Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Genetics

Encellede Gene Expression Profilering hjelp FACS og qPCR med interne standarder

doi: 10.3791/55219 Published: February 25, 2017

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Individuelle celler i en populasjon kan vise vidt forskjellige responser til en ensartet fysiologisk stimulans en, to, tre, fire. Den genetiske variasjon av celler i en populasjon er en mekanisme for denne rekke reaksjoner, men det finnes også flere ikke-genetiske faktorer som kan øke variasjonen av responser, selv i en klonal populasjon av celler. For eksempel kan nivåene av individuelle proteiner og andre viktige signalmolekyler variere på en celle-for-celle-basis, noe som gir opphav til variasjon i nedstrøms genekspresjonsprofiler. I tillegg kan genaktivering forekomme i kortvarige utbrudd av transkripter 5, 6 som kan være begrenset til et relativt lite antall transkripter pr burst 7, 8, 9. Slikstochasticity i genaktivering i stor grad kan bidra til variasjon i biologiske reaksjoner, og kan gi en selektiv fordel i mikroorganismer 10 og i pattedyrceller 1, 2 svarer på en fysiologisk stimulans. På grunn av både genetiske og ikke-genetiske kilder for variasjon, kan genekspresjonen profilen til en gitt celle som respons på en stimulus være svært forskjellig fra den gjennomsnittlige genekspresjon profilen oppnådd fra målingen av masseresponsen. Å bestemme i hvilken grad de enkelte cellene vise forskjell i respons på en stimulus krever teknikker for isolering av individuelle celler, er målingen av uttrykket nivåer for transkripter av interesse, og den matematisk analyse av de resulterende data uttrykk.

Det er flere tilnærminger for analysering av genekspresjon i enkeltceller, som dekker et bredt spekter av kostnader, antall transkripter undersøkt, ognøyaktigheten av kvantifisering. For eksempel, enkelt-celle RNA-Seq tilbyr et bredt dybde av transkripsjon dekning og evnen til å kvantifisere tusener av distinkte transkripter for de høyt uttrykte gener i individuelle celler; imidlertid, kan kostnadene forbundet med slik sekvensering dybde være prohibitive, selv om kostnadene fortsetter å avta. Omvendt, single-molekyl RNA fluorescens in situ hybridisering (smRNA FISH) gir presis kvantifisering av transkripsjoner for selv lave uttrykke genene til en rimelig pris per genet av interesse; kan imidlertid bare et lite antall av målgener bli analysert i en gitt celle ved denne tilnærming. Kvantitative PCR-baserte analyser, som beskrevet i denne protokollen, gir en mellomting mellom disse teknikkene. Disse analysene ansette en microfluidic real-time PCR maskin for å kvantifisere opptil 96 transkripsjoner av interesse om gangen i inntil 96 celler. Selv om hver av de forannevnte fremgangsmåter har de nødvendige maskinvarekostnader, er kostnaden for en hvilken som helst individuell qPCR-analyse relativtlav. Denne protokollen er tilpasset fra en foreslått av en produsent av en mikrofluid real-time PCR maskin (Protocol ADP 41, Fluidigm). For å aktivere estimering av det absolutte antall av hver transkripsjon i en PCR-basert tilnærming, har vi utvidet protokollen til å gjøre bruk av interne kontroller preparerte target gen amplikonene som kan brukes på tvers av flere eksperimenter.

Som et eksempel på denne teknikk blir kvantifisering av ekspresjonen av gener regulert av p53 tumor suppressor i MCF-7 humane brystcancer-celler som er beskrevet 11. Cellene blir utfordret med et kjemisk middel som induserer DNA dobbelttrådbrudd. Tidligere studier har vist at p53 svar på DNA-dobbelttrådbrudd viser stor heterogenitet i enkeltceller, både i form av p53 nivåer 12 og i aktivering av forskjellige målgener 11. Videre regulerer p53 ekspresjonen av over 100godt karakterisert målgener involvert i en rekke nedstrøms veier, inkludert cellesyklus arrest, apoptose, og senescence 13, 14. Siden p53-mediert respons i hver celle er både komplisert og variabel, analyse av systemet drar nytte av en tilnærming der nesten 100 målgener kan bli analysert samtidig i individuelle celler, slik som den som er beskrevet nedenfor. Med små modifikasjoner (slik som alternative fremgangsmåter for enkeltcelleisolasjon og lyse) kan protokollen lett tilpasses for å studere et bredt utvalg av pattedyrcelletyper, transkripter, og cellulære responser.

