Summary
Nel cuore, eventi molecolari coordinare le funzioni elettriche e contrattili dell'organo. Un insieme di campo fluorescenza tecniche di microscopia locali qui presentati consente la registrazione di variabili cellulari nei cuori intatti. Identificare i meccanismi che definiscono la funzione cardiaca è fondamentale per capire come funziona il cuore in situazioni patologiche.
Abstract
Nel cuore, studi di segnalazione molecolare sono di solito eseguite nei miociti isolati. Tuttavia, molte situazioni patologiche come ischemia e aritmie possono essere pienamente comprese solo a livello organo complesso. Qui, presentiamo la tecnica spettroscopica locale microscopia a campo a fluorescenza (LFFM) che permette la misurazione di segnali cellulari nel cuore intatto. La tecnica si basa sulla combinazione di un cuore perfuso Langendorff e fibre ottiche per registrare segnali fluorescenti. LFFM ha varie applicazioni nel campo della fisiologia cardiovascolare per studiare cuore in condizioni normali e patologiche. variabili cardiaci multipli possono essere monitorati utilizzando indicatori fluorescenti differenti. Questi includono citosolico [Ca 2+], intra-sarcoplasmatico reticolo [Ca 2+] e potenziali di membrana. Le sonde fluorescenti esogeni sono eccitati e la fluorescenza emessa rilevati con tre diverse disposizioni della tecnica LFFM epifluorescenzas presentato in questo articolo. Le differenze centrali tra queste tecniche sono il tipo di sorgente luminosa utilizzata per l'eccitazione e il modo in cui la luce di eccitazione viene modulata. Il LFFM pulsata (PLFFM) utilizza impulsi di luce laser, mentre onda continua LFFM (CLFFM) utilizza la luce laser continuo per l'eccitazione. Infine, diodi emettitori di luce (LED) sono stati usati come sorgente luminosa terzi. Questa disposizione non coerenti è chiamata ad impulsi microscopia a fluorescenza a LED (PLEDFM).
Introduction
Il cuore è l'organo centrale del sistema cardiovascolare. Contrazione del cuore viene avviata da un aumento intracellulare [Ca 2+]. Il rapporto tra eccitabilità elettrica e cambiamenti in intracellulare Ca 2+ stampa è stato storicamente studiato in cellule dissociate enzimaticamente 1, 2. Tuttavia, le cellule cardiache sono elettricamente, metabolicamente e meccanicamente accoppiati 3, 4. Quando isolato, i miociti non sono solo fisicamente disaccoppiati, ma miociti da diversi strati si mescolano durante la dissociazione 5. Inoltre, nonostante gli enormi vantaggi emersi dallo studio delle cellule isolate in condizioni clamp tensione, 6, 7, 8, la natura intrinseca del cuore come un sincizio alwa elettricoys pone la questione di come funzionalmente differenti sono dissociate cellule da quelli presenti nel tessuto 3.
In questo manoscritto, descriviamo i progressi conseguiti nella conoscenza della fisiologia cardiaca mediante l'uso di tecniche di microscopia locale campo fluorescenza (LFFM) nel cuore intatto. LFFM utilizza indicatori fluorescenti per misurare più variabili fisiologiche come citosolico Ca 2+, intra sarcoplasmatico reticolo (SR) Ca 2+ e potenziale di membrana. Queste misure possono essere ottenuti simultaneamente e in collaborazione con la pressione del ventricolo 9, 10, elettrocardiogrammi 9, potenziali d'azione elettrici (AP), le registrazioni corrente ionica e flash fotolisi di composti in gabbia 4, 11. Inoltre, queste misurazioni possono essere ottenute stimolazione cuore intatto a frequenze superiori closer per i tassi fisiologici. Sebbene numerosi articoli 9, 11, 12, 13, 14 sono stati pubblicati dal nostro gruppo utilizzando tecniche LFFM, la presunzione di complessità tecniche associate con questa tecnica ha impedito l'uso massiccio nello studio ex vivo fenomeni fisiologici nel cuore e altri organi.
La tecnica LFFM (Figura 1) è basata su misurazioni epifluorescenza ottenuti utilizzando una fibra ottica multimodale in contatto con il tessuto. Come qualsiasi tecnica di imaging contatto di fluorescenza, la risoluzione ottica dipende dal diametro e l'apertura numerica (NA) della fibra. Un diametro maggiore NA e più piccola della fibra aumenta la risoluzione spaziale delle misurazioni. AN e diametri delle fibre può variare da 0.22 a 0,66 e da 50 micron a 1 mm rispettivamente. Incordonatura la NA migliorerà il rapporto segnale-rumore (S / N) accettando fotoni che arrivano da un angolo solido più ampio. Per agire come dispositivo epifluorescenza, il fascio di luce viene focalizzato nella fibra ottica con una lente asferica o un obiettivo epifluorescenza dove la NA della lente e la partita fibra. Questa corrispondenza massimizza il trasferimento di energia per l'eccitazione e per raccogliere indietro i fotoni emessi dal fluoroforo.
Per eccitare gli indicatori fluorescenti esogeni caricati nel tessuto, diverse fonti di luce e modalità di illuminazione possono essere utilizzati. I nostri studi pionieristici che utilizzano il pulsato campo locale microscopia a fluorescenza 3, 12 (PLFFM) impiegato un laser a basso costo picosecondi (Figura 1a, PLFFM). Questo tipo di sorgente luminosa ha l'enorme vantaggio di eccitare una grande frazione di molecole fluoroforo sotto l'area di illuminazione, senza candeggio sostanzialmente il colorante a causaper il breve impulso durate 12. Inoltre, l'uso di impulsi ultracorti ha permesso di valutare la durata della fluorescenza del colorante 12. La durata della fluorescenza è una proprietà che può essere utilizzato per quantificare la frazione di molecole di colorante legate al Ca 2+. Purtroppo, il jitter temporale degli impulsi e le variazioni di ampiezza di impulso a impulso limitare l'applicazione di questa strategia sperimentale ai casi in cui la variazione di fluorescenza prodotta dal legame al colorante legante è grande.
Continuous Wave (CW) laser sono di solito usati come fonte di illuminazione principale di LFFM (figura 1b, CLFFM). Il raggio laser può illuminare continuamente il tessuto oppure può essere ferroelectrically modulata. La modulazione ferroelettrico del fascio permette la generazione di impulsi di luce microsecondi. Questa modulazione può essere controllato da hardware esterno. Questa procedura non solo riduce drasticamente tha jitter temporale degli impulsi di luce, ma permette anche fasci di diverse lunghezze d'onda di miscelazione. La miscelazione di fasci avviene multiplazione raggi di laser diversi. Di conseguenza, diversi coloranti aventi differenti proprietà spettrali possono essere eccitati per effettuare misurazioni di una serie di variabili fisiologiche, per esempio, Rhod-2 per citosolico Ca 2+, MagFluo4 per intra-SR Ca 2+ e di-8-ANEPPS per potenziale di membrana.
Sebbene laser presentano diversi vantaggi come la sorgente luminosa in LFFM, altri tipi di sorgenti di luce possono essere utilizzati compresi diodi emettitori di luce (LED). In questo caso, la sorgente di luce di eccitazione costituito da un LED InGaN (Figura 1c, PLEDFM). In LED, i fotoni vengono emessi spontaneamente quando elettroni dalla banda di conduzione si ricombinano con fori nella banda di valenza. La differenza con laser a stato solido è che l'emissione non viene stimolato da altri fotoni. Ciò si traduce in un fascio non coerente euna emissione spettrale più ampia per i LED.
