Summary
В самом центре, молекулярные события координировать электрическую и сократительную функцию органа. Набор локальных методов микроскопии поля флуоресценции, представленные здесь позволяет записывать клеточных переменных в интактных сердцах. Выявление механизмов, определяющих функцию сердца имеет решающее значение для понимания того, как сердце работает в патологических ситуациях.
Abstract
В сердце, исследования молекулярной сигнализации, как правило, выполняются в изолированных миоцитов. Тем не менее, многие патологические состояния, такие как ишемия и аритмий могут быть полностью поняты только на уровне целого органа. Здесь мы представляем метод спектроскопический локального поля флуоресцентной микроскопии (LFFM), что позволяет измерять клеточных сигналов в интактном сердце. Методика основана на комбинации Лангендорфа перфузию сердца и оптических волокон для записи флуоресцентные сигналы. LFFM имеет различные приложения в области сердечно-сосудистой физиологии для изучения сердца при нормальных и патологических состояниях. Несколько переменных сердца можно контролировать с помощью различных флуоресцентных индикаторов. К ним относятся цитозольного [Ca 2+], внутрисуставной саркоплазматического ретикулума [Ca 2+] и мембранных потенциалов. Экзогенные флуоресцентные зонды возбуждаются и излучаемый флуоресценции обнаружена с тремя различными расположений техники LFFM эпифлуоресцентнойы представлены в этой статье. Центральные различия между этими методами являются тип источника света, используемого для возбуждения и на пути света возбуждения модулируется. Импульсный LFFM (PLFFM) использует лазерные световые импульсы во время непрерывной волны LFFM (CLFFM) использует непрерывный лазерный луч для возбуждения. Наконец, светоизлучающие диоды (СИД) были использованы в качестве третьего источника света. Это некогерентного расположение называется импульсно светодиодной флуоресцентной микроскопии (PLEDFM).
Introduction
Сердце является центральным органом сердечно-сосудистой системы. Сокращение сердца инициируется увеличением внутриклеточного [Са 2+]. Взаимосвязь между электрической возбудимости и изменения внутриклеточного высвобождения Ca 2+ исторически изучены в ферментативно диссоциированных клеток 1, 2. Тем не менее, кардиальные клетки электрически, метаболически и механически соединены 3, 4. Когда изолированный, миоциты не только физически отсоединен, но миоциты из разных слоев смешиваются при диссоциации 5. Кроме того, несмотря на огромные преимущества, которые возникли из исследования изолированных клеток под напряжением условий зажима, 6, 7, 8 внутренняя природа сердца как электрический синцитий AlwaYS ставит вопрос о том , как функционально отличается диссоциированы клетки от присутствующих в ткани 3.
В этой рукописи, мы описываем успехи, полученные в познании физиологии сердца с использованием локального поля флуоресцентной микроскопии методами (LFFM) в интактном сердце. LFFM использует флуоресцентные индикаторы для измерения нескольких физиологических переменных , таких как цитозольного Ca 2+, внутри саркоплазматического ретикулума (СР) Са 2+ и мембранного потенциала. Эти измерения могут быть получены одновременно и в сочетании с желудочковой давлением 9, 10, 9, электрокардиограммы электрических потенциалов действия (AP), ионный ток записи и флеш - фотолиза проарретированных соединений 4, 11. Кроме того, эти измерения могут быть получены путем стимуляции интактного сердца на более высоких частотах, близкихг к физиологическим ставкам. Хотя несколько статей 9, 11, 12, 13, 14 были опубликованы нашей группой с использованием методов LFFM, презумпция технических сложностей , связанных с этой техникой предотвратил ее массовое использование при изучении естественных физиологических бывших явлений в сердце и других органах.
Методика LFFM (рис 1) основано на результатах измерений , полученных с использованием эпифлуоресцентной многомодовое оптическое волокно , находящийся в контакте с тканью. Как и любой другой метод визуализации контактная флуоресценции, оптическое разрешение зависит от диаметра и числовой апертуры (NA) оптического волокна. Более высокое NA и меньший диаметр волокна увеличится пространственное разрешение измерений. НСБУ и диаметры волокон может находиться в диапазоне от 0,22 до 0,66 и от 50 мкм до 1 мм, соответственно. Всморщиванию НС улучшит отношение сигнал-шум (S / N), принимая фотоны, приходящие от большего телесного угла. Для того, чтобы выступать в качестве эпифлуоресцентной устройства, световой луч фокусируется в оптическое волокно с асферической линзой или объектива эпифлуоресцентной где NA линзы и матч волокна. Такое согласование максимизирует передачу энергии для возбуждения и сбора обратно фотоны, испускаемые флуорофором.
Для возбуждения экзогенные флуоресцентные индикаторы, загруженному в ткани, различные источники света и режимы освещения могут быть использованы. Наши новаторские исследования с использованием импульсного локального поля флуоресцентной микроскопии 3, 12 (PLFFM) использовали пикосекундного лазера низкой стоимости (Рисунок 1a, PLFFM). Этот тип источника света имеет огромное преимущество захватывающем большой доли молекул флуорофора под области освещения без существенного отбеливания красителя из-зана короткий длительностью импульса 12. Кроме того, использование ультракоротких импульсов позволило оценку жизни флюоресценции красителя 12. Время жизни флюоресценции является свойством , которое может быть использовано для количественного определения фракции молекул красителя , связанного с Са 2+. К сожалению, временное дрожание импульсов и вариации амплитуды от импульса к импульсу ограничить применение этой экспериментальной стратегии в тех случаях, когда изменение флуоресценции получают путем связывания лиганда с красителем велико.
Непрерывного действия (НД) лазеры обычно используются в качестве основного источника освещения в LFFM (рисунок 1b, CLFFM). Лазерный луч может непрерывно освещать ткани или может быть сегнетоактив- модулированный. Сегнетоактивное модуляция пучка позволяет генерировать микросекунд импульсами света. Эта модуляция может управляться внешним оборудованием. Эта процедура не только значительно снижает Tон височной дрожание световых импульсов, но и позволяет микшировать пучки различных длин волн. Смешивание пучков осуществляется мультиплексирование лучей от различных лазеров. Как следствие, множественные красители , имеющие различные спектральные свойства могут возбуждаться проводить измерения различных физиологических переменных, например, Rhod-2 для цитозольного Ca 2+, MagFluo4 внутрираздельный SR Ca 2+ и ди-8-ANEPPS для мембранный потенциал.
Хотя лазеры представляют различные преимущества как источник света в LFFM, другие типы источников света могут быть использованы в том числе светодиодов (LED). В этом случае источник света возбуждения состоял из InGaN светодиода (фиг.1С, PLEDFM). В светодиодах, фотоны спонтанно испускается, когда электроны из зоны проводимости рекомбинируют с дырками в валентной зоне. Отличие твердотельных лазеров является то, что излучение не стимулируется другими фотонами. Это приводит к некогерентного пучка иболее широкий спектральный выбросов для светодиодов.
