Summary
중심부에 위치한 분자 이벤트는 기관의 전기 및 수축 기능을 조정. 여기에 제시된 지역 필드 형광 현미경 기술의 집합은 그대로 마음에 휴대 변수의 기록을 할 수 있습니다. 심장 기능을 정의하는 메커니즘을 확인하면 마음이 병적 인 상황에서 어떻게 작동하는지 이해에 중요하다.
Abstract
심장에서 분자 신호 전달 연구는 일반적으로 고립 된 근육 세포에서 수행된다. 그러나, 허혈 및 부정맥과 같은 많은 병리학 적 상황은 완전히 전체 기관 수준에서 잘 이해 될 수있다. 여기서는 본래 심장 세포 신호를 측정 할 수 있도록 로컬 필드 형광 현미경 (LFFM) 분광 기법을 제시한다. 이 기술은 랑겐 돌프 관류 심장 및 형광 신호를 기록하는 광 화이버의 결합에 기초한다. LFFM 정상 및 병적 상태에서 마음을 연구하는 심장 혈관 생리학의 분야에서 다양한 응용 프로그램이 있습니다. 다중 심장 변수는 상이한 형광 표시기를 사용하여 모니터링 할 수있다. 다음은 세포질 [칼슘 2 +] 내 근질 세망 [칼슘 2 +]와 막 전위를 포함한다. 외인성 형광 프로브 흥분 방출 된 형광 LFFM의 표면 형광 기법의 세 가지 다른 배열 검출이 논문에서 제시 s의. 이러한 기술들 중 중앙의 차이는 여기하고 상기 여기 광을 변조 방식에 사용되는 광원의 종류이다. 연속파 LFFM (CLFFM)는 연속 여기 레이저 광을 사용하는 반면 펄스 LFFM (PLFFM)의 레이저 광 펄스를 사용한다. 마지막으로, 발광 다이오드 (LED)는 제 3 광원으로 사용했다. 이 비 간섭 장치는 펄스 형 LED 형광 현미경 (PLEDFM)라고한다.
Introduction
핵심은 심장 혈관 시스템의 중심 기관이다. 심장의 수축은 세포 내에서 증가 [칼슘 2 +]에 의해 시작된다. 세포 내 칼슘 방출의 전기적 흥분성 변화 사이의 관계는 역사적으로 효소 적 세포 해리 (1, 2)에서 연구되고있다. 그러나, 심근 세포 대사되어 전기적 및 기계적 4 3 결합된다. 격리되면, 근육 세포가 물리적으로 결합되지 없지만, 상이한 계층에서 심근 세포를 해리 5 동안 혼합한다. 또한, 전압 클램프 조건 하에서 분리 된 세포 연구로부터 나왔다 막대한 장점, 6, 7, 8의 전기 syncytium ALWA 같은 심장의 본질 불구YS는 조직 3에 존재하는 것과 세포를 분해하는 방법을 기능적으로 다른 질문을 제기.
이 논문에서는 본래 심장 로컬 필드 형광 현미경 (LFFM) 기술을 사용하여 심장 생리학의 기술에서 얻어진 발전을 설명한다. LFFM는 세포질 칼슘, 내 근질 세망 (SR) 칼슘과 막 잠재력 등 여러 생리적 변수를 측정하는 형광 표시를 사용합니다. 이러한 측정은 심실 압력 9, 10, 9 심전도, 전기 활동 전위 (APS), 이온 전류 및 기록 갇힌 화합물 (4)의 플래시 광분해, (11)과 함께 동시에 얻을 수있다. 또한, 이들 측정은 가까운 높은 주파수에서 그대로 심장 페이싱에 의해 얻을 수있다생리 요금에 연구. 여러 문서 있지만 9, 11, 12, 13, 14 LFFM 기술을 이용하여 우리 그룹에 의해 출판 된, 이러한 기술과 관련된 기술적 인 복잡성의 추정은 심장 및 다른 기관에 생체 생리 현상 공부의 다량 사용을 방지하고있다.
LFFM 기술 (도 1)이 조직과 접촉하는 멀티 모드 광파이버를 사용하여 얻어진 표면 형광 측정에 기초한다. 접촉 형광 영상 법처럼, 광학 해상도는 직경, 섬유의 개구 수 (NA)에 따라 달라진다. 광섬유의 NA보다 작은 직경 측정의 공간 해상도를 증가시킬 것이다. NAS 및 섬유 직경은 각각 0.22에서 mm 0.66과 μm의 1 (50)에 이르기까지 다양 할 수 있습니다. 에서개구를 주름은 큰 입체각에서 도착 광자를 받아들임으로써 잡음비 (S / N)에 신호를 개선한다. 표면 형광 장치로서 작용하기 위해서는, 광 빔은 비구면 렌즈 표면 형광 또는 목적을 가진 광섬유에 집중되는 경우, 렌즈의 NA와 광 매치. 이 검색은 여기 및 형광 물질에 의해 방출되는 광자를 다시 수집하는 에너지 전달을 최대화한다.
조직에 들어 외인성 형광 표시기를 자극하기 위해, 다른 광원, 조명 모드가 이용 될 수있다. 펄스 지역 필드 형광 현미경 (3), 12 (PLFFM)를 사용하여 우리의 선구적인 연구는 저가의 피코 초 레이저 (그림 1a, PLFFM)를 사용. 광원이 유형의 실질적으로 인한 색소 표백 않고 조명 영역 하에서 형광 분자의 흥미로운 큰 분획의 큰 장점을 갖는다짧은 펄스 (12) 기간. 게다가 초단 펄스의 사용은 염료 (12)의 형광 수명의 평가를 허용했다. 형광 수명은 칼슘 결합 염료 분자의 비율을 정량하는 데 사용될 수있는 특성이다. 불행히도, 펄스 간에서 진폭 펄스 및 변화의 시간적 터링 색소에 결합하는 리간드에 의해 생성 된 형광의 변화가 큰 경우에,이 실험 전략의 적용을 제한한다.
연속파 (CW) 레이저는 일반적 LFFM (도 1b, CLFFM)의 메인 조명 원으로 사용된다. 레이저 빔은 연속 조직을 조명하거나 ferroelectrically 변조 될 수있다. 빔의 강유전체 변조 마이크로 광 펄스를 생성 할 수있다. 이 변조는 외부의 하드웨어에 의해 제어 될 수있다. 이 절차는뿐만 아니라 극적으로 t을 감소그는 광 펄스의 시간적 지터하지만, 또한 서로 다른 파장의 광선을 혼합 할 수 있습니다. 보의 혼합은 다른 레이저에서 다중 광선에 의해 수행된다. 결과적으로, 상이한 스펙트럼 특성을 가지는 다수의 염료는, 예를 들면, 생리 학적 변수의 다양한 측정을 수행하도록 기대 될 수 루비로드 -2- 세포질 칼슘 들면 MagFluo4 인트라 SR 칼슘 및 디 -8- ANEPPS 대한 대 막 잠재력.
