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Genetics

एकल कोशिका जीन अभिव्यक्ति की रूपरेखा आंतरिक मानकों के साथ FACS और qPCR का उपयोग

Published: February 25, 2017 doi: 10.3791/55219
Automatic Translation
1, 2, 1
1Laboratory of Pathology, Center for Cancer Research, National Cancer Institute, 2Experimental Transplantation and Immunology Branch, Center for Cancer Research, National Cancer Institute

Introduction

आबादी में व्यक्ति की कोशिकाओं के लिए एक समान शारीरिक प्रोत्साहन 1, 2, 3, 4 के लिए व्यापक रूप से भिन्न प्रतिक्रियाएं दिखा सकते हैं। आबादी में कोशिकाओं के आनुवंशिक परिवर्तन प्रतिक्रियाओं की इस किस्म के लिए एक तंत्र है, लेकिन वहाँ भी कर रहे हैं कई गैर आनुवांशिक कारक है कि प्रतिक्रियाओं की परिवर्तनशीलता बढ़ा सकते हैं, यहां तक ​​कि कोशिकाओं का एक प्रतिरूप जनसंख्या में। उदाहरण के लिए, व्यक्तिगत प्रोटीन और अन्य महत्वपूर्ण संकेतन अणुओं के स्तर को नीचे की ओर जीन की अभिव्यक्ति प्रोफाइल में बदलाव को जन्म दे रही है, एक सेल द्वारा सेल के आधार पर भिन्न हो सकते हैं। इसके अतिरिक्त, जीन सक्रियण टेप 5, 6 कि फट 7, 8, 9 प्रति टेप की एक अपेक्षाकृत छोटी संख्या को सीमित किया जा सकता है की छोटी अवधि के फटने में हो सकता है। ऐसाजीन सक्रियण में stochasticity बहुत जैविक प्रतिक्रियाओं में परिवर्तनशीलता के लिए योगदान कर सकते हैं और एक चयनात्मक लाभ सूक्ष्मजीवों 10 में और स्तनधारी कोशिकाओं 1, 2 एक शारीरिक उत्तेजना का जवाब दे सकता है। भिन्नता के दोनों आनुवंशिक और गैर-आनुवंशिक स्रोतों के कारण, एक उत्तेजना के जवाब में किसी भी कोशिका के जीन की अभिव्यक्ति प्रोफ़ाइल औसत जीन अभिव्यक्ति थोक प्रतिक्रिया की माप से प्राप्त प्रोफ़ाइल से काफी भिन्न हो सकते हैं। किस हद तक अलग-अलग कोशिकाओं को एक उत्तेजना के जवाब में परिवर्तनशीलता दिखाने का निर्धारण व्यक्ति की कोशिकाओं के अलगाव के लिए तकनीक की आवश्यकता है, ब्याज के टेप के लिए अभिव्यक्ति के स्तर की माप, और जिसके परिणामस्वरूप अभिव्यक्ति डेटा के कम्प्यूटेशनल विश्लेषण।

एकल कक्षों में जीन की अभिव्यक्ति परख करने की क्रिया, लागत की एक विस्तृत रेंज को कवर करने के लिए कई दृष्टिकोण हैं, टेप की संख्या की जांच की, औरमात्रा का ठहराव की सटीकता की। उदाहरण के लिए, एकल कोशिका शाही सेना Seq प्रतिलेख कवरेज और व्यक्ति की कोशिकाओं में सबसे उच्च व्यक्त जीनों के लिए अलग टेप के हजारों यों की क्षमता की एक विस्तृत गहराई प्रदान करता है; हालांकि, इस तरह अनुक्रमण गहराई के साथ जुड़े लागत निषेधात्मक जा सकता है, हालांकि लागत कम करने के लिए जारी है। इसके विपरीत, सीटू संकरण (smRNA मछली) में एकल अणु आरएनए प्रतिदीप्ति के लिए टेप की सटीक मात्रा का ठहराव प्रदान करता है यहां तक कि कम व्यक्त ब्याज की जीन प्रति एक उचित कीमत पर जीन; हालांकि, केवल लक्ष्य जीन की एक छोटी संख्या इस दृष्टिकोण से एक दिया सेल में यत्न किया जा सकता है। मात्रात्मक पीसीआर आधारित assays, इस प्रोटोकॉल में वर्णित है, इन तकनीकों के बीच एक बीच का रास्ता प्रदान करते हैं। ये assays एक microfluidic वास्तविक समय पीसीआर मशीन को रोजगार अप करने के लिए 96 कोशिकाओं में एक समय में ब्याज के 96 टेप करने के लिए यों तो। जबकि ऊपर उल्लिखित तरीकों में से प्रत्येक अपेक्षित हार्डवेयर की कीमत है, किसी भी व्यक्ति qPCR परख की लागत अपेक्षाकृत हैकम। इस प्रोटोकॉल एक एक microfluidic वास्तविक समय पीसीआर मशीन के एक निर्माता (प्रोटोकॉल ADP 41, Fluidigm) द्वारा सुझाए से अनुकूलित है। एक पीसीआर आधारित दृष्टिकोण में प्रत्येक प्रतिलिपि की पूर्ण संख्या के आकलन को सक्षम करने के लिए, हम प्रोटोकॉल है कि कई प्रयोगों में इस्तेमाल किया जा सकता है तैयार लक्ष्य जीन amplicons की आंतरिक नियंत्रण का उपयोग करने के लिए विस्तार किया है।

इस तकनीक का एक उदाहरण के रूप में, MCF 7 मानव स्तन कार्सिनोमा कोशिकाओं में ट्यूमर शमन P53 द्वारा विनियमित जीनों की अभिव्यक्ति की मात्रा का ठहराव 11 में वर्णित है। कोशिकाओं को एक रासायनिक एजेंट है कि डीएनए डबल कतरा टूटता लाती साथ चुनौती दी है। पिछले अध्ययनों से पता चला है कि डीएनए डबल कतरा टूटता P53 प्रतिक्रिया व्यक्ति की कोशिकाओं में विविधता का एक बड़ा सौदा दर्शाती है, दोनों स्तरों P53 12 के संदर्भ में और विशिष्ट लक्ष्य जीन की सक्रियता के 11 में है। इसके अलावा, P53 100 से अधिक की अभिव्यक्ति को नियंत्रित करता हैअच्छी तरह से विशेषता सेल चक्र गिरफ्तारी, apoptosis, और वार्धक्य 13, 14 सहित कई बहाव के रास्ते में शामिल लक्ष्य जीन। चूंकि प्रत्येक कोशिका में P53 की मध्यस्थता प्रतिक्रिया दोनों जटिल और चर रहा है, एक दृष्टिकोण से सिस्टम को लाभ का विश्लेषण है जिसमें लगभग 100 लक्ष्य जीन एक साथ इस तरह के नीचे वर्णित है कि जैसे व्यक्ति की कोशिकाओं में जांच की जा सकती। मामूली संशोधनों (जैसे एकल कोशिका अलगाव और सेल के लिए वैकल्पिक तरीकों के रूप में) के साथ, प्रोटोकॉल आसानी से स्तनधारी सेल प्रकार, टेप, और सेलुलर प्रतिक्रियाओं की एक विस्तृत श्रृंखला का अध्ययन करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।

उचित अग्रिम तैयारी के साथ, सेल छँटाई और जीन अभिव्यक्ति माप का एक चक्कर तीन दिन की अवधि में इस प्रोटोकॉल के अनुसार आयोजित किया जा सकता है। निम्नलिखित समय का सुझाव दिया है: अग्रिम में, ब्याज के टेप चयन की पहचान करने और प्राइमर जोड़े कि उन transcr से सीडीएनए बढ़ाना मान्यIPTS, और मानकों और प्राइमर घोला जा सकता है उन प्राइमरों का उपयोग तैयार करते हैं। दिन 1 पर, सेल उपचार, फसल के बाद और कोशिकाओं, रिवर्स प्रतिलेखन और विशिष्ट लक्ष्य प्रवर्धन करते हैं, और अनिगमित प्राइमरों दूर करने के लिए एक exonuclease के साथ नमूनों का इलाज। दिन 2 पर, qPCR का उपयोग कर हल कोशिकाओं पर गुणवत्ता नियंत्रण करते हैं। अंत में, दिन 3 पर, microfluidic qPCR का उपयोग कर हल कोशिकाओं में जीन की अभिव्यक्ति को मापने। चित्रा 1 शामिल कदम का सार।