могут быть использованы различные типы светодиодов высокой мощности. Для записей AP , используя ди-8-ANEPPS и Са 2+ , записанные с помощью Fluo-4 или Mag-Fluo-4, мы использовали светодиод , который имеет характерный пик излучения при 485 нм (синий) и половину ширины 20 нм (Рисунок 1d). Са 2+ , записанных с Rhod-2, светодиод имел типичный пик излучения при длине волны 540 нм (зеленый) и половину ширины 35 нм (рис 1d). Светодиоды излучают в диапазоне длины волны, и, следовательно, требуют фильтров, чтобы сузить спектральную излучение. Кроме того, импульсный свет может быть сформирован в размере 1,6 кГц с длительностью 20 мкс. СИДов импульсно быстрого питания MOSFET полевого транзистора. Одновременные записи с различными индикаторами могут быть выполнены с помощью временного мультиплексирования светодиодов. К сожалению, свет, испускаемый светодиодами труднее сосредоточиться на волоконно-оптический по сравнению с лазерным лучом. Таким образом, основным недостатком насING светодиодов является то, что их профили излучения имеют угловые смещения (± 15 °) от главной оси, а вспомогательный оптический должен использоваться, чтобы исправить ее.
Во всех оптических конфигураций, описанных ранее, возбуждающий свет отражается с помощью дихроичного зеркала. Пучок затем фокусировалось асферической линзой и объектив микроскопа на многомодового оптического волокна, который расположен на ткани. Как и в любом расположении эпифлуоресцентной, дихроичных зеркал также служит для отделения возбуждения от испускаемого света. Излучаемый световой спектр проходит обратно через барьерный фильтр для удаления любого отраженного возбуждения. И, наконец, излучаемый свет фокусируется объективом на фотодетектор (рисунок 1).
Трансдукция от света электрического тока осуществляется кремниевых лавинных фотодиодов. Эти диоды имеют быстрый отклик и высокую чувствительность, позволяя обнаружения низкой освещенности.фототок , вырабатываемые лавинных фотодиодов могут быть усилены двумя способами: усилитель , имеющий трансимпедансный резистивный элемент обратной связи (рисунок 1д) или с помощью интегратора для преобразования тока в напряжение (рис 1F). С помощью первого подхода, выходное напряжение пропорционально фототока и резистора обратной связи. Типичный пример резистивного обнаружения пикосе- лазерных импульсов показана на рисунке 2а, 2b и 2с. Панель 2a иллюстрирует выход усилителя трансимпедансного и панель 2b показывает расширение времени интервала , указанного звездочкой (*). Алгоритм отслеживания пик был реализован для обнаружения пика (красный) и основание (зеленый) для флуоресцентных ответов 12. Измерение базовой флуоресценции дает информацию как темнового тока лавинного фотодиода и помех, введенную окружающей среды осветиХТ и электромагнитное взаимодействие. Представление пиков и оснований показана на рисунке 2в. Этот рисунок иллюстрирует флуоресценции красителя (Rhod-2) , связанного с Са 2+ во время сердечного цикла бьющееся сердце Попугай.
Во втором способе, выходное напряжение интегратора является функцией текущей и емкостной обратной связью (рис 2d, 2e и 2f). Рисунок 2f показаны два последовательных циклов интеграции: первый без внешнего освещения , а второй с прикладными световыми импульсами от импульсного светодиода. Подробное описание представлено на рисунках 2g и 2h. Такой подход, хотя и более трудоемким, обеспечивает больший S / N из-за отсутствия теплового шума в конденсатор обратной связи. Прибор включает в себя стадию синхронизации, которая генерирует все управление и мультиплексирование возбуждающего света и команд интеграции headstage и ресЕТ периоды. Это, как правило , выполняется с блок обработки цифрового сигнала , который также выполняет цифровую дифференциацию интегрированного выходного сигнала путем вычисления на линии регрессии данных. В случае использования резистивный обратной связи, любой A / D плата сбора может быть использован.
И, наконец, наша техника LFFM является универсальным и может быть адаптирован для записи с более чем одной области. Добавление расщепитель луча на пути прохождения света позволяет разделить свет на два оптических волокна. Каждое оптическое волокно затем могут быть размещены на различных областях ткани, чтобы, независимо друг от друга, возбуждают и записывать излучение от экзогенных флуоресцентных зондов. Эта модификация позволяет оценить, как анатомическое региональные различия влияют на физиологические переменные. На рисунке 3 показан делитель луча используется для того разделения возбуждающего света CW таким образом, что два оптических волокна используются для измерения электрического трансмурального или внутриклеточным [Са 2+] Уровни Witч незначительной инвазии. Трансмуральных сигналы могут быть записаны путем размещения одного волокна на эндокарда, а другой на эпикарда слой стенки желудочков. Таким образом, метод LFFM имеет возможность измерять временной ход клеточных сигналов в разных регионах и могут быть использованы для тестирования, если региональные изменения происходят при патологических ситуациях.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Этот протокол и все обработки мышей был одобрен Institutional уходу и использованию животных комитета UC Мерсед (№ 2008-201) путем. Были проведены эксперименты с попугаи в 1999 году в соответствии с общей политикой для использования животных, установленной научной комиссией венесуэльского института научных исследований (IVIC).
1. Langendorff Set Up Подготовка
- Приготовьте раствор Тироде , содержащий следующие концентрации растворенных веществ в мм: 140 NaCl, 5,4 KCl, CaCl 2 2, 1 MgCl 2, 0,33 Na 2 HPO 4, 10 глюкозы, 10 HEPES. Доводят рН раствора Тироде до 7,4 с помощью NaOH и фильтруют раствор через фильтр с размером пор 0,22 мкм.
- Загрузите раствор Тироде в 60 мл шприцев и все трубы горизонтального Langendorff настройки 11, 12 , показанную на рисунке 4. Убедитесь в том, чтобы устранить все пузырьки воздуха.
- Подсоедините пластмассовую трубку к O 2 танка.
- Добавьте пластмассовый переходник тройник опустить "трубу 5 в раствор Тироде в 60 мл шприц.
- Приложить пластиковый камень воздуха до конца "трубы 5 так O 2 будет пузыриться из в раствор Тироде.
- Поместите нерассасывающегося хирургический шовный материал вокруг иглы, используемой в качестве канюли. Игла соединена с коллектором (смотри рисунок 4) , что позволяет ретро-перфузию с различными растворами. Наконец, аорта сердца будет канюлю в иглу.
2. Подготовка животных и сердца Вскрытие
- Взвешивание и впрыснуть мышь с гепарином (напр. Мышь весом 20 г, вводят 20 единиц или 200 мкл) за 15 мин до эвтаназии путем смещения шейных позвонков. Обезболить попугаи по то направляющие использования животных вашего протокола IACUC, а затем приступить к цервикальной дислокации.
Примечание: Используйте 8 недель мышей или 20 г попугаи. - Удалите сердце из грудной полости после euthanization. Экстракт Parakeet сердца точно таким же образом , как описано для мышей.
- Очистите грудь мыши с этанолом.
- Использование рассечение ножницами, сделать надрез в нижней части живота, а затем разрезали стороны в сторону шеи.
- Отойдите вырезанной ткани и пин-код его вниз.
- Вырезать диафрагму. Будьте осторожны при резке диафрагму, чтобы избежать повреждения сердца.
- Удалите легкие и окружающие ткани.
- Используйте пинцет, чтобы выкопать сердце не сдавливая его. Вырезать аорту как можно дольше.
