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Immunology and Infection

एक सरल लाल रक्त कोशिका बी Lymphoblastoid सेल लाइनों की स्थापना के लिए Lysis विधि

Published: January 14, 2017 doi: 10.3791/55191
Automatic Translation
1,2, 2, 2
1Wuhan Institute of Virology, Chinese Academy of Sciences, 2Genetic Resources Center, Institute of Genetics and Developmental Biology, Chinese Academy of Sciences

Summary

बी-LCLS स्थापना के लिए एक सरल लाल रक्त सेल विधि, उच्च अमरता दक्षता के साथ विकसित किया गया था खून की एक छोटी राशि की आवश्यकता होती है और cryopreservation को दीक्षा से समय की बचत।

Protocol

इस अध्ययन आनुवंशिकी और विकास जीवविज्ञान संस्थान के आचार समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था, और प्रोटोकॉल मानव कल्याण के लिए संस्थागत दिशा निर्देशों के बाद।

1. ईबी वायरस की तैयारी

  1. 1 दिन, 6 एमएल में B95-8 कोशिकाओं और संस्कृति गल पूरा RPMI 1640 मध्यम, एक में 10% भ्रूण गोजातीय सीरम, 2 मिमी एल glutamine, और एंटीबायोटिक दवाओं (100 माइक्रोग्राम / एमएल स्ट्रेप्टोमाइसिन, 100 यू / एमएल पेनिसिलिन) के साथ पूरक T25 संस्कृति फ्लास्क। 37 डिग्री सेल्सियस पर 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर में संस्कृति कुप्पी रखें।
  2. 2 दिन, एक खुर्दबीन के नीचे सेल आकृति विज्ञान निरीक्षण करते हैं। जब वे उज्ज्वल और गोल कर रहे हैं प्रकोष्ठों अच्छी हालत में हैं। 10 एमएल पूरा RPMI 1640 मध्यम जोड़ें।
  3. 4 दिन, 10 एमएल ताजा पूरा RPMI 1640 मध्यम जोड़ने के लिए, और फिर एक T75 संस्कृति फ्लास्क को हस्तांतरण।
  4. 8 दिन, 20 एमएल पूरा RPMI 1640 के माध्यम जोड़ें।
  5. ताजा माध्यम है, यानी, भुखमरी जोड़ने के बिना 8 दिनों के लिए कोशिकाओं को बनाए रखें।
  6. 16 दिन, कोशिकाओं का निरीक्षणमाइक्रोस्कोप के नीचे देखा। एक 15 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब, 12 एमएल / ट्यूब में कोशिकाओं को ले लीजिए।
  7. 1 घंटे के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर क्रायो की रक्षा, और फिर तेजी से 37 डिग्री सेल्सियस पर पिघलना। 3 बार दोहराएँ जब तक वायरस कणों कोशिकाओं से जारी कर रहे हैं।
  8. कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए 240 XG पर अपकेंद्रित्र।
  9. एक 0.22 माइक्रोन फिल्टर, विभाज्य, 12 एमएल / ट्यूब, और -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर के माध्यम से सतह पर तैरनेवाला फ़िल्टर।

2. लाल रक्त कोशिका lysis बफर के साथ पूरे रक्त का उपचार

  1. 0.5 एमएल पूरे रक्त एक 15 मिलीलीटर ट्यूब EDTA · कश्मीर 2 से anticoagulated जोड़ें।
  2. पूरे रक्त के लिए 1 एमएल लाल रक्त कोशिका lysis बफर (उपयोग करने से पहले 0.22 माइक्रोन फिल्टर द्वारा फ़िल्टर और कमरे के तापमान को thawed) रख दिया और मिश्रण अच्छी तरह से। कमरे के तापमान पर मिश्रण 4 मिनट के लिए रखें। स्टॉप प्रतिक्रिया करने के लिए जल्दी से 7 एमएल 1x पीबीएस - तो फिर 5 जोड़ें।
  3. कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 240 XG पर अपकेंद्रित्र। सफेद रक्त कोशिकाओं ट्यूब के नीचे वेग होगा।
  4. सतह पर तैरनेवाला त्यागें, और 7 एमएल 1640 बुनियादी मध्यम जोड़कर वर्षा धो लें। कमरे के तापमान पर 240 XG पर 5 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र। दो बार दोहराएँ।
  5. 300 μL परिवर्तन मध्यम में सेल गोली Resuspend (1640 RPMI मध्यम, 20% भ्रूण गोजातीय सीरम और 10 माइक्रोग्राम / एमएल phytohemagglutinin (पीएचए) युक्त)।

