Summary
Eine einfache roten Blutkörperchen die Lyse Verfahren zum Aufbau B-LCLs mit hoher Immortalisierung Effizienz entwickelt, eine kleine Menge von Blut benötigt und die Zeit von der Initiierung der Gefrierkonservierung zu speichern.
Protocol
Diese Studie wurde von der Ethikkommission des Instituts für Genetik und Entwicklungsbiologie genehmigt, und das Protokoll folgt den Richtlinien des Instituts für das Wohlergehen der Menschen.
1. Herstellung von EB-Virus
- Am Tag 1 auftauen B95-8 Zellen und der Kultur in 6 ml komplettem RPMI-1640-Medium, das mit 10% fötalem Rinderserum, 2 mM L-Glutamin und Antibiotika (100 ug / ml Streptomycin, 100 U / ml Penicillin) in einem ergänzten T25 Kulturflasche. Legen Sie die Kulturflasche in 5% CO 2 Inkubator bei 37 ° C.
- Am Tag 2 werden die Zellmorphologie unter einem Mikroskop zu beobachten. Die Zellen sind in einem guten Zustand, wenn sie hell und rund sind. In 10 ml komplettem RPMI-1640-Medium.
- Am Tag 4, 10 ml frisches vollständiges RPMI-1640-Medium, und dann in einen T75-Kulturkolben übertragen.
- Am Tag 8 20 ml komplettem RPMI-1640-Medium.
- Pflegen Sie die Zellen für 8 Tage ohne Zugabe von frischem Medium, das heißt, Hunger.
- Am Tag 16, beobachten Zellenunter dem Mikroskop beobachtet. Sammle die Zellen in einem 15 ml-Zentrifugenröhrchen wurden 12 ml / Röhrchen.
- für 1 h bei -80 ° C Cryo-bewahren, und dann bei 37 ° C schnell aufgetaut. 3-mal wiederholen, bis die Viruspartikel aus den Zellen freigesetzt werden.
- Zentrifuge bei 240 × g für 10 min bei Raumtemperatur.
- Filtern Sie die Überstand durch ein 0,22-um-Filter, aliquoten, 12 ml / Röhrchen, und bei -80 ° C.
2. Behandlung von Vollblut mit der roten Blutkörperchen Lysepuffer
- 0,5 mL Vollblut durch EDTA antikoaguliertem · K 2 in ein 15 ml Röhrchen.
- Geben Sie 1 ml der roten Blutkörperchen Lysepuffer (gefiltert durch 0,22 um Filter und Auftauen auf Raumtemperatur vor dem Gebrauch) mit dem Vollblut und gut mischen. Legen Sie die Mischung bei Raumtemperatur für 4 min. Dann fügen Sie 5-7 ml 1x PBS schnell auf die Stoppreaktion.
- Zentrifuge bei 240 × g für 5 min bei Raumtemperatur. Weiße Blutkörperchen werden am Boden des Röhrchens auszufällen.
- Überstand verwerfen und waschen Sie die Fällung durch Zugabe von 7 ml 1640 Basismedium. Zentrifuge für 5 Minuten bei 240 xg bei Raumtemperatur. Zweimal wiederholen.
- Resuspendieren des Zellpellets in 300 & mgr; l Transformationsmedium (RPMI 1640 Medium, 20% fötales Rinderserum und 10 ug / ml Phytohämagglutinin (PHA)).
3. EBV-Infektion
- Hinzuzufügen 60 ul 20 ug / ml Cyclosporin A (CsA) zu der Zellsuspension.
- Schnell ein Aliquot von EBV auftauen bei 37 ° C. Hinzufügen 240 uL EBV zu der Zellsuspension.
- Gut mischen und legen Sie die Zellsuspension auf eine 96-Well-Platte, 200 & mgr; l pro Vertiefung. Verdunstung, 200 ul 1x PBS zu jedem gut um der 96-Well-Platte zu vermeiden. Die Platte wird in einem 5% CO 2 Inkubator bei 37 ° C.
