Summary
שיטת תמוגה תאי דם אדומה פשוט לצורך ביסוס B-LCLS פותחה עם יעילות גבוהה הנצחה, מחייב כמות קטנה של דם חיסכון בזמן מן החניכה cryopreservation.
Protocol
מחקר זה אושר על ידי ועדת האתיקה של לשכת גנטיקה וביולוגיה התפתחותית, ואת הפרוטוקול עוקב אחר ההנחיות המוסדיות על רווחת אדם.
1. הכנת וירוס EB
- ביום 1, להפשיר B95-8 תאים והתרבות 6 מ"ל להשלים RPMI 1640 בינוני, בתוספת 10% בסרום שור עוברית, 2 מ"מ L- גלוטמין, ואנטיביוטיקה (100 מיקרוגרם / סטרפטומיצין מ"ל, 100 פניצילין U / mL) בבית בקבוק תרבות T25. מניח את בקבוק התרבות ב- CO 2 באינקובטור 5% ב 37 מעלות צלזיוס.
- ביום 2, לשמור על מורפולוגיה התאים תחת מיקרוסקופ. תאים הם במצב טוב כשהם מוארים ועגולים. הוסף 10 מ"ל בינוני RPMI להשלים 1640.
- ביום 4, להוסיף 10 מ"ל בינוני טרי שלם RPMI 1640, ולאחר מכן להעביר בקבוק תרבות T75.
- ביום 8, להוסיף 20 מ"ל בינוני RPMI להשלים 1640.
- לשמור על התאים למשך 8 ימים מבלי להוסיף בינוני טרי, כלומר, רעב.
- ביום 16, להתבונן תאיםשנצפו תחת מיקרוסקופ. אוספים את התאים בצינור צנטריפוגה 15 מ"ל, 12 מ"ל / צינור.
- קריו לשמר ב -80 מעלות צלזיוס למשך 1 שעה, ולאחר מכן להפשיר במהירות על 37 מעלות צלזיוס. חזור 3 פעמים עד חלקיקי הנגיף משתחררים מהתאים.
- צנטריפוגה ב 240 XG במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
- סנן את supernatant באמצעות C 0.22 מיקרומטר מסנן, aliquot, 12 מ"ל / צינור, ולאחסן ב -80 °.
2. טיפול דם מלא עם הצפת תמוגה תא דם האדום
- הוסף 0.5 מ"ל דם מלא anticoagulated ידי EDTA · K 2 לצינור 15 מ"ל.
- שים 1 חיץ דם תא תמוגה אדום מ"ל (מסוננים לפי 0.22 מיקרומטר לסנן מופשר לטמפרטורת החדר לפני השימוש) אל הדם כולו ומערבבים היטב. מניחים את התערובת בטמפרטורת החדר למשך 4 דקות. לאחר מכן להוסיף 5 - 7 מ"ל 1x PBS במהירות התגובה להפסיק.
- צנטריפוגה ב 240 XG במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. תאי דם לבנים יהיה להאיץ בתחתית של התחתית.
- בטל supernatant, ולשטוף את המשקעים על ידי הוספה בינונית בסיסי 7 מיליליטר 1640. צנטריפוגות במשך 5 דקות ב 240 XG בטמפרטורת החדר. חזור פעמיים.
- Resuspend התא גלולה במדיום טרנספורמציה 300 μL (בינוני RPMI 1640, המכילה סרום שור העובר 20% ו -10 מיקרוגרם / מ"ל phytohemagglutinin (PHA)).
3. EBV זיהום
- הוסף 60 μL של 20 מיקרוגרם / מ"ל ציקלוספורין A (CsA) על השעיית התא.
- במהירות להפשיר aliquot של EBV על 37 מעלות צלזיוס. להוסיף 240 μL EBV על השעיית התא.
- מערבבים היטב ומניחים ההשעיה תא לצלחת 96-היטב, 200 μL לכל טוב. כדי למנוע אידוי, להוסיף 200 μL 1x PBS לכל היטב סביב הצלחת 96-היטב. מניחים את הצלחת CO 2 באינקובטור 5% ב 37 מעלות צלזיוס.