- Транспорт сердце на небольшой лодке с взвешивании приблизительно 1 мл раствора Тироде.
- Используя нерассасывающегося хирургический шовный материал, связать аорту на горизонтальную Лангендорфа устройство черезигла. Tie сердечную аорту с помощью двух тонких пинцетом. Начало ретро-перфузию, открыв клапан, расположенный последовательно с 60 мл шприцев, содержащих раствор Тироде.
- Дайте сердце для стабилизации в течение 10 мин. Используйте это время, чтобы очистить кровь и жировой ткани, окружающие сердце перед загрузкой красителя. Вытяните жировой ткани у основания сердца с помощью пинцета и вырезать с помощью небольших рассечение ножницами. Не забудьте сделать это под видом рассекает микроскопа.
3. Цитозольные Ca 2+ Размеры: Готовимся Dye Rhod-2АМ
- Добавьте 20 мкл 20% Pluronic (неионное поверхностно-активное вещество) в ДМСО в специальном упакованном пластиковом флаконе, предоставленного производителем красителя, содержащего 50 мкг красителя.
- Смешайте с помощью пипетки вверх и вниз, избегая пузырьков.
- Перенести смешанный ДМСО с неионным поверхностно-активным веществом и красителем из специального упакованной пластиковой пробирке в прозрачный стеклянный флакон. Добавить 1 мл Тироде Солуние к прозрачному стеклянном флаконе.
- Разрушать ультразвуком в течение 15-20 мин в ванну для обработки ультразвуком.
- Заливать краску с помощью перистальтических насосов в течение 30 мин при комнатной температуре.
- Поместите краситель в камере красителя.
- Используйте механический зажим, чтобы сжать все другие линии трубок, подключенных к коллектору. Зажим находится над коллектором. Это предотвратит обратный поток в трубку, подключенный к 60 мл шприцы.
- Включите перфузионного перистальтический насос, чтобы начать циркуляцию краситель. Немедленно закройте 3-ходовой клапан ниже 60 мл шприца.
- Поместите маленькую трубку, которая соединена с всасывающим перистальтического насоса, рядом с сердцем рециркуляцию краситель, который был перфузии в сердце.
4. Intra-SR Ca 2+ Размеры: Подготовка Dye Mag-Fluo4AM
- Подготовить Mag-Fluo4AM таким же образом, как Rhod-2АМ. Обратитесь к разделу 3 для ступенчатых инструкции.
- Afteг загрузки красителя, открыть клапан, расположенный последовательно с 60 мл шприцев, содержащих раствор Тироде, чтобы начать ретро-перфузию. Не забудьте снять зажим над коллектором.
- Добавить раствор Тироде в горизонтальной камере и нагреться до 37 ° С.
- Ретро-заливать раствором Тироде в течение 45 мин, чтобы удалить цитозольного краситель.
5. Мембранный потенциал Размеры: Готовимся Dye Di-8-ANEPPS
- Добавляют 5 мл 99% -ного этанола в пузырьке краситель, который содержит 5 мг красителя.
- Алиготе 10 мкл в 500 отдельных 1 мл пластиковые флаконы с использованием ретранслятора пипетки.
- Высушиванию в вакууме скорости и хранят при -20 ° С.
- Добавить 20 мкл 20% Pluronic в ДМСО до пластиковом флаконе 10 мкг высушенной красителя.
- Смешайте с помощью пипетки вверх и вниз, избегая пузырьков.
- Перенести смесь, содержащую ДМСО с Pluronic и красителем из пластикового флакона в градуированный цилиндр (10 мл). Добавить раствор Тироде до конечной В.О.Луме 5 мл.
- Разрушать ультразвуком в течение 20-25 мин в ванну для обработки ультразвуком.
- Заливать в сердце в течение 30 мин с помощью перистальтических насосов. Обратитесь к пошаговым инструкциям в разделе 3.5.
6. Запись эпикардиального сигналов
- После загрузки красителя, ретро-заливать сердце с раствором Тироде путем удаления зажима над коллектором. Открыть кран, расположенный последовательно с 60 мл шприц, содержащий раствор Тироде. Ретро-заливать раствор Tyrode в течение 10 мин, чтобы стабилизировать сердце.
- Заполните горизонтальную камеру с раствором Тироде и включите устройство Пельтье, чтобы довести температуру ванны до 37 ° С.
- Поместите оптического волокна на поверхности сердца.
- Поместите оптоволокно внутри пипеткой 2 мл, а затем прикрепить пипетку микроманипулятора.
- С помощью микроманипулятор слегка нажмите оптического волокна к поверхности левого желудочка.
- Внешне темп НЕАк.т. с стимулятора под контролем генератора волн.
- Программирование генератор волн, чтобы обеспечить прямоугольный импульс с шириной 1 мс.
- Установите стимулятора, чтобы быть внешне синхронизированный и подключить внешний источник сигнала к генератору волн.
- Для каждого выхода стимулятора, подключить провод с иглоукалыванием иглы припаян в конце.
- Поместите обе акупунктурные иглы в верхушке сердца примерно 3 мм друг от друга.
- Только после того, как иглы помещены в ткани, включите на выходе стимулятора для предотвращения поражения электрическим током.
- В программном обеспечении сбора, настроить частоту сбора до 10 кГц.
7. Запись Эндокардиальный сигналов
- Обратитесь к шагу 6.1 и 6.2, чтобы стабилизировать сердце после загрузки красителя.
- Используя острый 23Ga пункт о размере оптического волокна, сделать небольшое отверстие в поверхности сердца в ЛЖ возле перегородки. <li> Поместите интравитреально адаптер хирургии склеротомия, чтобы помочь в размещении первого оптического волокна в эндокарда с помощью микроманипулятора.
- Внешне расхаживать сердце. Обратитесь к шагу 6.4.
- В программном обеспечении сбора, настроить частоту сбора до 10 кГц.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
AP и Са 2+ в эндокарда и эпикарда
Для сравнения сигналов через стенку желудочка, один волоконно-оптический позиционируется в эндокарда, а другой в эпикарда. Сравнивая морфологию AP, записанной от эндокарда с одним из эпикарда является лучшим способом оценить трансмурального функцию. Стенки желудочков является весьма гетерогенным и, таким образом, морфология ЛПВ сильно отличаются в этих двух областях. Хорошо известно , что эндокарда имеет меньше я , чем эпикарда 17, 18, 19. Чем меньше я делает переполяризацию фазы 1 медленнее в эндокарду 18, 20. На рисунке 5б шOWS типичную оптическую запись ЗС от эндокарда и эпикарда. Для выполнения этих записей, мыши, сердца были загружены с потенциометрического красителя ди-8-ANEPPS и измеряют флуоресценцию с использованием метода CLFFM. Морфология оптически записанной АР, в частности , в фазе 1, показывает более медленный ход времени для эндокарда (продолжительности потенциала действия (ЛФД) 30 : 8.01 мс ± 2,5) по сравнению с эпикарда (3.4 мс ± 0,59) (Фиг.5В). В общем случае , APD может быть описан как время, которое требуется , чтобы АП реполяризовать определенный процент в том числе 30, 70 или 90 (рис 5а). Эти следы были нормированы и сдвинуты иметь перекрывающийся фазу 0. При сравнении ЛФД (рис 5в), мы видим , что эндокарда и эпикарда существенно отличаются во время фазы 1. Хотя эти точки доступа являются сигналы флуоресценции, они могут быть откалиброваны для конкретного мембранный потенциал путем одновременного измерения с APрезкое микроэлектрода заполнены 3 М KCl 13.