Diversi tipi di LED ad alta potenza possono essere utilizzati. Per le registrazioni AP utilizzando Di-8-ANEPPS e Ca 2+ transitori registrati utilizzando Fluo-4 o Mag-Fluo-4, abbiamo utilizzato un LED che ha un'emissione tipica picco a 485 nm (blu) e mezzo larghezza di 20 nm (Figura 1d). Per Ca 2+ transitori registrati con Rhod-2, il LED ha una emissione tipica picco a 540 nm (verde) e mezza la larghezza di 35 nm (Figura 1d). LED emettono in una lunghezza d'onda di banda e quindi richiedono filtri per restringere la propria emissione spettrale. Inoltre, la luce pulsata può essere generata ad una velocità di 1,6 kHz con durata di 20 ms. I LED sono state pulsate con un transistore ad effetto di campo MOSFET di potenza veloce. registrazioni simultanee con differenti indicatori possono essere eseguite da time-multiplexing i LED. Sfortunatamente, la luce emessa dai LED è più difficile mettere a fuoco su una fibra ottica rispetto ad un fascio laser. Così, il principale svantaggio di noiing LED è che i loro profili di emissione hanno spostamenti angolari (± 15 °) rispetto all'asse principale e un ottica ausiliaria devono essere utilizzati per correggerlo.
In tutte le configurazioni ottiche precedentemente descritte, la luce di eccitazione viene riflessa con l'aiuto di uno specchio dicroico. Il fascio viene successivamente focalizzata da una lente asferica e un obiettivo microscopio su una fibra ottica multimodale che è posizionato sul tessuto. Come in qualsiasi disposizione epifluorescenza, lo specchio dicroico serve anche per separare l'eccitazione dalla luce emessa. Lo spettro della luce emessa viaggia indietro attraverso un filtro barriera per rimuovere ogni eccitazione riflessa. Infine, la luce emessa è focalizzato con un obiettivo su un fotorivelatore (Figura 1).
La trasduzione dalla luce a corrente elettrica viene eseguita da fotodiodi a valanga silicio. Questi diodi hanno una risposta veloce e una sensibilità elevata che consente il rilevamento di scarsa luminosità. Ilfotocorrente prodotto dai fotodiodi a valanga può essere amplificato in due modi: un amplificatore di transimpedenza avente un elemento resistivo di retroazione (Figura 1e) o da un integratore per convertire la corrente in una tensione (Figura 1f). Utilizzando il primo approccio, la tensione di uscita è proporzionale alla fotocorrente e la resistenza di feedback. Un tipico esempio di rilevamento resistivo di impulsi laser picosecondi è illustrata nelle figure 2a, 2b e 2c. Pannello 2a illustra l'uscita dell'amplificatore transimpedenza e il pannello 2b mostra un'espansione tempo dell'intervallo indicato con un asterisco (*). Un algoritmo di picco di tracciamento è stato realizzato per rilevare il picco (rosso) e la base (verde) per le risposte fluorescenti 12. La misurazione della fluorescenza di base fornisce informazioni sia della corrente scura del fotodiodo a valanga e le interferenze introdotto da lig ambientHT e accoppiamento elettromagnetico. Una rappresentazione di picchi e basi è mostrato in figura 2c. Questa figura illustra la fluorescenza emessa dal colorante (Rhod-2) legato a Ca 2+ durante il ciclo cardiaco di un cuore che batte pappagallo.
Nel secondo metodo, la tensione di uscita dell'integratore è una funzione della retroazione di corrente e capacitivi (figure 2d, 2e, 2f e). Figura 2f mostra due cicli consecutivi di integrazione: la prima senza illuminazione esterna e la seconda con impulsi luminosi applicati da un LED pulsata. Una descrizione dettagliata è presentato nelle figure 2g e 2h. Questo approccio, sebbene più laboriosa, fornisce una grande S / N per l'assenza di rumore termico nel condensatore di retroazione. Lo strumento comprende una fase di temporizzazione che genera tutto il controllo e multiplazione della luce di eccitazione e comanda l'integrazione headstage e resperiodi et. Questo è di solito eseguita con un circuito di elaborazione del segnale digitale che svolge anche una differenziazione digitale del segnale di uscita integrato calcolando una regressione on-line dei dati. Nel caso di utilizzo di un risposte resistivo, qualsiasi scheda di acquisizione A / D può essere utilizzato.
Infine, la nostra tecnica LFFM è estremamente versatile e può essere adattato per registrare da più di una regione. Aggiunta di un divisore di fascio nel percorso ottico consente di suddividere la luce in due fibre ottiche. Ciascuna fibra ottica può quindi essere posizionato su diverse regioni di un tessuto, in modo indipendente, eccitare ed emissione registrare da sonde fluorescenti esogeni. Questa modifica ci permette di valutare come anatomica differenze regionali influenzano variabili fisiologiche. La figura 3 mostra un divisore di fascio essendo impiegato per dividere la luce di eccitazione CW sono usati in modo tale che due fibre ottiche per misurare transmurale intracellulare elettrico o [Ca 2+] i livelli ingegnoh minore invasività. segnali transmurale possono essere registrati mettendo una fibra sul endocardio e l'altra sullo strato epicardio della parete ventricolare. Pertanto, la tecnica LFFM ha la capacità di misurare l'andamento temporale dei segnali cellulari in diverse regioni e può essere utilizzato per verificare se i cambiamenti regionali verificano in situazioni patologiche.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Questo protocollo e tutto il trattamento i topi è stato approvato dal Institutional Animal Care e Usa Comitato UC Merced (n ° 2008-201). Esperimenti con parrocchetti sono stati condotti nel 1999 secondo le norme generali per uso animale stabilito dalla commissione scientifica dell'Istituto venezuelano per la Ricerca Scientifica (IVIC).
1. Langendorff Set Up Preparazione
- Preparare la soluzione di Tyrode contenente le seguenti concentrazioni di soluto in mM: 140 NaCl, KCl 5,4, 2 CaCl 2, 1 MgCl 2, 0,33 Na 2 HPO 4, 10 glucosio, 10 HEPES. Regolare il pH della soluzione Tyrode a 7,4 con NaOH e filtrare la soluzione attraverso un filtro di 0,22 micron.
- Caricare la soluzione Tyrode nei 60 ml siringhe e tutti i tubi del Langendorff orizzontale set-up 11, 12 illustrati nella figura 4. Assicurati di eliminare tutte le bolle d'aria.
- Collegare tubazione di plastica ad un serbatoio di O 2.
- Aggiungere un adattatore Tee plastica per abbassare un tubo 5 "nella soluzione Tyrode in 60 mL siringa.
- Attaccare una pietra dell'aria plastica alla fine del tubo 5 "così O 2 si bolla fuori nella soluzione Tyrode.
- Collocare una sutura chirurgica non assorbibile intorno un ago usato come cannula. L'ago è accoppiato al collettore (vedi Figura 4) che permette retro-perfusione con soluzioni diverse. Infine, l'aorta del cuore sarà incannulata nell'ago.
2. Preparazione degli animali e di cuore Dissection
- Pesare e iniettare il mouse con eparina (es. Mouse di peso 20 g, iniettare con 20 unità o 200 mL) 15 minuti prima eutanasia da dislocazione cervicale. Anestetizzare parrocchetti secondo to le guide uso animale del vostro protocollo IACUC e poi procedere con la dislocazione cervicale.
NOTA: utilizzare 8 settimane di età topi o 20 g di parrocchetti. - Rimuovere il cuore dalla cavità toracica dopo euthanization. Estrarre cuori parakeet esattamente nello stesso modo descritto per i topi.
- Pulire il petto del mouse con etanolo.