4. Erweiterung und Kryokonservierung von B-LCL
- Ändern Sie die Hälfte des Mediums einmal pro Woche im ersten Monat nach der EBV-Infektion. Nur eine dicke Layer von Zellbruchstücke sichtbar ist unter dem Mikroskop am Tag 7 (Abbildung 2). Nach einem Monat der EBV - Infektion sind lymphoblastoiden Zellcluster sichtbar unter einer dicken Schicht von Zellfragmente unter dem Mikroskop (Figur 2).
- Ändern Sie die Hälfte des Mediums alle 3 Tage , bis die Zellhaufen deutlich sichtbar unter dem Mikroskop (Abbildung 2) sind. Typischerweise dauert dieser Vorgang 10 bis 20 Tage.
- Nach dem Mischen pipettieren die Zellen und Transfer zum 24-Well-Platte. Die doppelte Volumen des Kulturmediums mit komplettem RPMI 1640, während es gelb wird. Dieses Verfahren hängt von der Rate des Zellwachstums.
- Anschließend übertragen die Zellen zu T25 Kulturflasche. Die doppelte Volumen des Kulturmediums, wie es gelb wird, bis das Volumen des Mediums auf 10 erweitert - 15 ml.
- Ändern Sie Medium 24 h vor dem Einfrieren. Zentrifuge Zellsuspension für 5 min bei 240 x g. Zählen von Zellen mit einem Zellzähler und gefrier bei einer Dichte von von 5 bis 10 x 10 6 / ml in frozen Stammlösung 90% FBS und 10% Dimethylsulfoxid (DMSO) enthält. Einfrieren bei einer Rate von 1 ° C pro min auf -80 ° C und übertragen dann direkt in flüssigem Stickstoff.
5. 3- (4,5-Dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyl-tetrazoliumbromid (MTT) Assay 17
- Bereiten Sie eine B-LCL Einzelzellsuspension mit dem 1640-Medium, das 10% fötales Rinderserum enthält. Seed 3 x 10 4 Zellen pro Vertiefung auf 96-Well - Platte, 100 & mgr; l pro Vertiefung.
- Die Platte wird in 5% CO 2 Inkubator bei 37 ° C für 12 - 16 Uhr.
- In MTT (5 mg / ml) zu den Vertiefungen, in denen Zellen wachsen und halten weg von Licht für 4 h bei 37 ° C.
- Zentrifugenzellenplatte für 10 min bei 168 x g.
- Überstand entfernen und mit 100 & mgr; l DMSO pro Vertiefung.
HINWEIS: Seien Sie vorsichtig. Berühren Sie nicht die nadelförmigen Farbstoffkristalle. - Schütteln Sie die Platte für 10 Minuten bei niedriger Geschwindigkeit vollständig um die Kristalle aufzulösen.
- Measure Absorption bei 570 nm durchunter Verwendung eines Mikrotiterplatten-Spektrophotometer.
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Representative Results
Während des Prozesses der Transformation werden die morphologischen Veränderungen der Zellen durch Lichtmikroskopie (Abbildung 2) visualisiert. Kleine Gruppen von Zellen waren deutlich sichtbar mit dem Dichtegradienten Trennverfahren nach 7 Tagen nach der Infektion, während nur eine dicke Schicht aus Zellfragmente aus der roten Blutkörperchen Lyseverfahren sichtbar sind. Allerdings sind Lymphoblastoidzelllinien Cluster sichtbar unter der dicken Schicht von Zellfragmente 30 Tage nach Infektion. Mit häufigeren Mediumwechsel, die Zelltrümmer ab und die Zellcluster sind deutlich sichtbar und zeigen das gleiche Bild durch das Dichtegradienten-Trennungsverfahren hergestellt.
Wenn Zelllinien erfolgreich hergestellt wurden, wurde der MTT-Assay verwendet, um die Lebensfähigkeit von B-LCLs auszuwerten. Nach der Literatur 17, B-LCLs durch verschiedene Verfahren festgelegt wurden die Lebensfähigkeit der Zellen zu ermitteln ausgewählt und 1640 Medium wurde als Leerkontrolle verwendet. Die Daten zeigen , dass die Lebensfähigkeit der Zellen von B-LCLs mit der roten Blutkörperchen Lyseverfahren hergestellt ist deutlich höher als die die Lebensfähigkeit der Zellen von B-LCLs aus der Dichtegradienten - Trennungsverfahren (Abbildung 3).