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Protocol

1. अग्रिम तैयारी

  1. ब्याज के 96 जीन जिनकी अभिव्यक्ति मापा जाएगा करने के लिए का चयन करें।
    नोट: कम से कम इन जीनों में से एक ऐसे ACTB या GAPDH के रूप में एक "गृह व्यवस्था जीन," होना चाहिए, कि प्रयोग में इस्तेमाल की शर्तों के तहत एक अपेक्षाकृत उच्च और निरंतर स्तर पर व्यक्त किया जा करने के लिए जाना जाता है। इस जीन सकारात्मक हल किया कुओं (कदम 8.1) और प्रवर्धित नमूने (कदम 10.1) की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा।
    नोट: उदाहरण के प्रयोग के लिए, अच्छी तरह से विशेषता P53 की, प्रत्यक्ष लक्ष्यों में जाना जाता कार्यों 11, 14 और GAPDH के रूप में एक गृह व्यवस्था नियंत्रण चयन किया गया था की एक किस्म के साथ। लक्ष्य जीन और प्राइमर इस अध्ययन में इस्तेमाल दृश्यों की पूरी सूची के लिए कृपया संदर्भ 11 देखें।
  2. संभावित प्राइमर जोड़े ब्याज की जीन के लिए विशिष्ट पहचान (जैसे, वैज्ञानिक साहित्य या ऐसे प्राइमर-विस्फोट के रूप में एक किताब के डिजाइन उपकरण का उपयोग कर) 15। प्राइमर हैसंश्लेषित है और उन्हें nuclease मुक्त पानी में 100 माइक्रोन की शेयर एकाग्रता में बनाए रखें।
    नोट: ये प्राइमरों 15-25 ठिकानों लंबा होना चाहिए; एक amplicon 90-130 आधार जोड़े (बीपी) लंबे समय से उत्पादन; एक एक्सॉन जंक्शन अवधि है, अगर एक से मौजूद है, जीनोमिक डीएनए amplifying की संभावना को कम करने के लिए; 60 ± 1 डिग्री सेल्सियस के पिघलने तापमान है; और कम से कम माध्यमिक संरचना 16 है। ये प्राइमरों, प्रधानमंत्री रिवर्स प्रतिलेखन के लिए इस्तेमाल किया जाएगा ब्याज के टेप से सीडीएनए बढ़ाना, और बाध्यकारी डाई आधारित qPCR डीएनए में जीन की अभिव्यक्ति को मापने।
  3. प्राइमरों मान्य।
    1. सबसे पहले, ब्याज की कोशिकाओं से सीडीएनए प्राप्त करते हैं। निर्माता के निर्देशों या मानक आणविक जीव विज्ञान के तरीकों 17 के अनुसार एक शाही सेना कटाई किट का उपयोग कोशिकाओं से हार्वेस्ट आरएनए। रिवर्स टाइप सीडीएनए में शाही सेना यादृच्छिक hexamers के साथ एक रिवर्स प्रतिलेखन किट का उपयोग निर्माता के निर्देशों या मानक के अनुसार methoडी एस 17।
    2. प्रत्येक प्राइमर जोड़ी के लिए, डीएनए डाई मास्टर मिश्रण बंधन, आगे और रिवर्स प्राइमरों, और पिछले चरण से सीडीएनए, सुझाव प्रतिक्रिया की स्थिति के लिए मास्टर मिश्रण निर्माता की सिफारिशों का पालन के साथ qPCR की स्थापना की। मास्टर मिश्रण निर्माता है कि पिघल वक्र अधिग्रहण भी शामिल है ने सिफारिश की एक थर्मल साइकिल प्रोटोकॉल का उपयोग कर एक वास्तविक समय पीसीआर मशीन पर इन प्रतिक्रियाओं चलाएँ।
    3. QPCR के बाद, एक 2% w / v agarose जेल पर परिलक्षित डीएनए नमूने चलाने के लिए और एक मानक प्रोटोकॉल 17 के बाद एक डीएनए intercalating डाई के माध्यम से डीएनए कल्पना।
    4. सीडीएनए के धारावाहिक dilutions से एक मानक वक्र के निर्माण से प्राइमर जोड़ी की क्षमता का निर्धारण (कदम 1.3.1 में किए गए) एक मानक प्रोटोकॉल 16 के अनुसार।
      नोट: एक अच्छा प्राइमर जोड़ी जेल 16 पर उम्मीद स्थान में एक एकल, अच्छी तरह से परिभाषित शिखर और एक भी बैंड के साथ एक पिघल वक्र निकलेगा, अप वर्ग = "xref"> 17 (चित्रा 2)। पिघल वक्र ", कंधे" कई चोटियों या एक है, तो या तो जेल कई बैंड या एक धब्बा है, प्राइमरों एक बंद लक्ष्य अनुक्रम amplifying रहे हैं। किसी भी प्राइमरों कि बंद लक्ष्य दृश्यों बढ़ाना और आवश्यक के रूप में पूर्ववर्ती सत्यापन कदम दोहराने के लिए मनाया गया है नया स्वरूप देना। एक अच्छी किताब जोड़ी भी आर 2 ≥0.985 मानक वक्र 16 के लिए के साथ, 90-110% की दक्षता होगा; किसी भी प्राइमरों को नया स्वरूप है जिसके लिए दक्षता या आर 2 गिरावट इन सीमाओं के बाहर।
  4. शुद्ध डीएनए amplicons से मानकों को तैयार है।
    1. प्रत्येक मान्य प्राइमर जोड़ी के लिए:
      1. एक उच्च निष्ठा डीएनए पोलीमरेज़ का उपयोग सीडीएनए से ब्याज के क्षेत्र बढ़ाना प्राइमर और टेम्पलेट डीएनए सांद्रता, प्रतिक्रिया की स्थिति, और पीसीआर साइकिल चालन की स्थिति, या एक मानक पीसीआर प्रोटोकॉल का उपयोग करने के लिए पोलीमर्स निर्माता की सिफारिशों के अनुसार"xref"> 17।
      2. एक 2% w / v agarose जेल पर परिलक्षित सीडीएनए चलाने के लिए और एक डीएनए डाई 17 intercalating के साथ बैंड कल्पना। बैंड एक साफ रेजर ब्लेड का उपयोग amplicon का प्रतिनिधित्व आबकारी एवं एक microcentrifuge ट्यूब में जेल टुकड़ा जगह है।
      3. इस तरह के एक agarase आधारित निष्कर्षण 17 या एक स्पिन स्तंभ जेल निकालना किट के रूप में जेल में एक मानक जेल निकालना प्रक्रिया का उपयोग करने से amplicon शुद्ध, निर्माता के निर्देशों के अनुसार।
      4. amplicon की एकाग्रता को मापने के निर्माता के निर्देशों के अनुसार एक प्रतिदीप्ति आधारित dsDNA मात्रा का ठहराव किट का उपयोग। μl प्रति amplicon अणुओं की संख्या प्राप्त करने के लिए amplicon amplicon अनुक्रम के आधार पर जाना जाता आणविक वजन द्वारा मापा dsDNA एकाग्रता फूट डालो।
      5. एक 2.0 मिलीलीटर कम बाध्यकारी microfuge ट्यूब में, डीएनए निलंबन बफर के एक मात्रा को शुद्ध amplicon के 2 μl जोड़ने ऐसी है कि amp के अंतिम एकाग्रताlicon 5 एक्स 10 8 अणुओं / μl है।
    2. जब सभी amplicons शुद्ध किया गया है, एक 2.0 मिलीलीटर कम बाध्यकारी microcentrifuge ट्यूब में प्रत्येक शुद्ध amplicon के 18 μl गठबंधन। डीएनए निलंबन बफर 1,800 μl की कुल मात्रा बनाने के लिए जोड़ें; इस प्रकार, प्रत्येक amplicon की एकाग्रता 5 एक्स 10 6 अणुओं / μl है।
      नोट: इस मिश्रण है, जो ज्ञात equimolar मात्रा में ब्याज की सभी जीनों से सीडीएनए amplicons होता है, एकल कोशिका qPCR में एक मानक के रूप में काम करेगा।
    3. भंवर इस '5e6 "मानक अच्छी तरह से, 2,000 XG पर 10 सेकंड के लिए स्पिन, और कम से बाध्यकारी पीसीआर नलियों में 20 μl aliquots में विभाजित है। -80 डिग्री सेल्सियस पर aliquots स्टोर।
  5. विशिष्ट लक्ष्य प्रवर्धन (एसटीए) प्राइमर मिश्रण (10x) तैयार करें।
    1. एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में, (192 तक) प्रत्येक 100 माइक्रोन के शेयर प्राइमर का 25 μl गठबंधन। डीएनए निलंबन बफर 5000 μl की कुल मात्रा बनाने के लिए जोड़ें।
      ध्यान देंइस मिश्रण में प्रत्येक प्राइमर की एकाग्रता 500 एनएम है। हल कोशिकाओं के प्रत्येक प्लेट प्रधानमंत्री रिवर्स प्रतिलेखन और विशिष्ट लक्ष्य प्रवर्धन को यह प्राइमर मिश्रण के 105.6 μl का प्रयोग करेंगे। यहाँ दी प्राइमर मिश्रण की मात्रा सुलझाने के लिए 45 प्लेटें बनाने के लिए पर्याप्त है। यह इतना है कि यह केवल एक बार किए जाने की जरूरत प्राइमर मिश्रण का एक बड़ा पर्याप्त मात्रा बनाने के लिए सलाह दी जाती है; आवश्यक मात्रा पैमाने।
    2. vortexing द्वारा अच्छी तरह मिक्स, 110 μl aliquots में विभाजित है, और -20 डिग्री सेल्सियस पर aliquots की दुकान।
  6. Microfluidic चिप आधारित qPCR में उपयोग के लिए, परख घोला जा सकता है, प्रत्येक प्राइमर जोड़ी के लिए एक तैयार करें।
    1. एक 96 अच्छी तरह से पीसीआर थाली के प्रत्येक कुएं में, 100 माइक्रोन के आगे प्राइमर का 3.0 μl किसी जीन के लिए, इसी 100 सुक्ष्ममापी रिवर्स प्राइमर का 3.0 μl, डीएनए निलंबन बफर के 24.0 μl, और 2x परख लोड हो रहा है अभिकर्मक के 30.0 μl गठबंधन ।
    2. भंवर इस प्लेट, -20 डिग्री सेल्सियस पर 500 XG पर 10 सेकंड, और दुकान के लिए स्पिन।
  7. दो थर्मल साइकिल कार्यक्रमों बनाएं: RTSTA (ट्रांसक्रिप्शन और विशिष्ट लक्ष्य प्रवर्धन रिवर्स; 1 टेबल) और EXOI (exonuclease मैं उपचार; तालिका 2)।

