Summary
Um método simples de lise de glóbulos vermelhos para o estabelecimento de B-LCLS foi desenvolvido com alta eficiência de imortalização, requerendo uma pequena quantidade de sangue e de economia de tempo desde a iniciação à criopreservação.
Protocol
Este estudo foi aprovado pelo Comitê do Instituto de Genética e Biologia do Desenvolvimento de Ética e o protocolo segue as diretrizes institucionais para o bem-estar humano.
1. Preparação de vírus EB
- No dia 1, descongelar células B95-8 e cultura em 6 ml de RPMI completo 1640, suplementado com 10% de soro fetal de bovino, 2 mM de L-glutamina, e antibióticos (100 ug / ml de estreptomicina, 100 U / mL de penicilina) numa balão de cultura T25. Colocar o frasco de cultura em 5% de CO2 a 37 ° C.
- No dia 2, observar a morfologia das células sob um microscópio. As células estão em boas condições quando eles são brilhantes e redondos. Adicionar 10 ml de meio completo RPMI 1640.
- No dia 4, adicionar 10 mL de meio fresco completo RPMI 1640, e depois transferir para um balão de cultura T75.
- No dia 8, adicionar 20 mL de meio completo RPMI 1640.
- Manter as células durante 8 dias sem a adição de meio fresco, ou seja, inanição.
- No dia 16, células observarobservada sob o microscópio. Recolher as células num tubo de centrífuga de 15 mL, 12 mL / tubo.
- Cryo-preservar a -80 ° C durante 1 h, e depois descongelar rapidamente a 37 ° C. Repetir 3 vezes até que as partículas de vírus são libertados a partir das células.
- Centrifugar a 240 xg durante 10 min à temperatura ambiente.
- Filtra-se o sobrenadante através de um filtro de 0,22 um, alíquota, 12 mL / tubo, e armazenar a -80 ° C.
2. Tratamento de Sangue Total com Glóbulo Vermelho Tampão de Lise
- Adicionar 0,5 ml de sangue total anticoagulado por EDTA · K 2 para um tubo de 15 mL.
- Coloque 1 mL de tampão de lise de glóbulos vermelhos (filtrada por filtro de 0,22? M e descongeladas à temperatura ambiente antes da utilização) a todo o sangue e misture bem. Coloque a mistura à temperatura ambiente durante 4 min. Em seguida, adicionar 5-7 mL de PBS 1x rapidamente para a reacção parada.
- Centrifugar a 240 xg durante 5 min à temperatura ambiente. Os glóbulos brancos precipitará no fundo do tubo.
- Descartar o sobrenadante e lava-se a precipitação por adição de 7 ml 1640 de base. Centrifugar durante 5 minutos a 240 xg à temperatura ambiente. Repita duas vezes.
- Ressuspender o sedimento celular em 300 uL meio de transformação (meio RPMI 1640, contendo 20% de soro fetal de bovino e 10 ug / mL de f ito-hemaglutinina (PHA)).
Infecção 3. EBV
- Adicionar 60 uL de 20 ug / mL de ciclosporina A (CsA) para a suspensão de células.
- Descongelar rapidamente uma aliquota de EBV, a 37 ° C. Adicionar 240 uL de EBV para a suspensão de células.
- Misturar bem e coloque a suspensão de células para uma placa de 96 poços, 200 ul por poço. Para evitar a evaporação, adicionar 200 ul de 1x PBS a cada poço em torno da placa de 96 poços. Colocar a placa num incubador de CO2 a 5% a 37 ° C.
4. Expansão e Criopreservação de B-LCLS
- Mudar metade do meio, uma vez por semana durante o primeiro mês após a infecção por EBV. Apenas um laye de espessurar de fragmentos celulares é visível ao microscópio no dia 7 (Figura 2). Após um mês de infecção por VEB, os agregados de células linfoblastóides são visíveis sob uma espessa camada de fragmentos de células sob o microscópio (Figura 2).
- Mudar metade do meio a cada 3 dias até que os agregados de células são claramente visíveis ao microscópio (Figura 2). Tipicamente, este processo demora entre 10 a 20 dias.
- Depois de se misturar, pipetar as células e transferir para a placa de 24 poços. Dobrar o volume de meio de cultura com RPMI 1640 completo, enquanto ele fica amarelo. Este processo depende da taxa de crescimento celular.
- Posteriormente, a transferência das células para balão de cultura T25. O dobro do volume de meio de cultura, uma vez que se torna amarela até que o volume do meio expande-se para 10 - 15 mL.
