Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

وبسيط خلية الدم الحمراء تحلل طريقة لإنشاء خطوط الخلايا B Lymphoblastoid

Published: January 14, 2017 doi: 10.3791/55191
Automatic Translation
1,2, 2, 2
1Wuhan Institute of Virology, Chinese Academy of Sciences, 2Genetic Resources Center, Institute of Genetics and Developmental Biology, Chinese Academy of Sciences

Summary

وقد تم تطوير خلايا الدم الحمراء طريقة تحلل بسيط لإنشاء B-LCLs مع كفاءة عالية تخليد، الأمر الذي يتطلب كمية صغيرة من الدم وتوفير الوقت من بدء لالحفظ بالتبريد.

Protocol

تمت الموافقة على هذه الدراسة من قبل لجنة الأخلاقيات من معهد علم الوراثة وعلم الأحياء التنموي، وبروتوكول يتبع المبادئ التوجيهية المؤسسية لرفاهية الإنسان.

1. إعداد EB الفيروسات

  1. في يوم 1، ذوبان الجليد B95-8 الخلايا والثقافة في 6 مل كاملة RPMI 1640 المتوسطة، على أن تستكمل مع 10٪ مصل الجنين البقري، 2 مم L-الجلوتامين، والمضادات الحيوية (100 ميكروغرام / مل الستربتومايسين، و 100 U / مل البنسلين) في T25 الثقافة قارورة. ضع قارورة الثقافة في 5٪ CO 2 حاضنة عند 37 درجة مئوية.
  2. في يوم 2، ومراقبة مورفولوجيا الخلايا تحت المجهر. الخلايا هي في حالة جيدة عندما تكون مشرق وجولة. إضافة 10 مل الكامل المتوسط ​​1640 RPMI.
  3. في يوم 4، إضافة 10 مل جديدة كاملة RPMI 1640 المتوسطة، ومن ثم نقل إلى قارورة ثقافة T75.
  4. في يوم 8، إضافة 20 مل الكامل المتوسط ​​1640 RPMI.
  5. الحفاظ على الخلايا لمدة 8 أيام دون إضافة متوسطة جديدة، أي الموت جوعا.
  6. في يوم 16، ومراقبة الخلايالاحظ تحت المجهر. جمع الخلايا في أنبوب الطرد المركزي 15 مل، 12 مل / أنبوب.
  7. البرد الحفاظ على -80 درجة مئوية لمدة 1 ساعة، ومن ثم ذوبان الجليد بسرعة عند 37 درجة مئوية. كرر 3 مرات حتى يتم الإفراج عن جزيئات الفيروس من الخلايا.
  8. أجهزة الطرد المركزي في 240 x ج لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  9. تصفية طاف من خلال مرشح 0.22 ميكرون، قسامة، 12 مل / أنبوب، ومخزن في -80 درجة مئوية.

2. علاج من الدم الكامل مع خلايا الدم الحمراء الاحتياطي تحلل

  1. إضافة 0.5 مل من الدم الكامل anticoagulated من EDTA · K 2 إلى أنبوب 15 مل.
  2. وضع 1 مل عازلة خلايا الدم الحمراء تحلل (المصفاة بنسبة 0.22 ميكرون تصفية وإذابة إلى درجة حرارة الغرفة قبل الاستخدام) إلى الدم الكامل وتخلط جيدا. ضع الخليط في درجة حرارة الغرفة لمدة 4 دقائق. ثم إضافة 5-7 مل برنامج تلفزيوني 1X بسرعة إلى رد فعل توقف.
  3. أجهزة الطرد المركزي في 240 x ج لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. وخلايا الدم البيضاء يعجل في الجزء السفلي من الأنبوب.
  4. تجاهل طاف، وتغسل الأمطار عن طريق إضافة 7 مل 1640 وسط قاعدي. أجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 240 x ج في درجة حرارة الغرفة. كرر مرتين.
  5. Resuspend وبيليه الخلية في 300 متوسطة التحول ميكرولتر (المتوسط ​​1640 RPMI، التي تحتوي على 20٪ الجنين المصل البقري و 10 ميكروغرام / مل راصة دموية نباتية (فا)).

3. EBV العدوى

  1. إضافة 60 ميكرولتر من 20 ميكروغرام / مل السيكلوسبورين ألف (CSA) إلى تعليق خلية.
  2. بسرعة ذوبان قسامة من EBV عند 37 درجة مئوية. إضافة 240 ميكرولتر EBV إلى تعليق الخلية.
  3. تخلط جيدا ووضع تعليق خلية لوحة 96-جيدا، 200 ميكرولتر لكل بئر. لتجنب التبخر، إضافة 200 ميكرولتر برنامج تلفزيوني 1X إلى كل جيدا في جميع أنحاء لوحة 96-جيدا. وضع لوحة في 5٪ CO 2 حاضنة عند 37 درجة مئوية.