Abbildung 1. Flussdiagramm der Prozedur. Antikoagulierende Blut wird mit roten Blutkörperchen Lysepuffer vor der EBV-Infektion durch die Zugabe von CsA behandelt, gefolgt. Die infizierten B - Zellen werden bei 37 ° C in Gegenwart von 5% CO 2 zu schaffen und anschließend erweitern B-LCLs gezüchtet. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
FiAbbildung 2. Visualisierung von Cellular Morphologische Veränderungen im Prozess der EBV-Transformation. Die linke sind B-LCL durch rote Methode Blut Zelllyse etabliert mit 0,5 ml peripherem Blut und Zelltrümmer im Laufe der Zeit abnimmt geht weiter. Das rechte zeigt Zelllinien durch die Dichtegradienten-Trennverfahren mit 2,5 ml Blutprobe hergestellt. Maßstabsbalken ist 10 & mgr; m. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3. Vergleich der Lebensfähigkeit der Zellen für B-LCL Gegründet von verschiedenen Methoden. Jeder Balken repräsentiert den Mittelwert ± SD. Die Ergebnisse zeigen, dass es signifikante Unterschiede zwischen den beiden Methoden (p = 0,014). Klicken Sie bitte hiereine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Wir berichten über die Entwicklung eines neuartigen Verfahrens zum Lysieren von roten Blutkörperchen menschlichen B-Zellen aus Vollblut Immortalisierung und seine Lebensfähigkeit der Zellen von etablierten B-LCLs durch den MTT-Test bewertet. Die Ergebnisse zeigten, dass die Lebensfähigkeit der Zellen von B-LCLs durch die roten Blut Verfahren Zelllyse eingerichtet ist viel höher als die des Dichtegradienten Trennungsverfahren. Der große Vorteil der roten Blutkörperchen Verfahren der Lyse ist, dass es einfach ist, und erfordert ein geringes Volumen (weniger als 0,5 ml) Blut für eine permanente Zelllinie mit einer hohen Erfolgsquote und eine hohe Lebensfähigkeit der Zellen zu etablieren.
Nur eine einfache Lyseschritts vor EBV-Infektion benötigt. Ohne vorherige Reinigung der Lymphozyten, Zellverlust und Zellschäden werden vermieden. Ein weiteres Hindernis des Dichtegradienten Trennverfahren ist die Hämolyse. Die Verarbeitung des Blutes nach Langzeitlagerung bei unangemessenen Temperaturen und während des Transports Schütteln zu Hämolyse führen kann, which will stark die Isolierung von Lymphozyten beeinflussen. Andere Studien zeigten , dass die Verwendung von roten Blutkörperchen (RBC) Lyse in höheren Anzahlen lebensfähiger PBMC führte als die Verwendung des Dichtegradienten Trennverfahren 18 und Lymphozyten - Subtypen im wesentlichen nicht 19 beeinflusst wurden. Verglichen mit dem Dichtegradient-Trennungsverfahren, die kostspielig und umständlich ist, die roten Blutkörperchen Lyseverfahren viel einfacher, insbesondere für eine große Anzahl von klinischen Proben zu behandeln und praktischer für Anfänger.
In der Studie haben wir 24 Proben mit einer 100% Erfolgsrate unsterblich gemacht durch die roten Blutkörperchen Lyse-Verfahren. Verglichen mit dem 90-94% der Erfolgsquote von kryokonservierten Lymphozyten berichtet und frisch isolierten Lymphozyten 20 von 2 - 2,5 ml Blut, diese Erfolgsrate ist viel höher. Inzwischen haben wir auch frisch (0,5 ml) oder gefroren (auch 1 ml) Blut transformiert , wie in den Literatur 14,15 ohne Trennung beschrieben, und die efficiency Transformations ist viel geringer als die berichteten 16 (Daten nicht gezeigt).