3. EBV संक्रमण

  1. 20 माइक्रोग्राम / एमएल cyclosporin ए के 60 μL (सीएसए) सेल निलंबन में जोड़े।
  2. तेजी से 37 डिग्री सेल्सियस पर EBV के एक विभाज्य पिघलना। सेल निलंबन के लिए 240 μL EBV जोड़ें।
  3. अच्छी तरह मिक्स और अच्छी तरह से प्रति एक 96 अच्छी तरह से थाली करने के लिए सेल निलंबन जगह है, 200 μL। वाष्पीकरण से बचने के लिए 96 अच्छी तरह से थाली के चारों ओर हर अच्छी तरह से करने के लिए 200 μL 1x पीबीएस जोड़ें। 37 डिग्री सेल्सियस पर एक 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर में थाली रखें।

4. विस्तार और बी LCLS की cryopreservation

  1. EBV संक्रमण के बाद पहले महीने के लिए प्रति सप्ताह एक बार मध्यम के आधे बदलें। केवल एक मोटी लेयसेल टुकड़े के आर दिन 7 (चित्रा 2) पर खुर्दबीन के नीचे दिखाई दे रहा है। EBV संक्रमण से एक महीने के बाद, lymphoblastoid सेल समूहों माइक्रोस्कोप (चित्रा 2) के तहत सेल टुकड़े की एक मोटी परत के नीचे दिखाई दे रहे हैं।
  2. मध्यम के आधे हर 3 दिन बदल जब तक सेल समूहों स्पष्ट रूप से माइक्रोस्कोप (चित्रा 2) के तहत दिखाई दे रहे हैं। आमतौर पर, इस प्रक्रिया में 10 से 20 दिन लगते हैं।
  3. मिश्रण के बाद, कोशिकाओं pipet और 24 अच्छी तरह से थाली के लिए स्थानांतरण। पूरा RPMI 1640 के साथ संस्कृति के माध्यम से की मात्रा दोगुनी हो, जबकि यह पीले रंग बदल जाता है। इस प्रक्रिया को सेल के विकास की दर पर निर्भर करता है।
  4. बाद में, T25 संस्कृति फ्लास्क कोशिकाओं हस्तांतरण। संस्कृति के माध्यम से की मात्रा डबल के रूप में यह पीले रंग बदल जाता है जब तक मध्यम की मात्रा 10 से फैलता है - 15 एमएल।
  5. ठंड से पहले 24 घंटे के मध्यम बदलें। पर 240 x जी पर 5 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र सेल निलंबन। Fr में 10 x 10 6 मिलीग्राम / - 5 के घनत्व पर एक सेल काउंटर और फ्रीज के साथ कोशिकाओं की गणनाozen शेयर समाधान 90% FBS और 10% dimethylsulfoxide (DMSO) युक्त। -80 डिग्री सेल्सियस के लिए प्रति मिनट 1 डिग्री सेल्सियस की दर से रुक और फिर तरल नाइट्रोजन में सीधे हस्तांतरण।