- Mudança de meio 24 horas antes da congelação. suspensão de células Centrifugar durante 5 minutos a 240 x g. Contar as células com um contador de células e congelamento a uma densidade de 5-10 x 10 6 / mL em FRsolução estoque ozen contendo 90% de FBS e 10% de dimetilsulfóxido (DMSO). Congelar a uma taxa de 1 ° C por minuto a -80 ° C e, em seguida, transferir directamente em azoto líquido.
5. 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difenil-tetrazólio (MTT) 17
- Prepara-se uma suspensão de células individuais B-LCLS com o meio 1640 contendo soro bovino fetal a 10%. Semente de 3 x 10 4 culas por po em placas de 96 poços, 100 ul por poço.
- Colocar a placa em 5% de CO2 a 37 ° C durante 12-16 h.
- Adicionar MTT (5 mg / mL) aos poços em que as células estão a crescer e manter ao abrigo da luz durante 4 h a 37 ° C.
- placa de células Centrifugar durante 10 minutos a 168 x g.
- Remover o sobrenadante e adicionar 100 ul por poço de DMSO.
NOTA: Tenha cuidado. Não toque nos corante cristais em forma de agulha. - Agitar a placa durante 10 minutos a baixa velocidade para dissolver completamente os cristais.
- absorção medida a 570 nm porutilizando um espectrofotómetro de microplacas.
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Representative Results
Durante o processo de transformação, as modificações morfológicas das células são visualizados por microscopia de luz (Figura 2). Pequenos grupos de células foram claramente visíveis com o método de separação por gradiente de densidade depois de 7 dias de infecção, ao passo que apenas uma camada de espessura de fragmentos celulares são visíveis a partir do método de lise de glóbulos vermelhos. No entanto, grupos de células linfoblastóides são visíveis sob a espessa camada de fragmentos de células 30 dias após a infecção. Com a mudança mais frequente do meio diminui detritos celulares e os grupos de células são claramente visíveis e apresentar a mesma imagem estabelecido pelo método de gradiente de densidade de separação.
Quando as linhas celulares foram estabelecidas com êxito, o ensaio de MTT foi utilizado para avaliar a viabilidade de B-LCLS. De acordo com a literatura 17, B-LCLS estabelecido por diferentes métodos foram seleccionados para detectar a viabilidade celular e 1640 meio foi utilizado como testemunha. Os dados indicam que a viabilidade da célula de B-LCLS estabelecida com o método de lise de células vermelhas do sangue é significativamente mais elevado do que a viabilidade de células de B-LCLS do método de separação por gradiente de densidade (Figura 3).
Figura 1. Fluxograma do Processo. anticoagulante sanguíneo é tratado com tampão de lise de células vermelhas do sangue antes da infecção pelo EBV, seguido pela adição de CsA. As células B infectadas são cultivadas a 37 ° C na presença de 5% de CO 2 para estabelecer e, subsequentemente, expandir-B LCLS. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Visualização de celulares morfológicas mudanças no processo de transformação EBV. A esquerda são B-LCLS estabelecido pelo método de lise de glóbulos vermelhos com 0,5 mL de sangue periférico, e os restos celulares diminuindo à medida que o tempo passa. A direita mostra linhas celulares estabelecidas pelo método de separação de gradiente de densidade com 2,5 mL amostra de sangue. barra de escala é de 10 mm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. Comparação da viabilidade celular para B-LCLS estabelecidos através de métodos diferentes. Cada barra representa SD ± média. Os resultados mostram que houve diferença significativa entre os dois métodos (p = 0,014). Por favor, clique aquipara ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Relata-se o desenvolvimento de um novo método para imortalizar células B humanas a partir de sangue total por lise de células vermelhas do sangue, e a sua viabilidade celular estabelecida de B-LCLS foi avaliada pelo ensaio de MTT. Os resultados mostraram que a viabilidade da célula de B-LCLS estabelecidos pelo método da lise de células vermelhas do sangue é muito maior do que a do método de separação por gradiente de densidade. A principal vantagem do método de lise de glóbulos vermelhos é que é simples e não requer um pequeno volume (tão pouco quanto 0,5 mL) de sangue para o estabelecimento de uma linha celular permanente com uma elevada taxa de sucesso e viabilidade celular elevada.
Apenas um passo de lise simples é necessária antes da infecção EBV. Sem purificação prévia dos linfócitos, a perda de células e os danos celulares são evitados. Outro obstáculo do método de densidade de separação por gradiente é a hemólise. O processamento do sangue após armazenamento a longo prazo a temperaturas inadequadas e agitação durante o transporte podem conduzir a hemólise, WHich irá influenciar grandemente o isolamento de linfócitos. Outros estudos mostraram que o uso de células vermelhas do sangue (RBC) resultou em lise números mais elevados de PBMC viáveis do que a utilização do método de separação por gradiente de densidade e 18 subtipos de linfócitos não foram influenciados substancialmente 19. Comparado com o método de separação por gradiente de densidade, o que é dispendioso e complicado, o método de lise de células vermelhas do sangue é muito mais fácil, especialmente para o tratamento de um grande número de amostras clínicas e mais prática para principiantes.