Die vorliegende Strategie verbessert die Effizienz Immortalisierung nicht nur wesentlich, sondern reduziert auch das Volumen des Blutes erforderlich B-LCLs herzustellen. Aktuelle Technologien für die EBV - Transformation verwenden , relativ große Mengen von peripherem Blut, etwa 2 bis 2,5 ml Blut 20 zu isolieren Lymphozyten während andere 10 ml oder mehr 10,21. Dies steht im Gegensatz zu den 0,5 ml Vollblut benötigt eine immortalisierte Zelllinie mit dem hier beschriebenen Verfahren zu erhalten. Diese Methode könnte modifiziert werden , um erfolgreich das Blut aus dem Finger gesammelt verewigen spitzt 12, die stark genetischen Ressourcen von pädiatrischen Patienten und ältere Menschen erhalten erleichtern könnte.
Darüber hinaus sind die die Lebensfähigkeit der Zellen von B-LCLs durch die roten Blut Verfahren Zelllyse etabliert höher ist als die des Dichtegradienten Trennungsverfahren. Die rote Blutkörperchen llyse Verfahren vermeidet die mechanische Zentrifugalkraft in den Prozess der Dichtegradientenzentrifugation, die zu den Zellen nicht reparierbare Schäden verursacht. Es schlägt vor, dass die roten Blutkörperchen Lyseverfahren besser geeignet für genetische und funktionelle Studien ist, die so schnell wie möglich eine große Anzahl von Zellen erfordert. Unsere Methode wird die Zeit von Kulturbeginn zu Kryokonservierung verringern, die Ressourcen sparen und Arbeit zu reduzieren.
Eine mögliche Einschränkung der roten Blut Verfahren Zelllyse ist das Vorhandensein von kontaminierenden Debris aus roten Blutzell-Lysaten abgeleitet, die die klare Beobachtung der Umwandlung in den ersten vier Wochen nach der EBV-Infektion blockieren würde. Allerdings wird dieser Schmutz allmählich mit den Mediumwechsel entfernt werden. Eine weitere Einschränkung ist der Verlust der wachsenden transformierten Zellen, aber dies kann durch Entfernen der Hälfte des Überstandes in den ersten vier Wochen nach der Transformation verbessert werden. Eine weitere mögliche Modifikation Verunreinigungen zu entfernen isthäufige Mediumwechsel mit größerer Volumina oder die Zelllinien zweimal mit 10 ml 1x PBS gewaschen und dann bei 168 g für 5 min Zentrifugieren Verunreinigungen zu entfernen.
Zusammenfassend stellt dieses Protokoll eine einfache Strategie für den Aufbau B-LCLs mit hoher Effizienz Immortalisierung, Blutvolumen zu reduzieren und die Zeit zwischen dem Beginn und Kryokonservierung speichern. Die Zelllinien in der vorliegenden Studie entwickelt eine wertvolle und kostengünstige Quelle von Biomaterialien verschiedene Studien durchgeführt werden.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Centrifuge | Techcomp | CT6T | Centrifugation |
| Automated Cell Counter | Countstar | IC 1000 | For cell counting |
| Epoch Microplate Spectrophotometer | BioTek Instruments | SN263839 | For measuring the absorbance |
| 96 well cell culture cluster | Corning Incorporated | 3599 | Polystyrene plates |
| 24 well cell culture cluster | Corning Incorporated | 3524 | Polystyrene plates |
| 25 cm2 cell culture flask | Nest | 707001 | Polystyrene |
| FBS | Gibco | 10270 | Component of B-LCLs medium |
| RPMI Medium 1640 | Gibco | 31800-022 | For B-LCLs medium |
| L-Glutamine | Amresco | 0374 | Component of B-LCLs medium |
| 100x streptomycin penicillin solution BioRoYeeBRY-2309 | BioRoYee | BRY-2309 | Component of B-LCLs medium |
| Ficoll paque plus | GE Healthcare | 17-1440-03 | For in vitro isolation of lymphocyte |
| PHA-M | Sigma | L8902 | For stimulating lymphocyte proliferation |
| Cyclosporin A | Cayman Chemical | 12088 | For inhibiting the cytotoxicity effect of T cells |
| Red cell lysis buffer | Tiangen | RT122-01 | For lysing red blood cell |
| MTT | Amresco | 0793 | For the detection of cell viability |
| DMSO | Sigma | D2650 | For freezing cells |
References
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