В дополнение к мембранным потенциалом, экзогенные флуоресцентные индикаторы могут быть использованы для мониторинга внутриклеточного [Са 2+]. Как правило, мы используем Rhod-2АМ для измерения внутриклеточного Ca 2+ из - за его высоким динамическим диапазоном и ее способности оставаться в цитозоле даже при физиологических температурах. На рисунке 6б показана типичная запись внутриклеточных Са 2+ переходных процессов в эндокарда и эпикарда слоя. Эти результаты были частично опубликованы 15. Для того чтобы сравнить региональные различия в внутриклеточных уровней [2+] Ca, кинетика переходных процессов Са 2+ были оценены (рисунок 6 , а ). В целом, анализ Ca 2+ переходных кинетики (рис 6в) показывает , что переходные процессы Са 2+ из эндокарда имел значительно медленнее, чем кинетика, записанными от эпикарда.
Ca 2+ динамика в просвете SR
В самом центре, подъем и падение внутриклеточного [Са 2+] уровни имеют решающее значение при определении многих физиологических переменных , включая давление, сократимость и продолжительности потенциала действия (APD). В предыдущем разделе описывается нашу способность измерять цитозольного Ca 2+. Ca 2+ освобождается от СР в значительной степени ответственен за рост внутриклеточных цитозольных Са 2+. Таким образом, для каждого подъема внутриклеточного Са 2+ существует Са 2+ Истощение в СР. Тем не менее, цитозольных Са 2+ не только из - за SR Ca 2+ выпуска, но и включать в себя Ca 2+ , поступающих в клетку через мембрану плазмы. Наша лаборатория16 был в состоянии оценить содержание SR Ca 2+ с использованием флуоресцентного красителя, Mag-Fluo-4AM. Хотя этот краситель де-этерифицируют в myoplasm и СР, миоцитов может выдавить из цитозольного фракции. Этот экструзионный краситель может быть повышен путем простого повышения температуры до 37 ° С. При этой температуре, цитозольная краситель удаляется с помощью АТФ-связывающего кассетного типа мембранного белка. К счастью, этот белок не присутствует в С.Р. мембране. Таким образом, после того, как повышение температуры до 37 ° С, флуоресценции , измеренными с использованием метода PLFFM в основном является результатом Са 2+ связывания красителя внутри SR. Для того чтобы проверить специфичность измерения органелл, кофеин импульс подавался , чтобы стимулировать высвобождение Ca 2+ через RyR. Можно заметить , что сигнал действительно является результатом истощения SR (рисунок 7). Кофеин индуцированное SR Ca 2+ релиз (рис 7а) Производят как, снижение диастолического уровня МАГ-Fluo-4 флуоресценции (92 ± 0,05% (N = 4, p = 0,012)) и уменьшение амплитуды Са 2+ (51 ± 0,21% (N = 4, P = 0,003)) 16. Intra SR следы , записанные до и после того, как кофеин стимул представлены вниз на рисунке 7b-7d. С течением времени прогрессирует от кофеина стимула, амплитуда истощения SR меньше. На рисунке показано , что 7e СР обеднение не только вызывает уменьшение амплитуды сигнала Ca 2+ , но и замедляет SR Ca 2+ процесс выпуска. Флуоресценции след на рисунке 7а была ранее опубликована 15.
Импульсные LED: Потенциалы действия
На рисунке 5 показано , что Ди-8-ANEPPS может сообщить об измененияхв мембранного потенциала, когда он возбуждается при 532 нм. При выполнении этого условия возбуждения, происходит уменьшение излучаемой флуоресценции при длинах волн выше 590 нм. Интересно отметить, что, когда этот потенциометрический краситель возбуждается близка к максимальной длине волны возбуждения (~ 476 нм), флуоресцентное излучение сдвигов красителя в сторону более низких длинах волн, когда мембрана деполяризует. Следовательно, этот сдвиг спектра позволяет регистрировать излучаемый флуоресценции при двух различных длинах волн. Это спектральное свойство ди-8-ANEPPS позволяет нормирование излучаемой флуоресценции, измеренными при двух различных длинах волн, особенность, которая, как правило, большое значение, так как окончательный вычисленное записи будет зависеть от концентрации красителя в мембране. Для того, чтобы воспользоваться всеми преимуществами Ди-8-ANEPPS спектрального сдвига, мы использовали импульсные светодиоды в качестве источника света. Мы использовали импульсный синий свет для возбуждения флуорофора. Возбуждение проводилось при длине волны 485 нм, близкой к пиковой длиной волны поглощения Di-8-ANEPPS (~ 476 нм). Приобретение в двух различных спектроскопических выбросов полос позволяет формировать отношение и способность увеличивать S / N и отклонять синфазного шума, как охрана окружающей света и артефактов движения при сокращении сердца, где не использовались механические разобщитель blebbistatin. Эта ситуация очень важна для экспериментальных условиях , когда необходимо измерить одновременно и механическую активность сердца и кинетика Са 2+.
Временная диаграмма в PLEDFM показана на фигуре 8а. Диаграмма включает в себя логику управления для интеграции и сброса фотодетекторному headstage, двухпозиционный времени светодиода и аналого-цифрового преобразования. Во время хода точки доступа, флуоресценция обнаружена в зеленом диапазоне длин волн, показывает увеличение интенсивности флуоресценции в то время как обнаруженный в красной полосе уменьшается. Рисунок 8Вчто изменение флуоресценции сигнала, формируемого деполяризации мембраны движется в разных направлениях. Однако движение артефакт произведенный сокращением сердца всегда ориентирован в том же направлении, независимо от длины волны излучения. Как было объяснено выше, данные обоих каналов (зеленый и красный) должен быть программно обусловлено, прежде чем вычислить соотношение. Кондиционирования включает смещения и усиления корректировки. Выбор усиления и смещения поправок уровня не является автоматическим. Пользователь программного обеспечения должен выбрать переменные, чтобы состояние следы до соотношения. Полученное соотношение в панели 8b (рисунок 8) показывает , что артефакт введенный движения миокарда отменило.
Относительное изменение ди-8-ANEPPS флуоресценции во время AP, как правило, очень мал (~ 8% в расчете на 100 мВ). Изменение флуоресценции Этот ди-8-ANEPPS значительно меньше , чем та , производимого bindin Ca 2+г до Rhod-2 (<200%). Таким образом, для того, чтобы увеличить соотношение сигнал-шум-ди-8-ANEPPS, многократные записи могут быть усреднены.
Импульсные LED: Одновременные записи Са 2+ и мембранного потенциала
Последняя цель использования этого экспериментального подхода заключается в проведении одновременных записей Ca 2+ и точек доступа. Одновременные записи нескольких физиологических сигналов требуют решения технических трудностей, связанных с различными аспектами системы, включая: соединения источника света с оптическим волокном, сопоставив спектр поглощения красителя с излучением светодиодов, проектирования аналоговых и цифровых электронных схем для генерировать сроки и приобретения, а также разработку быстрого программного обеспечения для анализа данных в режиме онлайн.
