Summary
في القلب، والأحداث الجزيئية تنسيق وظيفة الكهربائية ومقلص من الجهاز. وهناك مجموعة من تقنيات المجهر مضان ميدانية محلية المعروضة هنا يمكن تسجيل المتغيرات الخلوية في قلوب سليمة. تحديد آليات تحديد وظيفة القلب أمر بالغ الأهمية في فهم الكيفية التي يعمل بها القلب في حالات المرضية.
Abstract
في القلب، وعادة ما تكون أداء دراسات الإشارات الجزيئية في myocytes معزولة. ومع ذلك، فإن العديد من الحالات المرضية مثل نقص التروية وعدم انتظام ضربات القلب لا يمكن إلا أن يكون مفهوما بشكل كامل على مستوى الجهاز كله. هنا، نقدم هذه التقنية باستخدام التحليل الطيفي للالمحلي مضان الحقل المجهري (LFFM) التي تسمح للقياس الإشارات الخلوية في قلب سليمة. وتستند هذه التقنية على مزيج من القلب perfused Langendorff والألياف البصرية لتسجيل إشارات الفلورسنت. LFFM لها تطبيقات مختلفة في مجال علم وظائف الأعضاء القلب والأوعية الدموية لدراسة القلب في الظروف العادية والمرضية. يمكن رصد المتغيرات القلب متعددة باستخدام المؤشرات الفلورسنت مختلفة. وتشمل هذه عصاري خلوي [كا 2+]، داخل الهيولى العضلية شبكية [كا 2+] وإمكانات الغشاء. تحقيقات الفلورسنت الخارجية متحمسون ومضان المنبعثة الكشف مع ثلاثة ترتيبات مختلفة من تقنية LFFM epifluorescenceق الواردة في هذه الورقة. الخلافات المركزية بين هذه التقنيات هي نوع من مصدر الضوء المستخدمة في الإثارة وعلى طريقة التضمين ضوء الإثارة. وLFFM نابض (PLFFM) يستخدم نبضات ضوء الليزر بينما موجة مستمرة LFFM (CLFFM) يستخدم ضوء الليزر المستمر للإثارة. وأخيرا، تم استخدام الضوء الثنائيات (المصابيح) كمصدر الضوء الثالث. ويسمى هذا الترتيب غير متماسك نابض المجهر مضان LED (PLEDFM).
Introduction
والقلب هو الجهاز المركزي للنظام القلب والأوعية الدموية. يبدأ تقلص القلب بزيادة في داخل الخلايا [كا 2+]. العلاقة بين استثارة الكهربائية والتغيرات في الخلايا إطلاق الكالسيوم 2+ تمت دراسته تاريخيا في الخلايا نأت إنزيمي 1 و 2. ومع ذلك، وخلايا القلب هي كهربائيا، عملية الأيض وميكانيكيا مقترنة 3 و 4. عندما معزولة، وmyocytes ليست فقط جسديا وفكت، ولكنها مختلطة myocytes من طبقات مختلفة خلال التفكك 5. وعلاوة على ذلك، على الرغم من المزايا الهائلة التي ظهرت من دراسة الخلايا المعزولة في ظل الظروف المشبك الجهد، 6، 7، 8 الطبيعة الجوهرية للقلب باعتبارها علوة مخلى الكهربائيةيس يطرح السؤال عن كيفية مختلفة وظيفيا وفصل الخلايا من تلك الموجودة في الأنسجة 3.
في هذا المخطوط، وصفنا التقدم التي تم الحصول عليها في علم وظائف الأعضاء القلب عن طريق استخدام المحلي مضان الحقل المجهري تقنيات (LFFM) في قلب سليمة. يستخدم LFFM مؤشرات لقياس الفلورسنت متعددة المتغيرات الفسيولوجية مثل عصاري خلوي كا 2+، داخل شبكية الهيولى العضلية (SR) كا 2+ وغشاء المحتملة. هذه القياسات يمكن الحصول في وقت واحد وبالتزامن مع الضغط البطيني 9، 10، كهربية 9، إمكانات العمل الكهربائية (الجزائرية) والتسجيلات الحالية الأيونية والتحلل الضوئي فلاش من المركبات في قفص 4 و 11. وبالإضافة إلى ذلك، فإن هذه القياسات يمكن الحصول على سرعة القلب سليما على ترددات أعلى قريبr لمعدلات الفسيولوجية. على الرغم من أن العديد من المواد 9، 11، 12، 13، 14 وقد نشرت من قبل مجموعتنا باستخدام تقنيات LFFM، وافتراض التعقيدات التقنية المرتبطة مع هذه التقنية قد تحول دون استخدام هذه ضخم في دراسة الظواهر الفسيولوجية خارج الجسم الحي في القلب وغيرها من الأجهزة.
وتستند هذه التقنية LFFM (الشكل 1) على قياسات epifluorescence الحصول عليها باستخدام الألياف الضوئية المتعدد في اتصال مع الأنسجة. مثل أي تقنية التصوير اتصال مضان، يعتمد قرار بصري على قطر والفتحة العددية (NA) من الألياف. وهناك قطر أعلى NA وأصغر من الألياف تزيد من دقة مكانية القياسات. ناس وأقطار الألياف يمكن أن تتراوح 0،22-0،66 ومن 50 ميكرومتر إلى 1 ملم، على التوالي. فيوالتجعيد لNA تحسين إشارة إلى نسبة الضوضاء (S / N) بقبول الفوتونات قادمة من زاوية الصلبة أكبر. من أجل أن تكون بمثابة جهاز epifluorescence، وتركز شعاع الضوء في الألياف البصرية مع عدسة شبه كروي أو هدف epifluorescence حيث NA العدسة والمباراة الألياف. هذا مطابقة يعظم نقل الطاقة لإثارة ولجمع الظهر الفوتونات المنبعثة من fluorophore.
من أجل إثارة المؤشرات الفلورسنت الخارجية التي تم تحميلها في الأنسجة، ومصادر الضوء المختلفة وطرق الإضاءة يمكن استخدامها. لدينا دراسات رائدة باستخدام نابض المجال المحلي مضان المجهر 3، 12 (PLFFM) المستخدمة في بيكو ثانية ليزر منخفضة التكلفة (الشكل 1A، PLFFM). هذا النوع من مصدر الضوء لديه ميزة كبيرة من المثير جزء كبير من جزيئات fluorophore تحت منطقة الإضاءة دون تبيض كبير الصبغة المناسبلنبض قصيرة المدد 12. بالإضافة إلى ذلك، فإن استخدام نبضات فائقة القصر سمح لتقييم مدى الحياة مضان من صبغ 12. عمر مضان هو الخاصية التي يمكن استخدامها لتحديد جزء من جزيئات الصبغة بد أن الكالسيوم 2+. للأسف، والنرفزة الزمنية للالبقول والاختلافات في السعة من نبض لنبض تحد من تطبيق هذه الاستراتيجية التجريبية إلى الحالات التي يكون فيها التغيير في مضان التي تنتجها يجند ملزم لصبغ كبير.
عادة ما تستخدم موجة مستمرة (CW) ليزر كمصدر للإضاءة الرئيسية في LFFM (الشكل 1B، CLFFM). شعاع الليزر يمكن أن تضيء باستمرار الأنسجة أو يمكن أن يكون منظم ferroelectrically. التشكيل متعلق بالعازل الكهربائي الشفاف من الحزم يسمح توليد نبضات ميكروثانية الضوء. يمكن التحكم هذا التشكيل من قبل الأجهزة الخارجية. هذا الإجراء لا يقلل فقط بشكل كبير رانه النرفزة الزمنية للنبضات الضوء ولكنه يسمح أيضا خلط أشعة موجات مختلفة. يتم خلط الحزم من مضاعفة أشعة من الليزر المختلفة. ونتيجة لذلك، يمكن أن الأصباغ متعددة ذات الخواص الطيفية المختلفة يكون متحمس لإجراء قياسات لمجموعة من المتغيرات الفسيولوجية، على سبيل المثال، Rhod-2 للعصاري خلوي كا 2+، MagFluo4 للداخل ريال كا 2+ ودي-8-ANEPPS ل غشاء المحتملة.
على الرغم من أن أشعة الليزر الحالية المزايا المختلفة كمصدر للضوء في LFFM، وأنواع أخرى من مصادر الضوء يمكن أن تستخدم بما في ذلك الثنائيات الباعثة للضوء (المصابيح). في هذه الحالة، تكون مصدر ضوء الإثارة لLED InGaN (الشكل 1C، PLEDFM). في المصابيح، وتنبعث الفوتونات بشكل عفوي عندما الإلكترونات من نطاق التوصيل تمتزج مع الثقوب في عصابة التكافؤ. الفرق مع ليزر الحالة الصلبة هو أن الانبعاثات لا يحفزه الفوتونات الأخرى. وهذا يؤدي إلى شعاع غير متماسك وانبعاث الطيف الأوسع للنظام بيانات تطبيق القانون.
