Summary
Un método de lisis de glóbulos rojos simple para el establecimiento de B-LCLs se desarrolló con una alta eficiencia de la inmortalización, lo que requiere una pequeña cantidad de sangre y el ahorro de tiempo desde el inicio de la crioconservación.
Protocol
Este estudio fue aprobado por el Comité de Ética del Instituto de Genética y Biología del Desarrollo, y el protocolo sigue las directrices institucionales para el bienestar humano.
1. Preparación de virus EB
- En el día 1, descongelar las células B95-8 y la cultura en 6 ml de RPMI completo 1640, suplementado con 10% de suero fetal bovino, 2 mM L-glutamina, y antibióticos (100 mg / ml de estreptomicina, 100 U / ml de penicilina) en una matraz de cultivo T25. Colocar el frasco de cultivo en 5% de CO2 a 37 ° C.
- En el día 2, observar la morfología de las células bajo un microscopio. Las células están en buenas condiciones cuando son brillantes y redondas. Añadir 10 ml de medio completo RPMI 1640.
- El día 4, se añaden 10 ml de medio completo RPMI 1640, y luego se transfieren a un matraz de cultivo T75.
- En el día 8, se añaden 20 ml de medio completo RPMI 1640.
- Mantener las células durante 8 días sin la adición de medio fresco, es decir, el hambre.
- En el día 16, observe las célulasobservado bajo el microscopio. Recoger las células en un tubo de centrífuga de 15 ml, 12 ml / tubo.
- Crio-preservar a -80 ° C durante 1 h, y luego descongelar rápidamente a 37 ° C. Repetir 3 veces hasta que las partículas de virus se liberan de las células.
- Centrifugar a 240 xg durante 10 min a temperatura ambiente.
- Se filtra el sobrenadante a través de un filtro de 0,22 micras, alícuota de 12 ml / tubo, y se almacena a -80 ° C.
2. El tratamiento de la sangre entera con glóbulos rojos tampón de lisis
- Añadir 0,5 ml de sangre total anticoagulada con EDTA · K 2 a un tubo de 15 ml.
- Ponga 1 ml de tampón de lisis de glóbulos rojos (filtrada por 0.22 m filtro y descongelado a temperatura ambiente antes de su uso) para la sangre entera y mezclar bien. Colocar la mezcla a temperatura ambiente durante 4 min. A continuación, añadir de 5 - 7 ml de PBS 1x rápidamente a la reacción de parada.
- Centrifugar a 240 xg durante 5 min a temperatura ambiente. Los glóbulos blancos se precipitarán en la parte inferior del tubo.
- Descartar el sobrenadante, y se lava la precipitación mediante la adición de 7 ml 1,640 medio básico. Centrifugar durante 5 min a 240 xg a temperatura ambiente. Repetir dos veces.
- Resuspender el sedimento celular en 300 medio de transformación l (medio RPMI 1640, que contiene 20% de suero bovino fetal y 10 mg / ml de fitohemaglutinina (PHA)).
La infección por VEB 3.
- Añadir 60 l de 20 mg / ml de ciclosporina A (CsA) a la suspensión celular.
- Descongelar rápidamente una alícuota de EBV a 37 ° C. Añadir 240 l EBV a la suspensión celular.
- Mezclar bien y colocar la suspensión celular a una placa de 96 pocillos, a 200 l por pocillo. Para evitar la evaporación, añadir 200 l de 1x PBS a cada pozo alrededor de la placa de 96 pocillos. Colocar la placa en un incubador de CO2 al 5% a 37 ° C.
4. La expansión y la criopreservación de B-LCL
- Cambiar la mitad del medio una vez por semana durante el primer mes después de la infección por VEB. Sólo una gruesa Layer de fragmentos de células es visible bajo el microscopio en el día 7 (Figura 2). Después de un mes de la infección por EBV, grupos de células linfoblastoides son visibles bajo una gruesa capa de fragmentos de células bajo el microscopio (Figura 2).
- Cambiar la mitad del medio cada 3 días hasta que los grupos de células son claramente visibles bajo el microscopio (Figura 2). Por lo general, este proceso tarda de 10 a 20 días.
- Después de mezclar, pipetear las células y la transferencia a la placa de 24 pocillos. Duplicar el volumen de medio de cultivo con RPMI 1640 completo, mientras que se vuelva amarillo. Este proceso depende de la tasa de crecimiento celular.
- Posteriormente, la transferencia de las células al matraz de cultivo T25. El doble del volumen de medio de cultivo, ya que se vuelve amarillo hasta que el volumen de medio se expande a 10 a 15 mL.