4. التوسع والحفظ بالتبريد من B-LCLs

  1. تغيير نصف المتوسط ​​مرة واحدة في الأسبوع لمدة الشهر الأول بعد الإصابة EBV. فقط أونلي سميكةص شظايا خلية مرئيا تحت المجهر في يوم 7 (الشكل 2). بعد شهر واحد من العدوى EBV، مجموعات الخلايا lymphoblastoid مرئية تحت طبقة سميكة من شظايا خلية تحت المجهر (الشكل 2).
  2. تغيير نصف المتوسط كل 3 أيام حتى مجموعات الخلايا مرئية تحت المجهر (الشكل 2) بوضوح. عادة، هذه العملية تستغرق من 10 إلى 20 يوما.
  3. بعد الاختلاط، الماصة الخلايا ونقل إلى لوحة 24 أيضا. مضاعفة حجم مستنبت مع كامل RPMI 1640 في حين أنه يتحول إلى اللون الأصفر. تعتمد هذه العملية على معدل نمو الخلايا.
  4. وفي وقت لاحق، نقل الخلايا إلى T25 قارورة الثقافة. مضاعفة حجم مستنبت لأنه يتحول إلى اللون الأصفر حتى حجم المتوسطة يتوسع إلى 10-15 مل.
  5. تغيير المتوسطة 24 ساعة قبل التجميد. تعليق خلية الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 240 × ز. عدد الخلايا التي تحتوي على عداد الخلايا وتجميد في مناطق ذات كثافة من 5-10 × 10 6 / مل في الابحل سهم ÖZEN تحتوي على 90٪ FBS و 10٪ ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO). تجميد بمعدل 1 درجة مئوية لكل دقيقة إلى -80 درجة مئوية ثم نقل مباشرة إلى النيتروجين السائل.

5. 3- (4،5-Dimethylthiazol-2-YL) -2،5-ثنائي-نتروبلو بروميد (الإنتقالي العسكري) الفحص 17

  1. إعداد B-LCLs تعليق خلية واحدة مع المتوسط ​​1640 تحتوي على 10٪ مصل بقري جنيني. البذور 3 × 10 4 خلايا لكل بئر على لوحة 96-جيدا، و 100 ميكرولتر لكل بئر.
  2. وضع لوحة في 5٪ CO 2 حاضنة عند 37 درجة مئوية لمدة 12-16 ساعة.
  3. إضافة الإنتقالي العسكري (5 ملغ / مل) إلى الآبار التي الخلايا تنمو والابتعاد عن الضوء لمدة 4 ساعات في 37 درجة مئوية.
  4. أجهزة الطرد المركزي لوحة خلية لمدة 10 دقيقة في 168 × ز.
  5. إزالة طاف وإضافة 100 ميكرولتر DMSO لكل بئر.
    ملاحظة: كن حذرا. لا تلمس البلورات صبغ على شكل إبرة.
  6. يهز لوحة لمدة 10 دقيقة على سرعة منخفضة إلى حل كامل بلورات.
  7. امتصاص التدبير في 570 نانومترباستخدام مطياف صفيحة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

خلال عملية التحول، وتصور التغييرات الشكلية الخلايا بواسطة المجهر الضوئي (الشكل 2). وكانت مجموعات صغيرة من الخلايا المرئية بشكل واضح مع أسلوب الفصل التدرج الكثافة بعد 7 أيام من الإصابة، في حين فقط طبقة سميكة من شظايا خلية مرئية من الدم الحمراء طريقة خلية تحلل. ومع ذلك، مجموعات الخلايا lymphoblastoid مرئية تحت طبقة سميكة من شظايا خلية 30 إصابة آخر أيام. مع تغيير المتوسطة أكثر تواترا، وانخفاض الحطام الخلية ومجموعات الخلايا هي واضحة للعيان وهذا نفس الصورة التي وضعتها طريقة كثافة الفصل المتدرج.

عندما أنشئت خطوط الخلايا بنجاح، تم استخدام الفحص الإنتقالي العسكري لتقييم جدوى B-LCLs. وفقا لأدبيات 17، وقد تم اختيار B-LCLs التي وضعتها أساليب مختلفة للكشف عن بقاء الخلية و16تم استخدام 40 المتوسطة عن السيطرة فارغة. وتشير البيانات إلى أن بقاء الخلية من B-LCLs أنشئت مع خلايا الدم الحمراء طريقة تحلل هي أعلى بكثير من بقاء الخلية من B-LCLs من أسلوب الفصل التدرج الكثافة (الشكل 3).