أنواع مختلفة من المصابيح عالية الطاقة يمكن استخدامها. للحصول على تسجيلات AP باستخدام دي-8-ANEPPS ول Ca 2+ تسجيل العابرين باستخدام فلوو-4 أو ماج-فلوو-4، استخدمنا LED التي لديها ذروة الانبعاثات نموذجي في 485 نانومتر (الأزرق) ونصف عرض 20 نانومتر (1D الشكل). ل Ca 2+ العابرين سجلت مع Rhod-2، وكان LED ذروة الانبعاثات نموذجي في 540 نانومتر (الأخضر) ونصف بعرض 35 نانومتر (1D الشكل). المصابيح تنبعث في طول موجة الفرقة، وبالتالي تتطلب المرشحات لتضييق الانبعاثات الطيفية. وبالإضافة إلى ذلك، وعلى ضوء نابض يمكن أن تتولد بمعدل 1.6 كيلو هرتز مع مدة 20 ميكرو ثانية. ونابض المصابيح مع سريع MOSFET السلطة تأثير الحقل الترانزستور. التسجيلات في وقت واحد مع مؤشرات مختلفة يمكن أن يقوم بها الوقت مضاعفة المصابيح. للأسف، الضوء المنبعث من المصابيح هو أكثر صعوبة في التركيز على الألياف البصرية مقارنة مع شعاع الليزر. وهكذا، فإن العيب الرئيسي مناجي المصابيح هو أن ملامح الانبعاثات لديها التشريد الزاوي (± 15 درجة) من المحور الرئيسي، ويجب استخدام والبصرية المساعدة لتصحيح ذلك.
في كل من التكوينات البصرية التي سبق وصفها، وينعكس ضوء الإثارة بمساعدة مرآة مزدوج اللون. وتركز شعاع في وقت لاحق من قبل عدسة شبه كروي والهدف المجهر على الألياف البصرية المتعدد الذي يتوضع على الأنسجة. كما هو الحال في أي ترتيب epifluorescence، ومرآة مزدوج اللون يخدم أيضا للفصل بين الإثارة من الضوء المنبعث. طيف الضوء المنبعث يسافر الى الوراء من خلال مرشح حاجز لإزالة أي الإثارة ينعكس. وأخيرا، يركز الضوء المنبعث مع هدف الصعود إلى مكشاف ضوئي (الشكل 1).
يتم تنفيذ تنبيغ من الضوء إلى تيار كهربائي من خلال ثنائيات ضوئية السيليكون الانهيار. هذه الثنائيات لديها استجابة سريعة وحساسية عالية تسمح منخفض كشف الضوء. الphotocurrent التي تنتجها فوتوديوديس سيل يمكن تضخيمه بطريقتين: مكبر للصوت transimpedance وجود مقاوم عنصر ردود الفعل (الشكل 1E) أو عن طريق تكامل لتحويل التيار إلى الجهد (الشكل 1F). باستخدام النهج الأول، والجهد الناتج يتناسب مع photocurrent والمقاوم ردود الفعل. ويرد مثال نموذجي للكشف مقاوم من نبضات الليزر بيكو ثانية في أرقام 2A، 2B و2C. يوضح 2A الفريق خرج مكبر للصوت transimpedance ويظهر لوحة 2B توسع الوقت الفاصل الزمني المشار إليها بعلامة النجمة (*). تم تنفيذ خوارزمية ذروة تتبع للكشف عن الذروة (أحمر) وقاعدة (الأخضر) للردود الفلورسنت 12. قياس مضان قاعدة يوفر المعلومات من كلا التيار المظلم من الثنائي الضوئي الانهيار والتدخلات التي أدخلها دوري الدرجة المحيطةحزب التحرير واقتران الكهرومغناطيسي. ويرد تمثيل قمم وقواعد في الشكل 2C. يوضح هذا الرقم مضان المنبعثة من الصبغة (Rhod-2) منضمة إلى الكالسيوم 2+ خلال دورة القلب من قلب ينبض ببغاء.
في الطريقة الثانية، والجهد الناتج من تكامل هو وظيفة من ردود الفعل الحالية وبالسعة (أرقام 2D، 2E، و2F). ويبين الشكل 2F دورتين متتاليتين التكامل: الأول مع عدم وجود إضاءة في الهواء الطلق، والثاني مع نبضات الضوء التطبيقية من الصمام نابض. ويرد وصف مفصل في أرقام 2G و 2H. هذا النهج، على الرغم من أن أكثر شاقة، ويوفر أكبر S / N نظرا لعدم وجود الضوضاء الحرارية في مكثف ردود الفعل. ويتضمن الصك مرحلة التوقيت الذي يولد كل السيطرة والمتنوعة من ضوء الإثارة والأوامر والتكامل headstage والدقةفترات آخرون. عادة ما يتم إجراء هذا مع دائرة معالجة الإشارات الرقمية التي تنفذ أيضا تمايز الرقمي للإشارة خرج متكاملة من خلال حساب والانحدار على الانترنت من بيانات. في حالة استخدام ردود الفعل مقاوم، أي لوحة اقتناء / D يمكن استخدامها.
وأخيرا، تقنية LFFM لدينا تنوعا للغاية ويمكن تكييفها لتسجيل من أكثر من منطقة. إضافة الخائن شعاع في مسار الضوء يسمح لنا لتقسيم الضوء إلى اثنين من الألياف البصرية. كل الألياف الضوئية ومن ثم يمكن وضعها على مناطق مختلفة من الأنسجة ل، بشكل مستقل، والإثارة وانبعاث سجل من تحقيقات الفلورسنت الخارجية. يسمح هذا التعديل لنا لتقييم مدى الاختلافات الإقليمية تشريحية التأثير على المتغيرات الفسيولوجية. ويبين الشكل 3 الخائن شعاع التي يجري استخدامها لتقسيم ضوء الإثارة CW تستخدم مثل أن اثنين من الألياف الضوئية لقياس بطريق داخل الخلايا الكهربائية أو [كا 2+] مستويات الذكاءح قاصر-الغازية. إشارات بطريق يمكن تسجيلها عن طريق وضع الألياف واحد على البطانة والآخر على طبقة النخاب الجدار البطيني. ولذلك، فإن تقنية LFFM لديه القدرة على قياس مدار الساعة من الإشارات الخلوية في مناطق مختلفة، ويمكن استخدامها لاختبار إذا تحدث التغييرات الإقليمية في إطار الحالات المرضية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وقد وافق هذا البروتوكول وعن التعامل مع الفئران عن طريق لجنة رعاية الحيوان المؤسسية واستخدام جامعة كاليفورنيا ميرسيد (رقم 2008-201). وأجريت التجارب مع الببغاوات في عام 1999 وفقا لسياسات عامة للاستخدام الحيواني التي وضعتها اللجنة العلمية للمعهد الفنزويلي للبحوث العلمية (أيفيتش).
1. Langendorff تعيين إعداد ما يصل
- يعد حل تايرود التي تحتوي على تركيزات المذاب التالية في ملي: 140 كلوريد الصوديوم، 5.4 بوكل، 2 CaCl 2، 1 MgCl 2، 0.33 نا 2 هبو 4، 10 الجلوكوز، 10 HEPES. ضبط درجة الحموضة من الحل تايرود إلى 7.4 مع هيدروكسيد الصوديوم وتصفية حل من خلال مرشح 0.22 ميكرون.
- تحميل حل تايرود في 60 المحاقن مل وجميع أنابيب من Langendorff الأفقي انشاء 11، 12 هو موضح في الشكل (4). تأكد للقضاء على جميع فقاعات الهواء.
- ربط الأنابيب البلاستيكية لخزان O 2.
- إضافة محول المحملة البلاستيك لخفض و"أنبوب 5 في حل تايرود في مل حقنة 60.
- نعلق حجر الهواء من البلاستيك لنهاية "أنبوب 5 حتى O 2 الإرادة فقاعة للخروج الى حل تايرود.
- وضع خياطة الجراحية غير قابل للامتصاص حول إبرة تستخدم قنية. ويقترن الإبرة إلى مشعب (انظر الشكل 4) الذي يسمح الرجعية نضح مع حلول مختلفة. وأخيرا، سيتم مقنى الشريان الأورطي للقلب في الإبرة.
2. إعداد الحيوانية والقلب تشريح
- وزن وحقن الفأر مع الهيبارين (مثل الفأر من وزنه 20 غراما، حقن مع 20 وحدة أو 200 ميكرولتر) لمدة 15 دقيقة قبل القتل الرحيم خلع عنق الرحم. تخدير الببغاوات وفقا رس أدلة استخدام الحيواني من بروتوكول IACUC الخاص بك ومن ثم المضي قدما في خلع عنق الرحم.