5. 3- (4,5-Dimethylthiazol-2-YL) -2,5-diphenyl-tetrazolium ब्रोमाइड (MTT) परख 17

  1. 10% भ्रूण गोजातीय सीरम युक्त 1,640 माध्यम के साथ एक बी LCLS एकल कक्ष निलंबन तैयार करें। अच्छी तरह पर 96 अच्छी तरह से थाली प्रति बीज 3 एक्स 10 4 कोशिकाओं, अच्छी तरह से प्रति 100 μL।
  2. 16 एच - 12 के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर में थाली रखें।
  3. MTT (5 मिलीग्राम / एमएल) जो कोशिकाओं से बढ़ रहे हैं कुओं में जोड़ें और 37 डिग्री सेल्सियस पर 4 घंटे के लिए प्रकाश से दूर रखना।
  4. पर 168 x जी 10 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र सेल प्लेट।
  5. तैरनेवाला निकालें और अच्छी तरह से प्रति 100 μL DMSO जोड़ें।
    नोट: सावधान रहें। सुई के आकार डाई क्रिस्टल मत छुओ।
  6. कम गति पर 10 मिनट के लिए पूरी तरह से थाली हिला क्रिस्टल भंग करने के लिए।
  7. 570 एनएम द्वारा पर उपाय अवशोषणएक microplate स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग।

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Representative Results

परिवर्तन की प्रक्रिया के दौरान, कोशिकाओं की रूपात्मक परिवर्तन प्रकाश माइक्रोस्कोपी (चित्रा 2) द्वारा कल्पना कर रहे हैं। कोशिकाओं के छोटे समूहों, संक्रमण के 7 दिनों के बाद घनत्व ढाल जुदाई विधि के साथ स्पष्ट रूप से दिखाई दे रहे थे, जबकि केवल सेल टुकड़े की एक मोटी परत लाल रक्त सेल विधि से दिखाई दे रहे हैं। हालांकि, lymphoblastoid सेल समूहों सेल टुकड़े की मोटी परत 30 दिनों के बाद संक्रमण के तहत दिखाई दे रहे हैं। अधिक लगातार मध्यम परिवर्तन के साथ, सेल मलबे घट जाती है और सेल समूहों स्पष्ट रूप से दिखाई दे रहे हैं और एक ही छवि घनत्व ढाल जुदाई विधि द्वारा स्थापित प्रस्तुत करते हैं।

जब सेल लाइनों को सफलतापूर्वक स्थापित किए गए थे, MTT परख बी LCLS की व्यवहार्यता का मूल्यांकन करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। साहित्य 17 के अनुसार, बी-LCLS अलग अलग तरीकों से स्थापित सेल व्यवहार्यता और 16 का पता लगाने के लिए चयन किया गया था40 मध्यम खाली नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया था। आंकड़ों से संकेत मिलता बी LCLS की सेल व्यवहार्यता लाल रक्त सेल विधि के साथ स्थापित घनत्व ढाल जुदाई विधि (चित्रा 3) से बी-LCLS की सेल व्यवहार्यता की तुलना में काफी अधिक है।

आकृति 1
चित्रा 1 फ्लो प्रक्रिया का चार्ट। Anticoagulant रक्त सीएसए के अलावा द्वारा पीछा EBV संक्रमण से पहले लाल रक्त कोशिका lysis बफर के साथ व्यवहार किया जाता है। संक्रमित बी कोशिकाओं 5% सीओ 2 की उपस्थिति स्थापित करने के लिए और बाद में विस्तार बी LCLS में 37 डिग्री सेल्सियस पर उगाए जाते हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
फाईEBV परिवर्तन की प्रक्रिया में सेलुलर morphological परिवर्तन का आंकड़ा 2. दृश्य। बाएं बी LCLS 0.5 एमएल परिधीय खून से लाल रक्त सेल विधि द्वारा स्थापित कर रहे हैं, और सेल मलबे के रूप में समय को कम करने पर चला जाता है। सही सेल लाइनों 2.5 एमएल रक्त नमूने के साथ घनत्व ढाल जुदाई विधि द्वारा स्थापित चलता। स्केल बार 10 माइक्रोन है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा बी LCLS अलग अलग तरीकों से स्थापित करने के लिए सेल व्यवहार्यता के 3. तुलना करें। प्रत्येक बार मतलब ± एसडी प्रतिनिधित्व करता है। परिणाम बताते हैं दो तरीकों (पी = 0.014) के बीच महत्वपूर्ण अंतर नहीं था। कृपया यहां क्लिक करेंयह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए।