LFFM의 광원으로서 레이저가 본 다양한 장점 있지만, 광원의 다른 유형의 발광 다이오드 (LED)를 포함하여 사용할 수있다. 이 경우, 상기 여기 광원은 InGaN으로 LED (도 1C, PLEDFM)로 구성되었다. 전도대의 전자가 가전 자대의 정공과 재결합 할 때의 LED에서 광자 자발적 방출된다. 고체 레이저와의 차이는 발광 다른 광자에 의해 자극되지 않는다는 것이다. 이것은 비 - 간섭 성 빔의 결과LED의 넓은 스펙트럼 방사.
하이 파워 LED의 종류가 사용될 수있다. 디 -8- ANEPPS 및 CA에 대해를 사용하여 AP의 레코딩을위한 2+ 과도 FLUO-4 또는 크기 - FLUO-4, 우리는 485 나노 미터 (블루), 20 nm의 절반 폭의 전형적인 피크 방출을 갖는 LED를 사용하여 기록 (그림 1D). 루비로드-2로 기록 칼슘 과도를 들어, LED는 540 nm의 (녹색), 35 nm의 (도 1D)의 절반 폭 일반적인 발광 피크를 가지고 있었다. LED는 밴드 파장에서 방출하기 때문에 자신의 스펙트럼 방사를 좁힐 필터를 필요로한다. 또, 펄스 광은 20 μs의 지속 시간 1.6 kHz의 속도로 생성 될 수있다. LED는 빠르고 전력 MOSFET 전계 효과 트랜지스터로 펄스 하였다. 다른 지표 동시 녹화 시간 다중화 LED에 의해 수행 될 수있다. 불행히도, LED에 의해 방출 된 광은 레이저 광과 비교하여 광섬유에 초점을 더 어렵다. 따라서, 우리의 주요 단점LED를 보내고 그들의 방출 프로파일 메인 축으로부터의 각도 변위 (± 15 °)를 가지며, 보조 광학 그것을 보정하기 위해 사용되어야한다는 것이다.
전술 한 광학 모든 구성에서, 여기 광은 다이크로 익 미러의 도움으로 반사된다. 빔이어서 조직에 위치하는 다중 모드 광섬유 상에 비구면 렌즈는 현미경 대물 렌즈에 의해 집광된다. 모든 표면 형광 장치에서와 같이, 다이크로 익 미러는 출사 된 광으로부터 음원을 분리하는 역할을한다. 방출 된 빛의 스펙트럼은 반영 여기를 제거하기 위해 다시 차단 필터를 통해 이동한다. 마지막으로, 출사 광은 광 검출기 (도 1) 상에 목적으로 집중된다.
전류 빛의 전달은 실리콘 애벌 런치 포토 다이오드에 의해 수행된다. 이 다이오드는 빠른 응답 및 낮은 광 검출을 허용하는 높은 감도를 가지고있다. 그만큼애벌랜치 포토 다이오드에 의해 생성 된 광전류는 두 가지 방식으로 증폭 될 수있다 : 트랜스 임피던스 증폭기의 전압 (도 1F)로 전류 변환하는 저항성 피드백 요소 (도 1E)을 갖는 또는 적분기로. 첫 번째 방법을 사용하여, 출력 전압과 광전류 피드백 저항에 비례한다. 피코 초 레이저 펄스의 저항 검출의 전형적인 예는도 2a, 2b 및 2c에 도시되어있다. 패널 2a는 트랜스 임피던스 증폭기의 출력을 도시하고 패널 (2B)은 별표 (*)로 표시된 구간의 시간 전개를 보여준다. 피크 추적 알고리즘은 형광 응답 (12)의 피크 (적색)과베이스 (녹색)을 검출하도록 실시 하였다. 기본 형광 측정은 주변 조명기구에 의해 도입 된 애벌랜치 포토 다이오드의 암전류와 간섭 양자의 정보를 제공한다HT 및 전자기 커플 링. 피크 염기의 표현은도 2c에 도시된다. 이 그림은 박동 잉꼬 심장의 심장주기 동안 2 + 칼슘 결합 염료 (루비로드-2)에 의해 방출되는 형광을 보여줍니다.
두 번째 방법에있어서, 상기 적분기의 출력 전압 및 전류 피드백 용량의 함수이다 (도 2D, 2E 및 2F). 어떤 외부 조명과 제 1 및 펄스 LED로부터인가 된 광 펄스와 두 번째 그림 2 층은 두 개의 연속적인 통합주기를 보여줍니다. 자세한 설명은도 2g과 2 시간에 제시되어있다. 이 접근법은 더 힘든 있지만 의한 피드백 커패시터의 열 잡음의 부재로 큰 S / N을 제공한다. 기기는 여기 광을 모두 제어 다중화를 생성하고 headstage 통합 및 입술 명령하는 타이밍 단을 포함등 기간. 이것은 일반적으로도 데이터의 온라인 회귀 계산으로 통합 된 출력 신호의 디지털 미분을 행하는 디지털 신호 처리 회로가 수행된다. 저항 피드백을 사용하는 경우에는, 어느 A / D 수집 보드를 사용할 수있다.
마지막으로, 우리 LFFM 기법 다용도이며 하나 이상의 영역으로부터 기록하도록 구성 될 수있다. 빛의 경로에 빔 스플리터를 추가하면 우리는 두 개의 광섬유로 빛을 분할 할 수 있습니다. 각 광섬유는 그 외인성 형광 프로브로부터 독립적으로 여기시키기 조직 기록 방출 서로 다른 영역에 배치 될 수있다. 이 수정은 생리 학적 변수에 영향을 미치는 방법을 해부학 적 지역적 차이 평가하기 위해 우리를 허용합니다. 도 3은 두 개의 광 화이버는 전층 전기 또는 세포를 측정하기 위해 사용되는 CW 여기 광을 분할하기 위해 사용되는 빔 스플리터를 도시한다 [칼슘] 레벨 재치시간 마이너 침입. 전층 신호는 하나의 내막의 섬유 심실 벽의 외막 층의 다른 배치하여 기록 할 수있다. 따라서, LFFM 기술은 상이한 영역에서 셀룰러 신호의 시간 경과를 측정하는 기능이 지역 변경 병리학 적 상황에서 발생하는지 테스트하는데 사용될 수있다.
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Protocol
이 프로토콜은 모든 마우스 처리는 UC 머 시드 기관 동물 관리 및 사용위원회 (제 2008-201)에 의해 승인되었다. 앵무새와 실험 과학 연구에 대한 베네수엘라 연구소 (이 비치)의 과학위원회에 의해 설립 동물 사용의 일반적인 정책에 따라 1999 년에 실시 하였다.
1. 랑겐 돌프 세트까지 준비
- 140의 NaCl, 5.4 KCl을,이 CaCl2를, 하나의 MgCl 2, 0.33 HPO 4, 10 글루코스, 10 HEPES 2 나트륨 : MM에서 다음과 용질 농도를 함유 타이로드 용액을 제조 하였다. NaOH로 7.4로 타이로드 용액의 pH를 조정 한 후 0.22 ㎛의 필터를 통해 용액을 필터.
- 60 ML의 주사기에 타이로드 용액 (11), (12)는도 4에 도시 설정 수평 랑겐 돌프의 모든 튜브를 넣습니다. 모든 기포를 제거해야합니다.
- 오 2 탱크에 플라스틱 튜브를 연결합니다.
- 60 ML의 주사기에서 타이로드 용액에 5 "튜브를 낮추기 위해 플라스틱 티 어댑터를 추가합니다.