شكل 1
الشكل 1. مخطط تدفق الداخلي. يتم التعامل مع الدم تخثر العازلة مع خلية تحلل الدم الحمراء قبل الإصابة EBV تليها إضافة الإساءة الجنسية للطفل. تزرع الخلايا البائية المصابة عند 37 درجة مئوية في وجود 5٪ CO 2 إلى تأسيس ومن ثم توسيع B-LCLs. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2
فايجوري 2. تصور التغيرات المورفولوجية الخلوية في عملية التحول EBV. اليسار وB-LCLs التي وضعتها الدم الحمراء طريقة خلية تحلل مع 0.5 مل الدم المحيطي، والحطام الخلية تناقص مع مرور الوقت. ويظهر الحق خطوط الخلايا التي وضعتها طريقة كثافة الفصل التدرج مع 2.5 مل عينة الدم. شريط النطاق هو 10 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (3)
الشكل 3. مقارنة بين بقاء الخلية لB-LCLs أنشأها طرق مختلفة. يمثل كل شريط يعني SD ±. وتظهر النتائج أن هناك فرق كبير بين الطريقتين (ع = 0.014). الرجاء الضغط هنالعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

نقدم تقريرا عن تطوير طريقة جديدة لتخليد الخلايا البائية الإنسان من الدم الكامل من قبل الناشر خلايا الدم الحمراء، وبقاء الخلية لإنشاء B-LCLs تم تقييمها من قبل الفحص الإنتقالي العسكري. وأظهرت النتائج أن بقاء الخلية من B-LCLs التي وضعتها خلايا الدم طريقة تحلل الأحمر أعلى بكثير من كثافة طريقة فصل الانحدار. والميزة الرئيسية لخلايا الدم الحمراء طريقة تحلل هو أنه بسيط ويتطلب حجم صغير (أقل من 0.5 مل) من الدم لإنشاء خط خلية دائمة مع نسبة نجاح عالية وبقاء الخلية عالية.

فقط هناك حاجة إلى خطوة واحدة تحلل بسيطة قبل الإصابة EBV. دون تنقية السابقة من الخلايا الليمفاوية، وتجنب فقدان الخلايا وتلف الخلايا. عقبة أخرى من أسلوب التدرج الكثافة الفصل هو انحلال الدم. تجهيز الدم بعد التخزين على المدى الطويل في درجات حرارة غير مناسبة واهتزاز أثناء النقل قد تؤدي إلى انحلال الدم، ذوي الخوذات البيضاءالتراث الثقافي غير المادي سوف تؤثر بشكل كبير على عزل الخلايا الليمفاوية. وأظهرت دراسات أخرى أن استخدام خلايا الدم الحمراء (RBC) تحلل أدى إلى ارتفاع أعداد PBMC قابلة للحياة من استخدام طريقة فصل كثافة التدرج قتل 18 واللمفاويات فرعية لم تتأثر بشكل كبير 19. مقارنة مع أسلوب كثافة الفصل الانحدار، وهي عملية مكلفة ومرهقة، وطريقة خلايا الدم الحمراء تحلل هو أسهل بكثير، وخاصة لعلاج عدد كبير من العينات السريرية وأكثر عملية بالنسبة للمستخدمين المبتدئين.

في هذه الدراسة، قمنا خلد 24 عينة مع نسبة نجاح 100٪ باستخدام الدم الحمراء طريقة خلية تحلل. مقارنة مع 90-94٪ من نسبة النجاح التي أبلغ عنها الخلايا الليمفاوية cryopreserved والخلايا الليمفاوية المعزولة حديثا 20 مع 2-2،5 مل الدم، وهذا معدل النجاح هو أعلى من ذلك بكثير. وفي الوقت نفسه، ونحن أيضا تحولت الطازجة (0.5 مل) أو المجمدة (حتى 1 مل) في الدم كما هو موضح في المراجع 14،15 دون فصل، وكفاءهقبرصي التحول هو أقل بكثير من تلك التي ذكرت 16 (لا تظهر البيانات).