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Discussion

हम लाल रक्त कोशिकाओं lysing द्वारा पूरे रक्त से मानव बी कोशिकाओं immortalizing के लिए एक उपन्यास पद्धति के विकास रिपोर्ट, और की स्थापना की बी-LCLS MTT परख द्वारा मूल्यांकन किया गया था उसके सेल व्यवहार्यता। परिणामों से पता चला बी LCLS लाल रक्त सेल विधि द्वारा स्थापित की सेल व्यवहार्यता घनत्व ढाल जुदाई विधि की तुलना में बहुत अधिक है। लाल रक्त सेल विधि का प्रमुख लाभ यह है कि यह आसान है और एक छोटे से एक उच्च सफलता दर और उच्च सेल व्यवहार्यता के साथ एक स्थायी सेल लाइन की स्थापना के लिए रक्त के रूप में (0.5 एमएल छोटा रूप) की मात्रा की आवश्यकता है।

केवल एक साधारण सेल कदम EBV संक्रमण से पहले की जरूरत है। लिम्फोसाइटों के पिछले शुद्धि के बिना, सेल नुकसान और सेलुलर क्षति से बचा रहे हैं। घनत्व ढाल जुदाई पद्धति का एक और बाधा hemolysis है। अनुचित तापमान पर लंबी अवधि के भंडारण के बाद रक्त प्रसंस्करण और परिवहन के दौरान मिलाते hemolysis को जन्म दे सकती, कआईसीएच बहुत लिम्फोसाइटों के अलगाव को प्रभावित करती है। अन्य अध्ययनों से पता चला है कि लाल रक्त कोशिका (आरबीसी) सेल के उपयोग के घनत्व ढाल जुदाई विधि 18 और लिम्फोसाइट उपप्रकार काफी हद तक प्रभावित नहीं कर रहे थे 19 के उपयोग से व्यवहार्य PBMC की अधिक संख्या में हुई। घनत्व ढाल जुदाई विधि है, जो महंगा है और बोझिल है के साथ तुलना में, लाल रक्त सेल विधि विशेष रूप से novices के लिए और अधिक व्यावहारिक नैदानिक ​​नमूनों की एक बड़ी संख्या है और इलाज के लिए ज्यादा आसान होता है।

अध्ययन में, हम लाल रक्त सेल विधि का उपयोग कर एक 100% सफलता दर के साथ 24 नमूने अमर कर दिया है। सफलता cryopreserved लिम्फोसाइट द्वारा रिपोर्ट दर और हौसले से पृथक लिम्फोसाइटों के 90-94% के साथ तुलना में 20 2 के साथ - 2.5 एमएल रक्त, इस सफलता की दर बहुत अधिक है। इस बीच, हम भी बदल ताजा (0.5 एमएल) या संदर्भ 14,15 जुदाई के बिना में वर्णित के रूप में जमे हुए हैं (यहां तक कि 1 एमएल) रक्त, और दक्षतापरिवर्तन की सीवाई कि सूचना 16 (नहीं दिखाया डेटा) की तुलना में काफी कम है।

वर्तमान रणनीति न केवल अमरता दक्षता में काफी सुधार है, लेकिन यह भी बी-LCLS स्थापित करने के लिए आवश्यक खून की मात्रा कम कर देता है। EBV परिवर्तन के लिए मौजूदा प्रौद्योगिकियों परिधीय रक्त की अपेक्षाकृत बड़ी मात्रा में उपयोग करते हैं, लगभग 2 - 2.5 एमएल रक्त 20 लिम्फोसाइट को अलग-थलग करने के लिए, जबकि दूसरों को 10 एमएल या अधिक 10,21 आवश्यकता होती है। इस पूरे रक्त के 0.5 एमएल विधि यहाँ वर्णित के साथ एक अमर सेल लाइन प्राप्त करने के लिए आवश्यक करने के लिए विरोधाभासों। इस पद्धति को सफलतापूर्वक उंगली से एकत्र रक्त अमर करने के लिए संशोधित किया जा सकता है 12 है, जो बहुत बाल चिकित्सा रोगियों और बुजुर्गों से आनुवंशिक संसाधनों के संरक्षण की सुविधा सकता चुभन।