- 타이로드 솔루션으로이 뜻 거품 밖으로 O 있도록 5 "튜브의 끝 부분에 플라스틱 공기 돌을 연결합니다.
- 캐 뉼러로 사용되는 바늘 주위에 비 흡수성 수술 용 봉합사를 놓습니다. 니들은 다른 솔루션 역 관류를 허용하는 매니 폴드 (도 4 참조)에 결합된다. 마지막으로, 심장의 대동맥은 바늘로 유관됩니다.
2. 동물 준비 및 심장 해부
- 헤파린 마우스를 달아 주입 (예. 마우스 무게 20g의 20 단위 또는 200 μL로 주입) 자궁 전위에 의해 안락사 전에 15 분. 마취 잉꼬 따라 t오 동물을 사용하여 IACUC 프로토콜의 가이드 다음은 자궁 경부 전위를 진행합니다.
참고 : 8 주 오래 된 마우스 또는 20g의 앵무새를 사용합니다. - euthanization 후 흉강에서 마음을 제거합니다. 마우스에 대한 설명과 동일하게 잉꼬 마음의 압축을 풉니 다.
- 에탄올로 마우스의 가슴을 청소합니다.
- 해부 가위를 사용하여 하복부에 절개를 한 후 목을 향해 측면을 잘라.
- 절단 된 조직을 다시 당겨 아래로 핀.
- 다이어프램을 잘라. 심장의 손상을 방지하기 위해 조리개를 절단 할 때주의해야합니다.
- 폐와 주변 조직을 제거합니다.
- 를 압박하지 않고 마음을 특종 핀셋을 사용합니다. 가능한 한 오랫동안 대동맥을 잘라.
- 약 1 mL의 타이로드 용액을 작은 무게 보트에 마음을 전송.
- 비 흡수성 봉합사를 사용하여 수술하는 통해 수평 랑겐 돌프 장치 상 대동맥 넥타이바늘. 이 미세 핀셋의 도움으로 심장 대동맥을 묶어. 타이로드 용액을 함유하는 60 mL의 주사기에 직렬로 위치한 밸브를 개방하여 역 관류를 시작한다.
- 심장이 10 분 동안 안정화 할 수 있습니다. 피와 염료를로드하기 전에 심장 주위의 지방 조직을 청소하는이 시간을 사용합니다. 핀셋으로 마음의베이스 근처의 지방 조직을 당겨 작은 해부 가위를 사용하여 잘라. 해부 현미경의 관점에서이 작업을 수행해야합니다.
3. 세포질 칼슘 측정 : 염료 루비로드 - 오전 2시 준비
- 염료를 50㎍을 함유하는 염료 제조업체에서 제공하는 특수 패키징 플라스틱 바이알 DMSO의 20 % 플루 20 μL (비이 온성 계면 활성제)를 추가한다.
- 거품을 피하고로 pipetting 아래로 섞는다.
- 비이 온성 계면 활성제 및 투명한 유리 바이알에 특별한 포장 플라스틱 바이알에서 염료 혼합 DMSO 전송. 타이로드의 SOLU 1 mL를 넣고투명한 유리 병에 기.
- 목욕 초음파기에서 15 ~ 20 분 동안 초음파 처리.
- 실온에서 30 분 동안 연동 펌프를 사용하여 염료를 관류.
- 염료 실에 염료를 놓습니다.
- 매니 폴드에 연결된 모든 다른 배관 라인을 압축하는 기계적 클램프를 사용한다. 클램프는 매니 폴드 위에 배치됩니다. 이를 60 mL의 주사기에 연결된 배관에 역류하는 것을 방지한다.
- 염료를 순환 시작 관류 연동 펌프를 켭니다. 즉시 60 ml 주사기 아래의 3 방향 밸브를 닫는다.
- 심장에 관류 된 염료를 재순환하는 마음 옆에 흡입 연동 펌프에 연결된 작은 튜브를 놓습니다.
4. 내부-SR 칼슘 2 + 측정 : 염료 매기 - Fluo4AM 준비
- 루비로드 - 오전 2시와 동일한 방식으로 매기 - Fluo4AM를 준비합니다. 단계별 지침은 3 장을 참조하십시오.
- Afte염료 로딩 R, 역 관류를 시작 타이로드 용액을 함유하는 60 mL의 주사기에 직렬로있는 밸브를 연다. 매니 폴드 위의 클램프를 제거해야합니다.
- 수평 챔버에 타이로드 솔루션을 추가하고 37 ° C로 예열.
- 45 분 동안 타이로드 솔루션 레트로 관류는 세포질 염료를 제거합니다.
5. 멤브레인 잠재적 인 측정 : 염료 디 - 8 - ANEPPS 준비
- 염료 5 ㎎을 포함하는 염료 바이알에 99 % 에탄올 5 mL를 추가한다.
- 나누어지는 리피터 피펫을 사용하여 500 개인 1 ML의 플라스틱 튜브에 10 μL.
- -20 ° C에서 고속 진공 건조하는 저장소.
- 건조 된 염료의 10 μg의와 플라스틱 병에 20 20 %의 μL 플루 DMSO에 추가합니다.
- 거품을 피하고로 pipetting 아래로 섞는다.
- 플라스틱 병에서 눈금 실린더 (10 ㎖)에 플루와 염료로 DMSO를 포함 믹스를 전송합니다. 최종 VO에 타이로드 솔루션을 추가5 ㎖의 LUME.
- 목욕 초음파기에서 20 ~ 25 분 동안 초음파 처리.
- 연동 펌프를 사용하여 30 분 동안 심장 내로 관류. 3.5 절에서 단계별 지침을 참조하십시오.
6. 심 외막 신호를 기록
- 염료를로드 한 후, 매니 폴드 위의 클램프를 제거하여 타이로드 용액과 마음을 복고 - 관류. 타이로드 용액을 함유하는 60 mL의 주사기에 직렬로있는 밸브를 연다. 10 분 동안 레트로 관류의 타이로드 솔루션은 마음을 안정.
- 타이로드 솔루션 가로 실을 작성하고 37 ° C로 목욕 온도를 가지고 펠티에 장치의 전원을 켭니다.
- 마음의 표면에 광섬유를 배치합니다.
- 2 mL를 피펫 내부의 광섬유를 배치 한 다음 미세 조작기에 피펫을 첨부합니다.
- 약간 LV의 표면에 광섬유를 눌러 미세 조작기를 사용합니다.
- 외부 난방 조절이파형 발생기에 의해 제어되는 자극과 실온.
- 1 ms의 폭의 사각형 펄스를 제공하는 파형 생성기 프로그램.
- 외부 적으로 동기화 될 수있는 자극을 설정하고 파동 발생기에 외부 입력을 연결한다.
- 자극기의 각 출력에, 마지막에 납땜 침술 바늘로 와이어를 연결합니다.
- 약 3mm 떨어져 서로 마음의 정점에 모두 침을 놓습니다.
- 바늘이 조직에 배치됩니다 만 후 전기 충격을 방지하기 위해 자극기의 출력을 켭니다.
- 인수 소프트웨어에서, 10 kHz로 획득 주파수를 조정합니다.