Med riktig forhånd forberedelser, kan en runde med celle sortering og genekspresjon måling utføres i henhold til denne protokoll over en periode på tre dager. Følgende timing er foreslått: på forhånd, velger transkripsjoner av interesse, identifisere og validere primer parene som forsterker cDNA fra de transcrIPTS, og forberede de standarder og primerblandinger bruker disse primere. På dag 1 etter cellen behandling, høsting og sorterer cellene, utføre revers transkripsjon og bestemt mål forsterkning, og behandle prøvene med en eksonuklease for å fjerne kommunefritt primere. På dag to, kvalitetssikre sortert celler ved hjelp av qPCR. Til slutt, på dag tre, måle genuttrykk i de sorterte celler ved hjelp microfluidic qPCR. Figur 1 oppsummerer de trinnene som er involvert.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. Advance Utarbeidelse

  1. Velg opp til 96 gener av interesse hvis uttrykk vil bli målt.
    MERK: Minst ett av disse genene bør være en "husholdningsgenet", slik som ACTB eller GAPDH, som er kjent for å bli uttrykt ved et forholdsvis høyt og konstant nivå under de betingelser som anvendes i forsøket. Dette genet vil bli brukt til å identifisere positivt sortert brønner (trinn 8.1) og amplifiserte prøver (trinn 10.1).
    MERK: For eksempel eksperiment, godt karakterisert, direkte mål av p53 med en rekke kjente funksjoner 11, 14 og GAPDH som en renhold kontroll ble valgt. Vennligst se referanse 11 for en komplett liste over mål gener og primer sekvenser brukt i denne studien.
  2. Identifisere potensielle primerpar spesifikke gener av interesse (f.eks ved hjelp av vitenskapelig litteratur eller en primer designverktøy som Primer-BLAST) 15. Har primers syntetisert og opprettholde dem i en lager-konsentrasjon på 100 pM i nuklease-fri vann.
    MERK: Disse primere bør være 15-25 baser lang; produsere en amplicon 90-130 basepar (bp) lange; span en ekson veikryss, hvis det finnes, for å redusere sjansen for å forsterke genomisk DNA; har smeltetemperaturer på 60 ± 1 ° C; og har minimal sekundærstruktur 16. Disse primere vil bli brukt for å prime revers transkripsjon, amplifisere cDNA fra transkripsjoner av interesse, og måle genekspresjon i DNA-bindende fargestoffbasert qPCR.
  3. Validere primere.
    1. Først oppnå cDNA fra cellene av interesse. Høste RNA fra cellene ved hjelp av en RNA-høsting sett i overensstemmelse med produsentens instruksjoner eller standard molekylærbiologiske metoder 17. Omvendt-transkribere RNA til cDNA ved hjelp av en omvendt transkripsjon kit med tilfeldige heksamer i henhold til produsentens instruksjoner eller standard metods 17.
    2. For hver primer par, satt opp qPCR med DNA-bindende fargestoff mester mix, forover og bakover primere, og cDNA fra forrige trinn, etter master mix produsentens anbefalinger for foreslåtte reaksjonsbetingelser. Kjør disse reaksjonene på en real-time PCR maskin ved hjelp av en termisk sykling protokoll anbefalt av master mix produsenten som omfatter smeltekurve oppkjøpet.
    3. Etter qPCR, drives de amplifiserte DNA-prøver på en 2% vekt / volum agarosegel og visualisere DNA via en DNA-interkalerende fargestoff etter en standard protokoll 17.
    4. Bestemme effektiviteten av primer-par ved å konstruere en standardkurve fra seriefortynninger av cDNA (fremstilt i trinn 1.3.1) i henhold til en standard protokoll 16.
