचा, क्लोन 1; लेन 3, पीएमजीएक्स- वाईफग 1, इकोआरआई के साथ पचा, क्लोन 2; लेन 4, पीएमजीएक्स-ए कंट्रोल इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

जब दो या दो से अधिक जीन वाले पॉलीसिस्टोनिक प्लाज्मिड उत्पन्न करते हैं, तो एक को अवेई साइट में क्लोन होने वाले जीन के अवांछनीय उलट सम्मिलन का सामना करना पड़ सकता है। चित्रा 6 एक जेल है जो एक पचाने वाली प्लाज्मिड के परिणामों के बीच अंतर को उजागर करता है जो जीन के विपरीत सही अभिविन्यास में डाली गई जीन के विपरीत है जो उलट उन्मुखीकरण में डाली जाती है। यदि जीन हैअवांछित अभिमुखता में लगीकृत और क्लोन किया गया, जीन के अंत में ईकोआरआई साइट को पिछले जीन के इकोआरआई साइट के ठीक ऊपर डाला जाएगा। इससे एक टुकड़ा आकार मिलेगा जो कि डीएनए जेल वैद्युतकणसंच (50 बीपी से कम) से वास्तव में undetectable होगा। इसके अतिरिक्त, अंतिम सम्मिलित जीन रीढ़ की हड्डी में दिखाई देगी, जो संभवतः रीढ़ की हड्डी के आकार के कारण अपेक्षाकृत अधिक होने की संभावना होती है। अपेक्षित आकार से रीढ़ की हड्डी के आकार में अंतर पिछले डाला जीन के आकार का संकेत देगा।

चित्रा 6
चित्रा 6: पीएमजीएक्स- वाईफ़ग 1-5 क्लोन की स्क्रीनिंग ईकोआरआई के साथ पचाए गए पीएमजीएक्स- वाईफग 1-5 के परिणाम दर्शाते हुए 1.3% agarose जेल (110 वी, 65 मिनट) दिखाया गया है। सफल क्लोन (लेन 2) आखिरी डाले गए जीन (इस मामले में yfg5 , 1.1 kb) के अनुरूप एक बैंड उत्पन्न करेगा। लैनई 1, 1-केबी डीएनए सीढ़ी; लेन 2, पीएमजीएक्स- वाईफजी 1-5 का सकारात्मक क्लोन, ईकोआरआई के साथ पचा; लेन 3, पीएमजीएक्स- वाईफ़ग 1-5 का नकारात्मक क्लोन, इकोआरआई के साथ पचा; लेन 4, पीएमजीएक्स- वाईफ़ग 1-4 नियंत्रण इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

पांच जीन पॉलीसिस्टोनिक एक्सप्रेशन वेक्टर को पूरा करने के लिए, पीएमजीएक्स-वाईफजी 1-5 (चरण 5 देखें) को उत्पन्न करने के लिए पीएमजीएक्स- वाईफजी -2,2 में शेष तीन जीन को क्लोन किया गया था। यह प्लाज्मिड तब BL21- (λDE3) में बदल गया था, और आईपीटीजी के अतिरिक्त द्वारा प्रोटीन्स की अभिव्यक्ति मध्य-लॉग चरण संस्कृति में प्रेरित थी। चित्रा 7 सेल lysates का एक पश्चिमी धब्बा है, यह पुष्टि करता है कि एक सिंगल ऑप्शन में एक से अधिक जीन युक्त एक प्लाज्मिड से सभी पांच प्रोटीन व्यक्त किए जा सकते हैं। पीएमजीएक्स- yfg1 की अभिव्यक्ति (1 जीन युक्त),पीएमजीएक्स- वाईफजी -1,2 (2 जीन युक्त), और पीएमजीएक्स-वाईफग 1-5 (5 जीन युक्त) दिखाए गए हैं।