7. 심 내막 신호를 기록
- 염료를로드 한 후 마음을 안정시키기 위해 6.1 및 6.2 단계를 참조하십시오.
- 광섬유의 크기를 급격히 23Ga 점을 이용하여, 격벽에 가까운 LV 심장의 표면에 작은 구멍을 만든다. <리>은 미세 조작기를 이용하여 내막에 처음으로 광섬유의 위치에 도움이되도록 유리체 강내 수술 공막 어댑터를 놓습니다.
- 외부 마음을 조절이. 6.4 단계를 참조하십시오.
- 수집 소프트웨어에서, 10 kHz로 획득 주파수를 조정합니다.
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Representative Results
내막과 외막의 AP와 칼슘 2 + 과도
심실 벽에 걸쳐 신호를 비교하기 위해, 하나의 광섬유는 심장 내막에 배치되고, 심장 외막에있는 다른. 심장 외막에서 하나로 내막에서 기록 된 AP의 형태를 비교하면 전층 기능을 평가하는 가장 좋은 방법입니다. 심실 벽은 매우 이질적이며, 따라서, 액세스 포인트의 형태는이 두 지역에서 매우 다릅니다. 잘 내막 덜 갖는 것으로 알려져 I의 외막 17, 18, 19 이상. 덜 나는 내막 (18), (20)의 1 단계 느린의 재분극을하게합니다. 도 5b 쉬내막과 외막의 AP의 일반적인 광 기록 유수 분리기. 이러한 레코딩을 수행하기 위해, 마우스 마음이 전위차 염료 디 -8- ANEPPs로드 된 형광은 CLFFM 기술을 사용하여 측정 하였다. 특히 1 단계에서 광학적으로 기록 된 AP의 형태는 심장 외막에 비해 심장 내막에 대한 느린 시간 코스 (활동 전위 기간 (APD) (30)는 2.5 ± 8.01 밀리) (0.59 ± 3.4 밀리 초) (그림 5B)를 보여줍니다. 일반적으로, APD는 30, 70 또는 90 (도 5a)를 포함하는 일정 비율 repolarize 위해 AP 걸리는 시간으로 설명 될 수있다. 이 흔적은 특정로 교정 할 수있다, 표준화와, 우리가이 액세스 포인트는 형광 신호가 있지만 내막과 외막이 단계 1시 유의 한 차이가 있음을 볼 때 (도 5c)을 APD는 비교 중첩 단계 0을 가지고 이동되었습니다 동시에으로 AP를 측정하여 막 전위3 M KCl을 13로 가득 날카로운 미세 전극.
막 전위에 부가하여, 외인성 세포 형광 지표 [칼슘]을 감시하기 위해 사용될 수있다. 일반적으로, 우리는 때문에 높은 동적 범위, 심지어 생리 학적 온도에서 세포질에 체류 할 수있는 능력의 세포 내 칼슘 2 + 과도 전압을 측정하기 위해 루비로드 - 오전 2시를 사용합니다. 도 6b는 내막과 심 외막 층의 세포 내 칼슘 2 + 과도의 전형적인 기록을 보여줍니다. 이러한 결과는 부분적으로 15을 발표했다. 세포 내에서 지역적 차이를 비교하기 위해 [칼슘 2 +] 수준은 칼슘 2 + 과도의 반응 속도는 (도 6a)을 평가 하였다. 전반적으로, 칼슘 2 + 과도 반응 속도 (도 6c)의 분석은 내막에서 칼슘 2 + 과도 signifi 것으로 보여심장 외막에서 기록 된 것보다 더 느린 반응 속도를 cantly.
스케줄링 루멘에서 칼슘 역학
심장에서 상승과 세포의 가을 [칼슘 2 +] 수준의 압력, 수축력, 및 활동 전위 기간 (APD) 등 많은 생리 학적 변수를 정의에서 중요하다. 이전 섹션에서는 세포질 칼슘 2 + 과도 전압을 측정 할 수있는 우리의 능력을 설명했다. 칼슘 2 + 스케줄링 해제는 세포 내 세포질 칼슘의 증가에 대해 크게 책임이있다. 따라서, 세포 내 칼슘의 모든 상승을 위해 2 + 칼슘이 2 + 스케줄링의 고갈. 그러나, 세포질 칼슘 과도 SR 칼슘 방출에 전적으로 기인 아니지만 역시 세포막을 통하여 세포 내로 들어오는 칼슘 등. 우리의 실험실16 형광 염료, 매기 - FLUO - 오전 4시의 사용에 의해 SR 칼슘 내용을 평가할 수있다. 이 염료는 myoplasm 및 SR에 탈 에스테르 화되지만, 근육 세포는 세포질 부분을 돌출 할 수 있습니다. 이 염료 압출 단순히 37 ℃로 온도를 증가시킴으로써 촉진 될 수있다. 이 온도에서, 세포질 염색은 막 단백질과 같은 ATP 결합 카세트에 의해 제거된다. 다행히도,이 단백질은 SR 막에 존재하지 않는다. 따라서, 37 ° C로 승온 한 후, PLFFM 기술을 사용하여 기록 된 형광 주로 SR 내의 염료 바인딩 칼슘의 결과이다. 소기관 측정의 특이성을 시험하기 위해, 카페인 펄스 RyR 통해 칼슘 방출을 자극하기 위해 적용 하였다. 이 신호가 실제로 SR 고갈 (도 7)의 결과임을 관찰 할 수있다. 카페인에 의한 SR 칼슘 2 + 릴리스 (도 7a) 모두 크기 - FLUO-4 형광 이완기 수준의 감소를 생성 (92 ± 0.05 % (N = 4, P = 0.012)) 및 칼슘 과도 (51 ± 0.21 %의 진폭의 감소 (N = 4, P = 0.003)) 16. 내부 SR 흔적 전에 기록 카페인의 자극 후 아래쪽으로도 7b-7D에 표시됩니다. 시간 카페인 자극으로부터 진행되는 SR 고갈의 진폭이 작다. 도 7E는 SR 고갈이 칼슘 신호의 진폭의 감소를 유도 할뿐만 아니라 SR 칼슘 방출 프로세스를 느리게 할뿐만 나타낸다. 도 7a의 형광 추적 이전에 15 게시되었습니다.
펄스 LED : 액션 잠재력
그림 5에서 우리는 디 - 8 - ANEPPS 변경 사항을보고 할 수 있음을 보여 주었다막 잠재력에는 532 nm에서 흥분 할 때. 이 여기 상태에서의 파장에서 방출 된 형광의 감소는 더 높은 590 nm의보다있다. 흥미롭게도,이 전위차 염료 최대 여기 파장으로 여기 된 근접 (~ 476 ㎚), 저급 파장 때 막 탈분극에 염료 이행의 형광 방출 경우. 따라서,이 스펙트럼 변화는 두 개의 서로 다른 파장에서 방출 된 형광을 기록하기 위해 우리를 허용합니다. 이 스펙트럼 속성 디-8-ANEPPS 두 개의 서로 다른 파장에서 기록 방출 형광, 최종 계산 된 기록 막 중의 색소 농도에 무관하기 때문에 일반적으로 큰 가치있는 특징의 배급 할 수있다. 디 -8- ANEPPS 시프트 스펙트럼을 최대한 활용하기 위해, 우리는 광원으로 펄스 형 LED를 사용 하였다. 우리는 형광을 자극하는 펄스 푸른 빛을 사용했다. 여기는 디-8-A의 흡수 극대 파장 485 nm의 부근에서 실시 하였다NEPPS (~ 476 ㎚). 두 개의 다른 방출 분광 대역 취득 비 형성 및 S / N을 향상시키고 기계적 uncoupler의 blebbistatin 사용되지 하트 수축에 환경 광 및 동 잡음과 같은 공통 모드 잡음을 제거 할 수있는 능력을 허용한다. 이러한 상황은 심장의 기계적 활성 및 칼슘 과도 동력학이 동시에 측정 될 필요 실험 조건에 매우 중요하다.