ملاحظة: استخدم 8 أسابيع الفئران القديمة أو 20 الببغاوات ز. - إزالة القلب من تجويف الصدر بعد euthanization. استخراج قلوب ببغاء في بنفس الطريقة تماما كما هو موضح بالنسبة للفئران.
- تنظيف الصدر الفأر مع الايثانول.
- باستخدام مقص تشريح، وجعل شق في البطن ومن ثم تقطيع الجانبين نحو الرقبة.
- سحب الأنسجة قطع ويعلقون عليه.
- قطع الحجاب الحاجز. كن حذرا عندما قطع الحجاب الحاجز لتجنب إتلاف القلب.
- إزالة الرئتين والأنسجة المحيطة بها.
- استخدام ملاقط لحلج القطن في القلب من دون الضغط عليه. قطع الشريان الأورطي لأطول فترة ممكنة.
- نقل قلب على وزن قارب صغير مع ما يقرب من 1 مل من محلول تايرود.
- باستخدام خياطة الجراحية غير قابل للامتصاص، ربط الشريان الأورطي على الجهاز Langendorff الأفقي عبرإبرة. ربط الشريان الأورطي في القلب بمساعدة اثنين من ملاقط غرامة. تبدأ الرجعية نضح عن طريق فتح صمام تقع في سلسلة مع 60 المحاقن مل تحتوي على حل تايرود.
- السماح القلب لتستقر لمدة 10 دقيقة. استخدام هذا الوقت لتنظيف الدم والأنسجة الدهنية المحيطة القلب قبل تحميل الصبغة. سحب الأنسجة الدهنية بالقرب من قاعدة للقلب مع ملاقط وقطع باستخدام مقص تشريح الصغيرة. يجب التأكد من القيام بذلك تحت ضوء مجهر تشريح.
3. عصاري خلوي كا 2+ القياسات: إعداد صبغ Rhod-02:00
- إضافة 20 ميكرولتر من 20٪ pluronic (السطحي غير الأيونية) في DMSO إلى قارورة بلاستيكية مغلفة الخاصة المقدمة من قبل الشركة المصنعة صبغ يحتوي على 50 ميكروغرام من الصبغة.
- مزيج من قبل pipetting صعودا وهبوطا، وتجنب الفقاعات.
- نقل DMSO مختلطة مع السطحي غير الأيونية وصبغ من الخاصة القارورة البلاستيكية المعبأة في قارورة زجاجية واضحة. إضافة 1 مل من تايرود المحاليلنشوئها إلى قارورة زجاجية واضحة.
- يصوتن لمدة 15-20 دقيقة في sonicator حمام.
- يروي الصبغة باستخدام مضخات تحوي لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- وضع الصبغة في غرفة صبغ.
- استخدام المشبك الميكانيكية لضغط جميع خطوط أنابيب أخرى متصلة متعددة. يتم وضع المشبك فوق متعددة. هذا سيمنع أي ارتجاع في أنابيب متصلة 60 المحاقن مل.
- بدوره على مضخة تحوي نضح لبدء تعميم الصبغة. إغلاق فورا 3-الطريقة صمام أقل من مل حقنة 60.
- وضع أنبوب صغير متصل شفط مضخة تحوي القادمة إلى قلب إعادة توزيع الصبغة التي تم perfused في القلب.
4. البينية ريال كا 2+ القياسات: إعداد صبغ ماج Fluo4AM
- إعداد ماج Fluo4AM في بنفس الطريقة التي Rhod-02:00. الرجوع إلى قسم 3 للحصول على تعليمات خطوة حكيمة.
- بعد عملية الشراءص تحميل الصبغة، افتح صمام تقع في سلسلة مع 60 المحاقن مل تحتوي على حل تايرود لبدء الرجعية الارواء. تأكد من إزالة المشبك فوق متعددة.
- إضافة حل تايرود إلى غرفة الأفقية والاحماء إلى 37 درجة مئوية.
- الرجعية يروي مع حل تايرود لمدة 45 دقيقة لإزالة الصبغة عصاري خلوي.
5. غشاء القياسات المحتملة: إعداد صبغ دي-8-ANEPPS
- إضافة 5 مل من 99٪ من الإيثانول إلى القارورة صبغ يحتوي على 5 ملغ من الصبغة.
- قسامة 10 ميكرولتر إلى 500 فرد 1 قارورة بلاستيكية مل باستخدام ماصة مكرر.
- يجفف في فراغ السرعة ومخزن في -20 درجة مئوية.
- إضافة 20 ميكرولتر من 20٪ pluronic في DMSO إلى قارورة من البلاستيك مع 10 ميكروغرام من الصبغة المجفف.
- مزيج من قبل pipetting صعودا وهبوطا، وتجنب الفقاعات.
- نقل مزيج تحتوي على DMSO مع pluronic وصبغ من قنينة بلاستيكية لاسطوانة تخرج (10 مل). إضافة حل تايرود لفو النهائيلوم من 5 مل.
- يصوتن لمدة 20-25 دقيقة في sonicator حمام.
- يروي في قلب لمدة 30 دقيقة باستخدام مضخات تحوي. الرجوع إلى تعليمات متدرجة في القسم 3.5.
6. تسجيل إشارات النخابية
- بعد تحميل الصبغة، الرجعية يروي القلب مع حل تايرود عن طريق إزالة المشبك فوق متعددة. فتح صمام تقع في سلسلة مع مل حقنة 60 تحتوي على حل تايرود. الرجعية يروي حل تايرود لمدة 10 دقيقة لتحقيق الاستقرار في القلب.
- تملأ الغرفة الأفقية مع حل تايرود وتشغيل وحدة بلتيير لتحقيق درجة حرارة الحمام إلى 37 درجة مئوية.
- ضع الألياف الضوئية على سطح القلب.
- وضع الألياف البصرية داخل ماصة 2 مل ثم نعلق ماصة لmicromanipulator.
- استخدام micromanipulator للضغط قليلا من الألياف البصرية على سطح LV.
- وتيرة خارجيا صناعة الثقيلةRT مع مشجعا التي تسيطر عليها مولد الموجة.
- برمجة مولد موجة لتوفير نبض مربع ويبلغ عرضه 1 مللي ثانية.
- تعيين مشجعا لتكون متزامنة من الخارج وربط المدخلات الخارجية للمولد الموجة.
- إلى كل ناتج من التحفيز والتشجيع، قم بتوصيل سلك مع إبرة الوخز بالإبر ملحوم في نهاية المطاف.
- وضع كل من إبر الوخز في قمة القلب حوالي 3 ملم بعيدا عن بعضها البعض.
- فقط بعد أن يتم وضع الإبر في الأنسجة، بدوره على إخراج مشجعا لمنع الصدمات الكهربائية.
- في اقتناء البرمجيات، وضبط التردد الاستحواذ إلى 10 كيلو هرتز.
7. تسجيل إشارات الشغاف
- الرجوع إلى الخطوة 6.1 و 6.2 لتحقيق الاستقرار في القلب بعد تحميل الصبغة.
- باستخدام نقطة 23Ga حادة حول حجم الألياف البصرية، وجعل ثقب صغير في سطح القلب في LV بالقرب من الحاجز. <لى> ضع علامة intravitreal محول جراحة بضع الصلبة للمساعدة في تحديد المواقع أول الألياف البصرية في شغاف باستخدام micromanipulator.
- وتيرة خارجيا القلب. الرجوع إلى الخطوة 6.4.
- في اقتناء البرمجيات، وضبط التردد الاستحواذ إلى 10 كيلو هرتز.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ا ف ب والكالسيوم 2+ العابرين في البطانة والنخاب
من أجل مقارنة الإشارات عبر جدار البطين، يتم وضع الألياف البصرية واحد في البطانة والآخر في النخاب. مقارنة مورفولوجية أب المسجلة من البطانة مع واحد من النخاب هو أفضل وسيلة لتقييم وظيفة بطريق. الجدار البطيني هو غير متجانسة للغاية، وبالتالي، فإن التشكل من نقاط وصول مختلفة جدا في هاتين المنطقتين. ومن المعروف أن البطانة ديها أقل أنا لمن النخاب 17 و 18 و 19. أقل أنني ليجعل من عودة الاستقطاب المرحلة 1 أبطأ في شغاف 18 و 20. الشكل 5B شالدودة الحلزونية تسجيل البصرية نموذجية من وكالة اسوشييتد برس من البطانة والنخاب. لإجراء هذه التسجيلات، تم تحميلها قلوب الفئران مع الصبغة الجهدية دي-8-ANEPPs وقياس مضان باستخدام تقنية CLFFM. مورفولوجية وكالة اسوشييتد برس سجلت بصريا، لا سيما في المرحلة 1، يبين مسار أبطأ الوقت لالبطانة (العمل مدة المحتملة (الهادئ) 30 هو 8.01 مللي ± 2.5) مقارنة مع النخاب (3.4 مللي ± 0.59) (الشكل 5B). بشكل عام، يمكن وصف الهادئ حيث أن الوقت الذي يستغرقه وكالة اسوشييتد برس للrepolarize نسبة معينة بما في ذلك 30، 70 أو 90 (الشكل 5A). تم تطبيع هذه الآثار وتحول لمرحلة متداخلة 0. عند مقارنة APDS (الشكل 5C)، ونحن نرى أن البطانة والنخاب تختلف اختلافا كبيرا خلال المرحلة 1. على الرغم من أن هذه الجزائرية هي إشارات مضان، ويمكن معايرة لمحددة غشاء المحتملة عن طريق قياس في وقت واحد AP معمسرى مكروي حادة مليئة 3 M بوكل 13.