- Utilizzando forbici dissezione, fare un'incisione nel basso addome e poi tagliare i lati verso il collo.
- Tirare indietro il tessuto tagliato e pin verso il basso.
- Tagliare il diaframma. Fare attenzione quando si taglia il diaframma per evitare di danneggiare il cuore.
- Rimuovere i polmoni e il tessuto circostante.
- Utilizzare le pinzette per raccogliere il cuore senza schiacciarla. Tagliare l'aorta a lungo possibile.
- Trasportare il cuore su una piccola barca pesare con circa 1 mL di soluzione Tyrode.
- Utilizzando una sutura chirurgica non riassorbibile, legare l'aorta sopra l'apparato Langendorff orizzontale tramite unago. Legare l'aorta cuore con l'ausilio di due pinzette sottili. Iniziare retro-perfusione aprendo la valvola posta in serie con le siringhe 60 ml contenente soluzione Tyrode.
- Lasciare che il cuore si stabilizzi per 10 min. Utilizzare questo tempo per pulire il sangue e il tessuto adiposo che circonda il cuore prima di caricare il colorante. Estrarre il tessuto adiposo vicino alla base del cuore con le pinzette e tagliato con piccole forbici dissezione. Essere sicuri di fare questo sotto la vista di un microscopio da dissezione.
3. Ca citosolico 2+ Misure: Preparing Dye Rhod-02:00
- Aggiungere 20 ml di Pluronic 20% (un tensioattivo non ionico) in DMSO ad una speciale fiala di plastica confezionato fornito dal produttore tintura contenente 50 ug del colorante.
- Mescolare pipettando su e giù, evitando le bolle.
- Trasferire il DMSO miscelato con il tensioattivo non ionico e il colorante dalla speciale fiala di plastica confezionato in una fiala di vetro chiaro. Aggiungere 1 ml di Tyrode Soluzione al flaconcino di vetro trasparente.
- Con ultrasuoni per 15-20 minuti in un bagno sonicatore.
- Profumato il colorante usando pompe peristaltiche per 30 minuti a temperatura ambiente.
- Posizionare il colorante nella camera di tintura.
- Utilizzare un morsetto meccanico per comprimere tutte le altre linee di tubi collegati al collettore. La pinza è disposto sopra il collettore. Questo impedirà qualsiasi riflusso nel tubo collegato ai 60 siringhe ml.
- Accendere la pompa peristaltica perfusione per iniziare circola il colorante. Immediatamente chiudere la valvola a 3 vie al di sotto del 60 mL siringa.
- Posizionare un piccolo tubo che è collegato all'aspirazione della pompa peristaltica accanto al cuore per ricircolare il colorante che è stato perfuso nel cuore.
4. Intra-SR Ca 2+ Misure: Preparing Dye Mag-Fluo4AM
- Preparare Mag-Fluo4AM nello stesso modo come Rhod-2 del mattino. Fare riferimento alla Sezione 3 per le istruzioni passo-saggio.
- after caricare il colorante, aprire la valvola posta in serie con le siringhe 60 ml contenente soluzione Tyrode iniziare retro-perfusione. Assicurarsi di rimuovere la fascetta sopra il collettore.
- Aggiungere la soluzione Tyrode alla camera orizzontale e riscaldare a 37 ° C.
- Retro-nei profumi con la soluzione Tyrode per 45 minuti per rimuovere il colorante citosolico.
5. potenziale di membrana Misure: Preparing Dye Di-8-ANEPPS
- Aggiungere 5 ml di 99% di etanolo al flaconcino di colorante che contiene 5 mg del colorante.
- Aliquota 10 ml in 500 singoli 1 fiale di plastica ml con una pipetta ripetitore.
- Desiccate nel vuoto velocità e conservare a -20 ° C.
- Aggiungere 20 ml di 20% Pluronic in DMSO ad una fiala di plastica con 10 ug del colorante essiccato.
- Mescolare pipettando su e giù, evitando le bolle.
- Trasferire la miscela contenente DMSO con Pluronic e colorante dalla fiala di plastica ad un cilindro graduato (10 mL). Aggiungere la soluzione Tyrode ad un vo finalelume di 5 ml.
- Con ultrasuoni per 20-25 minuti in un bagno sonicatore.
- Profumato nel cuore per 30 minuti utilizzando pompe peristaltiche. Fare riferimento alle istruzioni graduali nella Sezione 3.5.
6. La registrazione di segnali epicardici
- Dopo aver caricato il colorante, retro-defluire in cuore con soluzione Tyrode rimuovendo la pinza sopra il collettore. Aprire la valvola posta in serie al ml siringa da 60 contenente soluzione Tyrode. soluzione Tyrode Retro-nei profumi per 10 minuti per stabilizzare il cuore.
- Riempire la camera orizzontale con soluzione Tyrode e accendere l'unità Peltier per portare la temperatura del bagno a 37 ° C.
- Posizionare la fibra ottica sulla superficie del cuore.
- Posizionare la fibra ottica all'interno di una pipetta 2 ml e quindi collegare la pipetta ad un micromanipolatore.
- Utilizzare il micromanipolatore per premere leggermente la fibra ottica contro la superficie del LV.
- Esternamente ritmo il heaRT con uno stimolatore controllato da un generatore di onde.
- Programmare il generatore di onde fornire un impulso quadrato con una larghezza di 1 ms.
- Impostare lo stimolatore essere sincronizzato esternamente e collegare l'ingresso esterno al generatore d'onda.
- Per ogni uscita dello stimolatore, collegare un filo con un ago da agopuntura saldato alla fine.
- Posizionare entrambi aghi nel vertice del cuore circa 3 mm l'uno dall'altro.
- Solo dopo gli aghi vengono inseriti nel tessuto, attivare l'uscita dello stimolatore per evitare scosse elettriche.
- Nel software di acquisizione, regolare frequenza di acquisizione a 10 kHz.
7. La registrazione di segnali endocardici
- Fare riferimento al punto 6.1 e 6.2 per stabilizzare il cuore dopo aver caricato il colorante.
- Utilizzando un punto 23Ga tagliente delle dimensioni della fibra ottica, fare un piccolo foro nella superficie del cuore nel LV vicino al setto. <li> Inserire un adattatore chirurgia sclerotomie intravitreale per aiutare nel posizionamento della prima fibra ottica nella endocardio con un micromanipolatore.
- Esternamente stimolare il cuore. Fare riferimento al punto 6.4.
- Nel software di acquisizione, regolare frequenza di acquisizione a 10 kHz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
AP e Ca 2+ transitori in endocardio ed epicardio
Per confrontare i segnali attraverso la parete ventricolare, una fibra ottica è posizionata nella endocardio e l'altro nel epicardio. Confrontando la morfologia di un AP registrata dall'endocardio con una dal epicardio è il modo migliore per valutare la funzione transmurale. La parete ventricolare è altamente eterogenea e pertanto, la morfologia degli AP sono molto diversi in queste due regioni. È ben noto che l'endocardio ha meno I rispetto all'epicardio 17, 18, 19. Il meno che per fa la ripolarizzazione della fase 1 più lento nella endocardio 18, 20. Figura 5b shOWS una registrazione tipica ottica del AP dal endocardio e all'epicardio. Per eseguire queste registrazioni, cuori topi sono stati caricati con il colorante potenziometrica di-8-ANEPPs e fluorescenza è stata misurata con la tecnica CLFFM. La morfologia del AP otticamente registrata, soprattutto nella fase 1, mostra un corso lento tempo per l'endocardio (Operazione Durata Potential (APD) 30 è 8.01 ms ± 2.5) rispetto al all'epicardio (3,4 ms ± 0,59) (Figura 5b). In generale, l'APD può essere descritto come il tempo necessario al AP di ri-polarizzare una certa percentuale di cui 30, 70 o 90 (figura 5a). Queste tracce sono state normalizzate e spostata avere fase sovrapposizione 0. Quando si confrontano i APD (figura 5c), si vede che l'endocardio ed epicardio sono significativamente diversi durante la fase 1. Anche se questi punti di accesso sono segnali di fluorescenza, possono essere calibrati per una determinata potenziale di membrana misurando contemporaneamente la AP con unmicroelettrodo tagliente pieno di 3 M KCl 13.