PLEDFM의 타이밍도가도 8a에 도시된다. 이 그림은 광 검출 headstage 상기 LED의 온 - 오프 타이밍 및 아날로그 - 디지털 변환의 통합 및 재설정하기위한 제어 로직을 포함한다. 액세스 포인트의 시간 과정에서 녹색 파장 대역에서 검출 된 형광 적색 대역에서 검출 된 형광 강도가 감소하는 동안 증가를 나타낸다. 도 8b 쇼 그림그 막 탈분극에 의해 제조 된 형광 신호의 변화가 다른 방향으로 이동한다. 그러나, 심장 수축에 의해 생성 된 동 잡음은 항상 발광 파장과 무관하게 동일한 방향으로 배향된다. 앞서 설명한 바와 같이, (녹색 및 적색) 두 채널의 데이터는 소프트웨어 에어컨 비율을 계산하기 전에해야합니다. 컨디셔닝 오프셋 및 수정을 획득하는 것을 포함한다. 오프셋 및 이득 레벨 보정의 선택은 자동 아니다. 소프트웨어의 사용자는 비 전에 추적 상태로 변수를 선택한다. 패널도 8b에서 발생한 비율 (그림 8)은 심근의 움직임에 의해 도입 된 유물이 취소되었음을 보여줍니다.
액세스 포인트 중 디 -8- ANEPPS 형광의 상대적인 변화는 일반적으로 매우 작은 (~ 8 % 100 MV 당). 이 디 -8- ANEPPS 형광 변화는 칼슘 bindin 의해 생성되는 것보다 훨씬 작다루비로드-2 (<200 %)에 g. 따라서, 디 -8- ANEPPS의 신호 대 잡음비를 증가시키기 위해, 다수의 녹화가 평균화 될 수있다.
펄스는 LED : 동시 칼슘의 녹음 2+ 및 막 잠재력을
이 실험 방법을 사용하여 마지막 목표는 칼슘 2 + 과도 및 액세스 포인트의 동시 녹음을 수행하는 구성되어 있습니다. 광섬유와 광원의 결합, LED의 발광과 색소의 흡수 스펙트럼을 매칭에 아날로그 및 디지털 전자 회로의 설계 : 여러 생리적 신호의 동시 기록을 포함하여 시스템의 다른 양태에 관련된 기술적 인 문제를 해결 필요 타이밍 및 취득뿐만 아니라 온라인 데이터를 분석하기 위해 빠른 소프트웨어의 개발을 생성합니다.
OU의R 공부, 염료의 선택은 스펙트럼 특성에 의존한다. 다양한 신호들을 측정하기 위해 사용 Flourophores 상이한 스펙트럼 대역에서 흡수해야한다. 이 조건은 신호 소스를 구별하는 것이 필수적이다. 상이한 파장을 갖는 LED가 조직을 자극하는데 사용되는 때마다, 그 형광 파장에서 흡수하는 염료 관련 신호에 대응 검출. 이와 같이, 형광 방출은 다른 염색 으하지만 동일한 파장 대역에서, 각 흥분되는 시간에 의해 구별 될 수있다.
그렇지만, 염료의 스펙트럼 사이의 크로스 토크는 충분히 회피 될 수 없다. 염료의 흡수 스펙트럼 특성 그들의 흡수 극대 파장에서 멀리 광을 흡수 할 수 있기 때문이다. 실험에서, 크로스 토크는 두 가지 방법으로 제조 하였다 : (1) 루비로드 -2- 적색 채널을 활성화에 칼슘 신호를 가산, 청색 LED에 의해 여기 될리터의 AP 추적, (2) 디 - 8 - ANEPPS은 칼슘 2 + 과도 신호 (그림 9 층)에 표시되는 녹색 LED에 의해 흥분된다. 도 9에 도시 된 바와 같이,이 크로스 토크가 온라인으로 보정 될 수있다. 침입 신호를 측정 할 필요가있는 신호의 소수이므로 절차는 작동한다. 마지막으로, 염료 우리가 AP (그림 9D)를 분리 할 수에서 fluorecence의 대수 처리의이 유형을 사용하여이 칼슘 2 + 과도 (그림 9H)을 형성한다. 이 처리의 상세한 개요 도면 범례에 기재되어있다. 모든 펄스 LED 실험이 28 ° C를 실시 하였다 통지하는 것이 중요하다.
그림 1 : 로컬 필드 형광 현미경 (LFFM). LFFM는 표면 형광 배열로 구성조직과 접촉하는 멀티 모드 광파이버를 사용하여 심장 내로 관류 외인성 염료에서 방출 된 형광을 기록한다. LFFM 설정은 여기 광 펄스 피코 ND-YAG 레이저에 의해 제공되는 (a) PLFFM 포함한 세가지 다른 광원을 사용할 수있다; (b) 연속 발진 레이저가 이용되고, 광 펄스가 서로 다른 파장의 레이저의 다중화를 허용하는 강유전체 변조기에 의해 생성되는 CLFFM; 그리고 LED가 피크의 배출 (d)는 485 nm의 청색 및 녹색 LED를위한 540 나노 미터와 폭 넓은 발광 스펙트럼을 갖는 (C) PLEDFM는 각각 전자 펄스된다. 레이저 소스를 사용하는 경우, 빔은 빔 익스팬더에 의해 디 포커스된다. 마지막으로, 다이 클로 익 미러와 대물 렌즈는 다소 조직에 대해 가압되는 광섬유의 원위 단부 상에 상기 빔을 포커스. 발광 다시 동일한 광섬유를 통해 이동, 다이크로 익 미러, EMIssion 필터는, 광자는 전류로 변환된다 애벌란 포토 다이오드로 집중된다. 전류는 생성 된 출력 전압과 광전류 피드백 저항에 비례하는 두 가지 방법 (E) 트랜스 임피던스 증폭기에 의해 증폭 될 수있다; 출력 전압은 전류 피드백 용량의 함수 (F) 적분기. 최종적으로, 신호는 A / D 변환기에 의해 취득하고, 컴퓨터에서 볼 수있다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 : 저항 및 정전 용량 변환. (a) 피코 초 레이저 펄스의 검출 저항의 전형적인 예를 도시한다. 별표 (b)피크 추적 알고리즘은 피크 (적색)과베이스 (녹색)을 검출하도록 구현 된 시간 간격 확대를 나타낸다. (다) 봉우리와베이스 녹음에서 계산 된 흔적의 표현은 37 ° C로 설정 외부 7 Hz에서 진행 구타 잉꼬 마음에 루비로드-2 형광 반응 및 목욕 온도 표시됩니다. H로 d) 용량의 피드백을 사용하는 적분기에 의해 변환 된 광전류. 그대로 마우스 마음 칼슘 2 + 과도의 대표적인 녹음은 두 개의 서로 다른 시간 스케일 (D와 E)에 표시됩니다. (바)와 LED 조명없이 두 개의 연속적인 사이클의 통합이 표시됩니다. 광전류는 피드백 커패시터를 충전 선형 적으로 증가되는 신호의 적분. 시간 종속 적분 (탄 (Ɵ))의 기울기가 (P)에 의한 전자 - 정공 재결합에 부가 애벌 접합 영향 광자의 수에 비례hononic 활동 때 눈사태 다이오드는 광자를 감지하지 않습니다. 