В НУг исследование, выбор красителей зависит от их спектральных характеристик. Flourophores, используемые для измерения различных сигналов должны поглощать в различных спектральных диапазонах. Это условие важно провести различие между источниками сигнала. Каждый раз, когда светоизлучающий диод, имеющий различную длину волны используется для возбуждения ткани, флуоресценция обнаружена соответствует сигналу, связанного с красителем, который поглощает в этой длине волны. Таким образом, флуоресцентное излучение, поступающих из различных красителей, но в том же самом диапазоне длин волн, можно отличить по времени, при котором каждый из них возбуждена.
Тем не менее, перекрестные помехи между красителем спектрами не может быть полностью избежать. Это происходит потому, что спектральные характеристики поглощения красителей делают их поглощают свет с длиной волны далеко от своего пика поглощения. В наших экспериментах, перекрестных помех был произведен в обоих направлениях: (1) Rhod-2 возбуждается синим светодиодом, добавляя 2+ сигнал Ca до красной CHANNEл А.П. след, и (2) Ди-8-ANEPPS возбуждаться с помощью зеленого светодиода, который появляется на Ca 2+ переходного сигнала (рис 9F). Это перекрестные помехи могут быть скорректированы на линии, как показано на рисунке 9. Процедура работает, потому что вторгаясь сигнал представляет собой небольшой процент от сигнала, который должен быть измерен. И, наконец, используя этот тип алгебраической обработки флуоресценция от красителей позволило нам разделить точку доступа (рис 9d) образуют Ca 2+ (рис 9h). Подробное изложение этой обработки описан в подписи к фигуре. Важно заметить , что все светодиоды Импульсные эксперименты проводились на 28 ° C.
Рисунок 1: Локальная поле флуоресцентной микроскопией (LFFM). LFFM состоит из расположения эпифлуоресцентнойиспользуя многомодовое оптическое волокно, которое находится в контакте с тканью, чтобы записать флуоресценции, испускаемой из экзогенных красителей перфузией в сердце. LFFM настройки можно использовать три различных источников света , включая (а) PLFFM, где свет возбуждения обеспечивается импульсным пико Nd-YAG лазер; (Б) CLFFM, где непрерывные волновые лазеры используются и световые импульсы генерируются сегнетоэлектрического модулятора , позволяющего мультиплексирование лазеров с различными длинами волн; и (с) PLEDFM, где светодиоды , имеющие более широкие спектры эмиссии с пиком выбросов (г) 485 нм и 540 нм для синего и зеленого светодиодов, соответственно, в электронном виде в импульсном режиме. Когда лазерные источники используются, луч дефокусируются с помощью расширитель пучка. И, наконец, дихроичные зеркала и линзы объектива сфокусировать луч на дальнем конце волоконно-оптического, который слегка прижимают к ткани. Излучаемый свет проходит обратно через тот же волоконно-оптические, дихроичное зеркало, ЭМИssion фильтры, и фокусируется на лавинный фотодиод, где фотоны преобразуются в электрический ток. Ток может быть усилен двумя способами (е) трансимпедансного усилителя, где в результате чего выходное напряжение пропорционально фототока и резистор обратной связи; (Е) интегратора, где выходное напряжение является функцией текущей и емкостной обратной связью. Наконец, сигнал усваиваются A / D конвертер и просматривать на компьютере. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2: резистивные и емкостные преобразования. (А) Типичный пример резистивного обнаружения пикосе- лазерных импульсов показана. Звездочка (б)показывает время расширенный интервал, в котором алгоритм отслеживания пик был реализован для обнаружения пика (красный) и основание (зеленый). (С) представление следов , вычисленных из пиков и оснований записей показан для Rhod-2 флуоресцентных откликов в бьющегося сердца Parakeet внешне шагают в 7 Гц и температуре бане до 37 ° С. д-з) фототок преобразуется с помощью интегратора с использованием емкостной обратной связи. Типичные записи нетронутыми сердца мыши Ca 2+ показаны в двух разных временных масштабах (г и д). (Е) Интеграция двух последовательных циклов с и без светодиодной подсветки показаны. Интеграл сигнала возрастает линейно, как фототок заряжает конденсатор обратной связи. Наклон времени зависит интеграл (тангенс (Ɵ)) пропорциональна числу фотонов, воздействующих на лавинный переход в дополнение к электронно-дырочной рекомбинации, индуцированного рhononic активность, когда лавинный диод не обнаруживает никаких фотонов. Цифровые сигналы управления интеграции headstage и сброс периодов показаны в панели г. Сигналы , обнаруженные во время не-освещая (DC) и светодиодной подсветки периода (F) показаны на панели часов. Вычитание F и постоянного тока обеспечивает фактическое измерение флуоресцентно обнаружен Ca 2+ от мышей сердца внешне изменяющемся в 9 Гц при 37 ° С (Н). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 3: LFFM для эпикарда и эндокарда измерений. CLFFM настройки был использован для измерения флуоресценции, испускаемой от экзогенных флуоресцентных красителей, присутствующих в эпикарда А.Н.г эндокарда слои. Добавление светоделителе облегчается запись различных физиологических переменных в эпикарда и эндокарда. Два волоконной оптики были использованы с их индивидуальными headstages для обнаружения из эпикарда и эндокарда. Небольшой круговой разрез был сделан в желудочке и оптоволоконный был продет через запись из эндокарда. Эта установка используется преобразователь тока в напряжение с резистивной обратной связью. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 4: Горизонтальная камера с контролем температуры. Диаграмма, показывающая Лангендорфа запуск при интактные сердца поддерживаются функционал в течение нескольких часов. Сердце привязано к игле, через которую все растворы и красителиявляются ретро-перфузировались в сердце через коронарные отходящие аорту. Камера расположена над блоком Пельтье для поддержания температуры ванны, которая считывается с помощью датчика температуры, подключенного к вольтметру. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 5: Трансмуральный потенциал действия Измерения в неповрежденном Сердца. (А) длительности потенциала действия (APD) оценивается как время, необходимое для завершения 30%, 70% или 90% от реполяризации AP. (Б) Ди-8-ANEPPS флуоресценции от эпикарда (черный) и эндокарда (серый) показывают АП морфологические различия в переполяризацией между двумя слоями стенки желудочка. (С) После оценки тон APD 30, 70, и 90 в эндокарда и эпикарда, результаты показали только значительные различия произошли в ЛФД 30 (8 ± 2,5 мс эндокарда против 3 ± 0,6 мс эпикарда). Сердца изменяющемся при 6 Гц и температура установлена на 37 ° C. Данные представляют собой среднее ± SEM из 5 сердец. * P <0,05. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 6: Трансмуральный Ca 2+ пролетного Измерения в неповрежденном Сердца. (А) Параметры Ca 2+ преходящие кинетика измерений являются: время, необходимое для достижения максимальной, время до пика (ТП); время, которое требуется, чтобы перейти от 10% до 90% роста, время нарастания (RT); время, которое требуется, чтобы перейти от 10% до 90% от распада, время затухания (DT); иВремя, необходимое для завершения 50% от переходного процесса, половина длительности (HD). (Б) Флуоресценция , излучаемая Rhod 2 после возбуждения с зеленым CW лазерное шоу эпикарда (черный) и эндокарда (серый) Ca 2+ с различиями в релаксации. в) Са 2+ из эндокарда была значительно более медленной кинетикой в RT, TP, HD, и DT, записанные от эпикарда. Сердца изменяющемся при 6 Гц и температура установлена на 37 ° C. Данные представляют собой среднее ± SEM из 5 сердец. * P <0,05. Модифицированный из Mattiazzi и др. 15. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 7: Intra SR Ca 2+ Измерения в неповрежденном Сердца.(А) излучаемый флуоресцентной из красителя Mag-Fluo-4 падает с течением времени, что отражает снижение концентрации внутри- SR Ca 2+. (Б) увеличенный вид снижения Mag-Fluo 4 флуоресценции , указывающей Ca 2+ истощение , вызванное Са 2+ выхода из СР. (С) расширенное представление уменьшения переходных амплитуды от Mag-Fluo 4 флуоресценции , представляющей Ca 2+ релиз модифицированный перфузируя сердца с 20 мМ кофеина. (D) После длительного применения кофеина, уменьшение как диастолического уровня Mag-Fluo-4 флуоресценции и амплитуды Са 2+ [вплоть до 92 ± 0,05% (N = 4, P = 0,012) и наблюдается 51 ± 0,21% (N = 4, P = 0,003) начальных значений, соответственно],. Чем больше времени прогрессирует от кофеина, тем меньше амплитуда истощению SR. (Е) нормированные следы в бд показывает , что SR истощение не только индуцируютs уменьшается сигнала Ca 2+ , но и замедляет SR Ca 2+ пополнение. Сердца изменяющемся с частотой 4 Гц и температура установлена на 37 ° C. Флуоресцентный след от Kornyeyev и др. 16. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 8: логометрической Измерения точек доступа в неповрежденном сердца с импульсным светодиодом. (А) временная диаграмма , в том числе интеграции и сброса headstage, двухпозиционный времена светодиодом и фактической записи иллюстрируется. (Б) Следы от два канала имеют разные значения отдыхавших и смещение корректируется путем перемещения рычагов , пока каждый AP не предшествует значению покоя. Коэффициент усиления каждого канала также регулировки оборотовТед. Обратите внимание, что на обоих каналах между двумя деполяризаций появляется очень большой артефакт движения. После того, как программа обрабатывает сигналы ratiometrically, результатом является AP без заметных артефактов (синий). Сердца изменяющемся на 3 Гц и температура установлена на 28 ° C. Все записи указаны в среднем 10 следов. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 9: Одновременные Ca 2+ и AP Измерения в неповрежденном сердца с импульсным светодиодом. Перекрестное загрязнение ток сигналов при записи как Ca 2+ и AP может быть скорректировано он-лайн. Потенциометрический краситель, ди-8-ANEPPS, возбуждается с 20 мкс синий светодиод импульсы (а). Сигналы sPLIT, фильтруют с полосовой красным и зеленым фильтрами. Эти сигналы детектируются двумя разными лавинных фотодиодов , указанных в качестве красного (б) и зеленого канала (с). Можно заметить, что оба сигнала, красный и зеленый, представляют заметный артефакт движение, которое появляется как вниз отклонения. Оба сигнала, красный и зеленый, являются offseted и затем усиливается. Обусловленные сигналы используются для вычисления отношения между ними , и результат показан на D. Можно заметить , что в соотношении обоих сигналов (D) движущиеся артефакты отменяются. Панель Е показана последовательность логических импульсов, управляющих зеленый излучающий светодиод используется для возбуждения индикатора Са 2+ Rhod-2. Флуоресцентные сигналы , полученные с использованием этой процедуры показаны в ф. Хотя след в F в основном показывает увеличение сигнала флуоресценции вследствие bindin Ca 2+г до Rhod-2, также можно наблюдать отрицательное отклонение в трассе из-за флуоресцентно детектируемого сигнала от ди-8-ANEPPS, когда этот краситель возбуждается зеленым светом. Эта проблема может быть исправлена путем вычитания потенциометрического сигнала , показанного на г. Результат вычитания показан в таблице Н , где Ca 2+ сигнал свободной от получается контаминации AP. Сердца изменяющемся на 3 Гц и температура установлена на 28 ° C. Все записи указаны в среднем 10 следов. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Эта статья сосредоточена в описании локальных методов поля флуоресценции оценить функцию кардиомиоцитов бывших естественных условиях. Изучение этих клеток в сочетании среде не только более физиологические, но также очень подходит для оценки патологии органа уровня. Клеточные события , лежащие в основе возбуждения сжатия муфты (ECC) может быть оценена на уровне целого органа с использованием молекулярных зондов , которые осуществляют мониторинг внутриклеточного Са 2+ динамики (Rhod 2 цитозольного Ca 2+, Mag-Fluo4 SR Ca 2+) и электрическая активность (ди-8-ANEPPS). Здесь мы представили три метода LFFM эпифлуоресцентной, что оба возбуждают и собирать излучение от флуоресцентных индикаторов с использованием оптических волокон. Они различаются в зависимости от используемого источника света и типа модуляции света. PLFFM использует лазер, который световых импульсов, CLFFM использует непрерывный лазерный свет, в то время как LEDFM использует светодиоды, которые также могут быть пульсирующей в PLEDFM. Все этипредставлены на рисунке 1 , как один комплект, но может быть сконструирована только с одним из трех механизмов эпифлуоресцентной. Кроме того, обнаруженный свет может быть обработан различными способами. Например, на рисунке 2 показаны две различные ситуации , в которых фототок может быть либо интегрированы или непосредственно преобразуется в напряжение с помощью преобразователя тока в напряжение. В общем случае , LFFM подход может быть использован для одновременного измерения нескольких анатомических участков, как показано на рисунке 3.
Изложенный здесь метод оценки кардиологических свойств на неповрежденную уровне органа, является более адекватным для изучения проблем, в которых взаимодействие между клетками имеет решающее значение в определении поведения ткани. Характеристическая гетерогенность сердца может производить различные AP формы волны 13, 21, 22 на основании конкретной ткани , из которой CELLS происходят. Таким образом, целые исследования органов дают возможность оценить местную физиологическую функцию клетки в различных анатомических структур. Более того, мы уже видели , что внутриклеточные события , как искры и волны имеют различные кинетики в диссоциированных клетках , чем в неповрежденном органе 15.
Langendorff установка (Рисунок 4) имеет решающее значение для поддержания сердца в ситуации , которая находится ближе к в естественных условиях. Кроме того, это позволяет retroperfusion нескольких лекарственных препаратов и различных флуоресцентных молекулярных зондов, которые позволяют измерять нескольких физиологических параметров. Изменение экзогенных флуоресцентных зондов, используемых, увеличивая размер оптического волокна, или выбора другого источника света может резко изменить применение методики. Кроме того, устройство Пельтье ниже горизонтальной камеры может облегчить изучение Ca 2+ динамики при различных температурах. Добавление аксессуаровк LFFM таких как расщепитель луча может увеличить количество волоконной оптики, используемых для записи из различных областей в интактном сердце. Это очень полезно для проверки адаптации, если региональные различия возникают при патологических сценариях. На рисунке 3 показана эндокарда и эпикарда оценивается одновременно. Кроме того, перфузии сердца с различными агонистами позволяет нам понять, как различные регионы через стенки желудочков регулируются. Электрическая сигнализация (рис 5) и Са 2+ кинетический (рис 6) гетерогенность можно сравнить на эпикарда и эндокарда. Кроме того, можно использовать несколько красителей с различными длинами волн возбуждения и фильтров выбросов. Например, при использовании Mag-Fluo-4, уровни Са 2+ в просвете СР может быть записан (рисунок 7). Варьирования размера волоконно-оптического можно также расширить пропускную способность этого метода, позволяя флуоресцентного записи с LARгер область.