- Cambio de medio 24 h antes de la congelación. suspensión de células Centrifugar durante 5 min a 240 x g. Contar las células con un contador de células y se congelan a una densidad de 5 a 10 x 10 6 / ml en frsolución madre ozen que contiene 90% de FBS y 10% de dimetilsulfóxido (DMSO). Congelar a una velocidad de 1 ° C por minuto a -80 ° C y luego transferir directamente en nitrógeno líquido.
5. 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difenil-tetrazolio (MTT) ensayo de 17
- Preparar una suspensión de células individuales B-LCLs con el medio de 1640 que contiene suero bovino fetal 10%. Semilla 3 x 10 4 células por pocillo en placas de 96 pocillos, 100 l por pocillo.
- Colocar la placa en 5% de CO2 a 37 ° C por 12 - 16 h.
- Añadir MTT (5 mg / ml) a los pocillos en los que las células están creciendo y mantenerse alejado de la luz durante 4 horas a 37 ° C.
- placa de células se centrifuga durante 10 min a 168 x g.
- Aspirar el sobrenadante y añadir 100 l de DMSO por pocillo.
NOTA: Tenga cuidado. No toque los cristales tintados en forma de aguja. - Agitar la placa durante 10 minutos a baja velocidad para disolver completamente los cristales.
- Medida de absorción a 570 nmusando un espectrofotómetro de microplacas.
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Representative Results
Durante el proceso de transformación, los cambios morfológicos de células se visualizaron por microscopía de luz (Figura 2). Pequeños grupos de células eran claramente visibles con el método de separación en gradiente de densidad después de 7 días de la infección, mientras que sólo una capa gruesa de fragmentos de células son visibles desde el método de lisis de glóbulos rojos. Sin embargo, los grupos de células linfoblásticas son visibles bajo la gruesa capa de fragmentos de células de 30 días después de la infección. Con cambio de medio más frecuente, los descensos de los desechos de células y los grupos de células son claramente visibles y presentan la misma imagen establecido por el método de separación en gradiente de densidad.
Cuando se establecieron con éxito líneas celulares, se usó el ensayo de MTT para evaluar la viabilidad de las B-LCLs. De acuerdo con la literatura 17, se seleccionó B-LCLs establecido por diferentes métodos para detectar la viabilidad celular y la 1640 medio se utilizó como control en blanco. Los datos indican que la viabilidad de las células de B-LCLs establecido con el método de lisis de glóbulos rojos es significativamente mayor que la viabilidad de las células de B-LCLs del método de separación en gradiente de densidad (Figura 3).
Figura 1. Diagrama de flujo del procedimiento. sangre anticoagulante se trata con tampón de lisis de glóbulos rojos antes de la infección EBV seguido de la adición de CsA. Las células B infectadas se cultivan a 37 ° C en presencia de 5% de CO 2 para establecer y posteriormente expandirse B-LCLs. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. La visualización de celulares Cambios morfológicos en el proceso de transformación de EBV. La izquierda se B-LCL establecido por el método de lisis de glóbulos rojos con 0,5 ml de sangre periférica, y los restos celulares decreciente a medida que pasa el tiempo. La derecha muestra las líneas celulares establecidas por el método de separación por gradiente de densidad con 2,5 ml de muestra de sangre. La barra de escala es de 10 micras. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. Comparación de la viabilidad celular para B-LCL Establecido por diferentes métodos. Cada barra representa la media ± SD. Los resultados muestran que no había diferencia significativa entre los dos métodos (p = 0,014). Por favor, haga clic aquípara ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Se presenta el desarrollo de un nuevo método para inmortalizar células B humanas a partir de sangre completa por lisis de las células rojas de la sangre, y su viabilidad celular de establecido B-LCLs se evaluó por el ensayo MTT. Los resultados mostraron que la viabilidad de las células de B-LCLs establecidos por el método de lisis de glóbulos rojos es mucho mayor que la del método de separación en gradiente de densidad. La principal ventaja del método de lisis de glóbulos rojos es que es simple y requiere un pequeño volumen (tan poco como 0,5 ml) de sangre para el establecimiento de una línea celular permanente con una alta tasa de éxito y la viabilidad celular alta.
Sólo se necesita una etapa de lisis sencilla antes de la infección por VEB. Sin purificación previa de los linfocitos, la pérdida de células y daño celular se evitan. Otro obstáculo del método de separación por gradiente de densidad es la hemólisis. El procesamiento de la sangre después de almacenamiento a largo plazo a temperaturas inadecuadas y agitando durante el transporte puede conducir a la hemólisis, WHIch will influir mucho en el aislamiento de linfocitos. Otros estudios mostraron que el uso de lisis de glóbulos rojos (RBC) dio lugar a un mayor número de PBMC viable que el uso del método de separación en gradiente de densidad 18 y de linfocitos subtipos no fueron influenciadas sustancialmente 19. En comparación con el método de separación en gradiente de densidad, que es costoso y engorroso, el método de lisis de glóbulos rojos es mucho más fácil, especialmente para el tratamiento de un gran número de las muestras clínicas y más práctico para los principiantes.