بالإضافة إلى غشاء المحتملة، مؤشرات الفلورسنت الخارجية يمكن استخدامها لمراقبة داخل الخلايا [كا 2+]. عادة، ونحن نستخدم Rhod-02:00 لقياس الكالسيوم داخل الخلايا 2+ العابرين بسبب مجموعة ديناميكية عالية وقدرته على البقاء في العصارة الخلوية حتى في درجات الحرارة الفسيولوجية. ويبين الشكل 6B تسجيل نموذجية من الكالسيوم داخل الخلايا 2+ العابرين في طبقة البطانة والنخاب. وكانت هذه النتائج نشرت جزئيا 15. من أجل مقارنة الاختلافات الإقليمية في داخل الخلايا [كا 2+] المستويات، تم تقييم حركية العابرين الكالسيوم 2+ (الشكل 6A). وعموما، فإن تحليل الكالسيوم 2+ حركية عابرة (الشكل 6C) يدل على أن العابرين الكالسيوم 2+ من البطانة زيارتها significantly حركية أبطأ من تلك التي سجلت من النخاب.
كاليفورنيا 2+ ديناميكية في التجويف ريال
في القلب، وارتفاع وانخفاض من بين الخلايا [كا 2+] مستويات حاسمة في تحديد العديد من المتغيرات الفسيولوجية بما في ذلك الضغط، انقباض، وعمل مدة المحتملة (الهادئ). وصف القسم السابق قدرتنا على قياس عصاري خلوي كا 2+ العابرين. كا 2+ صدر عن ريال مسؤولة إلى حد كبير عن ارتفاع في داخل الخلايا 2+ الكالسيوم عصاري خلوي. وهكذا، على كل ارتفاع في الكالسيوم داخل الخلايا 2+ هناك الكالسيوم 2+ نضوب في ريال سعودي. ومع ذلك، عصاري خلوي كا 2+ العابرين هم لا يعود فقط إلى SR الكالسيوم 2+ الإفراج عنهم، وإنما تشمل أيضا الكالسيوم 2+ القادمة في الخلية من خلال غشاء البلازما. مختبرناوكان 16 قادرة على تقييم ريال كا 2+ المحتوى عن طريق استخدام صبغة الفلورسنت، ماج-فلوو-04:00. على الرغم من أن هذه الصبغة هي دي تجمعت في هيولى عضلية وريال، ويمكن للmyocytes قذف من الكسر عصاري خلوي. هذا قذف صبغ يمكن تعزيز ببساطة عن طريق زيادة درجة الحرارة إلى 37 درجة مئوية. في درجة الحرارة هذه، تتم إزالة الصبغة عصاري خلوي من قبل كاسيت ملزمة ATP مثل بروتين الغشاء. لحسن الحظ، وهذا البروتين هو غير موجود في غشاء ريال. ولذلك، بعد زيادة درجة الحرارة إلى 37 درجة مئوية، ومضان مسجلة باستخدام تقنية PLFFM هو في الغالب نتيجة لكا 2+ ملزمة لصبغ داخل ريال. من أجل اختبار خصوصية قياس عضية، تم تطبيق نبض الكافيين لتحفيز إطلاق الكالسيوم من خلال 2+ RYR. ومن الممكن أن نلاحظ أن الإشارة هي في الواقع نتيجة لنضوب ريال سعودي (الشكل 7). الكافيين التي يسببها ريال كا 2+ اطلاق سراح (الشكل 7A) تنتج سواء، انخفاض في مستوى الانبساطي من ماج-فلوو-4 مضان (92 ± 0.05٪ (N = 4، P = 0.012)) وانخفاض في سعة من الكالسيوم 2+ العابرين (51 ± 0.21٪ (N = 4، P = 0.003)) 16. آثار ريال البينية سجلت قبل وبعد التحفيز الكافيين وتمثل نحو الانخفاض في الشكل 7B-7D. مع مرور الوقت من التحفيز الكافيين، اتساع نضوب ريال أصغر. ويوضح الشكل 7E أن نضوب ريال سعودي يدفع ليس فقط انخفاض في اتساع إشارة الكالسيوم 2+ لكن يبطئ كا 2+ عملية الإفراج ريال أيضا. تتبع مضان في الشكل 7A قد نشرت سابقا 15.
نابض الصمام: إمكانات العمل
في الشكل 5 أظهرنا أن دي-8-ANEPPS يمكن الإبلاغ عن التغييراتفي غشاء المحتملة عندما يكون متحمس في 532 نانومتر. تحت هذا الشرط الإثارة، وجود انخفاض في مضان المنبعثة في موجات أعلى من 590 نانومتر. ومن المثير للاهتمام، عندما هذه الصبغة الجهدية هو قريب متحمسون إلى أقصى الطول الموجي الإثارة لها (~ 476 نانومتر)، والانبعاثات مضان من التحولات صبغ لانخفاض موجات عندما depolarizes الغشاء. وبناء على ذلك، يسمح هذا التحول الطيفي لنا لتسجيل مضان المنبعثة في اثنين من أطوال موجية مختلفة. هذه الخاصية الطيفية للدي-8-ANEPPS تسمح للتقنين مضان المنبعثة سجلت في اثنين من أطوال موجية مختلفة، وهي الميزة التي عادة ما تكون ذات قيمة كبيرة لأن التسجيل المحوسب النهائي سوف تكون مستقلة عن تركيز الصبغة في الغشاء. من أجل الاستفادة الكاملة من التحول الطيفي دي-8-ANEPPS، كنا المصابيح نابض كمصدر ضوء. كنا الضوء الأزرق نابض لإثارة fluorophore. وقد أجريت الإثارة في 485 نانومتر، على مقربة من امتصاص الطول الموجي ذروة دي-8-ANEPPS (~ 476 نانومتر). الاستحواذ في اثنين من مختلف العصابات الطيفية الانبعاثات يسمح بتشكيل نسبة والقدرة على زيادة S / N ورفض الضوضاء وضع المشتركة مثل ضوء البيئة وقطعة أثرية الحركة في التعاقد قلوب حيث لم يتم استخدام uncoupler blebbistatin الميكانيكية. هذا الوضع هو مهم جدا لظروف تجريبية حيث يحتاج إلى أن يقاس في الوقت نفسه كل من النشاط الميكانيكي للقلب وحركية الكالسيوم 2+ العابرين.
ويوضح الرسم البياني توقيت PLEDFM في الشكل 8A. ويشمل المخطط منطق التحكم لدمج وإعادة تعيين headstage photodetection، توقيت على الخروج من الصمام وتحويل التناظرية إلى الرقمية. خلال وقت أب، مضان الكشف عنها في الفرقة الطول الموجي الخضراء يظهر زيادة في كثافة بينما مضان الكشف عنها في الفرقة الحمراء يقلل. ويوضح الشكل 8Bان التغيير للإشارة مضان التي تنتجها الاستقطاب غشاء يتحرك في اتجاهات مختلفة. ومع ذلك، فإن قطعة أثرية الحركة التي تنتج من تقلص القلب دائما موجهة في الاتجاه نفسه، بغض النظر عن الطول الموجي الانبعاثات. كما هو موضح من قبل، ويجب أن تكون بيانات كل من قنوات (الأخضر والأحمر) قبل احتساب نسبة مكيفة البرمجيات. يتضمن تكييف تعويض وكسب التصحيحات. اختيار التصحيحات مستوى تعويض وكسب ليست تلقائية. المستخدم من البرنامج لديه لتحديد المتغيرات التي تشترط وجود آثار قبل النسبة. نسبة مما أدى إلى 8B لوحة (الشكل 8) تبين أن القطع الأثرية التي أدخلتها حركة عضلة القلب ألغت.