Oltre al potenziale di membrana, indicatori fluorescenti esogeni possono essere utilizzati per monitorare intracellulare [Ca 2+]. Di solito, usiamo Rhod-02:00 per misurare intracellulare di Ca 2+ transitori a causa della sua elevata gamma dinamica e la sua capacità di rimanere nel citoplasma anche a temperature fisiologiche. La figura 6b mostra una registrazione tipico delle intracellulare Ca 2 + transitori nello strato endocardio ed epicardio. Questi risultati sono stati parzialmente pubblicato 15. Al fine di confrontare le differenze regionali nel intracellulare livelli [ca] 2+, la cinetica dei Ca 2+ transitori sono stati valutati (Figura 6a). Nel complesso, l'analisi dei Ca 2+ cinetiche transitori (Figura 6c) mostra che i transienti di Ca 2+ dal endocardio avevano significativamente cinetica più lenti rispetto a quelli registrati dal epicardio.
Ca 2+ dinamiche nel lume SR
Nel cuore, l'ascesa e la caduta di intracellulare [Ca 2+] i livelli sono fondamentali nel definire molte variabili fisiologiche tra cui la pressione, la contrattilità e del potenziale d'azione della durata (APD). La sezione precedente ha descritto la nostra capacità di misurare i citosolico Ca 2+ transitori. Il Ca 2+ rilasciato dalla SR è in gran parte responsabile per l'aumento in intracellulare Ca citosolico 2 +. Così, per ogni incremento del Ca intracellulare 2+ c'è un Ca 2+ esaurimento nella SR. Tuttavia, Ca citosolico 2 + transitori non sono dovuti esclusivamente al rilascio SR Ca 2+, ma si trovano anche Ca 2+ venire nella cellula attraverso la membrana plasmatica. Il nostro laboratorio16 è stato in grado di valutare il SR contenuto di Ca 2+ mediante l'uso di un colorante fluorescente, Mag-Fluo-04:00. Anche se questo colorante viene de-esterificato nel mioplasma e SR, i miociti possibile estrudere la frazione citosolica. Questo estrusione colorante può essere promossa semplicemente aumentando la temperatura a 37 ° C. A questa temperatura, il colorante citosolica viene rimosso mediante ATP-binding cassette come proteina di membrana. Fortunatamente, questa proteina non è presente nella membrana SR. Pertanto, dopo aver aumentato la temperatura a 37 ° C, la fluorescenza registrata con la tecnica PLFFM è principalmente una conseguenza del Ca 2+ legame al colorante all'interno della SR. Per testare la specificità della misurazione organello, un impulso caffeina è stata applicata per stimolare Ca 2+ distribuito da RyR. È possibile osservare che il segnale è infatti risultato della deplezione SR (Figura 7). La caffeina indotto SR Ca 2+ rilascio (Figura 7a) Produrre sia, una diminuzione del livello di diastolica Mag-Fluo-4 fluorescenza (92 ± 0,05% (N = 4, P = 0,012)) e una diminuzione dell'ampiezza di Ca 2+ transienti (51 ± 0,21% (N = 4, p = 0.003)) 16. Intra tracce SR registrati prima e dopo lo stimolo caffeina sono rappresentati basso nella Figura 7b-7d. Col passare del tempo dallo stimolo caffeina, ampiezza della deplezione SR è più piccolo. Figura 7e illustra che la deplezione SR non solo induce una diminuzione dell'ampiezza del segnale Ca 2+, ma anche rallenta il processo di rilascio SR Ca 2+. La traccia di fluorescenza in Figura 7a è stato precedentemente pubblicato 15.
Pulsed LED: Il potenziale d'azione
Nella Figura 5 abbiamo dimostrato che Di-8-ANEPPS può segnalare le modifichenel potenziale di membrana quando è eccitato a 532 nm. In questa condizione di eccitazione, vi è una diminuzione della fluorescenza emessa a lunghezze d'onda superiori a 590 nm. È interessante notare che, quando questo colorante potenziometrica è eccitata vicino alla sua massima lunghezza d'onda di eccitazione (~ 476 nm), l'emissione di fluorescenza degli spostamenti tingere a lunghezze d'onda inferiori quando il depolarizza membrana. Di conseguenza, questo spostamento spettrale ci permette di registrare la fluorescenza emessa a due lunghezze d'onda differenti. Questa struttura spettrale di Di-8-ANEPPS permette razionamento della fluorescenza emessa registrato a due diverse lunghezze d'onda, una caratteristica che è solitamente di grande valore perché la registrazione calcolata finale sarà indipendente dalla concentrazione di colorante nella membrana. Al fine di trarre il massimo vantaggio dalla spostamento spettrale Di-8-ANEPPS, abbiamo usato LED pulsati come fonte luminosa. Abbiamo utilizzato la luce blu pulsata per eccitare il fluoroforo. Eccitazione è stata eseguita a 485 nm, vicino alla lunghezza d'onda di picco di assorbimento di Di-8-ANEPPS (~ 476 nm). Acquisizione in due diverse bande spettroscopiche emissione consente la formazione di rapporto e la capacità di aumentare S / N e respingere il rumore di modo comune come la luce ambientale e artefatti da movimento a contrarre cuori in cui non è stato utilizzato il disaccoppiante blebbistatin meccanica. Questa situazione è molto importante per condizioni sperimentali in cui devono essere misurati simultaneamente sia l'attività meccanica del cuore e la cinetica di Ca 2+ transitori.
Il diagramma temporale del PLEDFM è illustrato nella Figura 8a. Il diagramma include la logica di controllo per l'integrazione e reset del headstage fotorivelazione, la temporizzazione on-off del LED e la conversione analogico-digitale. Durante il periodo di tempo di un AP, la fluorescenza rilevata nella banda di lunghezze d'onda verde mostra un aumento di intensità mentre la fluorescenza rilevata nella banda rossa diminuisce. Figura 8b mostrache la variazione del segnale di fluorescenza prodotta dalla depolarizzazione della membrana si muove in direzioni diverse. Tuttavia, l'artefatto di movimento prodotto dalla contrazione del cuore è sempre orientato nella stessa direzione, indipendentemente dalla lunghezza d'onda di emissione. Come spiegato in precedenza, i dati di entrambi i canali (verde e rosso) devono essere-software condizionata prima di calcolare il rapporto. Il condizionamento comprende offset e guadagno correzioni. La selezione delle correzioni livello offset e di guadagno non è automatico. L'utente del software deve selezionare le variabili per condizionare le tracce prima del rapporto. Il rapporto risultante pannello 8b (figura 8) mostra che l'artefatto introdotto dal movimento miocardica è annullata.
La variazione relativa di di-8-ANEPPS fluorescenza durante l'AP è generalmente molto piccola (~ 8% per 100 mV). Questa di-8-ANEPPS cambiamento di fluorescenza è molto più piccola di quella prodotta dal Ca 2+ binding per Rhod-2 (<200%). Pertanto, al fine di aumentare il rapporto segnale-rumore di di-8-ANEPPS, registrazioni multiple possono essere mediate.