      MERK: En god primerparet vil gi en smeltekurve med en enkelt, veldefinert topp og et enkelt bånd på den forventede plassering på gelen 16, opp class = "xref"> 17 (figur 2). Dersom smeltekurven har flere topper eller en "skulder" eller om gelen har flere band eller en flekk, blir primerne å forsterke et off-target-sekvensen. Redesign noen primere som er observert å forsterke off-target-sekvenser og gjenta de foregående validerings trinn etter behov. En god primerpar vil også ha en virkningsgrad på 90-110%, med R2 ≥0.985 for standardkurven 16; redesign noen primere som effektiviteten eller R2 faller utenfor disse områdene.
  4. Forbered standarder fra renset DNA amplikonene.
    1. For hver validert primerpar:
      1. Forsterke regionen av interesse fra cDNA ved hjelp av en high-fidelity DNA polymerase ifølge polymerase produsentens anbefalinger for primer og mal DNA-konsentrasjoner, reaksjonsbetingelser, og PCR sykkelforholdene, eller bruke en standard PCR protokoll"xref"> 17.
      2. Kjør amplifiserte cDNA på en 2% vekt / volum agarosegel og visualisere bandet med en DNA-interkalerende fargestoff 17. Vesenet bandet representerer amplicon med en ren barberblad og plasser gel brikke i et mikrosentrifugerør.
      3. Rens fragment fra gelen ved anvendelse av en standard gel ekstraksjonsmetode, slik som en agarase-basert ekstraksjon 17 eller en spin-kolonne gel ekstraksjon kit, i henhold til produsentens instruksjoner.
      4. Måle konsentrasjonen av amplikonet ved anvendelse av en fluorescens-basert dsDNA kvantifisering sett i overensstemmelse med produsentens instruksjoner. Dele den målte dsDNA konsentrasjonen av den kjente molekylvekt av amplikonet basert på amplikonet sekvens for å oppnå antall amplikon molekyler pr ul.
      5. I et 2,0 ml lav-bindende mikrofugerør, tilsett 2 mL av renset fragment til et volum på DNA suspensjon buffer slik at sluttkonsentrasjonen av ampLicon er 5 x 10 8 molekyler / mikroliter.
    2. Når alle amplikonene har blitt renset, kombinere 18 ul av hver renset amplikon i et 2,0 ml lav-bindende mikrosentrifugerør. Legg DNA suspensjon buffer til et totalt volum på 1800 pl; således er konsentrasjonen av hvert fragment er 5 x 10 6 molekyler / mikroliter.
      MERK: Denne blandingen, som inneholder cDNA-amplikonene fra alle gener av interesse i kjente ekvimolare mengder, vil tjene som en standard i enkelt-celle qPCR.
    3. Vortex denne "5e6" standard grundig, spin for 10 sek ved 2000 xg, og dele inn i 20 ul porsjoner i lav-bindende PCR-rørene. Lagre alikvotene ved -80 ° C.
  5. Klargjør bestemt mål forsterkning (STA) primer mix (10x).
    1. I en 15 ml konisk rør, kombinerer 25 ul av hver 100 mikrometer lager primer (opp til 192). Legg DNA suspensjon buffer til et totalt volum på 5000 pl.
      MERK:Konsentrasjonen av hver primer i denne blanding er 500 nM. Hver plate av sorterte cellene vil bruke 105,6 mL av denne primer mix å prime revers transkripsjon og bestemt mål forsterkning. Volumet av primerblandingen gitt her er nok til å gjøre 45 plater for å sortere. Det er lurt å lage et stort nok volum av primer blanding slik at det bare må gjøres en gang; skalere volumene etter behov.
    2. Bland godt ved virvling, dele inn i 110 ul porsjoner, og lagre delmengder ved -20 ° C.
  6. Fremstille analyse mikser, en for hvert primer-par, for bruk i mikrofluid chip-baserte qPCR.
    1. I hver brønn av en 96-brønners PCR-plate, kombiner 3,0 ul av 100 uM forover primer for et gitt gen, 3,0 ul av den tilsvarende 100 uM revers primer, 24,0 mL av DNA suspensjon buffer, og 30,0 ul av 2x assay lasting reagens .
    2. Vortex denne platen, spin for 10 sek ved 500 xg, og oppbevar ved -20 ° C.
  7. Lag to termiske sykkelprogram: RTSTA (revers transkripsjon og bestemt mål forsterkning, tabell 1) og EXOI (eksonuklease jeg behandling, tabell 2).