En el estudio, hemos inmortalizado 24 muestras con una tasa de éxito del 100% utilizando el método de lisis de glóbulos rojos. En comparación con el 90-94% de tasa de éxito por los linfocitos criopreservados y linfocitos recién aislados 20 con 2 a 2,5 ml de sangre, esta tasa de éxito es mucho mayor. Mientras tanto, también transformados fresco (0,5 ml) o congelado en la sangre (incluso 1 ml) como se describe en las referencias 14,15 sin separación, y la efficiencia de la transformación es mucho menor que el reportado 16 (datos no mostrados).
La presente estrategia no sólo mejora la eficiencia de la inmortalización de manera significativa, sino que también reduce el volumen de sangre requerido para establecer B-LCLs. Las tecnologías actuales para la transformación EBV utilizan volúmenes relativamente grandes de sangre periférica, de aproximadamente 2 a 2,5 ml de sangre 20 para aislar los linfocitos mientras que otros requieren 10 ml o más 10,21. Esto contrasta con los 0,5 ml de sangre total necesario para obtener una línea celular inmortalizada con el método descrito aquí. Este método podría ser modificado para inmortalizar con éxito recogida de sangre del dedo pincha 12, lo que podría facilitar en gran medida a preservar los recursos genéticos de los pacientes pediátricos y ancianos.
Además, la viabilidad de las células de B-LCLs establecidos por el método de lisis de glóbulos rojos son más altos que el del método de separación en gradiente de densidad. La célula l de sangre rojaanalysis método evita la fuerza centrífuga mecánica en el proceso de centrifugación en gradiente de densidad, que causa daño no reparable a las células. Se sugiere que el método de lisis de glóbulos rojos es más adecuado para estudios genéticos y funcionales, lo que requiere un gran número de las células tan rápidamente como sea posible. Nuestro método disminuirá el tiempo de inicio del cultivo de la crioconservación, lo que permitirá ahorrar recursos y reducir la mano de obra.
Una posible limitación del método de lisis de glóbulos rojos es la presencia de contaminación de los residuos derivados de lisados de glóbulos rojos, lo que bloquearía la clara observación de la transformación en las primeras cuatro semanas de la infección por EBV. Sin embargo, estos restos se eliminará gradualmente con los cambios de medio. Otra limitación es la pérdida de células transformadas que crecen, pero esto se puede mejorar mediante la eliminación de la mitad del sobrenadante en las primeras cuatro semanas de transformación. Otra posible modificación para eliminar las impurezas es máscambios de medio frecuentes con mayores volúmenes o el lavado de las líneas celulares dos veces por 10 ml de 1x PBS y, a continuación centrifugación a 168 xg durante 5 min para eliminar las impurezas.
En resumen, este protocolo proporciona una estrategia sencilla para el establecimiento de los B-LCLs con alta eficiencia inmortalización, lo que reduce el volumen de sangre y el ahorro de tiempo entre el inicio y la crioconservación. Las líneas de células desarrolladas en el presente estudio proporcionan una fuente valiosa y rentable de biomateriales llevar a cabo diversos estudios.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Centrifuge | Techcomp | CT6T | Centrifugation |
| Automated Cell Counter | Countstar | IC 1000 | For cell counting |
| Epoch Microplate Spectrophotometer | BioTek Instruments | SN263839 | For measuring the absorbance |
| 96 well cell culture cluster | Corning Incorporated | 3599 | Polystyrene plates |
| 24 well cell culture cluster | Corning Incorporated | 3524 | Polystyrene plates |
| 25 cm2 cell culture flask | Nest | 707001 | Polystyrene |
| FBS | Gibco | 10270 | Component of B-LCLs medium |
| RPMI Medium 1640 | Gibco | 31800-022 | For B-LCLs medium |
| L-Glutamine | Amresco | 0374 | Component of B-LCLs medium |
| 100x streptomycin penicillin solution BioRoYeeBRY-2309 | BioRoYee | BRY-2309 | Component of B-LCLs medium |
| Ficoll paque plus | GE Healthcare | 17-1440-03 | For in vitro isolation of lymphocyte |
| PHA-M | Sigma | L8902 | For stimulating lymphocyte proliferation |
| Cyclosporin A | Cayman Chemical | 12088 | For inhibiting the cytotoxicity effect of T cells |
| Red cell lysis buffer | Tiangen | RT122-01 | For lysing red blood cell |
| MTT | Amresco | 0793 | For the detection of cell viability |
| DMSO | Sigma | D2650 | For freezing cells |
References
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