الاستراتيجية الحالية لا يحسن كفاءة تخليد بشكل كبير، ولكن أيضا يقلل من حجم الدم اللازمة لإنشاء B-LCLs. التكنولوجيات الحالية للتحول EBV استخدام كميات كبيرة نسبيا من الدم المحيطي، ما يقرب من 2-2،5 مل دم 20 لعزل الخلايا الليمفاوية في حين أن البعض الآخر يتطلب 10 مل أو أكثر 10،21. وهذا يتناقض مع 0.5 مل من الدم الكامل اللازمة للحصول على خط الخلية خلده مع الطريقة الموصوفة هنا. يمكن تعديل هذا الأسلوب لتخليد الدم التي تم جمعها من الإصبع بنجاح الغرزات 12، الذي يمكن أن يسهل إلى حد كبير المحافظة على الموارد الوراثية من المرضى من الأطفال وكبار السن.

وبالإضافة إلى ذلك، فإن بقاء الخلية من B-LCLs التي وضعتها الدم طريقة خلية تحلل الأحمر هي أعلى من كثافة طريقة فصل الانحدار. الخلية ليتر من الدم الأحمرطريقة يسيس يتجنب قوة الطرد المركزي الميكانيكية في عملية الطرد المركزي التدرج الكثافة، والذي يسبب الضرر غير للإصلاح إلى الخلايا. إنه يعني أن طريقة خلايا الدم الحمراء تحلل هو أكثر ملاءمة للدراسات الجينية والوظيفية، الأمر الذي يتطلب أعداد كبيرة من الخلايا في أسرع وقت ممكن. سوف أسلوبنا يقلل من الوقت من بدء الثقافة الحفظ بالتبريد، والذي سيوفر الموارد والحد من العمل.

وإمكانية تحديد طريقة خلايا الدم الحمراء تحلل هو وجود تلوث الحطام المستمدة من لست] خلايا الدم الحمراء، التي من شأنها منع الملاحظة واضحة من التحول في الأسابيع الأربعة الأولى من العدوى EBV. ومع ذلك، ستتم إزالة هذا الحطام تدريجيا مع التغيرات المتوسطة. الحد آخر هو فقدان الخلايا تحولت متزايد، ولكن يمكن تحسينها عن طريق إزالة نصف من طاف في الأسابيع الأربعة الأولى من التحول. تعديل آخر ممكن لإزالة الشوائب أكثرالتغييرات متوسطة متكررة مع كميات أكبر أو غسل خطوط الخلايا مرتين من قبل 10 مل برنامج تلفزيوني 1X ثم الطرد المركزي في 168 x ج لمدة 5 دقائق لإزالة الشوائب.

وباختصار، يوفر هذا البروتوكول استراتيجية بسيطة لإنشاء B-LCLs مع كفاءة تخليد عالية، والحد من حجم الدم وتوفير الوقت بين بدء والحفظ بالتبريد. خطوط الخلايا المتقدمة في هذه الدراسة توفر مصدرا قيما وفعالة من حيث التكلفة من المواد الحيوية إجراء الدراسات المختلفة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Centrifuge Techcomp CT6T Centrifugation
Automated Cell Counter  Countstar  IC 1000  For cell counting 
Epoch Microplate Spectrophotometer BioTek Instruments SN263839 For measuring the absorbance
96 well cell culture cluster Corning Incorporated 3599 Polystyrene plates
24 well cell culture cluster Corning Incorporated 3524 Polystyrene plates
25 cm2 cell culture flask Nest 707001 Polystyrene 
FBS Gibco 10270 Component of B-LCLs medium
RPMI Medium 1640 Gibco 31800-022 For B-LCLs medium
L-Glutamine   Amresco 0374 Component of B-LCLs medium
100x streptomycin penicillin solution BioRoYeeBRY-2309 BioRoYee BRY-2309 Component of B-LCLs medium
Ficoll paque plus GE  Healthcare 17-1440-03 For in vitro isolation of lymphocyte
PHA-M Sigma L8902 For stimulating lymphocyte proliferation
Cyclosporin A Cayman  Chemical 12088 For inhibiting the cytotoxicity effect of T cells
Red cell lysis buffer Tiangen RT122-01 For lysing red blood cell
MTT Amresco 0793 For the detection of cell viability
DMSO Sigma D2650 For freezing cells