4. הרחבה Cryopreservation של B-LCLS
- שנה וחצי של המדיום פעם בשבוע במשך החודש הראשון לאחר ההדבקה EBV. רק Laye עבהr של שברי תאים גלוי תחת מיקרוסקופ על יום 7 (איור 2). לאחר חודש אחד של זיהום EBV, אשכולות תא lymphoblastoid גלויים תחת שכבה עבה של שברי תאים מתחת למיקרוסקופ (איור 2).
- שנה וחצי של המדיום כל 3 ימים עד צבירי תאים גלויים לעין תחת מיקרוסקופ (איור 2). בדרך כלל, תהליך זה לוקח בין 10 ל -20 ימים.
- לאחר ערבוב, pipet התאים ולהעביר לצלחת 24 באר. להכפיל את נפח בינוני תרבות עם שלם RPMI 1640 בזמן שהוא הופך צהוב. תהליך זה תלוי בקצב צמיחת תאים.
- בהמשך לכך, ולהעביר את התאים בקבוק תרבות T25. להכפיל את נפח בינוני תרבות כפי שמתברר צהוב עד נפח בינוני מתרחב עד 10 - 15 מ"ל.
- שנה בינונית 24 שעות לפני ההקפאה. השעית תא צנטריפוגה במשך 5 דקות ב g 240 x. ספירת תאים עם דלפק תא ולהקפיא בצפיפות של 5 - 10 x 10 6 / מ"ל ב frפתרון המניות אוזן המכיל FBS 90% ו -10% dimethylsulfoxide (DMSO). להקפיא בשיעור של 1 ° C לדקה ל -80 מעלות צלזיוס ולאחר מכן להעביר ישירות לתוך חנקן נוזלי.
5. 3- (4,5-Dimethylthiazol-2-י.ל.) -2,5-diphenyl-tetrazolium ברומיד (MTT) Assay 17
- כן השעית תא בודד B-LCLS עם המדיום 1640 המכיל סרום שור העובר 10%. זרע 3 x 10 4 תאים לכל טוב על צלחת 96-היטב, 100 μL לכל טוב.
- מניח את הצלחת ב 5% CO 2 באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס במשך 12 - 16 שעות.
- להוסיף MTT (5 מ"ג / מ"ל) לבארות שבו תאים גדלים להתרחק אור עבור 4 שעות ב 37 מעלות צלזיוס.
- צלחת תא צנטריפוגה במשך 10 דקות ב g 168 x.
- הסר supernatant ולהוסיף 100 μL DMSO לכל טוב.
הערה: תיזהר. אל תיגעו גבישי צבע דמוי מחט. - לנער את הצלחת במשך 10 דקות במהירות נמוכה כדי לפזר את הגבישים לחלוטין.
- קליטה מדודה ב 570 ננומטר על ידיבאמצעות ספקטרופוטומטר microplate.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
במהלך התהליך של טרנספורמציה, השינויים המורפולוגיים של תאים הם דמיינו ידי מיקרוסקופ אור (איור 2). אשכולות קטנים של תאים נראו בבירור עם שיטת הפרדת שיפוע הצפיפות לאחר 7 ימים של זיהום, בעוד שרק שכבה עבה של שברי תאים גלויות משייט ימס דם אדום תא. עם זאת, צבירי תאי lymphoblastoid גלויים תחת השכבה העבה של שברי תאים 30 יום שלאחר זיהום. עם שינוי בינוני תכוף יותר, הירידות הפסולות תא ואת צבירי התאים גלויים לעין ולהציג אותה התמונה הוקמה בשיטת הפרדת שיפוע צפיפות.
כאשר שורות תאים הוקמו בהצלחה, assay MTT שימש כדי להעריך את הכדאיות של B-LCLS. על פי הספרות 17, B-LCLS הוקמה על ידי שיטות שונות נבחרו כדי לזהות את כדאיות התא 1640 בינוני שמש שליטה ריקה. מן הנתונים עולה כי כדאיות התא של B-LCLS הוקמה עם השיטה תמוגה תא דם אדום הוא גבוה באופן משמעותי מאשר כדאיות התא של B-LCLS משיטת ההפרדה שיפוע צפיפות (איור 3).