В этом документе также показывает, что в стороне от дорогих лазеров, светодиоды могут быть использованы в качестве источника возбуждения света в нашей технике. На рисунке 8 показано , что этот недорогой тип источника света может быть использован для измерения ratiometrically точек доступа. Ратиометрический измерения показано на рисунке 8 является преимуществом в производстве конечной записи без экспериментальных артефактов в том числе вызванные движением. Наконец, даже переходные Ca 2+ и AP может быть оптически записано, одновременно, путем мультиплексирования различных длин волн и с использованием красителей с той же спектров излучения. Обработка сигналов указаны на рисунке 9 имеет решающее значение для удаления внутреннего загрязнения производимого перекрытия в спектрах излучения красителей. Запись Ca 2+ и точек доступа, одновременно, но как два независимых выходных сигналов является полезным при изучении ECC и Ca 2+ индуцированная Ca 2+
LFFM представляет собой метод с несколькими приложениями в клеточной физиологии здоровых тканей. Тем не менее, одним из основных ограничений является то, что записанные флуоресценции в среднем эмиссии от лежащих флуоресцентных индикаторов в локальной области, где оптическое волокно в контакт с тканью. Даже при использовании двух волоконной оптики, LFFM не обеспечивает субклеточном пространственного распределения измеренных сигналов. Оптическое отображение является лучшим методом для мониторинга физиологических переменных , которые изменяются в пространстве и времени , таких как распространение переходных процессов AP, Ca 2+, и аНегпапз 23, 24, 25. LFFM также не в состоянии обеспечить визуализацию структур, как конфокальной микроскопии и других методов оптического картирования. Тем не менее, его использование волоконной оптики делает его практичным в гапись локальные сигналы флуоресценции от эндокарда или других регионов, которые трудно или невозможно получить доступ в интактном сердце с конфокальной микроскопии.
Сравнение физиологических переменных, полученных из неповрежденных сердца и от отдельных экспериментов миоцитов является сложной задачей. Наибольшее преимущество использования изолированных кардиомиоцитов это уникальная возможность оценить биофизические свойства клеток в условиях патч зажима. В противоположность этому, LFFM позволяет изучение физиологического и патологического явления в более естественном окружении. Например, в интактных сердцах мы можем оценить трансмуральных различия 15, зависимость частоты сердечных сокращений АП и Са 2+ при физиологических диапазонах 13 , которые недостижимы в изолированных клетках. Кроме того, мы можем изучить последствия ишемического инсульта на функцию интактного сердца 9, 10. Всего сердце эксрименты также позволяют оценить взаимодействие между другими типами клеток и миоцитов 11.
LFFM позволяет визуализировать клеточных сигналов на неповрежденную уровне сердца, в котором клетки имеют физиологическую связь. LFFM позволяет исследовать внутриклеточной активности в то время как клетки все еще находятся в неповрежденном органе. В сочетании с флуоресцентными красителями и epiluminescence, LFFM может контролировать два основных кардиологических свойства: Ca 2+ динамика и электрической активности.
И, наконец, метод, представленный здесь, может иметь несколько приложений в изучении ECC. Это инструмент , который показывает , как супрамолекулярная сигналы затронуты в патологических ситуациях , таких как аритмия 16 и ишемией 9, 15. Этот метод является обязательным для изучения этих патологий, так как они могут быть поняты только на неповрежденную уровне органа.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего раскрывать.
Acknowledgments
Мы благодарим доктора Алисии Mattiazzi для критического обсуждения представленной работы. Эта работа была поддержана грантом от NIH (R01 HL-084487) для ALE.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium chloride | Sigma | 7647-14-5 | |
| D-(+)-glucose | Sigma | 50-99-7 | |
| Potassium chloride | Sigma | 7447-40-7 | |
| HEPES | Sigma | 7365-45-9 | |
| Sodium phosphate | Sigma | 10049-21-5 | |
| Calcium chloride solution | Sigma | 10043-52-4 | |
| Magnesium chloride solution | Sigma | 7786-30-3 | |
| Sodium hyrdoxide | Sigma | S-8045 | |
| 0.2 μm nylon membrane filter | Whatman | 7402-004 | |
| Manifold MPP | Warner | 64-0216 | |
| 21G1.5 Precision glide needle | B-D | 305167 | |
| Black Braided silk string (non-absorbable surgical suture) | AllMech Tech | LOOK-SP105 | |
| Heparin sodium injection 1000USP/mL | AllMech Tech | NDC63323-540-11 | |
| DMSO D8779 | Sigma | 67-68-5 | |
| Blebbistatin | Sigma | 856925-71-8 | |
| Pluronic F-127 20% solution | Biotium | 59004 | |
| Materflex C/L peristaltic pump | Cole-Parmer | 77122-26 | |
| Isostim stimulator | World Precision Instruments | A320RC | |
| Waveform generator | Teledyne Lecroy | WaveStation 2012 | |
| Ultrasonic cleaner FS20 | Fisher Scientific | 1533530 | |
| Tygon tubing ID:1/32" OD:3/32" Wall 1/32" | Component Supply | TET-031A | |
| Tygon tubing ID:3/32" OD:5/32" Wall 1/32" | Component Supply | TET-094A | |
| Adapter luer lock to 3-way valve | Cole-Parmer | EW-31200-80 | |
| Tee adapters and plastic fittings | Cole-Parmer | 6365-90 | |
| Plastic clamp | WaterZoo | 2465 | |
| Peltier | TE Technology | TE-127-2.0-2.5 | |
| Rhod-2AM | ThermoFisher Scientific | R1245MP | |
| Di-8-ANEPPS | ThermoFisher Scientific | D3167 | |
| Mag-Fluo-4AM | ThermoFisher Scientific | M14206 | |
| Acupunture needles | LHASA | TC1.20x13 | |
| 60 mL BD syringe with luer-lok | Fisher Scientific | 14-820-11 | |
| LabView | National Instruments | ||
| Speed vacuum Eppendorf Vagufuge | Fisher Scientific | 07-748-13 | |
| Digital signal processing circuit DSP TMS 320 | Texas Instrument | ||
| Longpass Dichroic mirror 567 nm | ThorLabs | DMLP567L | |
| Objective 10X NA 0.25 DIN AchromaticFinite Intl Standard Objective | Edmund Optics | Stock# 33-437 | |
| Objective 20X NA 0.40 DIN Achromatic Finite Intl Standard Objective | Edmund Optics | Stock# 33-438 | |