التغير النسبي في مضان دي-8-ANEPPS خلال AP عادة ما تكون صغيرة جدا (~ 8٪ لكل 100 فولت). هذا دي-8-ANEPPS التغيير مضان هو أصغر بكثير من التي تنتجها المربوطة الكالسيوم 2+ز لRhod-2 (<200٪). وبالتالي، من أجل زيادة نسبة الإشارة إلى الضوضاء من دي-8-ANEPPS، تسجيلات متعددة يمكن المتوسط.
نابض الصمام: التسجيلات في وقت واحد من الكالسيوم 2+ وغشاء المحتملة
الهدف الأخير باستخدام هذا المنهج التجريبي يتكون في أداء التسجيلات في وقت واحد من الكالسيوم 2+ العابرين وكالة الانباء الجزائرية الرسمية. التسجيلات في وقت واحد من الإشارات الفيزيولوجية متعددة يتطلب حل الصعوبات التقنية المتعلقة بالجوانب المختلفة للنظام بما في ذلك: اقتران مصدر الضوء مع الألياف البصرية، مطابقة الطيف امتصاص الصبغة مع انبعاث المصابيح، تصميم التناظرية والدوائر الإلكترونية الرقمية ل توليد توقيت والاستحواذ وكذلك تطوير برنامج سريع لتحليل البيانات على شبكة الإنترنت.
انا اعرفدراسة ص، واختيار من الأصباغ تعتمد على خصائصها الطيفية. يجب Flourophores المستخدمة لقياس إشارات متنوعة تمتص في نطاقات طيفية مختلفة. هذا الشرط ضروري للتمييز بين مصادر الإشارة. في كل مرة أن أدى وجود الطول الموجي مختلفة تستخدم لإثارة الأنسجة، والكشف عن مضان يتوافق مع إشارة ذات الصلة مع الصبغة التي تمتص في هذا الطول الموجي. وبهذه الطريقة، وانبعاث مضان قادمة من الأصباغ المختلفة، ولكن في نطاق الطول الموجي نفسها، ويمكن تمييز في الوقت الذي كل واحد هو متحمس.
ومع ذلك، فإن الحديث المتبادل بين أطياف صبغ لا يمكن تجنبها تماما. وذلك لأن خصائص امتصاص الأطياف من الأصباغ جعلها تمتص الضوء بأطوال موجية بعيدا عن ذروة استيعابهم. في تجاربنا، تم إنتاج المتبادل في كلا الاتجاهين: (1) Rhod-2 أن ولع وادي الزرقاء، إضافة الكالسيوم 2+ إشارة إلى channe الحمراءل AP أثر، و (2) دي-8-ANEPPS أن ولع LED أخضر، والذي يظهر على كا 2+ إشارة عابرة (الشكل 9F). يمكن تصحيح هذا الحديث المتبادل على الخط، كما هو موضح في الشكل رقم 9. يعمل الإجراء لأن إشارة التطفل هي نسبة ضئيلة للإشارة التي يجب قياسها. وأخيرا، وذلك باستخدام هذا النوع من المعالجة الجبرية من fluorecence من سمحت الأصباغ لنا لفصل ا ف ب (الشكل 9D) تشكيل الكالسيوم 2+ العابرين (الشكل 9H). ووصف تفصيلي لهذه المعالجة في أسطورة الرقم. من المهم أن نلاحظ أن جميع التجارب نابض الصمام أجريت على 28 درجة مئوية.
الشكل 1: محلية الميدان مضان المجهر (LFFM). يتكون LFFM من ترتيب epifluorescenceباستخدام الألياف الضوئية المتعدد الذي هو على اتصال مع الأنسجة لتسجيل مضان المنبعثة من الأصباغ الخارجية perfused في القلب. وLFFM انشاء يمكن استخدام ثلاثة مصادر الضوء المختلفة بما في ذلك (أ) PLFFM، حيث يتم توفير ضوء الإثارة من قبل بيكو نابض بدون تاريخ ياج ليزر. (ب) CLFFM، حيث يتم استخدام أشعة الليزر موجة مستمرة ويتم إنشاء نبضات الضوء من خلال المغير متعلق بالعازل الكهربائي الشفاف السماح مضاعفة الليزر مع أطوال موجية مختلفة. و (ج) PLEDFM، حيث المصابيح ذات أطياف الانبعاث الأوسع مع انبعاثات ذروة (د) 485 نانومتر و 540 نانومتر للالمصابيح الزرقاء والخضراء، على التوالي، ونابض إلكترونيا. عندما تستخدم مصادر الليزر، وامتبائر شعاع من قبل المتوسع شعاع. وأخيرا، المرايا مزدوج اللون وعدسات موضوعية تركز شعاع على النهاية البعيدة الألياف البصرية والتي يتم الضغط قليلا على الأنسجة. الضوء المنبعث يسافر مرة أخرى من خلال نفس الألياف البصرية، مرآة مزدوج اللون، EMIمرشحات ssion، وتركز على أحد الضوئي الانهيار حيث يتم تحويل الفوتونات إلى تيار كهربائي. يمكن تضخيم التيار من قبل اثنين من أساليب (ه) transimpedance مكبر للصوت، حيث ينتج عن ذلك من الجهد الناتج يتناسب مع photocurrent والمقاوم ردود الفعل. (و) تكامل، حيث انتاج التيار الكهربائي هو وظيفة من ردود الفعل الحالية وبالسعة. وأخيرا، حصلت على إشارة من قبل محول A / D وعرضها على جهاز كمبيوتر. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: مقاوم وبالسعة التحويل. (أ) ويرد مثال نموذجي للكشف مقاوم من نبضات الليزر بيكو ثانية. العلامة النجمية (ب)يظهر وقت توسعت الفاصلة، حيث تم تنفيذ خوارزمية ذروة تتبع للكشف عن الذروة (أحمر) وقاعدة (الخضراء). (ج) يتم عرض تمثيل من آثار حسابها من قمم وقواعد التسجيلات لRhod-2 الردود الفلورسنت في الضرب ببغاء القلب تيرة خارجيا في 7 هرتز ودرجة الحرارة مجموعة حمام إلى 37 درجة مئوية. د أن ح) photocurrent تحويلها عن طريق تكامل باستخدام ردود الفعل بالسعة. وتظهر التسجيلات النموذجية سليمة الماوس القلب الكالسيوم 2+ العابرين في جدولين زمنية مختلفة (d و e). (و) وتظهر تكامل دورتين متتاليتين مع وبدون إضاءة LED. تكامل الزيادات إشارة خطية مع photocurrent التهم مكثف ردود الفعل. المنحدر من الوقت يعتمد يتجزأ (تان (Ɵ)) يتناسب مع عدد الفوتونات التي تؤثر على تقاطع سيل بالإضافة إلى إعادة التركيب الإلكترون حفرة الناجمة عن عالنشاط hononic عندما الصمام الثنائي سيل لا يكشف أي الفوتونات. الإشارات الرقمية التي تسيطر التكامل headstage وإعادة تعيين ترد فترات في لوحة ز. وتظهر إشارات الكشف خلال فترة غير مضيئة (DC) وLED الإنارة (F) في لوحة ح. الطرح من F والعاصمة يوفر القياس الفعلي من fluorescently الكشف الكالسيوم 2+ العابرين من الفئران قلوب تيرة خارجيا في 9 هرتز عند 37 درجة مئوية (ح). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل (3): LFFM لالنخاب والمقاييس البطانة. تم استخدام CLFFM انشاء لقياس مضان المنبعثة من الأصباغ الفلورية الخارجية الحالية في لالنخابد طبقات البطانة. إضافة الخائن شعاع سهلت تسجيل المتغيرات الفسيولوجية المختلفة في النخاب والبطانة. واستخدمت اثنين من الألياف البصرية مع headstages الفردي للكشف عن النخاب والبطانة. وقدم شق دائرية صغيرة في البطين والخيوط والألياف البصرية من خلال تسجيل من البطانة. هذه مجموعة المتابعة استخدام محول الحالي إلى الجهد مع ردود فعل مقاوم. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: غرفة الأفقية مع التحكم في درجة الحرارة. رسم تخطيطي يبين Langendorff مجموعة المتابعة حيث يتم الاحتفاظ قلوب سليمة وظيفية لساعات. ويرتبط القلب إلى إبرة من خلالها كل الحلول والأصباغوالرجعية perfused-إلى القلب عبر التاجية المتفرعة من الشريان الأورطي. تم وضع غرفة فوق وحدة بلتيير للحفاظ على درجة حرارة الحمام، وهو يقرأ من قبل جهاز استشعار درجة الحرارة وصله بجهاز الفولتميتر. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 5: بطريق عمل قياسات المحتملة في قلوب سليمة. ويتم تقييم (أ) العمل مدة المحتملة (الهادئ)، والوقت الذي يستغرقه لإكمال 30٪، 70٪، أو 90٪ من عودة الاستقطاب AP. (ب) دي-8-ANEPPS مضان من النخاب (أسود) والبطانة (الرمادي) تظهر AP الاختلافات الشكلية في عودة الاستقطاب بين طبقتين من جدار البطين. (ج) بعد تقييم رانه الهادئ 30، 70، و 90 في البطانة والنخاب، وأظهرت النتائج وقعت اختلافات كبيرة فقط في APD 30 (8 ± 2.5 مللي شغاف مقابل 3 ± 0.6 مللي النخاب). وتيرة القلوب في 6 هرتز وضبط درجة الحرارة إلى 37 درجة مئوية. البيانات يعني ± SEM من 5 القلوب. * P <0.05. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6: بطريق الكالسيوم 2+ القياسات عابر في قلوب سليمة. (أ) معلمات من الكالسيوم 2+ حركية عابرة قياسها هي: الوقت الذي يستغرقه للوصول إلى الحد الأقصى، والوقت ليصل إلى ذروته (TP)؛ الوقت المستغرق للانتقال من 10٪ إلى 90٪ من الارتفاع، ترتفع الوقت (RT)؛ الوقت المستغرق للانتقال من 10٪ إلى 90٪ من تسوس الأسنان، تسوس الوقت (DT)؛ و الالوقت الذي يستغرقه لإكمال 50٪ من عابر، نصف المدة (HD). (ب) الإسفار المنبعثة من Rhod 2 بعد الإثارة مع الأخضر CW عرض ليزر النخاب (أسود) والبطانة (الرمادي) كا 2+ العابرين مع وجود اختلافات في الاسترخاء. ج) كان كا 2+ العابرين من البطانة أبطأ بكثير حركية في RT، TP، HD، وDT من تلك التي سجلت من النخاب. وتيرة القلوب في 6 هرتز وضبط درجة الحرارة إلى 37 درجة مئوية. البيانات يعني ± SEM من 5 القلوب. * P <0.05. تعديل من Mattiazzi وآخرون. 15. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 7: كا 2+ القياسات ريال البينية في قلوب سليمة.(أ) مضان المنبعثة من الصبغة ماج-فلوو-4 قطرات مع مرور الوقت، مما يعكس انخفاضا في ريال تركيز داخل الكالسيوم 2+. (ب) عرض موسع للانخفاض في ماج-فلوو 4 مضان تشير الكالسيوم 2+ نضوب الناجم عن الكالسيوم 2+ الإفراج عن ريال. (ج) عرض موسع للانخفاض في سعة عابرة من ماج-فلوو 4 مضان يمثل الكالسيوم 2+ إطلاق تعديلها من قبل perfusing قلوب مع 20 ملي الكافيين. (د) بعد تطبيق طويلة من الكافيين، انخفاضا في كل من مستوى الانبساطي من ماج-فلوو-4 مضان وفي سعة من الكالسيوم 2+ العابرين [أسفل إلى 92 ± 0.05٪ (N = 4، P = 0.012) و لوحظ 51 ± 0.21٪ (N = 4، P = 0.003) من القيم الأولية، على التوالي]. كما تقدم المزيد من الوقت من الكافيين، وأصغر هو اتساع نضوب ريال. (ه) آثار تطبيع في دينار بحريني يظهر أن استنفاد ريال لا تحفز فقطالصورة يقلل من إشارة الكالسيوم 2+ لكن أيضا يبطئ ريال كا 2+ تجديد. وتيرة قلوب في 4 هرتز وضبط درجة الحرارة إلى 37 درجة مئوية. مضان التتبع من Kornyeyev وآخرون. 16. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 8: القياسات Ratiometric وكالة الأنباء الجزائرية في قلوب سليمة مع نابض الصمام. (أ) الرسم البياني توقيت بما في ذلك دمج وإعادة تعيين headstage، على الخروج مرة من الصمام وتسجيل الفعلي هو موضح. (ب) آثار من القنوات لهما القيم يستريح مختلفة، ويتم تصحيح عن طريق تحريك العتلات حتى يتم يسبق كل AP بواسطة قيمة يستريح على تعويض. كسب كل قناة هو أيضا موقف قابل للتعديلتيد. لاحظ أن الحركة قطعة أثرية كبيرة جدا يظهر على كل القنوات بين اللاإستقطابات depolarizations اثنين. بعد البرنامج بمعالجة الإشارات ratiometrically، والنتيجة هي AP دون التحف ملحوظة (الأزرق). وتيرة قلوب في 3 هرتز وضبط درجة الحرارة إلى 28 درجة مئوية. كافة السجلات المعروضة هي ما معدله 10 آثار. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 9: في وقت واحد كا 2+ العابرون والمقاييس AP في قلوب سليمة مع نابض الصمام. التلوث عبر الحديث الإشارات عندما كا 2+ وAP يمكن تصحيحه على الانترنت تسجيل على حد سواء. الصبغة الجهدية، دي-8-ANEPPS، هو متحمس مع 20 ميكرو ثانية الزرقاء البقول LED (أ). إشارات الصورةplit وتصفيتها مع الأحمر ممر الموجة والمرشحات الخضراء. تم الكشف عن هذه الإشارات من قبل اثنين من ثنائيات ضوئية الانهيار المختلفة مبينا أنها الحمراء (ب) وقناة الخضراء (ج). ومن الممكن أن نلاحظ أن كل الإشارات وحمراء وخضراء، تمثل قطعة أثرية حركة ملحوظة أن يظهر على شكل انحراف النزولي. كل الإشارات، الحمراء والخضراء، وoffseted ومن ثم تضخيمها. تستخدم الإشارات مكيفة لحساب النسبة بينهما، ويتم إظهار النتيجة في د. ومن الممكن أن نلاحظ أن في النسبة بين كل من الإشارات (د) يتم إلغاء القطع الأثرية تتحرك. ويوضح لوحة البريد تسلسل النبضات المنطق الذي السيطرة على انبعاث LED الأخضر تستخدم لإثارة مؤشر الكالسيوم 2+ Rhod-2. وتظهر إشارات الفلورسنت تم الحصول عليها باستخدام هذا الإجراء في و. على الرغم من أن أثر في و يظهر في الغالب زيادة في إشارة مضان بسبب المربوطة الكالسيوم 2+ز لRhod-2، فمن الممكن أيضا أن نلاحظ انحراف سلبي في التتبع بسبب إشارة الكشف عن fluorescently من دي-8-ANEPPS عند هذه الصبغة هو متحمس مع الضوء الأخضر. يمكن تصحيح هذه المشكلة عن طريق طرح إشارة فرق الجهد هو مبين في ز. تظهر النتيجة من الطرح في لوحة ح حيث كا 2+ إشارة خالية من يتم الحصول على تلوث AP. وتيرة قلوب في 3 هرتز وضبط درجة الحرارة إلى 28 درجة مئوية. كافة السجلات المعروضة هي ما معدله 10 آثار. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وتتركز هذه الورقة في وصف تقنيات مضان ميدانية محلية لتقييم وظيفة myocytes القلب خارج الحي. دراسة هذه الخلايا في بيئة بالإضافة ليست فقط أكثر الفسيولوجية، ولكن هو أيضا مناسبة للغاية لتقييم الحالات المرضية على مستوى الجهاز. الأحداث الخلوية الكامنة وراء اقتران الإثارة، تقلص (ECC) يمكن تقييمها على مستوى الجهاز كله مع استخدام الاختبارات الجزيئية التي ترصد الكالسيوم داخل الخلايا 2+ ديناميات (Rhod 2 عصاري خلوي كا 2+، ماج Fluo4 ريال كا 2+) و النشاط الكهربائي (دي-8-ANEPPs). هنا، قدمنا ثلاث تقنيات LFFM epifluorescence التي تثير وجمع الانبعاثات من المؤشرات الفلورسنت باستخدام الألياف البصرية على حد سواء. وهي تختلف استنادا إلى مصدر الضوء المستخدمة ونوع من التحوير خفيفة. يستخدم PLFFM الليزر التي نبضات الضوء، CLFFM يستخدم ضوء الليزر المستمر، في حين يستخدم LEDFM المصابيح التي يمكن أيضا أن نابض في PLEDFM. كل هذهوترد في الشكل (1)، مجموعة واحدة، ولكن يمكن بناؤها مع واحد فقط من الترتيبات epifluorescence الثلاثة. وبالإضافة إلى ذلك، وعلى ضوء الكشف يمكن معالجتها بطرق مختلفة. على سبيل المثال، يوضح الشكل 2 حالتين مختلفتين فيه photocurrent يمكن أن تكون متكاملة أو تحويلها مباشرة إلى الجهد عن طريق تحويل التيار إلى الجهد. بشكل عام، فإن النهج LFFM يمكن استخدامها لقياس وقت واحد المواقع التشريحية متعددة، كما رأينا لالشكل 3.