תרשים איור 1. זרימה של נוהל. דם קרישת מטופל עם חיץ תמוגה תאי דם אדום לפני הדבקת EBV ואחריו התוספת של CSA. תאי B הנגועים גדלים ב 37 מעלות צלזיוס בנוכחות של 5% CO 2 להקים ובהמשך מרחיב B-LCLS. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
אלחוטיויזואליזציה איור 2. על השינויים סלולריים מורפולוגי בתהליך של טרנספורמציה EBV. השמאל הוא B-LCLS שהקים שיטת תמוגה תא דם אדום עם 0.5 מיליליטר דם היקפי, ופסולת תא יורדת ככל שעוברת זמן. מהימין מראה שורות תאים הוקמו על ידי שיטת הפרדת שיפוע צפיפות עם דגימת דם 2.5 מיליליטר. סרגל קנה מידה הוא 10 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3. השוואת כדאיות התא עבור B-LCLS הוקמה על ידי שיטות שונות. כל עמודה מייצגת SD ± מתכוון. התוצאות מראות כי אין הבדל משמעותי בין שתי השיטות (p = 0.014). אנא לחץ כאןכדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
אנו מדווחים על פיתוח של שיטה חדשה המנציחה תאי B האדם מן הדם כולו על ידי lysing כדוריות דם אדומות, ואת כדאיות התא שלה הוקמה ב-LCLS הוערכה על ידי assay MTT. התוצאות הראו כי כדאיות התא של B-LCLS הוקמה בשיטת תמוגה תא דם אדום הוא גבוה הרבה יותר מזה של שיטת ההפרדה שיפוע צפיפות. היתרון העיקרי של שיטת תמוגה תא דם אדום הוא שזה פשוט ודורש נפח קטן (קטן כמו 0.5 מיליליטר) של דם עבור הקמת קו תא קבע עם שיעור הצלחה גבוה כדאיויות תא גבוהות.
רק צעד אחד תמוגה פשוט נדרש לפני הדבקת EBV. ללא טיהור הקודם של לימפוציטים, אובדן התא נזק לתאים נמנעים. מכשול נוסף של שיטת הפרדת שיפוע צפיפות הוא המוליזה. עיבוד הדם לאחר אחסון ארוך טווח בטמפרטורות הולמות ורועד במהלך ההובלה עלולה להוביל המוליזה, WHich ישפיע על הבידוד של לימפוציטים מאוד. מחקרים אחרים הראו כי שימוש של תאי דם אדומים (RBC) תמוגה הביא מספרים גבוהים יותר של PBMC קיימא מאשר השימוש בשיטת הפרדת שיפוע צפיפות 18 תת הלימפוציטים לא הושפעו 19 באופן משמעותי. בהשוואה לשיטת הפרדת שיפוע הצפיפות, אשר היא יקר ומסורבל, שיטת תמוגה תא דם אדום היא הרבה יותר קלה, במיוחד לטיפול במספר רב של הדגימות הקליניות ומעשי יותר עבור משתמשים חדשים.
במסגרת המחקר, יש לנו הנציחו 24 דגימות עם שיעור הצלחה של 100% על ידי שימוש בשיטת תא תמוגה דם אדום. בהשוואה 90-94% של שיעור ההצלחה המדווחים על ידי לימפוציטים cryopreserved ו לימפוציטים טרי מבודד 20 עם 2 - 2.5 מ"ל דם, שיעור ההצלחה הזו היא הרבה יותר גבוהה. בינתיים, גם הפכנו טריים (0.5 מ"ל) או קפוא (אפילו 1 מ"ל) דם כמתואר אזכור 14,15 ללא הפרדה, ואת efficienCY של השינוי הוא הרבה יותר נמוך ממה שדווח 16 (מידע לא מוצג).
האסטרטגיה הנוכחית לא רק משפרת את יעילות הנצחה משמעותית, אלא גם מפחיתה את נפח הדם הנדרש להקמת B-LCLS. טכנולוגיות נוכחיות לטרנספורמציה EBV להשתמש כמויות גדולות היחסי של דם היקפי, כ 2 - 2.5 מיליליטר דם 20 לבודד לימפוציטים בעוד אחרים דורשים 10 מיליליטר או יותר 10,21. זאת בניגוד ל 0.5 מ"ל של דם מלא הדרושים לקבלת קו התא הנציח עם השיטה המתוארת כאן. שיטה זו יכולה להיות שונה כדי להנציח דם שנאסף בהצלחת אצבע דוקרי 12, אשר יכול להקל מאוד לשמר משאבים גנטיים בילדים והקשישים.