| Longpass colored glass filter 590 nm | ThorLabs | FGL590 | |
| Green Nd-YAG laser 532 nm, 500 mW | |||
| Micromanipulator for laser | Siskiyou | MX130R | |
| Multimode fiber optic 200 µm NA 0.39 | ThorLabs | FT200UMT | |
| LEDs blue | Lumileds | L135-B475003500000 | |
| LEDs green | Lumileds | L135-G525003500000 | |
| Cube beam splitter, non-polarizing | ThorLabs | BS007 | |
| 36" Length, Dovetail Optical Rail | Edmund Optics | 54-402 | |
| 2.5" Width, Dovetail Carrier | Edmund Optics | 54-404 | |
| 0.75" Travel, micrometer stage | Edmund Optics | 37-983 | |
| Dovetail optical rail 3" | ThorLabs | RLA075/M | |
| Dovetail rail carrier 1" | ThorLabs | RC1 | |
| Avalanche photodiode Helix 902 | Digi-Key | HELIX-902-200 | |
| Objective holder XY Translator | ThorLabs | ST1XY-S | |
| Aluminum breadboard 6" x 6" | ThorLabs | MB6 | |
| Nexus otpical table 4' x 6' | ThorLabs | T46HK | |
| Stainless steel cap screws | ThorLabs | HW-KIT5/M | |
| Acrylic sheet | Home Depot/Lowes | ||
| Sylgard Silicone elastomer kit | Dow Corning | Sylgard 184 | |
| Epoxy gel | Walmart/Home Depot | 2-part 5 min clr 1oz | |
| 21G1.5 Precision glide needle | B-D | 305167 | |
| 23G Precision glide needle | B-D | 305145 | |
| Mounting base, 25 mm x 75 mm x 10 mm | ThorLabs | BA1/M | |
| Wire shelve posts 36" | Alera | AALESW59PO36SR | |
| Wire shelves | Alera | ALESW582424SR | |
| Post and angle clamp | ThorLabs | SWC/M-P5 | |
| Glass syringe for dye chamber | Wheaton | W851020 | |
| Rubber stopper | Home Science Tools | CE-STOP01C |
References
- Fabiato, A., Fabiato, F. Contractions induced by a calcium-triggered release of calcium from the sarcoplasmic reticulum of single skinned cardiac cells. J Physiol. 249 (3), 469-495 (1975).
- Mitra, R., Morad, M. A uniform enzymatic method for dissociation of myocytes from hearts and stomachs of vertebrates. Am J Physiol. 249 (5), 1056-1060 (1985).
- Escobar, A. L., et al. Developmental changes of intracellular Ca2+ transients in beating rat hearts. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 286 (3), H971-H978 (2004).
- Ramos-Franco, J., Aguilar-Sanchez, Y., Escobar, A. L. Intact Heart Loose Patch Photolysis Reveals Ionic Current Kinetics During Ventricular Action Potentials. Circ Res. 118 (2), 203-215 (2016).
- Mitra, R., Morad, M. A uniform enzymatic method for dissociation of myocytes from hearts and stomachs of vertebrates. Am J Physiol. 249, H1056-H1060 (1985).
- Fischmeister, R., DeFelice, L. J., Ayer, R. K., Levi, R., DeHaan, R. L. Channel currents during spontaneous action potentials in embryonic chick heart cells. The action potential patch clamp. Biophys J. 46 (2), 267-271 (1984).
- Banyasz, T., Horvath, B., Jian, Z., Izu, L. T., Chen-Izu, Y. Profile of L-type Ca(2+) current and Na(+)/Ca(2+) exchange current during cardiac action potential in ventricular myocytes. Heart Rhythm. 9 (1), 134-142 (2012).
- Apkon, M., Nerbonne, J. M. Characterization of two distinct depolarization-activated K+ currents in isolated adult rat ventricular myocytes. J Gen Physiol. 97 (5), 973-1011 (1991).
- Valverde, C. A., et al. Transient Ca2+ depletion of the sarcoplasmic reticulum at the onset of reperfusion. Cardiovasc Res. 85 (4), 671-680 (2010).
- Valverde, C. A., et al. Phospholamban phosphorylation sites enhance the recovery of intracellular Ca2+ after perfusion arrest in isolated, perfused mouse heart. Cardiovasc Res. 70 (2), 335-345 (2006).
- Escobar, A. L., et al. Role of inositol 1,4,5-trisphosphate in the regulation of ventricular Ca(2+) signaling in intact mouse heart. J Mol Cell Cardiol. 53 (6), 768-779 (2012).
- Mejía-Alvarez, R., et al. Pulsed local-field fluorescence microscopy: a new approach for measuring cellular signals in the beating heart. Pflügers Arch. 445 (6), 747-758 (2003).
- Ferreiro, M., Petrosky, A. D., Escobar, A. L. Intracellular Ca2+ release underlies the development of phase 2 in mouse ventricular action potentials. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 302 (5), H1160-H1172 (2012).
- Kornyeyev, D., et al. Calsequestrin 2 deletion shortens the refractoriness of Ca2+ release and reduces rate-dependent Ca2+-alternans in intact mouse hearts. J Mol Cell Cardiol. 52 (1), 21-31 (2012).
- Mattiazzi, A., Argenziano, M., Aguilar-Sanchez, Y., Mazzocchi, G., Escobar, A. L. Ca2+ Sparks and Ca2+ waves are the subcellular events underlying Ca2+ overload during ischemia and reperfusion in perfused intact hearts. J Mol Cell Cardiol. 79, 69-78 (2015).
- Kornyeyev, D., Reyes, M., Escobar, A. L. Luminal Ca(2+) content regulates intracellular Ca(2+) release in subepicardial myocytes of intact beating mouse hearts: effect of exogenous buffers. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 298 (6), H2138-H2153 (2010).
- Wang, Z. G., Fermini, B., Nattel, S. Repolarization differences between guinea pig atrial endocardium and epicardium: evidence for a role of Ito. Am J Physiol. 260, H1501-H1506 (1991).
- Liu, D. W., Gintant, G. A., Antzelevitch, C. Ionic bases for electrophysiological distinctions among epicardial, midmyocardial, and endocardial myocytes from the free wall of the canine left ventricle. Circ Res. 72 (3), 671-687 (1993).
- Litovsky, S. H., Antzelevitch, C. Transient outward current prominent in canine ventricular epicardium but not endocardium. Circ Res. 62 (1), 116-126 (1988).
- Lukas, A. Electrophysiology of Myocardial Cells in the Epicardial, Midmyocardial, and Endocardial Layers of the Ventricle. J Cardiovasc Pharmacol Ther. 2 (1), 61-72 (1997).
- Antzelevitch, C., Fish, J.
- Gomez, A. M. Modulation of electrical heterogeneity by compensated hypertrophy in rat left ventricle. Am J Physiol. 272 (3 Pt 2), H1078-H1086 (1997).
- Efimov, I. R. Innovation in optical imaging: looking inside the heart. Heart Rhythm. 4 (7), 925-926 (2007).
- Boukens, B. J., Efimov, I. R.
- Zhang, H., Iijima, K., Huang, J., Walcott, G. P., Rogers, J. M. Optical mapping of membrane potential and epicardial deformation in beating hearts. Biophysics J. 111 (2), 438-451 (2016).