चित्रा 7
चित्रा 7: पीएमजीएक्स सिस्टम का इस्तेमाल करते हुए बहु-जीन अभिव्यक्ति का पश्चिमी धब्बा विश्लेषण। एन- या सी-टर्मिनल हेक्साहिस्टिडाइन टैग के शामिल होने से प्रोटीन की अभिव्यक्ति के पश्चिमी धब्बों का पता लगाने में सक्षम हो गया। नमूनों को प्री-कास्ट 4-20% ग्रेडिएंट तनाव-मुक्त एसीलामाइड जैल (200 वी, 35 मिनट, 10 सेमी x 8.5 सेमी) पर अलग किया गया, और फिर एक नाइट्रोकेल्यूलोज झिल्ली (0.45 माइक्रोन पर स्थानांतरण (40 वी, 90 मिनट) 10 सेमी x 7 सेमी) प्रदर्शन किया गया था। एचआरपी-संयुग्मित विरोधी-उनका मोनोक्लोनल एंटीबॉडी, जिसमें एक माध्यमिक एंटीबॉडी की आवश्यकता नहीं होती है, इसका इस्तेमाल किया गया था। एंटीबॉडी निर्माता द्वारा अवरुद्ध, स्थानांतरण, और एंटीबॉडी कमजोर पड़ने वाले बफ़र्स तैयार किए गए थे। निर्माता के आईएनएस के बाद वेस्टर्न केमिल्मिनिसेंट एचआरपी सब्सट्रेट के साथ डिटेक्शन किया गया थाtructions। जिसके परिणामस्वरूप झिल्ली को एक फिल्टर के बिना इमेजर का उपयोग करके देखा गया था। लेन 1, दोहरे रंग मानक झिल्ली पर (नहीं chemiluminescent) पर स्थानांतरित; लेन 2, His6pMGX- yfg1 ; लेन 3, His6pMGX- yfg1,2 ; लेन 4, His6pMGX- yfg1-5 नोट: yfg5 द्वारा उत्पादित प्रोटीन समान आकार है जो yfg1 (दोनों 36 केडीए) द्वारा उत्पादित प्रोटीन हैं और जेल पर अलग नहीं किया जा सकता। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

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Discussion

बहु जीन की सह-अभिव्यक्ति, जरूरी है, विशेष रूप से जटिल, multigene चयापचय मार्गों 3 , 4 , 5 को चित्रण और पुनर्गठन में। पीएमजीएक्स प्रणाली ई। कोलाई दिनचर्या 6 , 7 , 8 में विविध-सह-अभिव्यक्ति बनाती है और विभिन्न शोधकर्ताओं के लिए सुलभ है। इस अध्ययन में, ब्याज की पांच प्रोटीन पीएमजीएक्स-ए का उपयोग कर एक एकल प्लाज्मिड सिस्टम से एक साथ उत्पन्न होने के लिए दिखाए गए थे। वर्तमान में उपलब्ध कई सह-अभिव्यक्ति प्रणाली केवल दो जीनों को सम्मिलित करने की अनुमति देती हैं, पीईटी डुएट वैक्टर 12 जैसे बीसिस्टोनिक प्लास्मिड उत्पन्न करती हैं। अगर किसी को अधिक जीन के अलावा की आवश्यकता होती है, तो अलग-अलग चयनकर्ता मार्करों के साथ कई बाइक्सीस्टोनिक वैक्टर आवश्यक हैं। अन्य multigene अभिव्यक्ति प्रणालियों के विपरीत, पीएमजीएक्स प्रणाली सहज क्लोनिंग के लिए अनुमति देता हैएकाधिक जीनों का एक प्लाज्मिड में, विभिन्न दाता प्लाज्मिड की आवश्यकता के बिना या जीन 13 , 14 से कई प्रतिबंध एंजाइम साइटों को निकालने के लिए प्रतिबंध साइटों को पुन: उपयोग करने की क्षमता के साथ। इस प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण कदमों में जीन डिज़ाइन, एकल पचाने वाले पीएमजीएक्स वैक्टर की पृष्ठभूमि के रीपरिक्रनाइजेशन की रोकथाम और सम्मिलित जीन की सही अभिविन्यास के लिए पॉलीसिस्टोनिक वैक्टर की स्क्रीन शामिल हैं।