בנוסף, כדאיויות התא של B-LCLS הוקמה בשיטת תמוגה תאי הדם האדומה הן גבוהות יותר מזה של שיטת הפרדת שיפוע הצפיפות. פתאום אני תאי דם אדומיםשיטת יסיס ימנע את הכוח הצנטריפוגלי מכני בתהליך של צנטריפוגה שיפוע צפיפות, הגורמת לנזק בלתי לתיקון אל התאים. זה מצביע על כך שיטת תמוגה תא דם אדום היא יותר מתאימה מחקרים גנטיים ופונקציונליים, מחייב מספר גדול של תאים מהר ככל האפשר. השיטה שלנו תקטין את התקופה מהתחלת תרבות cryopreservation, אשר תחסוך משאבים ולהקטין עבודה.
מגבלה אפשרית של שיטת תמוגה תא דם אדום היא הנוכחות של זיהום ופסולת שמקורם lysates תאי דם האדום, אשר תחסום את התצפית הברורה של שינוי בארבעת השבועות הראשונים של זיהום EBV. עם זאת, פסולת זו יוסרה בהדרגה בשינויים הבינוניים. מגבלה נוספת היא אובדן של תאים טרנספורמציה גדל, אבל זה יכול להשתפר על ידי הסרת מחצית supernatant בטרנספורמציה ארבעה שבועות של הראשונה. עוד שינוי אפשרי כדי להסיר זיהומים יותרשינויים בינוני תכופים עם נפחים גבוהים יותר או שטיפת שורות תאים פעמיים על ידי 10 מ"ל 1x PBS ולאחר מכן centrifuging ב 168 XG במשך 5 דקות כדי להסיר זיהומים.
לסיכום, פרוטוקול זה מספק אסטרטגיה פשוטה להקמת B-LCLS עם יעילות גבוהה הנצחה, צמצום נפח הדם ושמירה זמן בין ייזום cryopreservation. שורות התאים שפותחו במחקר הנוכחי לספק מקור חשוב וחסכוני של חומרים ביולוגיים לבצע מחקרים שונים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Centrifuge | Techcomp | CT6T | Centrifugation |
| Automated Cell Counter | Countstar | IC 1000 | For cell counting |
| Epoch Microplate Spectrophotometer | BioTek Instruments | SN263839 | For measuring the absorbance |
| 96 well cell culture cluster | Corning Incorporated | 3599 | Polystyrene plates |
| 24 well cell culture cluster | Corning Incorporated | 3524 | Polystyrene plates |
| 25 cm2 cell culture flask | Nest | 707001 | Polystyrene |
| FBS | Gibco | 10270 | Component of B-LCLs medium |
| RPMI Medium 1640 | Gibco | 31800-022 | For B-LCLs medium |
| L-Glutamine | Amresco | 0374 | Component of B-LCLs medium |
| 100x streptomycin penicillin solution BioRoYeeBRY-2309 | BioRoYee | BRY-2309 | Component of B-LCLs medium |
| Ficoll paque plus | GE Healthcare | 17-1440-03 | For in vitro isolation of lymphocyte |
| PHA-M | Sigma | L8902 | For stimulating lymphocyte proliferation |
| Cyclosporin A | Cayman Chemical | 12088 | For inhibiting the cytotoxicity effect of T cells |
| Red cell lysis buffer | Tiangen | RT122-01 | For lysing red blood cell |
| MTT | Amresco | 0793 | For the detection of cell viability |
| DMSO | Sigma | D2650 | For freezing cells |
References
- Mohyuddin, A., et al. Genetic instability in EBV-transformed lymphoblastoid cell lines. Biochim Biophys Acta. 1670 (1), 81-83 (2004).
- Hu, V. W., Frank, B. C., Heine, S., Lee, N. H., Quackenbush, J. Gene expression profiling of lymphoblastoid cell lines from monozygotic twins discordant in severity of autism reveals differential regulation of neurologically relevant genes. BMC Genomics. 7, 118 (2006).