Pulsed LED: registrazioni simultanee di Ca 2+ e potenziale di membrana
L'ultimo gol di utilizzare questo approccio sperimentale consiste nello svolgimento di registrazioni simultanee di Ca 2+ transitori e punti di accesso. registrazioni simultanea di più segnali fisiologici richiedono risolvere difficoltà tecniche relative a diversi aspetti del sistema tra cui: accoppiare la sorgente luminosa con la fibra ottica, corrispondenti allo spettro di assorbimento del colorante con l'emissione dei LED, progettazione analogica e circuito elettronico digitale generare la temporizzazione ed acquisizione nonché lo sviluppo di software veloce per analizzare i dati on-line.
Lo sor studio, la selezione di coloranti dipendeva loro caratteristiche spettrali. Flourophores utilizzati per misurare i segnali diversi devono assorbire in diverse bande spettrali. Questa condizione è essenziale distinguere tra sorgenti di segnale. Ogni volta che un LED avente una lunghezza d'onda differente viene utilizzato per eccitare il tessuto, la fluorescenza rilevato corrisponde al segnale correlato con il colorante che assorbe in quella lunghezza d'onda. In questo modo, emissione di fluorescenza provenienti da diversi coloranti, ma nella stessa banda di lunghezze d'onda, si distingue per il momento in cui ognuno è eccitato.
Tuttavia, il crosstalk tra spettri di colorante non può essere completamente evitata. Questo perché le caratteristiche di assorbimento spettrale dei coloranti rendono assorbono la luce con lunghezze d'onda lontano dal loro picco di assorbimento. Nei nostri esperimenti, crosstalk stato prodotto in due modi: (1) Rhod-2 essendo eccitato dal LED blu, l'aggiunta di un segnale di 2+ Ca al channe rossal traccia AP, e (2) Di-8-ANEPPS essere eccitata dal LED verde, che appare sul Ca 2+ segnale transitorio (figura 9f). Questo crosstalk può essere corretto in linea, come illustrato in figura 9. La procedura funziona perché il segnale di intrusione è una piccola percentuale del segnale che deve essere misurato. Infine, utilizzando questo tipo di elaborazione algebrica del fluorecence dai coloranti ci ha permesso di separare AP (Figura 9d) formano Ca 2+ transitori (Figura 9h). Una descrizione dettagliata di questa elaborazione è descritto nella figura legenda. È importante notare che tutti gli esperimenti sono stati eseguiti LED pulsata di 28 ° C.
Figura 1: Il campo locale microscopia a fluorescenza (LFFM). Il LFFM consiste in un accordo epifluorescenzautilizzando una fibra ottica multimodale che è in contatto con il tessuto per registrare la fluorescenza emessa da coloranti esogeni perfusi nel cuore. Il LFFM set-up può utilizzare tre diverse sorgenti luminose compreso (a) PLFFM, dove la luce di eccitazione è provvisto da un pico impulsi laser Nd-Yag; (B) CLFFM, dove vengono usati laser ad onda continua e impulsi luminosi vengono generati da un modulatore ferroelettrico permettendo multiplexing di laser con differenti lunghezze d'onda; e (c) PLEDFM, dove i LED hanno spettri di emissione più ampi con emissioni di picco (d) 485 nm e 540 nm per LED blu e verde, rispettivamente, sono pulsava elettronicamente. Quando si utilizzano sorgenti laser, il fascio viene defocalizzato da un espansore del fascio. Infine, specchi dicroici e lenti degli obbiettivi si concentrano il fascio sulla estremità distale della fibra ottica di che è leggermente premuto contro il tessuto. La luce emessa viaggia attraverso la stessa fibra ottica, specchio dicroico, emifiltri fissione, e si concentra su un fotodiodo a valanga in cui i fotoni vengono convertiti in una corrente elettrica. La corrente può essere amplificato da due metodi (e) amplificatore a transimpedenza, in cui la tensione di uscita risultante è proporzionale alla fotocorrente e la resistenza di feedback; (F) integratore, in cui la tensione di uscita è una funzione del feedback corrente capacitiva. Infine, il segnale viene acquisito da un convertitore A / D e visualizzato su un computer. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2: resistivo e capacitivo conversione. (A) è mostrato un tipico esempio di rilevamento resistivo di impulsi laser picosecondi. L'asterisco (b)mostra un intervallo esteso di tempo, in cui è stato implementato un algoritmo di inseguimento di picco per rilevare il picco (rosso) e la base (verde). (C) Una rappresentazione di tracce calcolate da picchi e basi registrazioni viene mostrato per Rhod-2 risposte fluorescenti in un cuore che batte parrocchetto ritmo esternamente a 7 Hz e temperatura del bagno impostati a 37 ° C. d per h) La fotocorrente convertito da un integratore utilizzando risposte capacitivo. Registrazioni tipici di intatta cuore del mouse Ca 2+ transitori sono presenti in due diverse scale temporali (D ed E). (F) sono presenti L'integrazione di due cicli consecutivi con e senza illuminazione a LED. L'integrale dei segnale aumenta linearmente con l'fotocorrente carica il condensatore di retroazione. La pendenza della dipendente dal tempo integrale (tan (Ɵ)) è proporzionale al numero di fotoni che incidono giunzione valanga oltre alla ricombinazione elettrone-lacuna indotta dal pattività hononic quando il diodo valanga non rileva alcun fotoni. I segnali digitali di controllo integrazione headstage e ripristinare periodi sono come da tabella g. I segnali rilevati durante il periodo di non-illuminazione (DC) e LED illuminante (F) sono mostrati in Pannello h. La sottrazione di F e DC fornisce la misura reale di fluorescenza rilevato Ca 2+ transitori da topi stimolati cuori esternamente 9 Hz a 37 ° C (h). Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3: LFFM per dell'epicardio e misure endocardio. Il CLFFM set-up è stato usato per misurare la fluorescenza emessa da coloranti fluorescenti esogeni presenti in un epicardiod strati endocardio. L'aggiunta di un divisore di fascio facilitato la registrazione di diverse variabili fisiologiche nel epicardio ed endocardio. Due fibre ottiche sono stati usati con i singoli headstages per rilevare dalla epicardio ed endocardio. Una piccola incisione circolare è stata fatta nel ventricolo e una fibra ottica è stato infilato attraverso registrare dal endocardio. Questo allestimento utilizzato un convertitore corrente-tensione con feedback resistivo. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4: camera orizzontale con controllo della temperatura. Un diagramma che mostra il set-up Langendorff dove i cuori sono mantenuti intatti funzionale per ore. Il cuore è legato ad un ago attraverso il quale tutte le soluzioni e colorantisono retro-perfusi nel cuore attraverso le coronarie si diramano l'aorta. La camera è posizionato sopra una unità Peltier per mantenere la temperatura del bagno, che viene letto da un sensore di temperatura collegato ad un voltmetro. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 5: transmurale del potenziale d'azione Misure nei cuori intatti. (A) Azione durata del potenziale (APD) viene valutato come il tempo necessario per completare il 30%, 70% o 90% della ripolarizzazione AP. (B) Di-8-ANEPPS fluorescenza dal epicardio (nero) e endocardio (grigio) visualizza AP differenze morfologiche ripolarizzazione tra i due strati della parete ventricolare. (C) Dopo aver valutato tegli APD 30, 70, e 90 nella endocardio e epicardio, i risultati hanno mostrato uniche differenze significative si sono verificati in APD 30 (8 ± 2,5 ms endocardium vs 3 ± 0,6 ms epicardio). Cuori sono stati stimolati a 6 Hz e temperatura impostata a 37 ° C. I dati sono media ± SEM di 5 cuori. * P <0,05. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 6: transmurale Ca 2+ Misure transitorie nei cuori intatti. (A) I parametri di Ca 2+ cinetica transitori misurati sono: il tempo necessario per raggiungere il massimo, il tempo di picco (TP); il tempo necessario per passare dal 10% al 90% di aumento, tempo di salita (RT); il tempo necessario per passare dal 10% al 90% del decadimento, tempo di decadimento (DT); e iltempo necessario per completare il 50% del transitorio, la metà della durata (HD). (B) fluorescenza emessa da Rhod 2 dopo l'eccitazione con un verde CW laser show epicardio (nero) e endocardio (grigio) Ca 2+ transitori con differenze di relax. c) Ca 2+ transitori dal endocardio aveva cinetica significativamente più lenti in RT, TP, HD, e DT di quelli registrati dal epicardio. Cuori sono stati stimolati a 6 Hz e temperatura impostata a 37 ° C. I dati sono media ± SEM di 5 cuori. * P <0,05. Modificato da Mattiazzi et al. 15. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 7: Intra SR Ca 2+ Misure nei cuori intatti.(A) La fluorescenza emessa dalla tintura Mag-Fluo-4 gocce nel tempo, un decremento nella intra SR concentrazione Ca 2+. (B) La vista espansa della riduzione Mag-Fluo 4 fluorescenza indica Ca 2+ esaurimento indotta dal rilascio di Ca 2+ dal SR. (C) una visione più ampia della riduzione di ampiezza transitoria da Mag-Fluo 4 fluorescenza che rappresenta Ca 2+ rilascio modificato mediante perfusione cuori con 20 mM caffeina. (D) Dopo una lunga applicazione di caffeina, una diminuzione sia del livello diastolica Mag-Fluo-4 fluorescenza e dell'ampiezza di Ca 2+ transitori [fino a 92 ± 0,05% (N = 4, p = 0,012) e si osserva 51 ± 0,21% (N = 4, P = 0.003) dei valori iniziali rispettivamente],. Come più tempo progredisce dalla caffeina, minore è l'ampiezza della deplezione SR. (E) le tracce normalizzate in bd dimostra che la deplezione SR non solo indurres diminuisce del segnale Ca 2+, ma rallenta anche SR Ca 2+ rifornimento. Cuori sono stati stimolati a 4 Hz e temperatura impostata a 37 ° C. Traccia fluorescenza è da Kornyeyev et al. 16. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 8: Misure Raziometrico di punti di accesso nei cuori intatto con Pulsed LED. (A) Il diagramma temporale compresa l'integrazione e reset headstage, on-off tempi del LED ed una registrazione effettiva è illustrata. (B) Tracce dai due canali hanno diversi valori a riposo e l'offset viene corretto spostando le leve fino a quando ogni AP è preceduta da un valore di riposo. Guadagno di ogni canale è anche adjusTed. Si noti che un grande artefatto movimento appare su entrambi i canali tra le due depolarizzazioni. Dopo il software elabora i segnali ratiometrically, il risultato è un AP senza artefatti notevoli (blu). Cuori sono stati stimolati a 3 Hz e temperatura impostata a 28 ° C. Tutti i record indicati sono una media di 10 tracce. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 9: simultanei Ca 2+ transitori e misure di AP nei cuori intatto con Pulsed LED. Il discorso contaminazione incrociata dei segnali durante la registrazione sia Ca 2+ e AP può essere corretto on-line. Il colorante potenziometrica, di-8-ANEPPS, è eccitato con 20 ms impulsi LED blu (a). I segnali sono split, filtrata con banda rossa e filtri verdi. Questi segnali vengono rilevati da due diversi fotodiodi a valanga indicati come il rosso (b) e canale verde (c). È possibile osservare che entrambi i segnali, rosso e verde, presentano un artefatto movimento evidente che appare come una deflessione verso il basso. Entrambi i segnali, rosso e verde, sono offseted e poi amplificati. I segnali condizionati sono utilizzati per calcolare il rapporto tra loro e il risultato è mostrato in d. È possibile osservare che nel rapporto tra i due segnali (d) i manufatti in movimento sono annullati. Pannello e illustra la sequenza di impulsi logiche che controllano un LED che emette verde utilizzato per eccitare l'indicatore di Ca 2+ Rhod-2. Segnali fluorescenti ottenuti usando questo procedimento sono mostrati in f. Anche se la traccia in f mostra principalmente un aumento del segnale di fluorescenza a causa del Ca 2+ binding per Rhod-2, è possibile osservare una deviazione negativa nella traccia a causa di un segnale fluorescente rilevato da Di-8-ANEPPS quando questo colorante è eccitato con luce verde. Questo problema può essere corretto sottraendo il segnale potenziometrico mostrato in g. Il risultato della sottrazione è mostrato in pannello h dove Ca 2+ segnalare gratuitamente si ottiene una contaminazione AP. Cuori sono stati stimolati a 3 Hz e temperatura impostata a 28 ° C. Tutti i record indicati sono una media di 10 tracce. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Questo documento è centrato nel descrivere le tecniche di campo fluorescenza locali per valutare la funzione dei miociti cardiaci ex vivo. Lo studio di queste cellule in un ambiente accoppiata non solo è più fisiologico, ma è anche molto appropriato per valutare patologie a livello di organo. Gli eventi cellulari sottostanti accoppiamento eccitazione-contrazione (ECC) possono essere valutati a livello organo complesso con l'uso di sonde molecolari che controllano intracellulari Ca 2+ dinamiche (Rhod 2 citosolico Ca 2+, Mag-Fluo4 SR Ca 2+) e attività elettrica (di-8-ANEPPs). Qui, abbiamo presentato tre tecniche LFFM epifluorescenza che sia eccitare e raccogliere l'emissione da indicatori fluorescenti che utilizzano fibre ottiche. Esse variano in base alla sorgente luminosa utilizzata e dal tipo di modulazione della luce. Il PLFFM utilizza un laser che impulsi di luce, CLFFM utilizza la luce laser in continua, mentre LEDFM usa LED che possono anche essere pulsate nella PLEDFM. Tutti questisono presentati in Figura 1 come un insieme, ma può essere costruito con una sola delle tre modalità epifluorescenza. Inoltre, la luce rilevata può essere elaborata in modi diversi. Ad esempio, la Figura 2 illustra due diverse situazioni in cui la fotocorrente può essere integrato o direttamente convertita in tensione mediante un convertitore corrente-tensione. In generale, l'approccio LFFM può essere utilizzato per misurare contemporaneamente più siti anatomici, come visto per la Figura 3.
Il metodo qui presentato per valutare le proprietà cardiache a livello organo intatto è più adeguato per studiare problemi in cui l'accoppiamento tra le cellule è critica nel definire il comportamento del tessuto. L'eterogeneità intrinseca del cuore può produrre diversi AP forme d'onda 13, 21, 22 sulla base dei tessuti specifico da cui ceLLS origine. Pertanto, studi interi organi forniscono la possibilità di valutare la funzione fisiologica locale della cella in diverse strutture anatomiche. Inoltre, abbiamo visto che gli eventi intracellulari, come le scintille e le onde hanno diverse cinetica nelle cellule dissociate rispetto nell'organo intatto 15.