2. Behandling

  1. Plate i pattedyrceller på en vevskulturskål slik at de vil vokse til den ønskede sammenløpet på tidspunktet for behandlingen, avhengig av tilstanden til den eksperimentelle undersøkelsen. For eksempel presenteres i denne studien, platen 4 x 10 5 MCF-7 p53-Venus celler 18 pr 6 cm plate i RPMI med 10% føtalt bovint serum (FBS), 100 U / ml penicillin, 100 mg / ml streptomycin, og 250 ng / ml amfotericin B. Inkuber cellene for to dager ved 37 ° C med 5% CO 2 før de når 50% konfluens.
  2. Behandle cellene for å fastslå tilstanden av interesse, basert på eksperimentell studie. For eksempel presenteres i denne studien, inkuber MCF-7 p53-Venus-celler med 400 ng / ml neocarzinostatin i 3 timer, 8,5 timer, 14 timer eller 24 timer.

3. Lysis Buffer Klargjøring for Cell Sorting

MERK: Lage én enkelt plate av lysis buffer tar ca 1 time. Det er lurt å gjøre og sortere flere plater, som cellesortering kan være ineffektiv og gi mange brønner uten påvisbare celle.

  1. Rengjør benken, pipetter, tube rack, kalde PCR plate holdere og hansker med DNA dekontaminering løsning i forberedelse til PCR.
  2. Fortynn RNAse inhibitoren til 2,64 U / ul ved tilsetning av lager RNAse inhibitor til nuklease-fri vann i et 1,5 ml rør.
    MERK: Dette lar RNase inhibitor som skal legges til lysis buffer uten å pipettere sub-ul volumer.
  3. Gjøre lyseringsbuffer for cellene ved å kombinere komponentene som er angitt i tabell 3.
  4. Overfør 92,4 pl av lyseringsbuffer for cellene inn i et eget rør; Dette vil være den lyseringsbuffer for amplikonet standarder.
  5. Bruke low-binding pipettespisser og mikrosentrifugerør, forberede 200 mL og 500 mL av E. coli DNA fortynnet til 3,1 pg / mL og 6,2 pg / mL, henholdsvis med DNA suspensjon buffer.
  6. Legg 184,8 mL av 3,1 pg / pl E. coli-DNA til den lyseringsbuffer for cellene.
    MERK: E. coli bærer DNA tjener til å utvide omfanget av ikke-spesifikk primer bindingsmuligheter og derved redusere sannsynligheten for at primer-dimerisering vil føre til et PCR-produkt.
  7. Forbered standarder.
    1. Merk seks lav-bindende mikrosentrifugerør som 5e5, 5E4, ... 5e0.
    2. Legg 90 mL av DNA suspensjon buffer til "5e5" rør.
    3. Legg 90 mL av 6,2 pg / pl E. coli-DNA til hver av de andre fem rør. Hold alle rørene på is.
      MERK: Innlemming bærer-DNA inn i de standarder som gjør den totale masse av DNA i standard brønner sammenlignes med den i 1-cellen brønner; dette reduserer probability at konsentrasjonen av standarder vil bli påvirket av DNA-binding til rør eller pipettespisser.
    4. Ta en prøve av det "5e6" standard (5 x 10 6 molekyler / mikroliter av hver amplikon, fremstilt i trinn 1.4) fra lagring. Vortex kort og spinne en kort stund (5 s ved 500 x g) for å sikre at væsken er på bunnen av røret.
    5. Ved hjelp av en lav-bindende pipette, tilsett 10 mL av 5e6 standard til "5e5" tube. Vortex kort, spin (5 sek ved 500 xg), og legg røret tilbake på isen.
    6. Pipetter 10 ul fra "5e5" tube inn i "5E4" rør. Vortex kort, spin (5 sek ved 500 xg), og satt tilbake på isen.
    7. Gjenta disse serielle fortynninger, med hvert rør mottok 10 pl fra den foregående rør, før alle rørene har en fortynning på standard.
  8. Forbered en rad med 12 PCR rør med caps. Fordel 67 ul av "celle" lyseringsbuffer til hvert rør. Lukk rørene og spinne ned kort (femsek ved 500 x g), hvis nødvendig.
  9. Ved hjelp av en 12-kanals pipette, fordele 9 ul "celle" lyseringsbuffer fra rekken av PCR-rørene i hver brønn i de første 7 radene i en PCR-platen (figur 3).
  10. Fordel 7 ul av "standard" lyseringsbuffer til hver brønn av den siste raden av platen (figur 3).
  11. Ved hjelp av lav-bindende pipettespisser, tilsett 2 mL av standard til hver brønn av den nederste raden i henhold til kartet platen (figur 3).
    MERK: 2 ul 5 x 10 0 molekyler / ul standard utgjør 10 molekyler, etc.
  12. Tilsett 2 mL av 3,1 pg / mL E. coli DNA inn i 10-celle og 100-celle brønner; tilsett 2 mL av 6,2 pg / mL E. coli DNA inn i noen celle brønner.
    MERK: Hver 1-celle, 10-celle, og 100-celle har vel 6,2 pg av E. coli-DNA, som er tilnærmet massen av genomisk DNA i en enkelt menneskecelle. Hver standard og ikke-cell vel har 12,4 pg of E. coli DNA, ca to menneskelige celler verd.
  13. Tett plate ved hjelp av en steril termisk segl, spinn for 5 sek ved 500 xg, og oppbevar ved 4 ° C inntil cellene er klare for sortering.