디지털 신호는 headstage 통합을 제어하고 기간은 패널 g에 표시됩니다 리셋. 조명 (DC) 조명 비 및 LED 기간 (F) 중에 감지 된 신호는 패널 시간에 표시됩니다. F 및 DC의 감산은 형광의 실제 측정 쥐의 마음에서 칼슘 과도 외부에서 37 ° C (H)에서 9 Hz에서 진행 검출 제공합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3 : 심장 외막과 내막 측정을위한 LFFM. CLFFM 셋업 심장 외막에 존재 외인성 형광 염료에서 방출 된 형광을 측정 하였다D 내막 층. 빔 스플리터의 첨가는 심장 외막과 내막이 다른 생리 학적 변수의 기록을 용이. 두 광섬유는 심장 외막과 내막에서 검출 개별 headstages으로 사용되었다. 작은 원형 절개 뇌실에 만들어진 및 광섬유는 내막에서 기록하기를 통해 스레드했다. 이 셋업 저항 피드백을 갖는 전류 - 전압 변환기를 사용 하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4 : 온도 제어 가로 상공 회의소. 그대로 마음이 시간 동안 기능을 유지하는 랑겐 돌프의 셋업을 보여주는 도면이다. 심장이 바늘에 연결되는 모든 솔루션과 염료를 통해대동맥을 분파 관상 동맥을 통해 심장에 복고풍 관류한다. 챔버는 전압계에 접속 된 온도 센서에 의해 판독되는 욕의 온도를 유지하기 위해 펠티에 유닛의 상부에 위치한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5 : 본래 마음에 전층 활동 전위 측정. (a) 활동 전위 기간 (APD)는 그 30 %, 70 %, 또는 AP의 재분극의 90 %를 완료하는 데 소요되는 시간으로 평가 하였다. (B) 외막 (검정)과 내막 (회색)에서 디 -8- ANEPPS 형광 AP에게 심실 벽의 두 층 사이 재분극의 형태의 차이를 나타낸다. t를 평가 한 후에 (c)그는 내막과 외막 30, 70, 90 APD, 결과는 유의 한 차이가 APD (30) (3 ± 0.6 밀리 심장 외막 대 8 ± 2.5 밀리 내막)에서 발생했다. 하트 6 Hz에서 진행하고 온도는 37 ° C로 설정. 데이터는 5 마음의 ± SEM 평균입니다. * P <0.05. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6 : 전층 칼슘 2 + 온전한 마음에 과도 측정. (a)는 칼슘의 매개 변수 2+ 측정 과도 반응 속도입니다 걸리는 시간이 최대에 도달하는 시간 (TP) 피크; 이 상승의 10 %에서 90 %로 이동하는 데 걸리는 시간은 시간 (RT)을 상승; 이 10 %의 감쇠, 감쇠 시간 (DT)의 90 %로 이동하는 데 걸리는 시간; 그리고이번에는 과도 절반 지속 기간 (HD)의 50 %를 완료하는 데 걸리는. 휴식의 차이와 녹색 CW 레이저 쇼 심장 외막 (검정)과 내막 (회색) 칼슘 2 + 과도로 여기 후 루비로드 2에 의해 방출 (b)에 형광. c) 상기 내막에서 2 + 과도 칼슘은 RT, TP, HD에 상당히 느린 반응 속도가 있고, 심장 외막에서 기록 된 것보다 DT. 하트 6 Hz에서 진행하고 온도는 37 ° C로 설정. 데이터는 5 마음의 ± SEM 평균입니다. * P <0.05. Mattiazzi 등의 수정. 15. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 7 : 본래 마음의 내부 SR 칼슘 측정.(a)는 크기 - FLUO-4 염료에서 방출 된 형광은 SR 내 칼슘 농도의 감소를 반영하는, 시간이 지남에 따라 떨어진다. (b)는 칼슘에게 SR에서 칼슘 방출에 의해 유도 2+ 고갈을 나타내는 크기 - FLUO 4 형광의 감소의 확대도. (다) 2 + 20 mM의 카페인 마음을 관류에 의해 수정 릴리스를 칼슘을 나타내는 크기 - FLUO 4 형광에서 과도 진폭의 감소의 확대도. 카페인 긴 애플리케이션 크기 - FLUO-4와 형광 칼슘 과도 [DOWN 92 ± 0.05 % (N = 4, P = 0.012)과의 진폭의 레벨 이완기 모두 저하 한 후 (d) 51 ± 0.21 % (N = 4, P = 0.003)의 초기 값의 각각은, 관찰된다. 시간은 카페인 진행됨에 따라 작아 SR 고갈의 진폭이다. (E) BD의 정규화 된 흔적은 SR 고갈은 유도하지 보여줍니다s는 칼슘 신호의 감소뿐만 아니라, 아래로 SR 칼슘 보충 느려집니다. 하트는 4 Hz에서 진행하고 온도는 37 ° C로 설정. 형광 추적 Kornyeyev 등의 알에서입니다. 16. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 8 : 펄스 LED와 본래 마음의 AP의 비례 측정. (a)와 통합 headstage 리셋 포함 타이밍도가 온 - 오프 LED 및 실제 녹화 시간이 도시되어있다. 두 채널 쉬고 다른 값을 가지며, 각 AP가 쉬고 값에 의해 선행 될 때까지 레버를 이동시켜 보정에서의 오프셋 (b) 추적. 각 채널의 이득도이다 adjus테드. 매우 큰 움직임 유물은 두 depolarizations 사이에 두 채널에 표시합니다. 소프트웨어 ratiometrically 신호를 처리 한 후, 그 결과는 아티팩트 (청색)없이 AP이다. 하트는 3 Hz에서 진행하고 온도는 28 ° C로 설정. 표시된 모든 기록은 10 트레이스의 평균입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 9 : 동시 칼슘 2 + 과도 및 펄스 LED와 온전한 마음에 AP 측정. 신호의 크로스 토크의 오염은 기록 할 때 모두 칼슘 및 AP가 온라인으로 보정 될 수있다. 전위차 염료, 디 -8- ANEPPS 20 μS으로 여기되어 청색 LED 펄스 (a). 신호는 S입니다PLIT, 대역 통과 빨간색과 녹색 필터로 여과. 이러한 신호는 적색 (B) 및 녹색 채널 (C)로 표시된 두 가지 애벌랜치 포토 다이오드에 의해 검출된다. 빨간색과 녹색 두 신호, 하향 편향으로 나타납니다 눈에 띄는 움직임 이슈를 제시 것을 관찰 할 수있다. 