2. उपचार

  1. एक टिशू कल्चर पकवान ऐसी है कि वे प्रयोगात्मक अध्ययन की शर्तों के आधार पर उपचार के समय पर वांछित संगम बढ़ेगा, पर स्तनधारी कोशिकाओं प्लेट। इस अध्ययन में प्रस्तुत उदाहरण के लिए, थाली 4 x 10 5 MCF 7 P53-वीनस कोशिकाओं 18 RPMI में 6 सेमी पकवान प्रति 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS), 100 यू / एमएल पेनिसिलिन, 100 मिलीग्राम / एमएल स्ट्रेप्टोमाइसिन, और साथ के लिए 250 एनजी / 5% सीओ 2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर दो दिनों के लिए मिलीलीटर amphotericin बी सेते कोशिकाओं जब तक वे 50% confluency तक पहुँचने।
  2. प्रयोगात्मक अध्ययन के आधार पर ब्याज की हालत स्थापित करने की कोशिकाओं को समझो। इस अध्ययन में प्रस्तुत उदाहरण के लिए, 400 एनजी के साथ MCF 7 P53-वीनस सेते कोशिकाओं / एमएल neocarzino3 घंटा, 8.5 घंटा, 14 घंटा, या 24 घंटे के लिए स्टैटिन।

सेल छंटनी के लिए 3. बफर तैयारी

ध्यान दें: lysis बफर के लिए एक एकल प्लेट बनाने के बारे में 1 घंटा लेता है। यह प्लेटें बनाने के लिए सलाह दी जाती है और तरह से अधिक है, के रूप में सेल छँटाई अक्षम हो सकता है और नहीं detectable सेल के साथ कई कुओं उपज कर सकते हैं।

  1. बेंच, pipettes, ट्यूब रैक, ठंड पीसीआर थाली धारकों, और दस्ताने पीसीआर के लिए तैयार करने में डीएनए decontaminating समाधान के साथ साफ करें।
  2. nuclease मुक्त करने के लिए एक 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में पानी के शेयर RNAse अवरोध जोड़कर 2.64 यू / μl को RNAse अवरोध पतला।
    नोट: यह RNAse अवरोध उप μl संस्करणों pipetting बिना lysis बफर करने के लिए जोड़ा जा करने की अनुमति देता है।
  3. 3 टेबल में सूचीबद्ध घटकों के संयोजन के द्वारा कोशिकाओं के लिए lysis बफर बनाओ।
  4. एक अलग ट्यूब में कोशिकाओं के लिए lysis बफर के 92.4 μl स्थानांतरण; इस amplicon मानकों के लिए lysis बफर होगा।
  5. का प्रयोग लोडब्ल्यू बाध्यकारी पिपेट सुझावों और microcentrifuge ट्यूब, 200 μl और 3.1 स्नातकोत्तर / μl और 6.2 स्नातकोत्तर / μl, क्रमशः को पतला ई कोलाई डीएनए के 500 μl तैयार डीएनए निलंबन बफर के साथ।
  6. कोशिकाओं के लिए lysis बफर 3.1 स्नातकोत्तर / μl ई कोलाई डीएनए के 184.8 μl जोड़ें।
    नोट: ई कोलाई वाहक डीएनए अविशिष्ट प्राइमर बाध्यकारी संभावनाओं के दायरे को व्यापक बनाने के लिए और इस तरह की संभावना है कि प्राइमर dimerization एक पीसीआर उत्पाद को बढ़ावा मिलेगा को कम करता है।
  7. मानकों को तैयार है।
    1. के रूप में 5e5, 5e4 ... 5e0 छह कम बाध्यकारी microcentrifuge ट्यूबों लेबल।
    2. "5e5" ट्यूब के लिए डीएनए निलंबन बफर के 90 μl जोड़ें।
    3. अन्य पांच नलियों में से प्रत्येक के 6.2 स्नातकोत्तर / μl ई कोलाई डीएनए के 90 μl जोड़ें। बर्फ पर सभी ट्यूबों रखें।
      नोट: मानकों में वाहक डीएनए शामिल है कि 1-सेल कुओं में करने के लिए तुलनीय मानक कुओं में डीएनए के कुल द्रव्यमान बनाता है; इस जनसंपर्क कम कर देता हैobability कि मानकों की एकाग्रता ट्यूब या पिपेट सुझावों के लिए बाध्यकारी डीएनए से प्रभावित हो जाएगा।
    4. "5e6" मानक (प्रत्येक amplicon के 5 एक्स 10 6 अणुओं / μl, 1.4 चरण में तैयार) भंडारण से की एक विभाज्य ले लो। भंवर संक्षिप्त और संक्षेप में स्पिन (500 XG पर 5 सेकंड) सुनिश्चित करने के लिए कि तरल ट्यूब के नीचे है।
    5. एक कम बाध्यकारी विंदुक टिप का उपयोग, "5e5" ट्यूब के लिए 5e6 मानक के 10 μl जोड़ें। भंवर संक्षिप्त, स्पिन (500 XG पर 5 सेकंड), और ट्यूब बर्फ पर वापस डाल दिया।
    6. पिपेट 10 "5e4" ट्यूब में "5e5" ट्यूब से μl। भंवर संक्षिप्त, स्पिन (500 XG पर 5 सेकंड), और बर्फ पर वापस डाल दिया।
    7. इन धारावाहिक dilutions दोहराएँ, प्रत्येक पिछले ट्यूब से 10 μl प्राप्त ट्यूब के साथ, जब तक सभी ट्यूबों मानक के कमजोर पड़ने की है।
  8. टोपी के साथ 12 पीसीआर ट्यूब की एक पंक्ति तैयार करें। प्रत्येक ट्यूब "सेल" lysis बफर के 67 μl बांटो। नलियों कैप और नीचे संक्षेप में स्पिन (5सेकंड 500 XG पर) यदि आवश्यक हो तो।
  9. एक 12-चैनल पिपेट का उपयोग करना, एक पीसीआर प्लेट (चित्रा 3) के पहले 7 पंक्तियों के प्रत्येक कुएं में पीसीआर नलियों की पंक्ति से "सेल" lysis बफर के 9 μl वितरित।
  10. थाली के अंतिम पंक्ति के प्रत्येक अच्छी तरह से 'मानक' lysis बफर के 7 μl बांटो (चित्रा 3)।
  11. कम-से बाध्यकारी पिपेट सुझावों का प्रयोग, थाली नक्शा (चित्रा 3) के अनुसार नीचे पंक्ति के प्रत्येक अच्छी तरह से मानक के 2 μl जोड़ें।
    नोट: 10 अणुओं, आदि के लिए 5 एक्स 10 0 अणुओं / μl मानक मात्रा के 2 μl
  12. 10-सेल और 100-सेल कुओं में 3.1 स्नातकोत्तर / μl ई कोलाई डीएनए के 2 μl जोड़ें; कोई सेल कुओं में 6.2 स्नातकोत्तर / μl ई कोलाई डीएनए के 2 μl जोड़ें।
    नोट: प्रत्येक 1-सेल, 10-सेल, और 100-सेल में अच्छी तरह से एक भी मानव कोशिका में जीनोमिक डीएनए के द्रव्यमान का अनुमान करने, ई कोलाई डीएनए के 6.2 पीजी है। प्रत्येक मानक और कोई सेल में अच्छी तरह से 12.4 पीजी ओ हैएफ ई कोलाई डीएनए, लगभग दो मानव कोशिकाओं के लायक।
  13. 4 डिग्री सेल्सियस पर 500 XG पर 5 सेकंड, और दुकान के लिए थाली एक बाँझ थर्मल सील, स्पिन का उपयोग कर सील तक कोशिकाओं छंटाई के लिए तैयार हैं।

4. सेल सॉर्टर सेटअप

  1. प्लेट नक्शा (चित्रा 3) के अनुसार एक 96 अच्छी तरह से थाली में सुलझाने के लिए प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल सॉर्टर कार्यक्रम; कोई कोशिकाओं कुओं H1-H8 या H11-H12 में हल किया जाना चाहिए।
  2. सत्यापित करें सेल सॉर्टर अच्छी तरह से एक पीसीआर थाली में छँटाई के लिए उद्देश्य से है कि।
    1. कम से कम संभव करने के लिए क्रमबद्ध धारा के कोण सेट; इस सेटिंग मौका है कि कोशिकाओं कुओं के नीचे में नहीं बल्कि हल हो जाएगा की तुलना पक्षों मारा बढ़ जाती है।
    2. मशीन उद्देश्य के लिए, एक खाली पीसीआर थाली सील करने और खाली प्लेट की मुहर पर "की तरह" पीबीएस की बूंदों के लिए परीक्षण धारा का उपयोग, मशीन 19 के निर्देशों के अनुसार; बूंदों वें पर जमीन चाहिएअच्छी तरह से केंद्र के ऊपर एक स्थान पर सील की सतह ई। सर्वोत्तम परिणामों के लिए, लंबाई और चौड़ाई में थाली के उद्देश्य की पुष्टि करें।
    3. बूंदों सही स्थिति में जमीन नहीं है, तो उन्हें बंद, सील की सतह पोंछे मशीन निर्माता के निर्देशों के अनुसार सेल सॉर्टर recalibrate, और दोहराएँ जब तक क्रमबद्ध धारा में बूंदों को सही ढंग से जमा कर रहे हैं।