4. Cell Sorter Setup

  1. Programmering av fluorescens-aktivert cellesorterer for å sortere inn i en 96-brønns plate i henhold til kartet platen (figur 3); ingen celler skal sorteres i brønner H1-H8 eller H11-H12.
  2. Kontroller at cellen sorter er godt rettet for sortering i en PCR-plate.
    1. Angi vinkelen av den typen strømmen til minst mulig; Denne innstillingen øker sjansen for at cellene skal sorteres i bunnen av brønnene i stedet treffer sidene.
    2. For å sikte maskinen, forsegle en tom PCR plate og bruke teststrømmen til "sorter" dråper av PBS på tetningen av den tomme tallerkenen, i henhold til instruksjonene fra maskinen 19; dråpene skulle lande på the overflate av tetningen ved en stilling over midten av brønnen. For de beste resultatene, verifisere sikte på tvers av lengden og bredden av platen.
    3. Hvis dråpene ikke lande i riktig posisjon, tørke dem av overflaten på sel, kalibrere cellen sorter etter maskinen produsentens instruksjoner, og gjenta til dråpene i sort strømmen er avsatt riktig.

5. Cell Harvest og sortering

  1. Trypsineres cellene som passer for cellelinje. For eksempel, for MCF-7 celler, aspirere mediet fra cellene, skylles cellene med 1 ml av 0,05% trypsin, og inkubere cellene med 2 ml av 0,05% trypsin i 5 min ved 37 ° C og 5% CO2 .
  2. Tilsett 8 ml cellekulturmedium til de trypsinert cellene og overføre alle 10 ml cellesuspensjon til et 15 ml rør. Sentrifuge i 4 minutter ved 400 x g.
  3. Aspirer supernatanten og cellepelleten suspenderes i PBS + 2% FBS. <br /> MERK: En mindre oppvirvling volum konsentrerer cellene og forenkler celle sortering; en 500 mL resuspensjon volum fungerer godt for en 6 cm rett av cellene ved 50% konfluens.
  4. Overfør cellesuspensjonen til en 5 ml flowcytometri rør, pipettering gjennom et 40 um filter for å fjerne klumper av celler.
  5. Sentrifuger plate av lyseringsbuffer ved 400 x g i 30 sekunder ved 4 ° C før sortering cellene for å sikre at væsken er på bunnen av brønnene.
  6. Før røret med cellesuspensjonen i cellen sorter. Åpne forseglingen på plate av lyseringsbuffer og nøye sortere celler av interesse inn i platen i henhold til kart platen og følge cellesorterer produsentens instruksjoner 19. For å sikre at enkeltceller er sortert på høyeste renhet, kjører maskinen i "enkelt celle" -modus og bruke standard flowcytometri gating basert på fremover og side scatter 19.
    MERK: Ieksempel eksperiment, gate cellene basert på p53-Venus fluorescens for å isolere den lyseste 15% av individuelle celler 11.
  7. Tett plate med en ny, steril termisk forsegling og sentrifuger ved 400 xg i 1 min ved 4 ° C. Sett platen i termosykler og kjør RTSTA programmet (se trinn 1.7).
    MERK: Dette utfører revers transkripsjon på mRNA fra de sorterte celler og forsterker deretter cDNA av transkripsjoner av interesse.