इसके अलावा, बी LCLS लाल रक्त सेल विधि द्वारा स्थापित की सेल व्यवहार्यता घनत्व ढाल जुदाई विधि की तुलना में अधिक हैं। लाल रक्त कोशिका एलविश्लेषण विधि घनत्व ढाल centrifugation, जो कोशिकाओं को गैर मरम्मत योग्य क्षति का कारण बनता की प्रक्रिया में यांत्रिक केन्द्रापसारक बल से बचा जाता है। यह पता चलता है कि लाल रक्त सेल विधि आनुवंशिक और कार्यात्मक अध्ययन है, जो जितनी जल्दी संभव हो कोशिकाओं की बड़ी संख्या की आवश्यकता के लिए अधिक उपयुक्त है। हमारे विधि है जो संसाधनों को बचाने और श्रम कम हो जाएगा cryopreservation संस्कृति दीक्षा, समय कम हो जाएगा।

लाल रक्त सेल पद्धति का एक संभव सीमा दूषित लाल रक्त कोशिका lysates से निकाली गई मलबे, जो EBV संक्रमण के पहले चार हफ्तों में परिवर्तन के स्पष्ट अवलोकन ब्लॉक होगा की उपस्थिति है। हालांकि, इस मलबे धीरे धीरे मध्यम परिवर्तन के साथ हटा दिया जाएगा। एक और सीमा से बढ़ बदल कोशिकाओं का नुकसान हुआ है, लेकिन इस बदलाव के पहले चार हफ्तों में सतह पर तैरनेवाला के आधे को हटाने के द्वारा ameliorated जा सकता है। अशुद्धियों को दूर करने के लिए एक अन्य संभावित संशोधन अधिक हैअधिक से अधिक मात्रा या सेल लाइनों 10 एमएल 1x पीबीएस द्वारा दो बार धोने और फिर 5 मिनट के लिए 168 XG पर centrifuging अशुद्धियों को दूर करने के साथ लगातार मध्यम बदल जाता है।

सारांश में, इस प्रोटोकॉल, उच्च दक्षता के साथ अमरता बी LCLS की स्थापना के रक्त की मात्रा को कम करने और दीक्षा और cryopreservation के बीच के समय को बचाने के लिए एक सरल रणनीति प्रदान करता है। सेल लाइनों वर्तमान अध्ययन में विकसित biomaterials के एक मूल्यवान और लागत प्रभावी स्रोत विभिन्न अध्ययनों के लिए बाहर ले प्रदान करते हैं।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Centrifuge Techcomp CT6T Centrifugation
Automated Cell Counter  Countstar  IC 1000  For cell counting 
Epoch Microplate Spectrophotometer BioTek Instruments SN263839 For measuring the absorbance
96 well cell culture cluster Corning Incorporated 3599 Polystyrene plates
24 well cell culture cluster Corning Incorporated 3524 Polystyrene plates
25 cm2 cell culture flask Nest 707001 Polystyrene 
FBS Gibco 10270 Component of B-LCLs medium
RPMI Medium 1640 Gibco 31800-022 For B-LCLs medium
L-Glutamine   Amresco 0374 Component of B-LCLs medium
100x streptomycin penicillin solution BioRoYeeBRY-2309 BioRoYee BRY-2309 Component of B-LCLs medium
Ficoll paque plus GE  Healthcare 17-1440-03 For in vitro isolation of lymphocyte
PHA-M Sigma L8902 For stimulating lymphocyte proliferation
Cyclosporin A Cayman  Chemical 12088 For inhibiting the cytotoxicity effect of T cells
Red cell lysis buffer Tiangen RT122-01 For lysing red blood cell
MTT Amresco 0793 For the detection of cell viability
DMSO Sigma D2650 For freezing cells

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References

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Liu, X., Xu, C., Duan, Z. A Simple Red Blood Cell Lysis Method for the Establishment of B Lymphoblastoid Cell Lines. J. Vis. Exp. (119), e55191, doi:10.3791/55191 (2017).… More

Liu, X., Xu, C., Duan, Z. A Simple Red Blood Cell Lysis Method for the Establishment of B Lymphoblastoid Cell Lines. J. Vis. Exp. (119), e55191, doi:10.3791/55191 (2017).

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