الطريقة المعروضة هنا لتقييم خصائص القلب على مستوى الجهاز سليمة هو أكثر ملاءمة لدراسة المشاكل التي اقتران بين الخلايا أمر بالغ الأهمية في تحديد سلوك الأنسجة. عدم تجانس جوهري من القلب يمكن أن تنتج مختلف AP الطول الموجي 13 و 21 و 22 على أساس الأنسجة محددة من الذي مLLS تنشأ. لذلك، توفر دراسات الجهاز كله فرصة لتقييم وظيفة فسيولوجية المحلية للخلية في الهياكل التشريحية المختلفة. وعلاوة على ذلك، فقد رأينا أن الأحداث داخل الخلية مثل الشرر وموجات لها حركية مختلفة في الخلايا فصلها من في الجهاز سليمة (15).
وLangendorff مجموعة المتابعة (الشكل 4) أمر بالغ الأهمية في الحفاظ على القلب في حالة أقرب إلى في الجسم الحي. بالإضافة إلى ذلك، فإنه يسمح للretroperfusion من أدوية متعددة ومختلفة تحقيقات الجزيئية الفلورسنت التي تسمح للقياس العديد من المتغيرات الفسيولوجية. يمكن تغيير تحقيقات الفلورسنت الخارجي المستخدمة، وزيادة حجم الألياف الضوئية، أو اختيار مصدر الضوء مختلفة يغير بشكل كبير من تطبيق هذه التقنية. بالإضافة إلى ذلك، وحدة بلتيير أدناه الغرفة الأفقية يمكن أن تسهل دراسة ديناميات الكالسيوم 2+ في درجات حرارة مختلفة. إضافة الملحقاتلLFFM مثل مقسم الأشعة يمكن أن تزيد من عدد من الألياف البصرية المستخدمة لتسجيل من مناطق مختلفة في قلب سليمة. هذا هو التكيف مفيد جدا لاختبار إذا تحدث الاختلافات الإقليمية في سيناريوهات المرضية. ويبين الشكل 3 البطانة والنخاب يجري تقييم في وقت واحد. وعلاوة على ذلك، perfusing القلب مع منبهات مختلفة تسمح لنا أن نفهم كيف يتم تنظيم مختلف المناطق عبر جدار البطين. الإشارات الكهربائية (الشكل 5) والكالسيوم 2+ الحركية (الشكل 6) التغاير يمكن مقارنة في النخاب والبطانة. وبالإضافة إلى ذلك، والأصباغ متعددة مع موجات الإثارة المختلفة والمرشحات الانبعاثات يمكن استخدامها. على سبيل المثال، باستخدام ماج-فلوو-4، كاليفورنيا 2+ المستويات في تجويف ريال يمكن تسجيل (الشكل 7). يمكن متفاوتة الحجم من الألياف البصرية أيضا توسيع قدرة هذه الطريقة من خلال السماح للتسجيل الفلورسنت من لارالمنطقة الالماني.
ويبين هذا البحث أيضا أن المصابيح يمكن أن تستخدم جانبا من أشعة الليزر باهظة الثمن كمصدر للضوء الإثارة في تقنية لدينا. ويبين الشكل 8 أن هذا النوع الرخيص من مصدر الضوء يمكن أن تستخدم لقياس ratiometrically الجزائرية. قياس ratiometric هو مبين في الشكل 8 هو مفيد في إنتاج تسجيل النهائي دون التحف التجريبية بما في ذلك تلك التي تسببها الحركة. وأخيرا، حتى عابرة الكالسيوم 2+ وAP يمكن تسجيل بصريا، في نفس الوقت، من خلال أطوال موجية مختلفة المتنوعة واستخدام الأصباغ مع أطياف الانبعاث نفسه. تجهيز الإشارات الواردة في الشكل 9 حرج في إزالة التلوث الداخلي التي تنتجها التداخل في أطياف الانبعاثات من الأصباغ. تسجيل الكالسيوم 2+ العابرين وكالة الأنباء الجزائرية، في وقت واحد، ولكن كما إشارتين الانتاج المستقلة هو مفيد في دراسة ECC والكالسيوم 2+ -induced الكالسيوم 2+
LFFM هو الاسلوب مع تطبيقات متعددة في الفيزيولوجيا الخلوية للأنسجة سليمة. ومع ذلك، واحدة قيد الرئيسي هو أن مضان سجلت في المتوسط من الانبعاثات من المؤشرات الفلورسنت الكامنة في المنطقة المحلية حيث الألياف البصرية في اتصال مع الأنسجة. حتى عند استخدام اثنين من الألياف البصرية، LFFM لا يوفر التوزيع المكاني التحت خلوية الإشارات قياسها. رسم الخرائط البصرية هو أسلوب أفضل لرصد المتغيرات الفسيولوجية التي تتغير في الزمان والمكان مثل نشر العابرين ا ف ب، الكالسيوم 2+، وتناوب 23 و 24 و 25. LFFM هو أيضا غير قادر على توفير صور من الهياكل، مثل الفحص المجهري متحد البؤر وغيرها من تقنيات رسم الخرائط البصرية. ومع ذلك، واستخدامه من الألياف البصرية يجعل من عملي في صتسجيل مفيدة إشارات مضان المحلية من البطانة أو المناطق الأخرى التي يصعب أو يستحيل الوصول إليها في قلب سليمة مع المجهر متحد البؤر.
المقارنة بين المتغيرات الفسيولوجية التي تم الحصول عليها من قلوب سليمة ومن التجارب العضلية المعزولة هو التحدي. أكبر ميزة استخدام myocytes القلب المعزولة هي فرصة فريدة لتقييم الخصائص الفيزيائية الحيوية للخلايا في ظل ظروف المشبك التصحيح. في المقابل، LFFM يسمح للدراسة الظاهرة الفسيولوجية والمرضية في بيئة أكثر الأصلي. على سبيل المثال، في قلوب سليمة يمكننا تقييم الاختلافات بطريق 15، معدل ضربات القلب تبعية ا ف ب والكالسيوم 2+ في الفسيولوجية يتراوح 13 التي هي غير قابلة للتحقيق في الخلايا المعزولة. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن أن ندرس الآثار المترتبة على إهانة الدماغية على وظيفة القلب سليما 9 و 10. الجامعة بحكم القلبperiments يتيح لنا أيضا لتقييم التفاعل بين أنواع الخلايا الأخرى وmyocytes 11.
LFFM يسمح التصور من الإشارات الخلوية على مستوى القلب سليما في الخلايا التي لها اقتران الفسيولوجية. LFFM يسمح للدراسة النشاط داخل الخلايا في حين أن الخلايا لا تزال في الجهاز سليمة. في تركيبة مع الأصباغ الفلورية وepiluminescence، يمكن LFFM مراقبة خاصيتين القلب رئيسية هي: الكالسيوم 2+ ديناميات والنشاط الكهربائي.
وأخيرا، فإن الطريقة المعروضة هنا يمكن أن يكون لها تطبيقات متعددة في دراسة ECC. هو الأداة التي تكشف كيف إشارات supramolecular تتأثر في حالات المرضية مثل عدم انتظام ضربات القلب 16 و نقص التروية 9 و 15. هذه التقنية أمر لا بد منه لدراسة هذه الأمراض لأنها لا يمكن فهمها إلا على مستوى الجهاز سليمة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لديهم ما يكشف.