빨간색과 녹색 두 신호는, offseted 다음 증폭된다. 조절 된 신호는 그들 사이의 비율을 계산하는 데 사용되며, 그 결과 D에 도시된다. 움직이는 아티팩트 취소 두 신호 (d) 사이의 비율을 관찰하는 것이 가능하다. 패널 E 녹색 발광 LED가 칼슘 인디케이터 루비로드 -2- 여기 시키는데 사용되는 제어 논리 펄스의 시퀀스를 도시한다. 이 절차를 사용하여 얻은 형광 신호 F에 도시된다. F의 추적 주로 기인 칼슘 bindin하여 형광 신호의 증가를 보여 주지만루비로드-2 g, 때문에이 염료는 녹색 빛으로 흥분 디 - 8 - ANEPPS에서 형광 검출 신호 추적에 부정적인 편향을 관찰 할 수있다. 이 문제는 g에 나타내는 전위차 신호를 감산하여 보정 될 수있다. 감산의 결과는 패널 H Ca를 같다 2+ AP에 오염을 얻을 수없는 신호. 하트는 3 Hz에서 진행하고 온도는 28 ° C로 설정. 표시된 모든 기록은 10 트레이스의 평균입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
이 문서는 심장 근세포 생체의 기능을 평가하기 위해 국소 체 형광 기술을 설명하기에 중심. 결합 된 환경에서 이러한 세포의 연구뿐만 아니라 더 많은 생리적 인뿐만 아니라 장기 레벨 병리학을 평가하기위한 매우 적합하다. 여기 수축 커플 링 (ECC)를 기본 셀룰러 이벤트 세포 내 칼슘 역학을 모니터링 분자 프로브의 사용과 전체 기관 수준에서 (루비로드 2 세포질 칼슘을 매기-Fluo4 SR 칼슘) 평가 될 수 있으며, 전기 활동 (디 -8- ANEPPs). 여기, 우리는 모두 흥분과 광섬유를 이용하여 형광 지표에서 방출을 수집 세 LFFM의 표면 형광 기법을 제시 하였다. 이들은 사용 된 광원과 광 변조의 유형에 따라 다르다. LEDFM도 PLEDFM에 펄스 수의 LED를 사용하는 반면 PLFFM는, 빛, CLFFM 연속 레이저 빛을 사용하여 펄스 레이저를 사용합니다. 이 모든한 세트로서도 1에 제시되지만, 세 개의 표면 형광 배열의 하나로 구성 될 수있다. 또한, 상기 검출 된 광은 다양한 방법으로 처리 될 수있다. 예를 들어,도 2는 광전류가 통합 또는 직접 전류 전압 변환기에 의해 전압으로 변환 될 수있는 두 가지 경우를 예시한다. 도 3와 같이 일반적 LFFM 방식은 동시에 다수의 해부학 적 위치를 측정하는데 사용될 수있다.
본래 기관 수준에서 심근 특성을 평가하기 위해 여기에 제시된 방법은 셀들 사이의 커플 링은 상기 조직의 행동을 정의하는 중요한 문제를 연구하는 것이 더 적절하다. 다른 AP를 생산할 수있는 심장의 극한 이질성 특정 조직에 기초하여, 22 21, 13 파형하는 CE로부터LLS 유래. 따라서, 전체 장기 연구는 다른 해부학 적 구조의 셀의 로컬 생리 기능을 평가하는 기회를 제공한다. 또한, 우리는 불꽃과 파도 같은 세포 내 이벤트가 그대로 기관 (15)보다 해리 세포에서 다른 동력학을 가지고 보았다.
랑겐 돌프 세트 업 (그림 4)는 생체에 가까운 상황에서 마음을 유지하는 것이 중요합니다. 또한, 여러 가지 생리 학적 변수의 측정을 허용 다중 약물 및 다양한 형광 분자 프로브 retroperfusion 있습니다. 서로 다른 광원을 사용하는 외인성 형광 프로브 변경 광섬유의 크기를 증가 또는 선택 극적 기술의 응용을 변경할 수있다. 또한, 수평 챔버 아래 펠티에 유닛은 다양한 온도에서 칼슘 역학에 대한 연구를 촉진 할 수있다. 액세서리를 추가빔 스플리터가 그대로 마음에 다른 지역에서 기록하는 데 사용 광섬유의 수를 증가시킬 수 등 LFFM합니다. 이 지역의 차이는 병적 인 시나리오에서 발생할 경우 테스트하는 매우 유용한 적응이다. 그림 3은 내막을 보여주고 심장 외막 동시에 평가된다. 또한, 다른 효능과 마음을 관류하는 것은 우리가 심실 벽에서 서로 다른 영역을 조절하는 방법을 이해 할 수 있습니다. 전기 신호 (그림 5)과 칼슘 2 + 운동 (그림 6)은 이질성은 심장 외막과 내막에 비교 될 수있다. 또한, 상이한 여기 파장 및 방출 필터를 다수의 염료가 사용될 수있다. 예를 들어 크기 - FLUO-4를 사용함으로써, SR의 루멘의 칼슘 이온 농도는 (도 7)에 기록 될 수있다. 광섬유의 크기를 변경하는 것도 LAR에서 형광 촬영을 허용함으로써 이러한 방법의 용량을 확장 할 수있다게르 영역입니다.
이 논문은 또한 별도로 고가의 레이저에서, LED는 우리의 기술에서는 여기 광원으로서 사용할 수 있음을 보여준다. 도 8은 광원이 저렴 유형 ratiometrically AP를 측정 할 수 있음을 보여준다. 도 8에 도시 된 비율 적 측정은 이동에 의한 아티팩트를 포함한 실험없이 최종 기록 생산에 유리하다. 마지막으로, 심지어 칼슘 과도 AP 광학적 다중화 상이한 파장과 동일한 발광 스펙트럼과 염료를 사용하여, 동시에 기록 될 수있다. 도 9에 설명 된 신호 처리는 염료의 발광 스펙트럼의 중첩에 의해 생성 된 내부의 오염을 제거하는데 중요하다. 칼슘을 2 + 과도 및 AP를 동시에하지만, 두 개의 독립적 인 출력 신호를 기록하는 ECC 및 칼슘 유도 된 칼슘을 공부에 도움이됩니다 2+
LFFM 그대로 조직의 세포 생리학의 여러 응용 프로그램과의 기술이다. 그러나, 하나의 중요한 한계는 녹음 된 형광 광파이버가 조직과 접촉되는 로컬 영역 내의 기본 형광 표시기에서의 평균 발광 점이다. 두 개의 광섬유를 사용하는 경우에도, LFFM은 측정 된 신호의 세포 내 공간 분포를 제공하지 않는다. 광학 매핑 같은 AP, 칼슘 과도 전파로서 공간과 시간의 변화 생리 학적 변수를 모니터링하는 좋은 방법이며, alternans 23, 24, 25. LFFM는 공 초점 현미경 및 기타 광학 매핑 기술과 같은 구조의 영상을 제공 할 수 없습니다. 그럼에도 불구하고, 광섬유의 사용은 R에이 실용적심 내막 또는 공 초점 현미경으로 온전한 마음에 접근이 어렵거나 불가능한 다른 지역에서 지역 형광 신호를 ecording.
