내부 기준에 FACS 및 qPCR에 사용 단일 세포 유전자 발현 프로파일 링
Summary
We describe a method to sort single mammalian cells and to quantify the expression of up to 96 target genes of interest in each cell. This method includes the use of internal qPCR standards to enable the estimation of absolute transcript counts.
Abstract
Gene expression measurements from bulk populations of cells can obscure the considerable transcriptomic variation of individual cells within those populations. Single-cell gene expression measurements can help assess the role of noise in gene expression, identify correlations in the expression of pairs of genes, and reveal subpopulations of cells that respond differently to a stimulus. Here, we describe a procedure to measure the expression of up to 96 genes in single mammalian cells isolated from a population growing in tissue culture. Cells are sorted into lysis buffer by fluorescence-activated cell sorting (FACS), and the mRNA species of interest are reverse-transcribed and amplified. Gene expression is then measured using a microfluidic real-time PCR machine, which performs up to 96 qPCR assays on up to 96 samples at a time. We also describe the generation and use of PCR amplicon standards to enable the estimation of the absolute number of each transcript. Compared with other methods of measuring gene expression in single cells, this approach allows for the quantification of more distinct transcripts than RNA FISH at a lower cost than RNA-Seq.
Introduction
집단 내의 개별 셀은 균일 생리적 자극 1,2,3,4 널리 상이한 응답을 표시 할 수있다. 인구의 세포의 유전 적 변이는 응답이 다양한 한기구이지만, 심지어 세포의 클론 인구에서, 응답의 변동성을 증가시킬 수있는 몇 가지가 아닌 유전 적 요인도 있습니다. 예를 들어, 각각의 단백질과 다른 중요한 신호 분자의 농도는 하류의 유전자 발현 프로파일의 변동을 초래하는, 셀별로 달라질 수있다. 또한, 유전자 활성화 버스트 7, 8, 9 당 사체 비교적 적은 수로 제한 될 수있다 사체 (5), (6)의 짧은 지속 기간의 버스트에서 발생할 수있다. 이러한유전자 활성화에 확률 성이 크게 생물학적 반응의 다양성에 기여하고, 생리 학적 자극에 반응하는 미생물 (10) 및 포유 동물 세포 (1)에 2 선택적인 이점을 제공 할 수있다. 인해 변형 모두 유전 및 비유 전적 소스, 자극에 대한 응답에서 특정 셀의 유전자 발현 프로파일은 벌크 응답의 측정으로부터 구한 평균 유전자 발현 프로파일과 크게 다를 수있다. 개별 세포가 자극에 응답하여 변화 표시되는 범위를 결정하는 개별 세포의 분리를위한 기술을 필요로 관심 사체에 대한 발현 수준을 측정하고, 얻어진 발현 데이터의 계산 분석.
비용의 넓은 범위를 덮고, 단일 세포에서의 유전자 발현을 분석하기위한 몇 가지 방법이 있으며, 전 사체의 수 프로브 및정량의 정확성. 예를 들어, 단일 셀 RNA-SEQ은 전사 따르면 개별 셀에서 가장 높은 발현 유전자 고유 사체 수천 정량화하는 능력의 다양한 깊이를 구비하고; 비용 감소를 계속하지만 그러나, 이러한 시퀀싱 깊이와 관련된 비용이 엄청날 수있다. 반대로, 현장 하이브리드 (smRNA의 FISH)에서 단일 분자 RNA의 형광에 대한 성적 증명서의 정확한 정량을 제공에도 낮은 발현 관심의 유전자에 따라 합리적인 비용으로 유전자; 그러나, 표적 유전자의 소수만이 방법에 의해 주어진 셀에서 분석 될 수있다. 이 프로토콜에 설명 된 정량 PCR 기반의 분석은, 이러한 기술 사이의 중간을 제공합니다. 이 분석은 96 개의 셀을 한 번에 관심 96 사체까지 정량화하는 마이크로 유체 실시간 PCR 기계를 사용한다. 상기 한 방법들의 각각은 필요한 하드웨어 비용이 있지만, 개별의 qPCR 분석의 비용은 상대적이며낮은. 이 프로토콜은 마이크로 유체 실시간 PCR 기기의 제조업체 (프로토콜 ADP 41, 플루)에 의해 제안 된 하나에서 적응된다. PCR을 기반 접근 방식의 각 증명서의 절대 수의 추정을 가능하게하기 위해, 우리는 여러 실험을 통해 사용할 수있는 준비된 표적 유전자의 증폭의 내부 통제의 사용을 할 수있는 프로토콜을 확장했다.