- Toda, T., Sugimoto, M. Proteome analysis of Epstein-Barr virus-transformed B-lymphoblasts and the proteome database. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 787 (1), 197-206 (2003).
- Chiorazzi, N., Wasserman, R. L., Kunkel, H. G. Use of Epstein-Barr virus-transformed B cell lines for the generation of immunoglobulin-producing human B cell hybridomas. J Exp Med. 156 (3), 930-935 (1982).
- Traggiai, E., et al. An efficient method to make human monoclonal antibodies from memory B cells: potent neutralization of SARS coronavirus. Nat Med. 10 (8), 871-875 (2004).
- Hussain, T., Kotnis, A., Sarin, R., Mulherkar, R. Establishment & characterization of lymphoblastoid cell lines from patients with multiple primary neoplasms in the upper aero-digestive tract & healthy individuals. Indian J Med Res. 135 (6), 820-829 (2012).
- Neitzel, H. A Routine Method for the Establishment of Permanent Growing Lymphoblastoid Cell-Lines. Hum Genet. 73 (4), 320-326 (1986).
- Oh, H. M., et al. An efficient method for the rapid establishment of Epstein-Barr virus immortalization of human B lymphocytes. Cell Prolif. 36 (4), 191-197 (2003).
- Louie, L. G., King, M. C. A Novel-Approach to Establishing Permanent Lymphoblastoid Cell-Lines - Epstein-Barr-Virus Transformation of Cryopreserved Lymphocytes. Am J Hum Genet. 48 (3), 637-638 (1991).
- Tremblay, S., Khandjian, E. V. Successful use of long-term frozen lymphocytes for the establishment of lymphoblastoid cell lines. Clin Biochem. 31 (7), 555-556 (1998).
- Reidy, J. A., Wheeler, V. A. Sample age and Epstein-Barr virus transformation of cryopreserved lymphocytes. In Vitro Cell Dev Biol. 28 (6), 383-384 (1992).
- Amoli, M. M., Carthy, D., Platt, H., Ollier, W. E. R. EBV immortalization of human B lymphocytes separated from small volumes of cryo-preserved whole blood. Int J Epidemiol. 37, suppl 1 41-45 (2008).
- Lacelle, C., Wang, E. Establishing lymphoblastoid cell lines from frozen blood of extremely old individuals. Mech Ageing Dev. 123 (10), 1415-1418 (2002).
- Tohda, H., Oikawa, A., Kudo, T., Tachibana, T. A greatly simplified method of establishing B-lymphoblastoid cell lines. Cancer Res. 38 (10), 3560-3562 (1978).
- Ventura, M., et al. Use of a Simple Method for the Epstein-Barr Virus Transformation of Lymphocytes from Members of Large Families of Reunion Island. Hum Hered. 38 (1), 36-43 (1988).
- Chenevixtrench, G., Kerr, B., Walters, M. Lymphoblastoid Cell-Lines from Frozen Whole-Blood - a Quick and Economical Safeguard for Linkage Analysis. Am J Hum Genet. 46 (1), 635-636 (1990).
- Hansen, M. B., Nielsen, S. E., Berg, K. Re-Examination and Further Development of a Precise and Rapid Dye Method for Measuring Cell-Growth Cell Kill. J Immunol Methods. 119 (2), 203-210 (1989).
- Bogoslovsky, T., et al. Preservation and enumeration of endothelial progenitor and endothelial cells from peripheral blood for clinical trials. Biomark Med. 9 (7), 625-637 (2015).
- Ambach, A., Bonnekoh, B., Gollnick, H. Routine flow cytometric immuno-staining of T-cell perforin is preserved using diethylene glycol for erythrocyte-lysis but lost by the use of ammonium chloride. Exp Dermatol. 12 (6), 825-831 (2003).
- Beck, J. C., Beiswanger, C. M., John, E. M., Satariano, E., West, D. Successful transformation of cryopreserved lymphocytes: A resource for epidemiological studies. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 10 (5), 551-554 (2001).
- Tosato, G., Cohen, J. I. Generation of Epstein-Barr Virus (EBV)-immortalized B cell lines. Curr Protoc Immunol. , Chapter 7, Unit 7 22 (2007).