5. सेल हार्वेस्ट और छंटनी

  1. सेल लाइन के लिए के रूप में उपयुक्त कोशिकाओं Trypsinize। उदाहरण के लिए, MCF 7 कोशिकाओं के लिए, कोशिकाओं से मध्यम aspirate, 0.05% trypsin के 1 मिलीलीटर के साथ कोशिकाओं कुल्ला, और 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2 पर 5 मिनट के लिए 0.05% trypsin के 2 मिलीलीटर के साथ कोशिकाओं को सेते ।
  2. trypsinized कोशिकाओं को सेल संस्कृति के माध्यम से 8 मिलीलीटर जोड़ें और एक 15 मिलीलीटर ट्यूब सेल निलंबन के सभी 10 मिलीलीटर हस्तांतरण। 400 x जी 4 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र।
  3. सतह पर तैरनेवाला Aspirate और पीबीएस + 2% FBS में सेल गोली resuspend। <br /> नोट: एक छोटे मेजबान मात्रा कोशिकाओं केंद्रित है और सेल छँटाई की सुविधा; एक 500 μl मेजबान मात्रा 50% confluency पर कोशिकाओं के एक 6 सेमी डिश के लिए अच्छी तरह से काम करता है।
  4. एक 5 सेल निलंबन स्थानांतरण एक 40 माइक्रोन फिल्टर के माध्यम से ट्यूब प्रवाह cytometry मिलीलीटर, pipetting कोशिकाओं के झुरमुटों हटा दें।
  5. lysis बफर के प्लेट कोशिकाओं छँटाई सुनिश्चित करने के लिए कि तरल कुओं के नीचे स्थित है पहले 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 सेकंड के लिए 400 XG पर अपकेंद्रित्र।
  6. सेल सॉर्टर में सेल निलंबन के साथ ट्यूब डालें। Lysis बफर के प्लेट पर मुहर खोलें और ध्यान से प्लेट नक्शा करने के लिए और सेल सॉर्टर निर्माता के निर्देशों 19 निम्न अनुसार थाली में ब्याज की कोशिकाओं को सुलझाने। यह सुनिश्चित करें कि एकल कक्षों अधिकतम पवित्रता पर क्रमबद्ध हैं, "एकल कोशिका" मोड में मशीन चलाने के लिए और gating आगे के आधार पर और पक्ष तितर बितर 19 cytometry मानक प्रवाह का उपयोग करें।
    नोट: मेंउदाहरण के प्रयोग, गेट कोशिकाओं P53-वीनस प्रतिदीप्ति के आधार पर अलग-थलग करने के लिए अलग-अलग 11 कोशिकाओं के प्रतिभाशाली 15%।
  7. 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 मिनट के लिए एक नया, बाँझ थर्मल सील और 400 XG पर सेंट्रीफ्यूज के साथ थाली सील। थर्मल cycler में थाली प्लेस और RTSTA कार्यक्रम (1.7 कदम देखें) चलाते हैं।
    नोट: यह हल कोशिकाओं से mRNA पर रिवर्स प्रतिलेखन करता है और फिर ब्याज की टेप की सीडीएनए amplifies।

6. exonuclease उपचार

  1. तालिका 4 में सूचीबद्ध घटकों के संयोजन के द्वारा मिक्स पतला exonuclease रहा। टोपी के साथ 12 पीसीआर ट्यूब की एक पंक्ति तैयार करें। प्रत्येक ट्यूब में पतला exonuclease मैं का 30.5 μl बांटो। नलियों कैप और यह सुनिश्चित करना है कि तरल ट्यूब के नीचे है संक्षेप में (500 XG पर 5 सेकंड) स्पिन।
  2. जब RTSTA समाप्त हो गया है, पर 500 x जी 5 सेकंड के लिए नमूना थाली स्पिन। एक 12-चैनल पिपेट का प्रयोग, पतला exonuclease के 3.6 μl वितरितमैं थाली के प्रत्येक कुएं में।
  3. एक बाँझ थर्मल सील और स्पिन संक्षिप्त (500 XG पर 5 सेकंड) के साथ थाली सील। थर्मल cycler में थाली प्लेस और EXOI कार्यक्रम (1.7 कदम देखें) चलाते हैं।
    नोट: यह कदम किसी भी विशिष्ट लक्ष्य प्रवर्धन के बाद शेष प्राइमरों degrades इतना है कि वे भविष्य पीसीआर के साथ हस्तक्षेप नहीं करेगा।

7. नमूना कमजोर पड़ने

  1. जब exonuclease उपचार समाप्त हो गया है, नमूना थाली के प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए ते बफर के 32.4 μl जोड़ने; यह एक वैकल्पिक रोक बिंदु है, और नमूने कई दिनों के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जा सकता है।

8. क्रमबद्ध गुणवत्ता नियंत्रण qPCR का उपयोग

नोट: क्योंकि सेल छँटाई पूरी तरह से प्रभावी नहीं है, इस कदम है जो हल थाली के कुओं वास्तव में एक सेल प्राप्त की पहचान करने के लिए आवश्यक है। ये नमूने तो आगे के विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

  1. QPCR द्वारा प्रत्येक नमूने में गृह व्यवस्था जीन अभिव्यक्ति उपाय।
  2. 1.1 चरण में चयन किया हाउसकीपिंग जीनों में से एक के लिए पोलीमर्स निर्माता प्रोटोकॉल का उपयोग कर प्राइमरों के अनुसार 96 प्रतिक्रियाओं के लिए डीएनए बाध्यकारी डाई qPCR मास्टर मिश्रण के 900 μl तैयार करें; प्रतिक्रिया बफर, पोलीमर्स, प्राइमरों, आदि इस प्रतिक्रिया विशिष्ट पोलीमर्स पर निर्भर करेगा की सटीक सांद्रता का इस्तेमाल किया जा रहा है।
  3. एक 96 अच्छी तरह से पीसीआर थाली के हर अच्छी तरह से करने के लिए मास्टर मिश्रण के 9 μl बांटो। पीसीआर थाली की अच्छी तरह से इसी के लिए नमूना थाली से नमूने के 1 μl जोड़ें।
  4. मास्टर मिश्रण निर्माता द्वारा सुझाए गए एक थर्मल साइकिल प्रोटोकॉल का उपयोग या एक मानक प्रोटोकॉल 20 के बाद एक वास्तविक समय पीसीआर मशीन पर थाली चलाएँ।
  • QPCR डेटा विश्लेषण 20; क्रमबद्ध गुणवत्ता नियंत्रण नीचे सूचीबद्ध चरणों से qPCR डेटा का एक उदाहरण चित्रा 4 में दिखाया गया है।
    1. सत्यापित करें कि कोई सेल कुओं से माप एक कम (पृष्ठभूमि) स्तर दिखाजीन अभिव्यक्ति या सब पर कोई अभिव्यक्ति की।
    2. सत्यापित करें कि 1-सेल कुओं से माप को दो समूहों में स्पष्ट रूप से विभाजित: उच्च जीन अभिव्यक्ति और सब पर अभिव्यक्ति या कोई अभिव्यक्ति की पृष्ठभूमि के स्तर, कोई सेल कुओं के समान के साथ नकारात्मक नमूनों के साथ सकारात्मक नमूने हैं।
      नोट: उच्च जीन अभिव्यक्ति के साथ नमूने वास्तविक हल कोशिकाओं का प्रतिनिधित्व करते हैं; पृष्ठभूमि अभिव्यक्ति के साथ उन लोगों के आगे के विश्लेषण से बाहर रखा जाना चाहिए।
    3. सत्यापित करें कि 10-सेल और 100-सेल कुओं से माप सकारात्मक 1-सेल कुओं की तुलना में अधिक जीन अभिव्यक्ति प्रतिबिंबित करती हैं, संभावना है कि अकुशल छँटाई से वांछित उन कुओं कम कोशिकाओं के लिए कारण सकता है के लिए अनुमति देता है।
    4. सत्यापित करें कि मानक कुओं से माप समान रूप से (यानी कि सी टी मूल्यों में समान रूप से वितरित कर रहे हैं) लघुगणक अंतरिक्ष में वितरित कर रहे हैं।
  • सभी सकारात्मक 1-सेल के नमूने की पहचान करने के बाद, सकारात्मक 1-सीई नक्शा करने के लिए एक "नमूना घोला जा सकता है" थाली नक्शा बनानेएक नया 96 अच्छी तरह से थाली पर डालूँगा नमूने हैं। इस प्लेट के नक्शे पर मानकों के लिए आठ कुओं को शामिल करें। एक उदाहरण के लिए चित्रा 5 देखें।

    • 9. जीन एक्सप्रेशन मापन Microfluidic qPCR का उपयोग

    नोट: इस खंड में हर कदम के लिए, केवल पहला पड़ाव को पिपेट अभिकर्मकों में बुलबुले के गठन को कम करने के लिए।