एक पॉलीसिस्टोनिक प्रणाली के निर्माण के लिए क्लोनिंग रणनीति की योजना बनाने में, यह सुनिश्चित करना जरूरी है कि ब्याज के जीन में डाउनस्ट्रीम क्लोनिंग के लिए आवश्यक प्रतिबंध साइट शामिल न हों। विशेष रूप से, इनमें एक्सबाआई और एआरआरआईआई शामिल हैं, जो कि पीएमजीएक्स वेक्टर में दूसरे और बाद के जीनों को सम्मिलित करने के लिए जरूरी हैं, जिसमें रुचि के पहले जीन (चरण 3 और 4) शामिल हैं। इसके अलावा, प्रतिबंध साइटों को खत्म करने के लिए आवश्यक है जो कि जी के प्रारंभिक क्लोनिंग के लिए उपयोग किए जाएंगेपीएमजीएक्स (चरण 2) में दिलचस्पी के एनस आम तौर पर, इन जीन के 5 'अंत के जीन और बाममी या इकोआरआई में एनडीआई या नेही शामिल होते हैं, हालांकि जीन के अंत में' 3 'के अंत में, अन्य प्रतिबंध साइटों को भी इस चरण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, यदि आवश्यक हो अतिरिक्त, अवांछित प्रतिबंध साइटों को खत्म करने के लिए जीन संश्लेषण स्टेज पर आसानी से प्रदर्शन किया जा सकता है या अन्य स्रोतों से क्लोन किए जाने वाले जीनों के मामले में साइट-निर्देशित उत्परिवर्तजन 20 के जरिए समानार्थक न्यूक्लियोटाइड प्रतिस्थापनों द्वारा किया जा सकता है।

ब्याज की पहली जीन वाले पीएमजीएक्स में रुचि के बाद के जीन को जोड़कर पीएमजीएक्स- वाईफजी 1 को एआरआरआईआई के साथ लाइनरीकरण करना होगा (चरण 3.1; ध्यान रखें कि यह एक्सबाआई के साथ भी दोहराया जा सकता है) यह लाइनरीकृत वेक्टर ब्याज की दूसरी जीन (चरण 3.5) के सम्मिलन के दौरान तेजी से धर्म करता है, जिससे पृष्ठभूमि क्लोन की एक बहुत बड़ी संख्या होती है। इस से बचने के लिए, 5 5 डीफोसफ्रैरलेट के लिए फॉस्फेट के साथ लाइनरीकृत वेक्टर का इलाज करना आवश्यक है2; लाइनरिज्ड वेक्टर की समाप्ति आमतौर पर, सीआईपी का उपयोग किया जाता है, हालांकि अन्य उपलब्ध हैं। रेखावर्ती वेक्टर में ब्याज के बाद के जीनों के ligations को अनुकूलित करने के लिए फॉस्फेटस और उष्मायन समय की दोनों इकाइयों का अनुकूलन आवश्यक हो सकता है।