Il Langendorff set-up (figura 4) è critico per il mantenimento cuore in una situazione che è più vicino in vivo. Inoltre, permette l'retroperfusion di droghe e varie sonde molecolari fluorescenti che consentono la misurazione di diverse variabili fisiologiche. Modifica delle sonde fluorescenti esogeni utilizzati, aumentando la dimensione della fibra ottica, o scegliendo una sorgente di luce differente può alterare drasticamente l'applicazione della tecnica. Inoltre, l'unità Peltier sotto la camera orizzontale può facilitare lo studio di Ca 2+ dinamiche a varie temperature. L'aggiunta di accessoriper LFFM quale un divisore del fascio può aumentare il numero di fibre ottiche utilizzate per registrare da diverse regioni nel cuore intatto. Questo è un adattamento molto utile per testare se le differenze regionali verificano in scenari patologici. Figura 3 mostra l'endocardio ed epicardio essere valutato simultaneamente. Inoltre, perfusione il cuore con diversi agonisti ci permette di comprendere come le diverse regioni di tutta la parete del ventricolo sono regolati. La segnalazione elettrica (figura 5) e Ca 2+ cinetica (Figura 6) eterogeneità può essere paragonato al epicardio ed endocardio. Inoltre, più coloranti con diverse lunghezze d'onda di eccitazione e filtri di emissione possono essere utilizzati. Ad esempio, utilizzando Mag-Fluo-4, i livelli di Ca 2+ nel lume del SR possono essere registrati (Figura 7). Variando la dimensione della fibra ottica può anche aumentare la capacità di questo metodo, consentendo la registrazione fluorescenza da una larregione ger.
Questo documento mostra anche che oltre a laser costosi, i LED possono essere utilizzati come fonte di luce di eccitazione nella nostra tecnica. La Figura 8 mostra che questo tipo economico di sorgente di luce può essere utilizzato per misurare ratiometrically AP. La misura raziometrico mostrato in figura 8 è vantaggiosa nella produzione di una registrazione finale senza artefatti sperimentali comprese quelle causate dal movimento. Infine, anche il transitorio di Ca 2+ e AP possono essere otticamente registrati, contemporaneamente, da multiplexing diverse lunghezze d'onda e l'utilizzo di coloranti con lo stesso spettro di emissione. L'elaborazione dei segnali illustrato nella figura 9 è fondamentale nella rimozione di contaminazione interna prodotta dalla sovrapposizione spettri di emissione dei coloranti. Registrazione Ca 2+ transitori e punti di accesso, contemporaneamente, ma come due segnali di uscita indipendenti, è utile nello studio di ECC e Ca 2+ indotta Ca 2+
LFFM è una tecnica con più applicazioni in fisiologia cellulare dei tessuti intatti. Tuttavia, una limitazione importante è che la fluorescenza registrata è una media di emissioni da parte degli indicatori fluorescenti sottostanti della regione locale in cui la fibra ottica è in contatto con il tessuto. Anche quando si utilizzano due fibre ottiche, LFFM non fornisce una distribuzione spaziale subcellulare dei segnali misurati. Mappatura ottica è una tecnica migliore per monitorare le variabili fisiologiche che cambiano nello spazio e nel tempo, come la propagazione delle AP, Ca 2+ transitori, e alternans 23, 24, 25. LFFM è anche in grado di fornire immagini di strutture, come la microscopia confocale e di altre tecniche di mappatura ottica. Tuttavia, l'uso di fibre ottiche rende pratico in recording segnali di fluorescenza locali dalla endocardium o di altre regioni che sono difficili o impossibili da l'accesso in un cuore intatto con un microscopio confocale.
Il confronto tra le variabili fisiologiche ottenute dai cuori intatte e dagli esperimenti miociti isolati è impegnativo. Il più grande vantaggio di utilizzare isolati miociti cardiaci è l'occasione unica per valutare le proprietà biofisiche delle cellule in condizioni di patch clamp. Al contrario, LFFM permette lo studio dei fenomeni fisiologici e patologici in un ambiente più nativo. Ad esempio, nei cuori intatti possiamo valutare le differenze transmurale 15, frequenza cardiaca dipendenza di AP e Ca 2+ al fisiologico gamme 13 che sono irraggiungibili in cellule isolate. Inoltre, si possono studiare gli effetti di un insulto ischemico sulla funzione del cuore intatto 9, 10. Tutto il cuore exesperi- permettono anche di valutare l'interazione tra altri tipi di cellule e miociti 11.
LFFM permette la visualizzazione dei segnali cellulari a livello del cuore intatto in cui le cellule hanno accoppiamento fisiologico. LFFM consente lo studio dell'attività intracellulare mentre le cellule sono ancora nell'organo intatto. In combinazione con coloranti fluorescenti e epiluminescenza, LFFM può monitorare due principali proprietà cardiaci: Ca 2+ dinamica e l'attività elettrica.
Infine, il metodo qui presentato può avere molteplici applicazioni nello studio di ECC. E 'uno strumento che rivela come i segnali supramolecolare sono interessati in situazioni patologiche, come aritmie 16 e ischemia 9, 15. Questa tecnica è un must per studiare queste patologie poiché possono essere comprese solo a livello di organo intatto.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Ringraziamo il Dott Alicia Mattiazzi per la discussione critica del lavoro presentato. Questo lavoro è stato sostenuto da una sovvenzione da NIH (R01 HL-084.487) per ALE.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium chloride | Sigma | 7647-14-5 | |
| D-(+)-glucose | Sigma | 50-99-7 | |
| Potassium chloride | Sigma | 7447-40-7 | |
| HEPES | Sigma | 7365-45-9 | |
| Sodium phosphate | Sigma | 10049-21-5 | |
| Calcium chloride solution | Sigma | 10043-52-4 | |
| Magnesium chloride solution | Sigma | 7786-30-3 | |
| Sodium hyrdoxide | Sigma | S-8045 | |
| 0.2 μm nylon membrane filter | Whatman | 7402-004 | |
| Manifold MPP | Warner | 64-0216 | |
| 21G1.5 Precision glide needle | B-D | 305167 | |
| Black Braided silk string (non-absorbable surgical suture) | AllMech Tech | LOOK-SP105 | |
| Heparin sodium injection 1000USP/mL | AllMech Tech | NDC63323-540-11 | |
| DMSO D8779 | Sigma | 67-68-5 | |
| Blebbistatin | Sigma | 856925-71-8 | |
| Pluronic F-127 20% solution | Biotium | 59004 | |
| Materflex C/L peristaltic pump | Cole-Parmer | 77122-26 | |
| Isostim stimulator | World Precision Instruments | A320RC | |
| Waveform generator | Teledyne Lecroy | WaveStation 2012 | |
| Ultrasonic cleaner FS20 | Fisher Scientific | 1533530 | |
| Tygon tubing ID:1/32" OD:3/32" Wall 1/32" | Component Supply | TET-031A | |
| Tygon tubing ID:3/32" OD:5/32" Wall 1/32" | Component Supply | TET-094A | |
| Adapter luer lock to 3-way valve | Cole-Parmer | EW-31200-80 | |
| Tee adapters and plastic fittings | Cole-Parmer | 6365-90 | |
| Plastic clamp | WaterZoo | 2465 | |
| Peltier | TE Technology | TE-127-2.0-2.5 | |