    1. 8 पीसीआर ट्यूब की एक पंक्ति खोलें। नमूने के कई प्लेटों देखते हैं, तो 8 पीसीआर ट्यूब की एक दूसरी पंक्ति खोलने और ट्यूबों 1-8 लेबल। यह पंक्ति कई प्लेटों से मानकों पूलिंग के लिए किया जाएगा।
    2. एक 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में, बाध्यकारी डाई नमूना लोड हो रहा अभिकर्मक डीएनए के 36 μl के साथ डीएनए बाध्यकारी डाई qPCR मास्टर मिश्रण के 360 μl मिश्रण। भंवर संक्षिप्त और कम 2000 x जी 10 सेकंड के लिए स्पिन। 8 पीसीआर ट्यूबों के लेबल हटाया गया पंक्ति में इस मिश्रण (396 μl) फूट डालो, प्रत्येक ट्यूब में 48 μl रखकर।
    3. एक 8 चैनल पिपेट का उपयोग करना, प्रत्येक कुएं में मास्टर मिश्रण / नमूना लोड हो रहा है अभिकर्मक मिश्रण के 3.3 μl वितरितएक नया 96 अच्छी तरह से पीसीआर प्लेट की। इस प्लेट, लेबल "नमूना घोला जा सकता है।"
    4. नमूने के प्रत्येक पीसीआर थाली के लिए:
      1. भंवर 10 सेकंड और कम 500 x जी 10 सेकंड के लिए स्पिन के लिए थाली। कवर निकालें और इसके नमूने पर अच्छी तरह से इसी के लिए प्रत्येक के लिए सकारात्मक 1-सेल नमूना के 2.7 μl स्थानांतरण 1-सेल कुओं की थाली नक्शे पर संकेत के लिए थाली घोला जा सकता है।
      2. अगर वहाँ के नमूनों की केवल एक ही थाली है, इसका नमूना पर अच्छी तरह से इसी के लिए प्रत्येक प्रवर्धित मानक के 2.7 μl हस्तांतरण प्लेट नक्शे के अनुसार घोला जा सकता है थाली।
      3. नमूने के कई प्लेटों देखते हैं, तो पीसीआर ट्यूबों के लेबल पंक्ति में अपनी इसी स्थिति प्रत्येक प्रवर्धित मानक के 2.7 μl हस्तांतरण। पहले से ही वहाँ किसी भी मानकों के नमूने की वर्तमान थाली से मानकों जोड़ें। नमूनों की प्लेट सील जब एक सील फिल्म का प्रयोग किया।
    5. अगर वहाँ के नमूनों की कई प्लेटें हैं:
      1. के लिए मानकों युक्त पीसीआर नलियों की पंक्ति भंवर10 सेकंड और कम 2000 x जी 10 सेकंड के लिए स्पिन। अच्छी तरह से नमूना पर इसी में मिश्रित मानकों के प्रत्येक ट्यूब से 2.7 μl स्थानांतरण प्लेट नक्शे के अनुसार प्लेट घोला जा सकता है।
    6. जहां प्लेट नक्शे पर संकेत nuclease मुक्त पानी की 2.7 μl के साथ एनटीसी कुओं लोड। सील नमूना 4 डिग्री सेल्सियस पर प्लेट और दुकान घोला जा सकता है जब तक की जरूरत है।
    7. एक नए microfluidic qPCR चिप के नीचे बंद स्टीकर छील। पर अभी भी टोपी के साथ नियंत्रण रेखा तरल पदार्थ की एक सिरिंज का प्रयोग, यह ढीला करने के लिए प्रत्येक संचायक वसंत नीचे धक्का, और नियंत्रण रेखा द्रव के 150-200 μl के साथ प्रत्येक संचायक इंजेक्षन।
    8. लोडिंग मशीन में चिप डालें और "प्रधानमंत्री" स्क्रिप्ट चलाते हैं। यह लेता है ~ 20 मिनट।
    9. जब भड़काना किया, भंवर और परख घोला जा सकता है की प्लेट नीचे स्पिन है और नमूना घोला जा सकता है (1.6 चरण में तैयार)।
    10. एक 8 चैनल पिपेट का उपयोग करना, में चित्र के अनुसार microfluidic qPCR चिप के बाईं ओर में प्रत्येक परख मिश्रण के 4.5 μl हस्तांतरण जी> चित्रा 6। पिपेट बहुत ध्यान से कुओं के नीचे हवा के बुलबुले बनाने से बचने के लिए। जब समाप्त हो, भविष्य में उपयोग के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर परख घोला जा सकता है और दुकान के प्लेट सील।
    11. चित्रा 6 के अनुसार microfluidic qPCR चिप के दाईं ओर करने के लिए प्रत्येक नमूना मिश्रण के 4.5 μl स्थानांतरण। लोडिंग मशीन में चिप डालें और "लोड मिक्स" स्क्रिप्ट चलाएँ। यह लेता है ~ 90 मिनट।
    12. microfluidic वास्तविक समय पीसीआर मशीन चालू डेटा संग्रह सॉफ्टवेयर शुरू, और यह गर्म अप करने के लिए दीपक पर बारी। यह लेता है ~ 20 मिनट।
    13. जब लोड मिक्स स्क्रिप्ट किया है, पुष्टि वहाँ भर में कोई लाइनें हैं कि चिप इस एक लोडिंग की समस्या का संकेत होगा। ध्यान से चिप से किसी भी धूल कणों स्कॉच टेप या प्रयोगशाला टेप का उपयोग कर हटा दें। microfluidic वास्तविक समय पीसीआर मशीन में चिप डालें और डेटा संग्रह स्क्रिप्ट चलाएँ। परिणामों का निरीक्षण किया और आगे के विश्लेषण के लिए डेटा निर्यात करने के लिए विश्लेषण सॉफ्टवेयर का प्रयोग करें।
    _title "> 10। डेटा विश्लेषण

    1. माप जिसके लिए qPCR प्रवर्धन घटता खराब गुणवत्ता (यानी, जिसके लिए घटता मानक sigmoidal प्रवर्धन वक्र समान नहीं है) 20 दिखाने निकालें।
    2. 30 से अधिक गरीब गुणवत्ता या शून्य माप के साथ या जो गृह व्यवस्था जीन अभिव्यक्ति (1.1 कदम देखें) (चित्रा 7) अन्य नमूने के बहुमत से बहुत कम है के लिए नमूने निकालें।
    3. प्रत्येक जीन के लिए, प्रत्येक नमूने से पिघल चोटी स्थानों की औसत रूप में सही पिघल चोटी स्थान का अनुमान है। एक माप एक पिघल मंझला से अधिक से अधिक 1 डिग्री सेल्सियस स्थित चोटी है, तो विचार 20 से कि माप को हटा दें।
    4. प्रत्येक जीन के लिए, एक स्प्रेडशीट या पटकथा भाषा का उपयोग कर 20 प्रत्येक नमूने में mRNA गिनती अनुमान लगाने के लिए एक मानक वक्र पैदा करते हैं।
      नोट: इस प्रयोग में मानकों 10 से मिलकर, 100, 1,000, 10,000 या अणुओंdsDNA के ब्याज की प्रत्येक प्रतिलिपि के लिए इसी। अगर रिवर्स प्रतिलेखन पूरी तरह से कुशल थे, मानकों, 20, 200, 2,000, और mRNA के 20,000 अणुओं के अनुरूप होगा, क्योंकि mRNA और सीडीएनए एकल असहाय हैं। व्यवहार में, यह मामला नहीं है, तो हम × ई आर टी, जहां ई आर टी रिवर्स प्रतिलेखन की दक्षता है अणुओं की इकाइयों में एक अनुमान के रूप में माप व्यक्त करते हैं।
      1. प्रत्येक मानक अच्छी तरह से, मी, प्रवर्धन से पहले ssDNA के अणुओं की संख्या (दो बार dsDNA के अणुओं की संख्या) (जैसे, 20 अणुओं, 200 अणुओं, आदि) की पहचान।
      2. प्रत्येक मानक अच्छी तरह से, qPCR 20 से सी टी मूल्य की पहचान।
      3. एम और सी टी के लिए मूल्यों के साथ, निम्न समीकरण का उपयोग पैरामीटर एक और प्रत्येक जीन के लिए बी के साथ एक मानक वक्र उत्पन्न करने के लिए एक रेखीय प्रतिगमन करते हैं, और एक के रूप में आर 2 मूल्य मिलफिट की भलाई के एन सूचक:
        1 समीकरण
      4. मानक वक्र से, गणना प्रत्येक जीन के लिए पीसीआर दक्षता ई:
        2 समीकरण
        नोट: 1.0 (जैसे, ई> 1.1) शारीरिक रूप से यथार्थवादी नहीं है की तुलना में बहुत अधिक से अधिक ई के एक मूल्य; रेखीय प्रतिगमन के लिए एक आर 2 मूल्य बहुत कम से कम 1.0 (जैसे, आर 2 <0.985) का अर्थ है कि मानकों मज़बूती से काम नहीं कर रहे हैं। इन समस्याओं को आम तौर पर संकेत मिलता है कि सबसे कम amplicon मानक विश्वसनीय मात्रा का ठहराव की एक सीमा से नीचे गिर जाता है, और इस तरह से सबसे कम मानक रेखीय प्रतिगमन से बाहर रखा जाना चाहिए। एक पर्याप्त रेखीय प्रतिगमन कम से कम तीन अद्वितीय मानकों का प्रयोग नहीं किया जा सकता है, तो जीन के लिए अभिव्यक्ति माप त्यागें।
      5. अगर रेखीय प्रतिगमन पर्याप्त है, जिसके परिणामस्वरूप फिट मापदंडों ए और बी का उपयोग </ em> प्रत्येक जीन mRNA की संख्या का अनुमान लगाने के लिए के लिए अणुओं मीटर स्था मापा सी टी मूल्य से प्रत्येक एकल कोशिका नमूने में इसी जीन के लिए (× ई आर टी अणुओं की इकाइयों में):
        3 समीकरण
      6. किसी भी माप मीटर स्था नामित <1 मीटर स्था = 0 के रूप में भी, किसी भी माप qPCR में कोई प्रवर्धन और इस प्रकार मीटर स्था = 0 के रूप में कोई सी टी मूल्य के साथ नामित।
        नोट: एक एम स्था सबसे कम से कम या प्रतिगमन में इस्तेमाल सर्वोच्च मानक से अधिक के साथ माप मानक वक्र से एक्सट्रपलेशन से पाए जाते हैं। ये अनुमान जरूरी अवैध नहीं हैं, लेकिन सावधानी के साथ माना जाना चाहिए।
    5. एकल कोशिका जीन अभिव्यक्ति डेटा कल्पना।
      1. एक beeswarm साजिश (Dorn, जे और पवित्र, टी, 2012, http://www.mathworks.com/matlabcentral/filee बनाओXchange / 37105) जिसमें प्रत्येक बिंदु एक विशेष सेल में जीन की अभिव्यक्ति का प्रतिनिधित्व करता है; एक उदाहरण चित्रा 8 में दिखाया गया है।
      2. एक वायलिन साजिश (Dorn, जे 2012, http://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/23661) जिसमें "वायलिन" की चौड़ाई में एक विशेष स्तर के आसपास जीन अभिव्यक्ति माप की आवृत्ति का प्रतिनिधित्व बनाओ विश्लेषण किया कोशिकाओं की आबादी; एक उदाहरण चित्रा 8 में दिखाया गया है।
        नोट: अधिक परिष्कृत विश्लेषण जीन 21, 22 के जोड़े के बीच अभिव्यक्ति में रिश्तों की जांच कर सकते हैं और जीन अभिव्यक्ति नेटवर्क अनुमान कर सकते हैं।