이 기술의 일례로서, MCF-7 인간 유방암 세포에서 p53 유전자에 의해 조절 유전자 발현의 정량화 11를 설명한다. 세포는 DNA 이중 가닥 휴식을 유도하는 화학 제로 도전. 이전의 연구는 DNA 이중 가닥 나누기에 p53의 응답이 모두 p53의 수준 (12)의 측면에서 별개의 표적 유전자 (11)의 활성화에 개별 셀의 이질성의 큰 거래를 나타내는 것으로 나타났습니다. 또한, p53의 100 개 이상의 발현을 조절세포주기 억류, 아폽토시스 및 노화 13, 14을 포함한 다수의 다운 스트림 경로에 관여 표적 유전자를 잘 특성화. 각 세포에서 p53에 매개 반응은 복잡하고 변수 모두이기 때문에, 접근법에서 시스템 이익 분석은 거의 100 표적 유전자는 예컨대 이하에 설명하는 개별 세포를 동시에 탐색 할 수있다. (예 : 단일 셀 분리 및 용해를위한 대안의 방법)를 약간의 수정 프로토콜 용이 포유 동물 세포 유형 성적 및 세포 반응의 다양한 연구에 적용 할 수 있습니다.
적절한 사전 준비로, 세포 선별 유전자 발현 측정 라운드는 3 일 동안이 프로토콜에 따라 수행 될 수있다. 다음 타이밍 제안 : 사전에 관심있는 성적표를 선택 파악하고 그 transcr에서의 cDNA를 증폭 프라이머 쌍을 확인IPTS, 그리고 표준과 그 프라이머를 이용하여 프라이머 믹스를 준비합니다. 1 일에, 세포 치료, 수확을 다음과 세포를 분류, 역전사 및 특정 대상 증폭을 수행하고, 비법 인 프라이머를 제거하는 엑소 뉴 클레아 제와 샘플을 취급합니다. 제 2 일에, qPCR에를 사용하여 정렬 세포에 대한 품질 관리를 수행합니다. 마지막 3 일에 qPCR에 미세 유체를 이용하여 정렬 세포에서 유전자 발현을 측정한다. 그림 1은 관련된 단계를 요약 한 것입니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
우리는 배양에서 성장 부착 세포 집단에서 개별 포유 동물 세포를 분리하는 각 셀에서 약 96 유전자의 발현을 분석하기위한 방법을 제시하고있다. 이 방법은 잘 작동하는 좋은 사전 준비는 매우 중요하다. 프라이머는 단일 셀 측정의 품질을 결정으로서 특히 주목 사체 (1.2~1.3 단계) 특정 설계 및 테스트 프라이머 쌍은, 시간 소모적이지만 중요한 단계이다. 신뢰할 수있는 프라이머 쌍을 얻을되고 ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는이 프로토콜의 개발 과정에서 셀 정렬을 수행하는 그녀의 도움에 대해 CCR ETIB 유동 세포 계측법 코어에서 V. 카푸어에게 감사의 말씀을 전합니다. 우리는 또한이 프로토콜의 개발하는 동안 qPCR에를 수행에서의 원조 M. Raffeld과 CCR LP 분자 진단 장치 및 J. 주홍 및 NHLBI DNA 시퀀싱 및 유전체학 코어 감사합니다. 이 연구는 NIH의 교내 프로그램에 의해 지원되었다.
Materials
| RNeasy Plus Mini Kit | Qiagen | 74134 | |
| High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit with RNase Inhibitor | ThermoFisher | 4374966 | |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | New England BioLabs | M0530S | |
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | |
| Quant-iT High-Sensitivity dsDNA Assay Kit | ThermoFisher | Q33120 | |
| 2.0-mL low adhesion microcentrifuge tubes | USA Scientific | 1420-2600 | |
| DNA Suspension Buffer | Teknova | T0221 | |
| Axygen 0.2-mL Maxymum Recovery Thin Wall PCR Tubes | Corning | PCR-02-L-C | |
| GE 96.96 Dynamic Array DNA Binding Dye Sample & Assay Loading Reagent Kit | Fluidigm | 100-3415 | |
| HyClone RPMI 1640 media | GE Healthcare Life Sciences | SH30027.01 | |
| Fetal Bovine Serum, Certified (US) | ThermoFisher | 16000-044 | |
| Antibiotic-Antimycotic Solution | Corning | 30-004-CI | |
| Neocarzinostatin | Sigma | N9162 | |
| ELIMINase | Decon Labs | 1101 | |
| SUPERase-In | ThermoFisher | AM2696 | |
| CellsDirect One-Step qRT-PCR Kit | ThermoFisher | 11753500 | |
| E. coli DNA | Affymetrix | 14380 10 MG | |
| ThermalSeal Sealing Film, Sterile | Excel Scientific | STR-THER-PLT | |
| BD FACSAria IIu | BD Biosciences | ||
| HyClone Trypsin 0.05% | GE Healthcare Life Sciences | SH30236.01 | |
| PBS, 1x | Corning | 21-040-CV | |
| Falcon 40µm Cell Strainer | Corning | 352340 | |
| Exonuclease I | New England BioLabs | M0293S | |
| SsoFast EvaGreen Supermix with Low ROX | Bio-Rad | 172-5210 | |
| 96.96 Dynamic Array IFC for Gene Expression (microfluidic qPCR chip) | Fluidigm | BMK-M-96.96 | |
| IFC Controller HX (loading machine) | Fluidigm | ||
| BioMark or BioMark HD (microfluidic qPCR machine) | Fluidigm | ||
| Real-Time PCR Analysis software | Fluidigm | ||
| MATLAB software | MathWorks |
References
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