| Rhod-2AM | ThermoFisher Scientific | R1245MP | |
| Di-8-ANEPPS | ThermoFisher Scientific | D3167 | |
| Mag-Fluo-4AM | ThermoFisher Scientific | M14206 | |
| Acupunture needles | LHASA | TC1.20x13 | |
| 60 mL BD syringe with luer-lok | Fisher Scientific | 14-820-11 | |
| LabView | National Instruments | ||
| Speed vacuum Eppendorf Vagufuge | Fisher Scientific | 07-748-13 | |
| Digital signal processing circuit DSP TMS 320 | Texas Instrument | ||
| Longpass Dichroic mirror 567 nm | ThorLabs | DMLP567L | |
| Objective 10X NA 0.25 DIN AchromaticFinite Intl Standard Objective | Edmund Optics | Stock# 33-437 | |
| Objective 20X NA 0.40 DIN Achromatic Finite Intl Standard Objective | Edmund Optics | Stock# 33-438 | |
| Longpass colored glass filter 590 nm | ThorLabs | FGL590 | |
| Green Nd-YAG laser 532 nm, 500 mW | |||
| Micromanipulator for laser | Siskiyou | MX130R | |
| Multimode fiber optic 200 µm NA 0.39 | ThorLabs | FT200UMT | |
| LEDs blue | Lumileds | L135-B475003500000 | |
| LEDs green | Lumileds | L135-G525003500000 | |
| Cube beam splitter, non-polarizing | ThorLabs | BS007 | |
| 36" Length, Dovetail Optical Rail | Edmund Optics | 54-402 | |
| 2.5" Width, Dovetail Carrier | Edmund Optics | 54-404 | |
| 0.75" Travel, micrometer stage | Edmund Optics | 37-983 | |
| Dovetail optical rail 3" | ThorLabs | RLA075/M | |
| Dovetail rail carrier 1" | ThorLabs | RC1 | |
| Avalanche photodiode Helix 902 | Digi-Key | HELIX-902-200 | |
| Objective holder XY Translator | ThorLabs | ST1XY-S | |
| Aluminum breadboard 6" x 6" | ThorLabs | MB6 | |
| Nexus otpical table 4' x 6' | ThorLabs | T46HK | |
| Stainless steel cap screws | ThorLabs | HW-KIT5/M | |
| Acrylic sheet | Home Depot/Lowes | ||
| Sylgard Silicone elastomer kit | Dow Corning | Sylgard 184 | |
| Epoxy gel | Walmart/Home Depot | 2-part 5 min clr 1oz | |
| 21G1.5 Precision glide needle | B-D | 305167 | |
| 23G Precision glide needle | B-D | 305145 | |
| Mounting base, 25 mm x 75 mm x 10 mm | ThorLabs | BA1/M | |
| Wire shelve posts 36" | Alera | AALESW59PO36SR | |
| Wire shelves | Alera | ALESW582424SR | |
| Post and angle clamp | ThorLabs | SWC/M-P5 | |
| Glass syringe for dye chamber | Wheaton | W851020 | |
| Rubber stopper | Home Science Tools | CE-STOP01C |
References
- Fabiato, A., Fabiato, F. Contractions induced by a calcium-triggered release of calcium from the sarcoplasmic reticulum of single skinned cardiac cells. J Physiol. 249 (3), 469-495 (1975).
- Mitra, R., Morad, M. A uniform enzymatic method for dissociation of myocytes from hearts and stomachs of vertebrates. Am J Physiol. 249 (5), 1056-1060 (1985).
- Escobar, A. L., et al. Developmental changes of intracellular Ca2+ transients in beating rat hearts. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 286 (3), H971-H978 (2004).
- Ramos-Franco, J., Aguilar-Sanchez, Y., Escobar, A. L. Intact Heart Loose Patch Photolysis Reveals Ionic Current Kinetics During Ventricular Action Potentials. Circ Res. 118 (2), 203-215 (2016).
- Mitra, R., Morad, M. A uniform enzymatic method for dissociation of myocytes from hearts and stomachs of vertebrates. Am J Physiol. 249, H1056-H1060 (1985).
- Fischmeister, R., DeFelice, L. J., Ayer, R. K., Levi, R., DeHaan, R. L. Channel currents during spontaneous action potentials in embryonic chick heart cells. The action potential patch clamp. Biophys J. 46 (2), 267-271 (1984).
- Banyasz, T., Horvath, B., Jian, Z., Izu, L. T., Chen-Izu, Y. Profile of L-type Ca(2+) current and Na(+)/Ca(2+) exchange current during cardiac action potential in ventricular myocytes. Heart Rhythm. 9 (1), 134-142 (2012).
- Apkon, M., Nerbonne, J. M. Characterization of two distinct depolarization-activated K+ currents in isolated adult rat ventricular myocytes. J Gen Physiol. 97 (5), 973-1011 (1991).
- Valverde, C. A., et al. Transient Ca2+ depletion of the sarcoplasmic reticulum at the onset of reperfusion. Cardiovasc Res. 85 (4), 671-680 (2010).
- Valverde, C. A., et al. Phospholamban phosphorylation sites enhance the recovery of intracellular Ca2+ after perfusion arrest in isolated, perfused mouse heart. Cardiovasc Res. 70 (2), 335-345 (2006).
- Escobar, A. L., et al. Role of inositol 1,4,5-trisphosphate in the regulation of ventricular Ca(2+) signaling in intact mouse heart. J Mol Cell Cardiol. 53 (6), 768-779 (2012).
- Mejía-Alvarez, R., et al. Pulsed local-field fluorescence microscopy: a new approach for measuring cellular signals in the beating heart. Pflügers Arch. 445 (6), 747-758 (2003).
- Ferreiro, M., Petrosky, A. D., Escobar, A. L. Intracellular Ca2+ release underlies the development of phase 2 in mouse ventricular action potentials. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 302 (5), H1160-H1172 (2012).
- Kornyeyev, D., et al. Calsequestrin 2 deletion shortens the refractoriness of Ca2+ release and reduces rate-dependent Ca2+-alternans in intact mouse hearts. J Mol Cell Cardiol. 52 (1), 21-31 (2012).
- Mattiazzi, A., Argenziano, M., Aguilar-Sanchez, Y., Mazzocchi, G., Escobar, A. L. Ca2+ Sparks and Ca2+ waves are the subcellular events underlying Ca2+ overload during ischemia and reperfusion in perfused intact hearts. J Mol Cell Cardiol. 79, 69-78 (2015).
- Kornyeyev, D., Reyes, M., Escobar, A. L. Luminal Ca(2+) content regulates intracellular Ca(2+) release in subepicardial myocytes of intact beating mouse hearts: effect of exogenous buffers. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 298 (6), H2138-H2153 (2010).
- Wang, Z. G., Fermini, B., Nattel, S. Repolarization differences between guinea pig atrial endocardium and epicardium: evidence for a role of Ito. Am J Physiol. 260, H1501-H1506 (1991).
- Liu, D. W., Gintant, G. A., Antzelevitch, C. Ionic bases for electrophysiological distinctions among epicardial, midmyocardial, and endocardial myocytes from the free wall of the canine left ventricle. Circ Res. 72 (3), 671-687 (1993).
- Litovsky, S. H., Antzelevitch, C. Transient outward current prominent in canine ventricular epicardium but not endocardium. Circ Res. 62 (1), 116-126 (1988).
- Lukas, A. Electrophysiology of Myocardial Cells in the Epicardial, Midmyocardial, and Endocardial Layers of the Ventricle. J Cardiovasc Pharmacol Ther. 2 (1), 61-72 (1997).
- Antzelevitch, C., Fish, J.
- Gomez, A. M. Modulation of electrical heterogeneity by compensated hypertrophy in rat left ventricle. Am J Physiol. 272 (3 Pt 2), H1078-H1086 (1997).
- Efimov, I. R. Innovation in optical imaging: looking inside the heart. Heart Rhythm. 4 (7), 925-926 (2007).
- Boukens, B. J., Efimov, I. R.
- Zhang, H., Iijima, K., Huang, J., Walcott, G. P., Rogers, J. M. Optical mapping of membrane potential and epicardial deformation in beating hearts. Biophysics J. 111 (2), 438-451 (2016).