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mohyuddin, A., et al. Genetic instability in EBV-transformed lymphoblastoid cell lines. Biochim Biophys Acta. 1670 (1), 81-83 (2004).
  2. Hu, V. W., Frank, B. C., Heine, S., Lee, N. H., Quackenbush, J. Gene expression profiling of lymphoblastoid cell lines from monozygotic twins discordant in severity of autism reveals differential regulation of neurologically relevant genes. BMC Genomics. 7, 118 (2006).
  3. Toda, T., Sugimoto, M. Proteome analysis of Epstein-Barr virus-transformed B-lymphoblasts and the proteome database. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 787 (1), 197-206 (2003).
  4. Chiorazzi, N., Wasserman, R. L., Kunkel, H. G. Use of Epstein-Barr virus-transformed B cell lines for the generation of immunoglobulin-producing human B cell hybridomas. J Exp Med. 156 (3), 930-935 (1982).
  5. Traggiai, E., et al. An efficient method to make human monoclonal antibodies from memory B cells: potent neutralization of SARS coronavirus. Nat Med. 10 (8), 871-875 (2004).
  6. Hussain, T., Kotnis, A., Sarin, R., Mulherkar, R. Establishment & characterization of lymphoblastoid cell lines from patients with multiple primary neoplasms in the upper aero-digestive tract & healthy individuals. Indian J Med Res. 135 (6), 820-829 (2012).
  7. Neitzel, H. A Routine Method for the Establishment of Permanent Growing Lymphoblastoid Cell-Lines. Hum Genet. 73 (4), 320-326 (1986).
  8. Oh, H. M., et al. An efficient method for the rapid establishment of Epstein-Barr virus immortalization of human B lymphocytes. Cell Prolif. 36 (4), 191-197 (2003).
  9. Louie, L. G., King, M. C. A Novel-Approach to Establishing Permanent Lymphoblastoid Cell-Lines - Epstein-Barr-Virus Transformation of Cryopreserved Lymphocytes. Am J Hum Genet. 48 (3), 637-638 (1991).
  10. Tremblay, S., Khandjian, E. V. Successful use of long-term frozen lymphocytes for the establishment of lymphoblastoid cell lines. Clin Biochem. 31 (7), 555-556 (1998).
  11. Reidy, J. A., Wheeler, V. A. Sample age and Epstein-Barr virus transformation of cryopreserved lymphocytes. In Vitro Cell Dev Biol. 28 (6), 383-384 (1992).
  12. Amoli, M. M., Carthy, D., Platt, H., Ollier, W. E. R. EBV immortalization of human B lymphocytes separated from small volumes of cryo-preserved whole blood. Int J Epidemiol. 37, suppl 1 41-45 (2008).
  13. Lacelle, C., Wang, E. Establishing lymphoblastoid cell lines from frozen blood of extremely old individuals. Mech Ageing Dev. 123 (10), 1415-1418 (2002).
  14. Tohda, H., Oikawa, A., Kudo, T., Tachibana, T. A greatly simplified method of establishing B-lymphoblastoid cell lines. Cancer Res. 38 (10), 3560-3562 (1978).
  15. Ventura, M., et al. Use of a Simple Method for the Epstein-Barr Virus Transformation of Lymphocytes from Members of Large Families of Reunion Island. Hum Hered. 38 (1), 36-43 (1988).
  16. Chenevixtrench, G., Kerr, B., Walters, M. Lymphoblastoid Cell-Lines from Frozen Whole-Blood - a Quick and Economical Safeguard for Linkage Analysis. Am J Hum Genet. 46 (1), 635-636 (1990).
  17. Hansen, M. B., Nielsen, S. E., Berg, K. Re-Examination and Further Development of a Precise and Rapid Dye Method for Measuring Cell-Growth Cell Kill. J Immunol Methods. 119 (2), 203-210 (1989).
  18. Bogoslovsky, T., et al. Preservation and enumeration of endothelial progenitor and endothelial cells from peripheral blood for clinical trials. Biomark Med. 9 (7), 625-637 (2015).
  19. Ambach, A., Bonnekoh, B., Gollnick, H. Routine flow cytometric immuno-staining of T-cell perforin is preserved using diethylene glycol for erythrocyte-lysis but lost by the use of ammonium chloride. Exp Dermatol. 12 (6), 825-831 (2003).
  20. Beck, J. C., Beiswanger, C. M., John, E. M., Satariano, E., West, D. Successful transformation of cryopreserved lymphocytes: A resource for epidemiological studies. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 10 (5), 551-554 (2001).
  21. Tosato, G., Cohen, J. I. Generation of Epstein-Barr Virus (EBV)-immortalized B cell lines. Curr Protoc Immunol. , Chapter 7, Unit 7 22 (2007).

Tags

علم المناعة، العدد 119، EBV، الدم الحمراء طريقة خلية تحلل، والتحول، B-LCLs، PBMC، كثافة التدرج طريقة الفصل
وبسيط خلية الدم الحمراء تحلل طريقة لإنشاء خطوط الخلايا B Lymphoblastoid
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Liu, X., Xu, C., Duan, Z. A Simple… More

Liu, X., Xu, C., Duan, Z. A Simple Red Blood Cell Lysis Method for the Establishment of B Lymphoblastoid Cell Lines. J. Vis. Exp. (119), e55191, doi:10.3791/55191 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter