Summary
B-LCLを確立するための単純な赤血球溶解方法は、少量の血液を必要とし、凍結保存し、開始からの時間を節約し、高い不死化効率で開発されました。
Protocol
本研究では、遺伝学と発生生物学研究所の倫理委員会によって承認され、プロトコルが人間の福祉のための機関のガイドラインに従います。
EBウイルスの調製
- 1日目に、6 mLのB95-8細胞培養を解凍完全RPMI 1640培地、10％ウシ胎児血清、2mM L-グルタミン、および抗生物質（100μg/ mLのストレプトマイシン、100 U / mLペニシリン）を補充しT25培養フラスコ。 37℃、5％CO 2インキュベーター内で培養フラスコを置きます。
- 2日目に、顕微鏡下で細胞形態を観察します。彼らは明るいとラウンドしているときに細胞が良好な状態です。 10 mLの完全RPMI 1640培地を追加します。
- 4日目に、10 mLの新鮮な完全RPMI 1640培地を追加し、T75培養フラスコに移します。
- 8日目に、20 mLの完全RPMI 1640培地を追加します。
- 新鮮な培地、 すなわち 、飢餓を追加せずに8日間細胞を維持します。
- 16日目に、細胞を観察します顕微鏡下で観察しました。 15 mL遠心チューブ内の細胞を回収し、12ミリリットル/チューブ。
- 1時間-80℃で凍結保存し、その後急速に37℃で解凍。ウイルス粒子が細胞から放出されるまで3回繰り返します。
- 室温で10分間、240×gで遠心分離します。
- -80℃で0.22μmのフィルター、分量、12ミリリットル/チューブ、およびストアを介して上清をフィルタリングします。
赤血球溶解バッファーで全血の2治療
- 15 mLチューブにEDTA・K 2によって抗凝固処理された0.5 mLの全血を追加します。
- 全血に（使用前に0.22μmのフィルターで濾過し、室温に解凍）1 mLの赤血球溶解緩衝液を入れ、よく混ぜます。 4分間、室温で混合物を配置します。停止反応に迅速に7 mLの1×PBS - 次に5を追加します。
- 室温で5分間、240×gで遠心分離します。白血球は、チューブの底に沈殿します。
- 上清を捨て、そして7mLの1640塩基性媒体を追加することによって、沈殿を洗います。室温で240×gで5分間遠心します。二回繰り返します。
- （20％ウシ胎児血清および10μg/ mLのフィトヘムアグルチニン（PHA）を含有するRPMI 1640培地）300μL変換培地中で細胞ペレットを再懸濁します。
3. EBV感染
- 細胞懸濁液に20μgの/ mLのシクロスポリンA（CSA）の60μLを追加します。
- 急速に37℃でEBVのアリコートを解凍。細胞懸濁液に240μLEBVを追加します。
- よく混合し、96ウェルプレートに細胞懸濁液を置き、ウェルあたり200μL。蒸発を避けるために、96ウェルプレートの周りにあらゆるに200μLの1×PBSを追加します。 37℃で5％CO 2インキュベーターでプレートを置きます。
B-LCLを4.拡大と凍結保存
- EBV感染後の最初の月に週1回培地の半分を変更します。唯一の厚いレー細胞断片のrは7日目（ 図2）で、顕微鏡下で可視です。 EBV感染の1ヶ月後、リンパ芽球様細胞クラスターは、顕微鏡下で細胞断片の厚い層（ 図2）の下に表示されます。
- 細胞クラスターは、顕微鏡（ 図2）の下にはっきりと見えるようになるまで、3日毎に培地の半分を変更します。典型的には、このプロセスは、10〜20日を要します。
- 混合した後、細胞をピペットし、24ウェルプレートに移します。それが黄色に変わりつつ完全RPMI 1640で培養液の量を倍増。このプロセスは、細胞増殖の速度に依存します。
- 続いて、T25培養フラスコに細胞を移します。 15 mLの - 媒体の体積が10に展開するまで、それが黄色に変わりとして、培地の量を2倍になります。
- 凍結前媒体24時間を変更します。 240×gで5分間遠心細胞懸濁液。細胞カウンターで細胞をカウントし、5の密度で凍結- FRで10×10 6 / mLの90％のFBS、10％ジメチルスルホキシド（DMSO）を含むozenストック溶液。 -80℃まで毎分1℃の速度で凍結した後、液体窒素に直接転送します。
5. 3-（4,5-ジメチルチアゾール-2-イル）-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロミド（MTT）アッセイ17
- 10％ウシ胎児血清を含む1640培地でB-LCLを単一細胞懸濁液を調製します。シード3×10 96ウェルプレート上にウェルあたり4細胞、ウェルあたり100μL。
- 16時間- 12、37℃で5％CO 2インキュベーターでプレートを置きます。
- 細胞が成長しているウェルにMTT（5 mg / mlで）を追加し、37℃で4時間光から遠ざけます。
- 168×gで10分間遠心分離セルプレート。
- 上清を除去し、ウェルあたり100μLのDMSOを追加します。
注：注意してください。針状の染料結晶を触れないでください。 - 完全に結晶を溶解するために、低速で10分間プレートを振ります。
- により570 nmで測定吸収マイクロプレート分光光度計を使用して。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
変換プロセスの間、細胞の形態学的変化は、光学顕微鏡（ 図2）によって可視化されます。細胞の小さなクラスターは、細胞断片のみ厚い層が、感染の7日後に密度勾配分離法ではっきり見えた赤血球溶解法から見えます。しかし、リンパ芽球様細胞クラスターは30日、感染後細胞断片の厚い層の下に表示されます。より頻繁な培地交換して、細胞破片を減少し、細胞クラスターは明確に視認され、密度勾配分離法によって確立された同じ画像を提示します。
細胞株は正常に確立されたときに、MTTアッセイは、B-LCLをの生存率を評価しました。文献17によれば、異なる方法によって確立されたB-LCLを、細胞の生存率および16を検出するために選択しました。40培地をブランク対照として使用しました。データは、赤血球の溶解法で確立B-LCLをの細胞生存率は、密度勾配分離法（ 図3）からB-LCLをの細胞生存率よりも有意に高いことを示しています。
手順の図1.フローチャート。 EBV感染はCsAを加え、続いて前に抗凝固血液を赤血球溶解緩衝液で処理されます。感染したB細胞は、B-LCLを確立し、その後拡大し、5％CO 2の存在下で37℃で増殖させます。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
FiのEBV形質転換の過程における細胞形態変化のグレ2.可視化。左は、時間が経つにつれて減少赤0.5 mLの末梢血で血細胞溶解法、および細胞破片によって確立されたB-LCLをしています。右側は、2.5mLの血液試料で密度勾配分離法によって確立された細胞株を示します。スケールバーは10μmです。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
異なる方法によって設立され、B-LCLをのための細胞生存率の図3の比較。各バーは平均±SDを表します。結果は、2つの方法（p = 0.014）との間に有意な差があったことを示しています。 こちらをクリックしてくださいこの図の拡大版を表示します。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
我々は、赤血球を溶解することによって、全血からのヒトB細胞を不死化するための新規な方法の開発を報告し、そして確立されたB-LCLを、その細胞生存率をMTTアッセイにより評価しました。結果は、赤血球溶解法により確立B-LCLをの細胞生存率は、密度勾配分離法よりもはるかに高いことが示されました。赤血球溶解法の主な利点は、簡単であり、高い成功率と高い細胞生存率と永久細胞株を確立するための血液（0.5mLのわずかなど）少量を必要とすることです。
一つだけの単純な溶解工程は、EBV感染の前に必要とされています。リンパ球の前精製することなく、細胞の喪失および細胞の損傷が回避されます。密度勾配分離法の別の障害は、溶血です。 WH、不適切な温度での長期保存後の血液を処理し、輸送中の揺れは、溶血につながる可能性がありICH大幅リンパ球の分離に影響を与えます。他の研究は、赤血球（RBC）溶解の使用は、18およびリンパ球のサブタイプは、実質的に19の影響を受けなかった密度勾配分離法を使用するよりも、生存PBMCの高い数をもたらしたことを示しました。費用がかかり、面倒である密度勾配分離法と比較して、赤血球溶解方法は特に大規模な臨床サンプル数と初心者のためのより実用的に治療するために、はるかに簡単です。
研究では、赤血球細胞溶解法を用いて、100％の成功率で24サンプルを不死化しています。凍結保存リンパ球および2で新たに単離したリンパ球20によって報告された成功率の90-94％と比較して- 2.5 mLの血液、この成功率は非常に高いです。一方、我々はまた、新鮮な（0.5 mL）を形質転換または分離しない参考文献14,15に記載されているように（でも1 mL）で血液を凍結し、efficien変換のCYは、16（データは示していない）が報告よりもはるかに低いです。
本戦略は、著しく不死化効率を向上させるだけでなく、B-LCLを確立するために必要な血液量を減少させるだけでなく、。他の人が10 mLを10,21またはそれ以上を必要としながら、2.5 mLの血液20は、リンパ球を単離するために- EBV形質転換のための現在の技術は、およそ2は、末梢血の比較的大きなボリュームを使用します。これは、ここに記載した方法と不死化細胞株を得るために必要な全血を0.5 mLに対照的です。このメソッドは、成功した指から採取した血液を不死化するように変更することができる非常に小児患者や高齢者からの遺伝資源を維持促進する可能性があり、12を刺し。
また、赤血球の溶解法により確立B-LCLをの細胞生存率は、密度勾配分離法のそれよりも高いです。赤血球Lysis方法は、細胞への非修復損傷を引き起こす密度勾配遠心分離の過程で機械的な遠心力を回避します。これは、可能な限り迅速に多数の細胞を必要とする、赤血球の溶解方法は、遺伝的および機能的研究のために適していることを示唆しています。本手法は、資源を節約し、労力を軽減します凍結保存培養開始からの時間を短縮します。
赤血球溶解方法の可能な限界は、EBV感染の最初の4週間での変換の明確な観察をブロックする赤血球溶解物に由来する破片、汚染の存在です。しかし、この破片は徐々に培地の変更と削除されます。別の制限は、成長する形質転換された細胞の喪失であり、これは、変換の最初の4週間で、上清の半分を除去することによって改善することができます。不純物を除去するための別の可能な変更は、より多くのですより大きなボリュームまたは10 mLの1×PBSによって二回の細胞株を洗浄した後、不純物を除去するために5分間168×gで遠心分離すると頻繁に培地交換。
要するに、このプロトコルは、血液量を減少させ、開始および凍結保存の間の時間を節約し、高い不死化効率のB-LCLを確立するための単純な戦略を提供します。本研究で開発した細胞株は、生体材料の貴重かつ費用対効果の源は様々な研究を行っています。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Centrifuge | Techcomp | CT6T | Centrifugation |
| Automated Cell Counter | Countstar | IC 1000 | For cell counting |
| Epoch Microplate Spectrophotometer | BioTek Instruments | SN263839 | For measuring the absorbance |
| 96 well cell culture cluster | Corning Incorporated | 3599 | Polystyrene plates |
| 24 well cell culture cluster | Corning Incorporated | 3524 | Polystyrene plates |
| 25 cm2 cell culture flask | Nest | 707001 | Polystyrene |
| FBS | Gibco | 10270 | Component of B-LCLs medium |
| RPMI Medium 1640 | Gibco | 31800-022 | For B-LCLs medium |
| L-Glutamine | Amresco | 0374 | Component of B-LCLs medium |
| 100x streptomycin penicillin solution BioRoYeeBRY-2309 | BioRoYee | BRY-2309 | Component of B-LCLs medium |
| Ficoll paque plus | GE Healthcare | 17-1440-03 | For in vitro isolation of lymphocyte |
| PHA-M | Sigma | L8902 | For stimulating lymphocyte proliferation |
| Cyclosporin A | Cayman Chemical | 12088 | For inhibiting the cytotoxicity effect of T cells |
| Red cell lysis buffer | Tiangen | RT122-01 | For lysing red blood cell |
| MTT | Amresco | 0793 | For the detection of cell viability |
| DMSO | Sigma | D2650 | For freezing cells |
References
- Mohyuddin, A., et al. Genetic instability in EBV-transformed lymphoblastoid cell lines. Biochim Biophys Acta. 1670 (1), 81-83 (2004).
- Hu, V. W., Frank, B. C., Heine, S., Lee, N. H., Quackenbush, J. Gene expression profiling of lymphoblastoid cell lines from monozygotic twins discordant in severity of autism reveals differential regulation of neurologically relevant genes. BMC Genomics. 7, 118 (2006).
- Toda, T., Sugimoto, M. Proteome analysis of Epstein-Barr virus-transformed B-lymphoblasts and the proteome database. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 787 (1), 197-206 (2003).
- Chiorazzi, N., Wasserman, R. L., Kunkel, H. G. Use of Epstein-Barr virus-transformed B cell lines for the generation of immunoglobulin-producing human B cell hybridomas. J Exp Med. 156 (3), 930-935 (1982).
- Traggiai, E., et al. An efficient method to make human monoclonal antibodies from memory B cells: potent neutralization of SARS coronavirus. Nat Med. 10 (8), 871-875 (2004).
- Hussain, T., Kotnis, A., Sarin, R., Mulherkar, R. Establishment & characterization of lymphoblastoid cell lines from patients with multiple primary neoplasms in the upper aero-digestive tract & healthy individuals. Indian J Med Res. 135 (6), 820-829 (2012).
- Neitzel, H. A Routine Method for the Establishment of Permanent Growing Lymphoblastoid Cell-Lines. Hum Genet. 73 (4), 320-326 (1986).
- Oh, H. M., et al. An efficient method for the rapid establishment of Epstein-Barr virus immortalization of human B lymphocytes. Cell Prolif. 36 (4), 191-197 (2003).
- Louie, L. G., King, M. C. A Novel-Approach to Establishing Permanent Lymphoblastoid Cell-Lines - Epstein-Barr-Virus Transformation of Cryopreserved Lymphocytes. Am J Hum Genet. 48 (3), 637-638 (1991).
- Tremblay, S., Khandjian, E. V. Successful use of long-term frozen lymphocytes for the establishment of lymphoblastoid cell lines. Clin Biochem. 31 (7), 555-556 (1998).
- Reidy, J. A., Wheeler, V. A. Sample age and Epstein-Barr virus transformation of cryopreserved lymphocytes. In Vitro Cell Dev Biol. 28 (6), 383-384 (1992).
- Amoli, M. M., Carthy, D., Platt, H., Ollier, W. E. R. EBV immortalization of human B lymphocytes separated from small volumes of cryo-preserved whole blood. Int J Epidemiol. 37, suppl 1 41-45 (2008).
- Lacelle, C., Wang, E. Establishing lymphoblastoid cell lines from frozen blood of extremely old individuals. Mech Ageing Dev. 123 (10), 1415-1418 (2002).
- Tohda, H., Oikawa, A., Kudo, T., Tachibana, T. A greatly simplified method of establishing B-lymphoblastoid cell lines. Cancer Res. 38 (10), 3560-3562 (1978).
- Ventura, M., et al. Use of a Simple Method for the Epstein-Barr Virus Transformation of Lymphocytes from Members of Large Families of Reunion Island. Hum Hered. 38 (1), 36-43 (1988).
- Chenevixtrench, G., Kerr, B., Walters, M. Lymphoblastoid Cell-Lines from Frozen Whole-Blood - a Quick and Economical Safeguard for Linkage Analysis. Am J Hum Genet. 46 (1), 635-636 (1990).
- Hansen, M. B., Nielsen, S. E., Berg, K. Re-Examination and Further Development of a Precise and Rapid Dye Method for Measuring Cell-Growth Cell Kill. J Immunol Methods. 119 (2), 203-210 (1989).
- Bogoslovsky, T., et al. Preservation and enumeration of endothelial progenitor and endothelial cells from peripheral blood for clinical trials. Biomark Med. 9 (7), 625-637 (2015).
- Ambach, A., Bonnekoh, B., Gollnick, H. Routine flow cytometric immuno-staining of T-cell perforin is preserved using diethylene glycol for erythrocyte-lysis but lost by the use of ammonium chloride. Exp Dermatol. 12 (6), 825-831 (2003).
- Beck, J. C., Beiswanger, C. M., John, E. M., Satariano, E., West, D. Successful transformation of cryopreserved lymphocytes: A resource for epidemiological studies. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 10 (5), 551-554 (2001).
- Tosato, G., Cohen, J. I. Generation of Epstein-Barr Virus (EBV)-immortalized B cell lines. Curr Protoc Immunol. , Chapter 7, Unit 7 22 (2007).