No estudo, foram imortalizadas 24 amostras com uma taxa de sucesso de 100% usando o método de lise de glóbulos vermelhos. Em comparação com a 90-94% de taxa de sucesso reportada por linfócitos criopreservados e linfócitos isolados de fresco 20 com 2-2,5 mL de sangue, esta taxa de sucesso é muito maior. Entretanto, também transformada fresco (0,5 mL) ou congelado sangue (mesmo 1 mL) como descrito nas referências 14,15 sem separação, e a eficiêncy de transformação é muito mais baixa do que a relatada 16 (dados não mostrados).
A actual estratégia não só melhora a eficiência de imortalização de forma significativa, mas também reduz o volume de sangue necessário para estabelecer B-LCLS. As tecnologias correntes para a transformação EBV utilizar volumes relativamente grandes de sangue periférico, cerca de 2-2,5 ml de sangue 20 para isolar linfócitos, enquanto outros requerem 10 mL ou mais 10,21. Isto contrasta com os 0,5 ml de sangue total necessário para se obter uma linha celular imortalizada com o método descrito aqui. Este método poderia ser modificado para imortalizar com sucesso sangue recolhido do dedo pica 12, o que poderia facilitar grandemente preservar os recursos genéticos de pacientes pediátricos e idosos.
Além disso, a viabilidade da célula de B-LCLS estabelecidos pelo método da lise de glóbulos vermelhos são mais elevados do que o método de separação por gradiente de densidade. A l de glóbulos vermelhosysis método evita a força centrífuga mecânica no processo de centrifugação em gradiente de densidade, o que provoca danos irreparáveis às células. Ele sugere que o método de lise de células vermelhas do sangue é mais adequado para estudos genéticos e funcionais, o que requer um grande número de células tão rapidamente quanto possível. Nosso método irá diminuir o tempo de iniciação cultura para criopreservação, que vai economizar recursos e reduzir o trabalho.
Uma possível limitação do método de lise de glóbulos vermelhos, é a presença de contaminação de detritos provenientes de lisados de células de sangue vermelhas, o que iria bloquear a observação clara de transformação nas primeiras quatro semanas de infecção por EBV. No entanto, este detritos serão gradualmente removidas com o meio de mudanças. Outra limitação é a perda de crescimento de células transformadas, mas isto pode ser melhorado através da remoção de metade do sobrenadante nas primeiras quatro semanas de transformação. Uma outra modificação possível é para remover as impurezas maisfrequentes mudanças de meio com volumes maiores ou lavar as linhas celulares duas vezes por 10 mL de 1x PBS e depois centrifugação a 168 xg durante 5 min para remover as impurezas.
Em resumo, este protocolo prevê uma estratégia simples para o estabelecimento de B-LCLS com alta eficiência imortalização, reduzindo o volume de sangue e economia de tempo entre o início e criopreservação. As linhas de células desenvolvidas no presente estudo fornecem uma fonte valiosa e de baixo custo de levar a cabo vários biomateriais estudos.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Centrifuge | Techcomp | CT6T | Centrifugation |
| Automated Cell Counter | Countstar | IC 1000 | For cell counting |
| Epoch Microplate Spectrophotometer | BioTek Instruments | SN263839 | For measuring the absorbance |
| 96 well cell culture cluster | Corning Incorporated | 3599 | Polystyrene plates |
| 24 well cell culture cluster | Corning Incorporated | 3524 | Polystyrene plates |
| 25 cm2 cell culture flask | Nest | 707001 | Polystyrene |
| FBS | Gibco | 10270 | Component of B-LCLs medium |
| RPMI Medium 1640 | Gibco | 31800-022 | For B-LCLs medium |
| L-Glutamine | Amresco | 0374 | Component of B-LCLs medium |
| 100x streptomycin penicillin solution BioRoYeeBRY-2309 | BioRoYee | BRY-2309 | Component of B-LCLs medium |
| Ficoll paque plus | GE Healthcare | 17-1440-03 | For in vitro isolation of lymphocyte |
| PHA-M | Sigma | L8902 | For stimulating lymphocyte proliferation |
| Cyclosporin A | Cayman Chemical | 12088 | For inhibiting the cytotoxicity effect of T cells |
| Red cell lysis buffer | Tiangen | RT122-01 | For lysing red blood cell |
| MTT | Amresco | 0793 | For the detection of cell viability |
| DMSO | Sigma | D2650 | For freezing cells |
References
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