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    Representative Results

    प्रोटोकॉल की एक सामान्य अवलोकन चित्र 1 में दिखाया गया है सेल उपचार, FACS, द्वारा एकल कक्षों के अलगाव के लिए कदम भी शामिल हैं, पीढ़ी और एकल कोशिका lysates, में एकल कक्ष सीडीएनए पुस्तकालयों की पुष्टि से सीडीएनए पुस्तकालयों के पूर्व प्रवर्धन हल कुओं, और qPCR द्वारा जीन अभिव्यक्ति की माप।

    एकल कोशिका अलगाव और जीन अभिव्यक्ति के विश्लेषण के लिए तैयार करने में, यह पहली बार ब्याज की प्रत्येक लक्ष्य जीन के लिए मान्य oligonucleotide प्राइमर जोड़े की पहचान करने के लिए आवश्यक है। चित्रा 2 प्राइमर गुणवत्ता नियंत्रण के तरीकों के दो उदाहरण से पता चलता है। पिघला घटता प्राइमर जोड़ी परीक्षण किया जा रहा के साथ qPCR निम्नलिखित उत्पन्न कर रहे हैं। मान्य प्राइमरों एक भी चोटी (चित्रा 2A, हरी वक्र) के साथ एक पिघल वक्र में परिणाम। कई चोटियों (चित्रा 2A, नीला वक्र) या एक स्पष्ट कंधे के साथ एक वक्र (Figur हैंई 2A, लाल वक्र) मौजूद हैं, यह कई पीसीआर उत्पादों की उपस्थिति को इंगित करता है, और प्राइमरों बदल दिया जाना चाहिए। एक दूसरे की गुणवत्ता नियंत्रण विधि के रूप में, agarose जेल वैद्युतकणसंचलन नेत्रहीन सत्यापित करें कि सही आकार की एक एकल बैंड प्रत्येक प्राइमर का परीक्षण (चित्रा 2 बी) जोड़ी के लिए मौजूद है के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। एकाधिक बैंड या गलत आकार के बैंड से संकेत मिलता है कि प्राइमरों वैध (चित्रा 2 बी) नहीं हैं।

    प्राइमर सत्यापन और सही amplicons से qPCR मानकों के पुस्तकालयों की पीढ़ी के बाद, सेल छँटाई किया जा सकता है। एक उदाहरण छँटाई योजना में 3 चित्र में संकेत दिया है। प्रत्येक हल किया प्लेट प्रत्येक लक्ष्य amplicon के 10, 100, 1000, या 10,000 प्रतियों के साथ, amplicon मानकों की एक कमजोर पड़ने श्रृंखला युक्त कुओं को शामिल करना चाहिए। यह भी कुओं कोई कोशिकाओं, 10 कोशिकाओं, या 100 कोशिकाओं को हल कर रहे हैं जिस में एकल कोशिका कुओं के अलावा, शामिल करने के लिए सिफारिश की है।अक्षमता छँटाई के कारण, यह अक्सर प्लेट, जिसमें एकल कक्षों सफलतापूर्वक जमा किया गया है के कुओं की पहचान करने के लिए आवश्यक है। इस मान्यता के कदम, रिवर्स प्रतिलेखन और विशिष्ट लक्ष्य प्रवर्धन के लिए प्रक्रिया का पालन करने के लिए, qPCR एक गृह व्यवस्था जीन (चित्रा 4) की अभिव्यक्ति को मापने के लिए किया जाना चाहिए। Amplicon मानकों के लिए कुओं (चित्रा 4, काले घटता) समान रूप से स्थान प्रवर्धन घटता दिखाना चाहिए। (; लाल घटता चित्रा 4), "10-सेल" कुओं (चित्रा 4, नीले घटता), और "100-सेल" कुओं (चित्रा 4 वहाँ भी घटता "नहीं-सेल" कुओं के लिए इसी में स्पष्ट विभाजन होना चाहिए ; बैंगनी घटता)। एक स्पष्ट विभाजन भी सफल सेल बयान (चित्रा 4 के लिए इसी "1-सेल" कुओं के लिए होने चाहिए, सी टी मूल्यों कोई सेल नियंत्रण लेकिन जी के लिए उन लोगों से भी कम समय के साथ हरी प्रवर्धन घटताकोई सेल नियंत्रण के लिए उन लोगों के पास सी टी मान) के साथ हरी घटता; बनाम असफल सेल बयान (चित्रा 4 10-सेल नियंत्रण के लिए उन) से reater। एक बार एक सेल lysate के साथ कुओं पहचान की गई है, कुओं से सीडीएनए (एकाधिक प्लेटों से संभावित) एक microfluidic qPCR चिप में स्थानांतरित किया जा सकता है, अच्छी तरह से प्रति एक एकल कोशिका lysate के साथ। उदाहरण के लिए, चित्रा 5 एक काल्पनिक सरणी है कि एकल कक्षों तीन अलग-अलग qPCR विश्लेषण के लिए एक भी नई प्लेट में 96 अच्छी तरह प्लेटें हल किया से सीडीएनए को जोड़ती है पता चलता है।

    Microfluidic qPCR परिणामों का विश्लेषण करने के लिए, नमूने की संभावना है कि एक सेल प्राप्त नहीं किया था, पहले हटा दिया जाना चाहिए के रूप में कई लापता या शून्य जीन अभिव्यक्ति माप (चित्रा 7, तीर द्वारा संकेत पंक्तियों) या असामान्य रूप से कम गृह व्यवस्था जीन अभिव्यक्ति द्वारा संकेत दिया। प्रत्येक परख के लिए, पिघल चोटियों के साथ किसी भी माप है कि othe के उन लोगों से मेल नहीं खातेएक ही परख में आर के नमूने भी हटाया जाना चाहिए। बुरा नमूने और माप हटाने के बाद, रेखीय प्रतिगमन प्रत्येक एकल कोशिका नमूने में ब्याज की प्रत्येक प्रतिलिपि के पूर्ण गिनती अनुमान लगाने के लिए माप amplicon मानकों करने के लिए इसी पर प्रदर्शन किया जा सकता है। 8 चित्रा इन जीन अभिव्यक्ति का अनुमान है, × रिवर्स प्रतिलेखन दक्षता अणुओं की इकाइयों में मापा जाता beeswarm और वायलिन भूखंडों के रूप में के एक दृश्य से पता चलता है। इस उदाहरण में, अनुपचारित कोशिकाओं कई कोशिकाओं सब पर CDKN1A व्यक्त नहीं के साथ और परिमाण के दो आदेशों में फैले स्तरों पर जीन व्यक्त दूसरों के साथ, CDKN1A अभिव्यक्ति के स्तर की एक विस्तृत रेंज को दिखाते हैं। 3 घंटे के लिए neocarzinostatin (NCS) के साथ उपचार के बाद, सबसे कोशिकाओं में बहुत उच्च स्तर CDKN1A एक्सप्रेस, और परिवर्तनशीलता मोटे तौर पर परिमाण के एक आदेश के लिए कम हो जाती है। उपचार बढ़ जाती है की अवधि के रूप में, CDKN1A अभिव्यक्ति की औसत स्तर कम हो जाती है और में परिवर्तनशीलता अभिव्यक्ति का विस्तार है।

    आकृति 1
    चित्रा 1: एकल कोशिका जीन अभिव्यक्ति की रूपरेखा में कदम का अवलोकन। इलाज किया कोशिकाओं काटा और सीधे lysis बफर में FACS के माध्यम से हल किया जाता है। ब्याज की mRNA प्रजातियों रिवर्स लिखित रहे हैं, और जिसके परिणामस्वरूप सीडीएनए पीसीआर से परिलक्षित होता है। प्रत्येक नमूने में हाउसकीपिंग जीन अभिव्यक्ति qPCR से मापा जाता है निर्धारित करने के लिए जो नमूने वास्तव में एक सेल प्राप्त किया। नमूने इस गुणवत्ता नियंत्रण परीक्षण से गुजर रहा है, अप करने के लिए 96 जीनों की अभिव्यक्ति microfluidic qPCR का उपयोग कर मापा जाता है। यह आंकड़ा पिछले एक प्रकाशन 11 से संशोधित किया गया है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

    19 / 55219fig2.jpg "/>
    चित्रा 2: प्राइमर परीक्षण के उदाहरण का परिणाम है। (ए) qPCR से घटता पिघला। नीले पिघल वक्र (TNFRSF10D) कई चोटियों है और लाल पिघल वक्र (TRIM22) एक "कंधे," जो पहली बार चोटी के करीब एक दूसरी शिखर पर मात्रा में है। ये संकेत मिलता है कि उन प्रतिक्रियाओं में इस्तेमाल किया प्राइमरों कई लक्ष्यों को बढ़ाना और बदल दिया जाने की जरूरत है। हरी पिघल वक्र (SCN3B) एक एकल शिखर, प्राइमरों कि एक ही लक्ष्य बढ़ाना साथ सुसंगत है। (बी) के एक agarose जेल पर डीएनए रन प्रवर्धित। SCN3B, TRIM22, और TRPM2 के लिए गलियों कई बैंड होते हैं; उन डीएनए amplicons बनाने के लिए इस्तेमाल प्राइमरों कई लक्ष्यों को बढ़ाना और बदल दिया जाने की जरूरत है। TNFRSF10D के लिए लेन एक एकल बैंड, प्राइमरों कि एक ही लक्ष्य बढ़ाना साथ सुसंगत है। यह ध्यान देने योग्य है कि SCN3B के लिए प्राइमरों पिघल वक्र की परीक्षा उत्तीर्ण लेकिन जेल परीक्षण असफल हो, जबकि TNFRSF10D के लिए उन लोगों को जेल की परीक्षा उत्तीर्ण लेकिन पिघल वक्र असफल लायक हैपरीक्षण; प्राइमर सत्यापन के इन दो तरीकों पूरक हैं। इस उदाहरण में, एक निष्कर्ष निकाल सकते हैं कि सभी चार प्राइमर सेट बदल दिया जाने की जरूरत है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