Acknowledgments
نشكر الدكتور أليسيا Mattiazzi لمناقشة الحرجة من العمل المقدم. وأيد هذا العمل من خلال منحة من المعاهد الوطنية للصحة (R01 HL-084487) إلى الرابطة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium chloride | Sigma | 7647-14-5 | |
| D-(+)-glucose | Sigma | 50-99-7 | |
| Potassium chloride | Sigma | 7447-40-7 | |
| HEPES | Sigma | 7365-45-9 | |
| Sodium phosphate | Sigma | 10049-21-5 | |
| Calcium chloride solution | Sigma | 10043-52-4 | |
| Magnesium chloride solution | Sigma | 7786-30-3 | |
| Sodium hyrdoxide | Sigma | S-8045 | |
| 0.2 μm nylon membrane filter | Whatman | 7402-004 | |
| Manifold MPP | Warner | 64-0216 | |
| 21G1.5 Precision glide needle | B-D | 305167 | |
| Black Braided silk string (non-absorbable surgical suture) | AllMech Tech | LOOK-SP105 | |
| Heparin sodium injection 1000USP/mL | AllMech Tech | NDC63323-540-11 | |
| DMSO D8779 | Sigma | 67-68-5 | |
| Blebbistatin | Sigma | 856925-71-8 | |
| Pluronic F-127 20% solution | Biotium | 59004 | |
| Materflex C/L peristaltic pump | Cole-Parmer | 77122-26 | |
| Isostim stimulator | World Precision Instruments | A320RC | |
| Waveform generator | Teledyne Lecroy | WaveStation 2012 | |
| Ultrasonic cleaner FS20 | Fisher Scientific | 1533530 | |
| Tygon tubing ID:1/32" OD:3/32" Wall 1/32" | Component Supply | TET-031A | |
| Tygon tubing ID:3/32" OD:5/32" Wall 1/32" | Component Supply | TET-094A | |
| Adapter luer lock to 3-way valve | Cole-Parmer | EW-31200-80 | |
| Tee adapters and plastic fittings | Cole-Parmer | 6365-90 | |
| Plastic clamp | WaterZoo | 2465 | |
| Peltier | TE Technology | TE-127-2.0-2.5 | |
| Rhod-2AM | ThermoFisher Scientific | R1245MP | |
| Di-8-ANEPPS | ThermoFisher Scientific | D3167 | |
| Mag-Fluo-4AM | ThermoFisher Scientific | M14206 | |
| Acupunture needles | LHASA | TC1.20x13 | |
| 60 mL BD syringe with luer-lok | Fisher Scientific | 14-820-11 | |
| LabView | National Instruments | ||
| Speed vacuum Eppendorf Vagufuge | Fisher Scientific | 07-748-13 | |
| Digital signal processing circuit DSP TMS 320 | Texas Instrument | ||
| Longpass Dichroic mirror 567 nm | ThorLabs | DMLP567L | |
| Objective 10X NA 0.25 DIN AchromaticFinite Intl Standard Objective | Edmund Optics | Stock# 33-437 | |
| Objective 20X NA 0.40 DIN Achromatic Finite Intl Standard Objective | Edmund Optics | Stock# 33-438 | |
| Longpass colored glass filter 590 nm | ThorLabs | FGL590 | |
| Green Nd-YAG laser 532 nm, 500 mW | |||
| Micromanipulator for laser | Siskiyou | MX130R | |
| Multimode fiber optic 200 µm NA 0.39 | ThorLabs | FT200UMT | |
| LEDs blue | Lumileds | L135-B475003500000 | |
| LEDs green | Lumileds | L135-G525003500000 | |
| Cube beam splitter, non-polarizing | ThorLabs | BS007 | |
| 36" Length, Dovetail Optical Rail | Edmund Optics | 54-402 | |
| 2.5" Width, Dovetail Carrier | Edmund Optics | 54-404 | |
| 0.75" Travel, micrometer stage | Edmund Optics | 37-983 | |
| Dovetail optical rail 3" | ThorLabs | RLA075/M | |
| Dovetail rail carrier 1" | ThorLabs | RC1 | |
| Avalanche photodiode Helix 902 | Digi-Key | HELIX-902-200 | |
| Objective holder XY Translator | ThorLabs | ST1XY-S | |
| Aluminum breadboard 6" x 6" | ThorLabs | MB6 | |
| Nexus otpical table 4' x 6' | ThorLabs | T46HK | |
| Stainless steel cap screws | ThorLabs | HW-KIT5/M | |
| Acrylic sheet | Home Depot/Lowes | ||
| Sylgard Silicone elastomer kit | Dow Corning | Sylgard 184 | |
| Epoxy gel | Walmart/Home Depot | 2-part 5 min clr 1oz | |
| 21G1.5 Precision glide needle | B-D | 305167 | |
| 23G Precision glide needle | B-D | 305145 | |
| Mounting base, 25 mm x 75 mm x 10 mm | ThorLabs | BA1/M | |
| Wire shelve posts 36" | Alera | AALESW59PO36SR | |
| Wire shelves | Alera | ALESW582424SR | |
| Post and angle clamp | ThorLabs | SWC/M-P5 | |
| Glass syringe for dye chamber | Wheaton | W851020 | |
| Rubber stopper | Home Science Tools | CE-STOP01C |
References
- Fabiato, A., Fabiato, F. Contractions induced by a calcium-triggered release of calcium from the sarcoplasmic reticulum of single skinned cardiac cells. J Physiol. 249 (3), 469-495 (1975).
- Mitra, R., Morad, M. A uniform enzymatic method for dissociation of myocytes from hearts and stomachs of vertebrates. Am J Physiol. 249 (5), 1056-1060 (1985).
- Escobar, A. L., et al. Developmental changes of intracellular Ca2+ transients in beating rat hearts. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 286 (3), H971-H978 (2004).
- Ramos-Franco, J., Aguilar-Sanchez, Y., Escobar, A. L. Intact Heart Loose Patch Photolysis Reveals Ionic Current Kinetics During Ventricular Action Potentials. Circ Res. 118 (2), 203-215 (2016).
- Mitra, R., Morad, M. A uniform enzymatic method for dissociation of myocytes from hearts and stomachs of vertebrates. Am J Physiol. 249, H1056-H1060 (1985).
- Fischmeister, R., DeFelice, L. J., Ayer, R. K., Levi, R., DeHaan, R. L. Channel currents during spontaneous action potentials in embryonic chick heart cells. The action potential patch clamp. Biophys J. 46 (2), 267-271 (1984).
- Banyasz, T., Horvath, B., Jian, Z., Izu, L. T., Chen-Izu, Y. Profile of L-type Ca(2+) current and Na(+)/Ca(2+) exchange current during cardiac action potential in ventricular myocytes. Heart Rhythm. 9 (1), 134-142 (2012).
- Apkon, M., Nerbonne, J. M. Characterization of two distinct depolarization-activated K+ currents in isolated adult rat ventricular myocytes. J Gen Physiol. 97 (5), 973-1011 (1991).
- Valverde, C. A., et al. Transient Ca2+ depletion of the sarcoplasmic reticulum at the onset of reperfusion. Cardiovasc Res. 85 (4), 671-680 (2010).
- Valverde, C. A., et al. Phospholamban phosphorylation sites enhance the recovery of intracellular Ca2+ after perfusion arrest in isolated, perfused mouse heart. Cardiovasc Res. 70 (2), 335-345 (2006).
- Escobar, A. L., et al. Role of inositol 1,4,5-trisphosphate in the regulation of ventricular Ca(2+) signaling in intact mouse heart. J Mol Cell Cardiol. 53 (6), 768-779 (2012).
- Mejía-Alvarez, R., et al. Pulsed local-field fluorescence microscopy: a new approach for measuring cellular signals in the beating heart. Pflügers Arch. 445 (6), 747-758 (2003).
- Ferreiro, M., Petrosky, A. D., Escobar, A. L. Intracellular Ca2+ release underlies the development of phase 2 in mouse ventricular action potentials. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 302 (5), H1160-H1172 (2012).
- Kornyeyev, D., et al. Calsequestrin 2 deletion shortens the refractoriness of Ca2+ release and reduces rate-dependent Ca2+-alternans in intact mouse hearts. J Mol Cell Cardiol. 52 (1), 21-31 (2012).
- Mattiazzi, A., Argenziano, M., Aguilar-Sanchez, Y., Mazzocchi, G., Escobar, A. L. Ca2+ Sparks and Ca2+ waves are the subcellular events underlying Ca2+ overload during ischemia and reperfusion in perfused intact hearts. J Mol Cell Cardiol. 79, 69-78 (2015).
- Kornyeyev, D., Reyes, M., Escobar, A. L. Luminal Ca(2+) content regulates intracellular Ca(2+) release in subepicardial myocytes of intact beating mouse hearts: effect of exogenous buffers. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 298 (6), H2138-H2153 (2010).
- Wang, Z. G., Fermini, B., Nattel, S. Repolarization differences between guinea pig atrial endocardium and epicardium: evidence for a role of Ito. Am J Physiol. 260, H1501-H1506 (1991).
- Liu, D. W., Gintant, G. A., Antzelevitch, C. Ionic bases for electrophysiological distinctions among epicardial, midmyocardial, and endocardial myocytes from the free wall of the canine left ventricle. Circ Res. 72 (3), 671-687 (1993).
- Litovsky, S. H., Antzelevitch, C. Transient outward current prominent in canine ventricular epicardium but not endocardium. Circ Res. 62 (1), 116-126 (1988).
- Lukas, A. Electrophysiology of Myocardial Cells in the Epicardial, Midmyocardial, and Endocardial Layers of the Ventricle. J Cardiovasc Pharmacol Ther. 2 (1), 61-72 (1997).
- Antzelevitch, C., Fish, J.
- Gomez, A. M. Modulation of electrical heterogeneity by compensated hypertrophy in rat left ventricle. Am J Physiol. 272 (3 Pt 2), H1078-H1086 (1997).
- Efimov, I. R. Innovation in optical imaging: looking inside the heart. Heart Rhythm. 4 (7), 925-926 (2007).
- Boukens, B. J., Efimov, I. R.
- Zhang, H., Iijima, K., Huang, J., Walcott, G. P., Rogers, J. M. Optical mapping of membrane potential and epicardial deformation in beating hearts. Biophysics J. 111 (2), 438-451 (2016).