그대로 마음에서 얻은 생리 학적 변수들 사이에 고립 된 심근 세포 실험에서 비교는 어렵습니다. 절연 심장 근세포를 이용하는 가장 큰 이점은 패치 클램프 조건 하에서 세포의 생물 리 학적 특성을 평가할 수있는 유일한 기회이다. 반면, LFFM보다 네이티브 환경에서 생리와 병리 현상의 연구를 할 수 있습니다. 예를 들어, 그대로 마음에 우리는 분리 된 세포에서 달성 할 수없는 전층 생리의 차이 (15), AP와 칼슘의 심장 박동 의존성 2+ 범위 (13)을 평가할 수 있습니다. 또, 본래의 중심 구 (10)의 기능에 허혈의 효과를 연구 할 수있다. 항목의 심장 전위한 실험은 또한 우리가 다른 유형의 세포 및 근육 세포 (11) 사이의 상호 작용을 평가하기 위해 허용한다.
LFFM는 세포 생리 학적 커플 링이있는 그대로 심장 수준에서 세포 신호 시각화 할 수 있습니다. 세포가 손상 기관에서 여전히 동안 LFFM은 세포 활동의 연구를 할 수 있습니다. 칼슘 역학과 전기 활동 : 형광 염료 및 epiluminescence와 함께, LFFM 두 가지 주요 심장 속성을 모니터링 할 수 있습니다.
마지막으로, 여기에 제시된 방법은 ECC의 연구에서 여러 응용 프로그램을 사용할 수 있습니다. 이 같은 부정맥 (16)과 허혈 9, 15으로 병적 인 상황에 영향을받는 방법 초분자 신호를 나타낼 수있는 도구입니다. 이 기술들이 단지 그대로 기관 수준에서 잘 이해 될 수 있기 때문에 이러한 병리를 연구하기 위해 필요한 것이다.
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Disclosures
저자는 공개 아무것도 없어.
Acknowledgments
우리는 제시된 작품의 중요한 논의 박사 알리샤 Mattiazzi 감사합니다. 이 작품은 NIH로부터 연구비 (R01 HL-084487) ALE에 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium chloride | Sigma | 7647-14-5 | |
| D-(+)-glucose | Sigma | 50-99-7 | |
| Potassium chloride | Sigma | 7447-40-7 | |
| HEPES | Sigma | 7365-45-9 | |
| Sodium phosphate | Sigma | 10049-21-5 | |
| Calcium chloride solution | Sigma | 10043-52-4 | |
| Magnesium chloride solution | Sigma | 7786-30-3 | |
| Sodium hyrdoxide | Sigma | S-8045 | |
| 0.2 μm nylon membrane filter | Whatman | 7402-004 | |
| Manifold MPP | Warner | 64-0216 | |
| 21G1.5 Precision glide needle | B-D | 305167 | |
| Black Braided silk string (non-absorbable surgical suture) | AllMech Tech | LOOK-SP105 | |
| Heparin sodium injection 1000USP/mL | AllMech Tech | NDC63323-540-11 | |
| DMSO D8779 | Sigma | 67-68-5 | |
| Blebbistatin | Sigma | 856925-71-8 | |
| Pluronic F-127 20% solution | Biotium | 59004 | |
| Materflex C/L peristaltic pump | Cole-Parmer | 77122-26 | |
| Isostim stimulator | World Precision Instruments | A320RC | |
| Waveform generator | Teledyne Lecroy | WaveStation 2012 | |
| Ultrasonic cleaner FS20 | Fisher Scientific | 1533530 | |
| Tygon tubing ID:1/32" OD:3/32" Wall 1/32" | Component Supply | TET-031A | |
| Tygon tubing ID:3/32" OD:5/32" Wall 1/32" | Component Supply | TET-094A | |
| Adapter luer lock to 3-way valve | Cole-Parmer | EW-31200-80 | |
| Tee adapters and plastic fittings | Cole-Parmer | 6365-90 | |
| Plastic clamp | WaterZoo | 2465 | |
| Peltier | TE Technology | TE-127-2.0-2.5 | |
| Rhod-2AM | ThermoFisher Scientific | R1245MP | |
| Di-8-ANEPPS | ThermoFisher Scientific | D3167 | |
| Mag-Fluo-4AM | ThermoFisher Scientific | M14206 | |
| Acupunture needles | LHASA | TC1.20x13 | |
| 60 mL BD syringe with luer-lok | Fisher Scientific | 14-820-11 | |
| LabView | National Instruments | ||
| Speed vacuum Eppendorf Vagufuge | Fisher Scientific | 07-748-13 | |
| Digital signal processing circuit DSP TMS 320 | Texas Instrument | ||
| Longpass Dichroic mirror 567 nm | ThorLabs | DMLP567L | |
| Objective 10X NA 0.25 DIN AchromaticFinite Intl Standard Objective | Edmund Optics | Stock# 33-437 | |
| Objective 20X NA 0.40 DIN Achromatic Finite Intl Standard Objective | Edmund Optics | Stock# 33-438 | |
| Longpass colored glass filter 590 nm | ThorLabs | FGL590 | |
| Green Nd-YAG laser 532 nm, 500 mW | |||
| Micromanipulator for laser | Siskiyou | MX130R | |
| Multimode fiber optic 200 µm NA 0.39 | ThorLabs | FT200UMT | |
| LEDs blue | Lumileds | L135-B475003500000 | |
| LEDs green | Lumileds | L135-G525003500000 | |
| Cube beam splitter, non-polarizing | ThorLabs | BS007 | |
| 36" Length, Dovetail Optical Rail | Edmund Optics | 54-402 | |
| 2.5" Width, Dovetail Carrier | Edmund Optics | 54-404 | |
| 0.75" Travel, micrometer stage | Edmund Optics | 37-983 | |
| Dovetail optical rail 3" | ThorLabs | RLA075/M | |
| Dovetail rail carrier 1" | ThorLabs | RC1 | |
| Avalanche photodiode Helix 902 | Digi-Key | HELIX-902-200 | |
| Objective holder XY Translator | ThorLabs | ST1XY-S | |
| Aluminum breadboard 6" x 6" | ThorLabs | MB6 | |
| Nexus otpical table 4' x 6' | ThorLabs | T46HK | |
| Stainless steel cap screws | ThorLabs | HW-KIT5/M | |
| Acrylic sheet | Home Depot/Lowes | ||
| Sylgard Silicone elastomer kit | Dow Corning | Sylgard 184 | |
| Epoxy gel | Walmart/Home Depot | 2-part 5 min clr 1oz | |
| 21G1.5 Precision glide needle | B-D | 305167 | |
| 23G Precision glide needle | B-D | 305145 | |
| Mounting base, 25 mm x 75 mm x 10 mm | ThorLabs | BA1/M | |
| Wire shelve posts 36" | Alera | AALESW59PO36SR | |
| Wire shelves | Alera | ALESW582424SR | |
| Post and angle clamp | ThorLabs | SWC/M-P5 | |
| Glass syringe for dye chamber | Wheaton | W851020 | |
| Rubber stopper | Home Science Tools | CE-STOP01C |
References
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