    चित्र तीन
    चित्रा 3: सेल छँटाई के लिए प्लेट नक्शा। यह प्लेट नक्शा 1-सेल कुओं (लाल), 10 और 100-सेल कुओं (गहरा लाल), मानक (हरा), और कोई सेल कुओं (सफेद) भी शामिल है। एक थाली पर प्रत्येक मानक के दो प्रतिकृति सहित मानकों में परिवर्तनशीलता के लिए क्षतिपूर्ति करने में मदद करता है। 10-सेल और 100-सेल कुओं सहित जीन अभिव्यक्ति के लिए एक मानसिक स्वास्थ्य की जांच के रूप में उपयोगी है। कोई सेल कुओं एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में सेवा करते हैं। टी का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करेंउसका आंकड़ा।

    चित्रा 4
    चित्रा 4: GAPDH अभिव्यक्ति को मापने क्रमबद्ध गुणवत्ता नियंत्रण से qPCR प्रवर्धन घटता का उदाहरण है। कोई-सेल के नमूने (लाल) अभिव्यक्ति की एक पृष्ठभूमि के स्तर दिखा। 1-सेल के नमूने (हरा) दो अलग-अलग समूहों, उच्च अभिव्यक्ति के साथ एक और कोई सेल के नमूने लिए इसी तरह की कम अभिव्यक्ति के साथ एक में विभाजित। उच्च अभिव्यक्ति के नमूने सबसे अधिक संभावना छंटाई के दौरान एक असली सेल प्राप्त; कम-अभिव्यक्ति के नमूने सबसे अधिक संभावना नहीं किया। 10-सेल (नीला) और 100-सेल (बैंगनी) नमूने 1-सेल के नमूने की तुलना में अधिक अभिव्यक्ति दिखाने; 10-सेल के नमूने क्रमबद्ध अक्षमता की वजह से उच्चतम व्यक्त 1-सेल के नमूने के करीब हैं। मानक (काला) समान रूप से वितरित कर रहे हैं जैसा कि उम्मीद थी। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें। </ P>

    चित्रा 5
    चित्रा 5: नमूना का उदाहरण प्लेट नक्शा घोला जा सकता है। यह प्लेट नक्शा qPCR (H11-H12 के लिए तीन अलग-अलग प्लेट (पंक्तियों एजी) से 1-सेल के नमूने, सभी तीन प्लेट (H1-H8), कोई सेल नियंत्रण (H9-एच 10) से मिलाया मानकों और कोई टेम्पलेट नियंत्रण भी शामिल है )। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

    चित्रा 6
    चित्रा 6: लोड हो रहा है (1, 2, 3 ...) के आदेश के साथ microfluidic qPCR चिप का आरेख। पायदान (A1) थाली के शीर्ष बाएँ कोने है। Thi का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करेंएस आंकड़ा।

    चित्रा 7
    चित्रा 7: qPCR परिणाम की गर्मी नक्शा। प्रत्येक पंक्ति में एक 1-सेल नमूना, मानक, या नियंत्रण का प्रतिनिधित्व करता है; प्रत्येक स्तंभ एक मापा प्रतिलेख प्रतिनिधित्व करता है। काले वर्गों या X (तीर) का एक असामान्य संख्या के साथ पंक्तियों की संभावना नमूने है कि एक वास्तविक सेल प्राप्त नहीं किया संकेत मिलता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

    आंकड़ा 8
    8 चित्रा: Beeswarm और वायलिन भूखंडों। एक beeswarm साजिश (नीला अंक) में, प्रत्येक बिंदु एक विशेष सेल में जीन की अभिव्यक्ति का प्रतिनिधित्व करता है। एक वायलिन साजिश (ग्रे आकार) में, "वायलिन" की चौड़ाई जीन अभिव्यक्ति measu की आवृत्ति का प्रतिनिधित्व करता हैविश्लेषण किया कोशिकाओं की आबादी में एक विशेष स्तर के आसपास rements। हल्के नीले रंग की सलाखों के सबसे कम मानक प्रतिनिधित्व करते हैं। नीले सलाखों के ऊपर माप, मानकों के बीच interpolated रहे हैं, जबकि नीले सलाखों के भीतर माप extrapolated रहे हैं। यहाँ दिखाया गया डेटा MCF 7 कोशिकाओं आदेश डीएनए डबल कतरा टूटता के लिए प्रेरित करने में संकेत समय के लिए neocarzinostatin (NCS) के साथ इलाज वीनस टैग P53 को व्यक्त करने में CDKN1A अभिव्यक्ति की माप कर रहे हैं। यह आंकड़ा पिछले प्रकाशन 11 से संशोधित किया गया है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

    शर्त तापमान पहर
    पकड़ 50 डिग्री सेल्सियस 15 मिनट
    पकड़ 95 डिग्री सेल्सियस 2 मिनट
    20 चक्र 95 डिग्री सेल्सियस 15 सेकंड
    60 डिग्री सेल्सियस 4 मिनट
    पकड़ 4 डिग्री सेल्सियस ∞

    तालिका 1: रिवर्स प्रतिलेखन और विशिष्ट लक्ष्य प्रवर्धन (RTSTA) थर्मल साइकिल कार्यक्रम।

    शर्त तापमान पहर
    पकड़ 37 डिग्री सेल्सियस 30 मिनट
    पकड़ 80 डिग्री सेल्सियस 15 मिनट
    पकड़ 4 डिग्री सेल्सियस ∞

    तालिका 2: exonuclease मैं उपचार (EXOI) थर्मल साइकिल कार्यक्रम।

    अंग वॉल्यूम / अच्छी तरह से (μl) 96 खंडों डब्ल्यू / 10% व्यय (μl)
    2x प्रतिक्रिया मिश्रण 5.00 528.00
    रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस / पोलीमर्स मिश्रण 0.20 21.12
    10x एसटीए प्राइमर मिश्रण 1.00 105.60
    2.64 यू / μl (पतला) RNAse अवरोध 0.02 2.00
    Nuclease मुक्त पानी 0.78 82.48
    कुल 7.00 739.20

    तालिका 3: कोशिकाओं के लिए lysis बफर के अवयव।

    अंग वॉल्यूम / अच्छी तरह से (μl) 96 खंडों डब्ल्यू / 10% व्यय (μl)
    Nuclease मुक्त पानी 2.52 266.00
    Exonuclease मैं प्रतिक्रिया बफर (10x) 0.36 38.00
    Exonuclease मैं (20 यू / μl) 0.72 76.00
    कुल 3.60 380.00

    सारणी 4: exonuclease के घटक प्रवर्धित सीडीएनए नमूने के इलाज के लिए मिश्रण।

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    Discussion

    हम संस्कृति में विकसित पक्षपाती कोशिकाओं की आबादी से अलग-अलग स्तनधारी कोशिकाओं को अलग करने के लिए और प्रत्येक कोशिका में लगभग 96 जीनों की अभिव्यक्ति परख करने की क्रिया के लिए एक विधि प्रस्तुत किया है। अच्छा अग्रिम तैयारी के लिए महत्वपूर्ण इस विधि में अच्छी तरह से काम करने के लिए है। विशेष रूप से, डिजाइन और परीक्षण प्राइमर जोड़े ब्याज के टेप (कदम 1.2-1.3) के लिए विशिष्ट रूप में प्राइमरों एकल कोशिका माप की गुणवत्ता का निर्धारण, समय लेने वाली है, लेकिन महत्वपूर्ण कदम उठाए हैं। एक बार विश्वसनीय प्राइमर जोड़े प्राप्त किया गया है, वे ब्याज के टेप से सीडीएनए बढ़ाना इस्तेमाल कर रहे हैं; amplicons तो equimolar मात्रा में एक साथ संयुक्त कर रहे हैं मानकों (1.4 चरण) बनाने के लिए। के रूप में मानकों पूर्ण प्रतिलेख मायने रखता अनुमान लगाने के लिए आवश्यक हैं यह कदम महत्वपूर्ण है; मानकों, एक बार किया जाना चाहिए aliquoted, और सेल छँटाई और जीन अभिव्यक्ति माप के बाद के सभी राउंड के लिए इस्तेमाल किया। इसी तरह, दिन है कि कोशिकाओं को हल कर रहे हैं, यह विशेष रूप से importan हैटी मानकों को ध्यान से कम बाध्यकारी पिपेट सुझावों और microcentrifuge ट्यूब का उपयोग जब lysis बफर के प्लेट (कदम 3.7 और 3.11) बनाने कमजोर करने के लिए। सेल सॉर्टर एमिंग (4.2 कदम) एक और महत्वपूर्ण कदम है; इस क्रम में बहुत सावधानी से किया जाना चाहिए कोशिकाओं को सफलतापूर्वक एक पीसीआर थाली में lysis बफर के 9 μl का लक्ष्य प्राप्त करने के लिए।

    वहाँ प्रोटोकॉल है कि अनुसंधान की जरूरत की एक किस्म के लिए अनुकूल बनाया जा सकता करने के लिए कई संशोधन कर रहे हैं। यहाँ, हम एक डीएनए बाध्यकारी डाई आधारित qPCR दृष्टिकोण है, जो जीन अभिव्यक्ति बढ़ाता के लिए एक अपेक्षाकृत सस्ती तरीका प्रदान करता है पर ध्यान केंद्रित किया। हालांकि, इस पद्धति एक फ्लोरोसेंट संकेत में बंद लक्ष्य दृश्यों, परिणामों की भी है कि एक उच्च पृष्ठभूमि संकेत बनाने, किसी भी परिलक्षित डीएनए के बाद से, के लिए क्षमता है। ऐसी पृष्ठभूमि सुनिश्चित करना है कि प्राइमर एक विशेष लक्ष्य बढ़ाना इस्तेमाल जोड़ी एक भी चरम पर है और सही आकार का एक भी पीसीआर उत्पाद (चित्रा 2 के साथ एक पिघल वक्र पैदावार द्वारा कम किया जा सकता है)। पृष्ठभूमि अभी भी इस तरह के गुणवत्ता नियंत्रण के तरीकों का उपयोग करने के बाद एक चिंता का विषय है, तो इस मामले की जांच के आधार पर qPCR दृष्टिकोण अभिकर्मकों का अधिक से अधिक कीमत पर बंद लक्ष्य का पता लगाने के लिए कम से कम करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है यद्यपि। एक अन्य विकल्प के एक नेस्टेड पीसीआर दृष्टिकोण है, जो में प्राइमरों के एक सेट रिवर्स टाइप करने के लिए और प्रतिलिपि के एक बड़े क्षेत्र और प्राइमरों की एक दूसरे सेट है, जो कि बड़े क्षेत्र के भीतर निहित एक छोटे क्षेत्र amplifies बढ़ाना RTSTA चरण में इस्तेमाल किया जाता है हो सकता है , qPCR द्वारा जीन अभिव्यक्ति को मापने के लिए प्रयोग किया जाता है। इस दृष्टिकोण से बाध्यकारी डाई आधारित qPCR 23 डीएनए की विशिष्टता में सुधार करने के लिए दिखाया गया है।

    कई तरीकों जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण के लिए व्यक्तिगत कोशिकाओं को अलग करने के लिए उपलब्ध हैं। सेल अलगाव विधि का चुनाव उपकरण (जैसे एक प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल सॉर्टर के रूप में) की उपलब्धता सहित कई कारकों पर निर्भर करता है, कोशिकाओं का स्रोत (जैसे एक ऊतक से प्राथमिक कोशिकाओं की तुलना में स्थापित सेल लाइनों के रूप में) का मूल्यांकन किया जाना है, याजिस गति के साथ कोशिकाओं को अलग किया जाना चाहिए। इस प्रोटोकॉल में प्रस्तुत उदाहरण में, हम एक सेल लाइन एक स्पष्ट रूप से पहचाने जाने फ्लोरोसेंट टैग प्रोटीन व्यक्त की FACS इस्तेमाल किया। FACS दुर्लभ सेल का पता लगाने क्षमताओं और अपेक्षाकृत तेजी से सेल अलगाव का लाभ है। विधि से एक चुनौती है कि एक 96 अच्छी तरह से पीसीआर थाली में lysis बफर के अपेक्षित छोटी मात्रा में ब्याज की कोशिकाओं के बयान अक्षम हो सकता है और एक सफल अलगाव सुनिश्चित करने के लिए सेल छँटाई ज्यामिति के अनुकूलन की आवश्यकता हो सकती है। वैकल्पिक दृष्टिकोण है कि कम गति और / या उच्च लागत पर सेल अलगाव में अधिक से अधिक सटीक करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं व्यक्ति की कोशिकाओं के micropipetting, एक ट्यूमर नमूना से विशिष्ट कोशिकाओं की लेजर कब्जा microdissection, या microfluidic सिस्टम के उपयोग (जैसे, Fluidigm C1 शामिल प्रणाली)।

    यहां वर्णित प्रोटोकॉल का एक प्रमुख लाभ यह है कि आंतरिक नियंत्रण, शुद्ध पीसीआर amplicons के कमजोर पड़ने श्रृंखला, ई है प्रत्येक कोशिका में प्रत्येक प्रतिलिपि की पूर्ण संख्या के आकलन NABLE। इन मानकों के बिना, जीन अभिव्यक्ति के ही रिश्तेदार का स्तर सी टी मूल्यों से निकाली गई गणना के आधार पर प्राप्त किया जा सकता है। हालांकि, इन मानकों के साथ, पूर्ण प्रतिलेख मायने रखता है, अनुमान लगाया जा सकता आदर्श ठीक मात्रा निर्धारित मानकों amplicon (8 चित्रा) की सीमा के भीतर प्रक्षेप के माध्यम से। जीन अभिव्यक्ति मात्रा का ठहराव के किसी भी पीसीआर आधारित विधि के साथ के रूप में, सटीक पूर्ण मात्रा का ठहराव प्रत्येक प्रक्रिया की दक्षता, रिवर्स प्रतिलेखन सहित के ज्ञान की आवश्यकता है।

    एकल कक्षों में प्रतिलेख के स्तर को बढ़ाता में एक मौजूदा चुनौती यह है कि कई तरीकों के लिए पता लगाने की सीमा, सेल 24 प्रति 10-100 mRNAs होने की transcriptome की एक महत्वपूर्ण प्रतिशत के विश्वसनीय मात्रा का ठहराव रोकने अनुमान है। एक वैकल्पिक दृष्टिकोण के रूप में, एक विशेष रुचि के लक्ष्यों को यों तो smRNA मछली का उपयोग कर सकते हैंगधा = "xref"> 25, 26, बहुत कुछ टेप के साथ उन सहित। SmRNA मछली के क्षेत्र में अग्रिम अलग टेप की संख्या 27 है कि एक बार में पता लगाया जा सकता है और कोशिकाओं है कि एक बार 28 में profiled जा सकता है की संख्या, उचित उपकरण दिए गए विस्तार किया है। smRNA मछली अपनी ही सीमाएँ यद्यपि (संभावित झूठी सकारात्मक और नकारात्मक झूठी प्रतिलेख का पता लगाने, सेल प्रति केवल कुछ ही लक्ष्य जीन के लिए प्रतिबंध, उपकरण और अभिकर्मकों की लागत), यह एक शक्तिशाली विधि के पूरक हैं और एक से परिणामों को मान्य करने के लिए प्रदान कर सकता है ब्याज का लक्ष्य जीन की एक सबसेट की qPCR आधारित विश्लेषण।

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    Acknowledgments

    हम इस प्रोटोकॉल के विकास के दौरान सेल छँटाई प्रदर्शन करने में उसकी सहायता के लिए सीसीआर ETIB से फ्लो कोर में वी कपूर का शुक्रिया अदा करना चाहते हैं। हम भी इस प्रोटोकॉल के विकास के दौरान qPCR प्रदर्शन करने में उनकी सहायता के लिए एम Raffeld और सीसीआर एल.पी. आण्विक निदान यूनिट और जे झू और NHLBI डीएनए अनुक्रमण और जीनोमिक्स कोर धन्यवाद। इस शोध एनआईएच के अंदर का प्रोग्राम द्वारा समर्थित किया गया।

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    RNeasy Plus Mini Kit Qiagen 74134
    High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit with RNase Inhibitor ThermoFisher 4374966
    Phusion High-Fidelity DNA Polymerase New England BioLabs M0530S
    QIAquick Gel Extraction Kit Qiagen 28704
    Quant-iT High-Sensitivity dsDNA Assay Kit ThermoFisher Q33120 
    2.0 ml low adhesion microcentrifuge tubes USA Scientific 1420-2600
    DNA Suspension Buffer Teknova T0221
    Axygen 0.2 ml Maxymum Recovery Thin Wall PCR Tubes Corning PCR-02-L-C
    GE 96.96 Dynamic Array DNA Binding Dye Sample & Assay Loading Reagent Kit Fluidigm 100-3415
    HyClone RPMI 1640 media GE Healthcare Life Sciences SH30027.01
    Fetal Bovine Serum, Certified (US) ThermoFisher 16000-044
    Antibiotic-Antimycotic Solution Corning 30-004-CI
    Neocarzinostatin Sigma N9162
    ELIMINase Decon Labs 1101
    SUPERase-In ThermoFisher AM2696
    CellsDirect One-Step qRT-PCR Kit ThermoFisher 11753500
    E. coli DNA Affymetrix 14380 10 MG
    ThermalSeal Sealing Film, Sterile Excel Scientific STR-THER-PLT
    BD FACSAria IIu BD Biosciences
    HyClone Trypsin 0.05% GE Healthcare Life Sciences SH30236.01
    PBS, 1x Corning 21-040-CV
    Falcon 40 µm Cell Strainer Corning 352340
    Exonuclease I New England BioLabs M0293S
    SsoFast EvaGreen Supermix with Low ROX Bio-Rad 172-5210
    96.96 Dynamic Array IFC for Gene Expression (microfluidic qPCR chip) Fluidigm BMK-M-96.96
    IFC Controller HX (loading machine) Fluidigm
    BioMark or BioMark HD (microfluidic qPCR machine) Fluidigm
    Real-Time PCR Analysis software  Fluidigm
    MATLAB software MathWorks

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

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    आनुवंशिकी अंक 120 एकल कक्ष qPCR प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल छँटाई stochasticity आंतरिक मानकों सेल भाग्य का निर्णय
    एकल कोशिका जीन अभिव्यक्ति की रूपरेखा आंतरिक मानकों के साथ FACS और qPCR का उपयोग
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    Porter, J. R., Telford, W. G.,… More

    Porter, J. R., Telford, W. G., Batchelor, E. Single-cell Gene Expression Profiling Using FACS and qPCR with Internal Standards. J. Vis. Exp. (120), e55219, doi:10.3791/55219 (2017).

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