अन्त में, एक पॉलीसिस्टोनिक प्रणाली का निर्माण करते समय, ब्याज की जीन शुरू में एक्सबाआई और एआरआरआईआई के साथ पाचन द्वारा उत्तेजित की जाती है, जो जीन (चरण 3.2 और 4.2) के 5 'और 3' छोरों पर पूरक एकत्रीय छोर पैदा करती है। यह सम्मिलित लाइनरिज्ड वेक्टर में आगे या पीछे की दिशा में ligated किया जा सकता है। चूंकि सभी एकजुट सिरों समान होते हैं, इसलिए किसी दिशा-निर्देश को एकजुट करने वाली छोरों के पूरक एनेलिंग के जरिये लागू नहीं किया जाता है। इस प्रकार ब्याज की जीन की सही प्रविष्टि दिशा के लिए परिणामी क्लोन को स्क्रीन करना आवश्यक है। इसे पीएमजीएक्स (चरण 2) में मूल जीन को क्लोन करने के लिए इस्तेमाल किए जाने वाले प्रतिबंध साइटों में से एक के साथ स्क्रीनिंग क्लोन द्वारा आसानी से किया जा सकता है। आमतौर पर,ईकोआरआई का उपयोग किया जाता है, क्योंकि प्रतिबंध साइट जीन के 3 'अंत में है, और इस प्रकार दिशात्मकता के लिए स्क्रीन के लिए उचित है, जैसा कि चित्रा 6 में दिखाया गया है। ज्यादातर मामलों में, ब्याज की जीन वाले 50% क्लोनों को सही दिशा में जीन होता है और 50% में विपरीत दिशा-निर्देश में जीन होता है।

कभी-कभी (~ 10% ligations), एक विशेष ligation से सभी क्लोनों में केवल एक ही दिशा में सम्मिलित ब्याज की जीन हो सकती है। यह परिणाम अनुक्रम-आश्रित प्रतीत होता है, क्योंकि यह इन विशिष्ट उदाहरणों में अत्यधिक प्रतिलिपि बनाने योग्य है। यदि ऐसा होता है, और रिवर्स ओरिएंटेशन में ब्याज की जीन लगातार डालने जा रही है, वांछित वेक्टर आमतौर पर क्लोनिंग की दिशा में स्विच करके पहुंचा जा सकता है। उदाहरण के लिए, पीएमजीएक्स- yfg1 की एविआरआई साइट में yfg2 क्लोनिंग के बजाय, yfg1 को पीएमजीएक्स- yfg2 की एक्सबाआई साइट में क्लोन किया जा सकता है। ध्यान दें कि यह समान अंतिम वेक्टर देता हैप्रणाली। अलग क्लोनिंग रणनीतियों से एक ही सिस्टम तक पहुंच को सक्षम करने के लिए यह लचीलापन बहुत अधिक लाभकारी है।

इस पद्धति का एक महत्वपूर्ण सीमा यह है कि पॉलीसिस्टोनिक प्रतिलेख के 3 'अंत में प्रोटीन को एन्कोड किया जाता है, आमतौर पर प्रतिलिपि के 5' अंत में एन्कोडेड प्रोटीन की तुलना में निचले स्तर पर व्यक्त किया जाता है, और यह प्रभाव अधिक लंबा प्रतिलेख है । इसका अर्थ है कि सिंथेटिक ऑपरेशन में रुचि के जीनों के क्रम को बदलने से उन प्रोटीनों के रिश्तेदार अभिव्यक्ति के स्तर पर प्रभाव पड़ सकता है, जो वे सांकेतिक शब्दों में बदलते हैं, ठीक-ट्यूनिंग रिश्तेदार अभिव्यक्ति के स्तर के लिए एक तंत्र प्रदान करते हैं।

संक्षेप में, पीएमजीएक्स सिस्टम ई। कोलाई में एक एकल प्लाज्मिड से कई प्रोटीन की सह-अभिव्यक्ति के लिए एक विश्वसनीय तरीका प्रदान करता है, जो कि विभिन्न प्रकार के सिंथेटिक जीव विज्ञान अनुप्रयोगों के लिए और जैव रासायनिक मार्ग लक्षण वर्णन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासे के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

यह काम प्राकृतिक विज्ञान और कनाडा के इंजीनियरिंग अनुसंधान परिषद द्वारा समर्थित था

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Enzymes
Alkaline Phosphatase, Calf Intestinal (CIP) New England Biolabs M0290S
AvrII New England Biolabs R0174S
EcoRI New England Biolabs R0101S
NdeI New England Biolabs R0111S
XbaI New England Biolabs R0145S
Herculase II Fusion DNA Polymerase Agilent Technologies 600677
T4 DNA Ligase New England Biolabs M0202S
Name Company Catalog Number Comments
Reagents
1 kb DNA ladder New England Biolabs N3232L
4-20% Mini-PROTEAN TGX Stain-Free Protein Gels Bio-Rad 456-8095
50x TAE Fisher Thermo Scientific BP1332-4
Agar Fisher Thermo Scientific BP1423-500
Agarose Fisher Thermo Scientific BP160-500
Ampicilin Sigma-Alrich A9518-5G
BL21 (DE3) chemically comeptent cells Comeptent cell prepared in house
B-PER Bacterial Protein Extraction Reagent Fisher Thermo Scientific PI78243
dNTP mix Agilent Technologies Supplied with polymerase
Gel Extraction Kit Omega D2500-02 E.Z.N.A Gel Extraction, supplied by VWR Cat 3: CA101318-972
Glycine Fisher Thermo Scientific BP381-1
His Tag Antibody [HRP], mAb, Mouse GenScript A00612
Immobilon Western Chemiluminescent HRP Substrate EMD Millipore WBKLS0100
IPTG Sigma-Alrich 15502-10G
LB Fisher Thermo Scientific BP1426-500
Methanol Fisher Thermo Scientific A411-20
Pasteurized instant skim milk powder Local grocery store No-name grocery store milk is adequate
Nitrocellulose membrane Amersham Protran (GE Healthcare Life Sciences) 10600007 Membrane PT 0.45 µm 200 mm x 4 m, supplied by VWR Cat #: CA10061-086
Plasmid DNA Isolation Kit Omega D6943-02 E.Z.N.A Plasmid DNA MiniKit I, supplied by VWR Cat #: CA101318-898
pMGX Boddy Lab Request from the Boddy Lab Contact cboddy@uottawa.ca
Primers Intergrated DNA Technologies Design primers as needed for desired gene
Synthetic Gene Life Technologies Design and optimize as needed
Thick Blot Filter Paper Bio-Rad 1703932
Tris base BioShop TRS001.1
Tween-20 Sigma-Alrich P9416-50ML
XL1-Blue chemically competent cells Comeptent cell prepared in house
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
BioSpectrometer Eppendorf RK-83600-07
Gel box - PAGE Bio-Rad 1658005 Mini-PROTEIN Tetra Vertical Electrophoresis Cell
Gel Imager Alpha Innotech AlphaImager EC
Incubator-oven Fisher Thermo Scientific 11-690-650D Isotemp
Incubator-shaker Fisher Thermo Scientific SHKE6000-7 MaxQ 6000
Personna Razors Fisher Thermo Scientific S04615
Power Pack Bio-Rad S65533Q FB300
Transilluminator VWR International M-10E,6W
Thermocylcer Eppendorf Z316091 Mastercycler Personal, supplied by Sigma
UV Face-Shield 18-999-4542
Waterbath Fisher Thermo Scientific 15-460-2SQ
Western Transfer Apparatus Bio-Rad 1703935 Mini-Trans Blot Cell

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References

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आनुवंशिकी अंक 124 सिंथेटिक जीव विज्ञान जैव रसायन मल्टीजीन अभिव्यक्ति सिंथेटिक ऑपेरॉन पॉलीसिस्टोनिक टी 7 आरएनए पोलीमरेज़ प्लाज्मिड डीएनए।
Inducible T7 आरएनए पोलीमरेज़ मध्यस्थता बहुउद्देशीय अभिव्यक्ति प्रणाली, पीएमजीएक्स
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Hassan, M. I., McSorley, F. R.,… More

Hassan, M. I., McSorley, F. R., Hotta, K., Boddy, C. N. Inducible T7 RNA Polymerase-mediated Multigene Expression System, pMGX. J. Vis. Exp. (124), e55187, doi:10.3791/55187 (2017).

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