6. Eksonuklease Treatment

  1. Bland fortynnet eksonuklease I ved å blande komponentene angitt i tabell 4. Forbered en rad med 12 PCR rør med caps. Fordel 30,5 ul fortynnet eksonuklease I inn i hvert rør. Lukk rørene og spinne en kort stund (5 s ved 500 x g) for å sikre at væsken er på bunnen av røret.
  2. Når RTSTA er ferdig, spinne prøveplaten i 5 s ved 500 x g. Ved hjelp av en 12-kanals pipette, distribuere 3,6 ul fortynnet eksonukleaseI inn i hver brønn av platen.
  3. Tett plate med en steril termisk segl og spinn kort (5 sek ved 500 xg). Sett platen i termosykler og kjør EXOI programmet (se trinn 1.7).
    MERK: Dette trinnet forringer noen primere igjen etter bestemt mål forsterkning, slik at de ikke vil forstyrre fremtiden PCR.

7. Prøve fortynning

  1. Når eksonuklease behandlingen er ferdig, tilsett 32,4 pl TE-buffer til hver brønn av prøven plate; dette er en valgfri stoppunktet, og prøvene kan oppbevares ved -20 ° C i flere dager.

8. Sort Kvalitetskontroll hjelp qPCR

MERK: Fordi cellesortering er ikke helt effektiv, er dette trinnet nødvendig å identifisere hvilke brønner i den sorterte plate faktisk mottatt en celle. Disse prøver kan deretter brukes for videre analyse.

  1. Mål housekeeping genuttrykk i hver prøve ved qPCR.
  2. Forbered 900 mL av DNA-bindende fargestoff qPCR Master Mix for 96 reaksjoner i henhold til polymerase produsentens protokoll bruke primere for en av renhold gener valgt i trinn 1.1; de nøyaktige konsentrasjonene av reaksjonsbuffer, polymerase, primere, etc. for denne reaksjonen vil avhenge av den spesifikke polymerase som brukes.
  3. Fordel 9 mL av master-mix til hver brønn i en 96-brønns PCR plate. Tilsett 1 pl av prøven fra prøveplaten til den tilsvarende brønn i PCR-plate.
  4. Kjør plate på en real-time PCR maskinen ved hjelp av en termisk sykling protokoll foreslått av master mix produsenten eller etter en standard protokoll 20.
  • Analyser qPCR data 20; et eksempel på qPCR data fra sorterings kvalitetskontroll fremgangsmåten angitt nedenfor, er vist i figur 4.
    1. Kontroller at målingene fra de ikke-cellebrønner viser en lav (bakgrunn) nivåav genekspresjon eller ikke noe uttrykk i det hele tatt.
    2. Kontroller at målinger fra en celle brønner dele tydelig inn i to grupper: positive prøver med høy genekspresjon og negative prøver med bakgrunnsnivåer av uttrykk eller ingen uttrykk på alle, ligner på ingen celle brønner.
      MERK: Prøvene med høy genuttrykk representerer faktiske sorterte cellene; de med bakgrunn uttrykk bør utelukkes fra videre analyse.
    3. Kontroller at målinger fra de 10-celle og 100-cellebrønner reflektere høyere genekspresjon enn i de positive ett-celle brønner, noe som åpner for muligheten for at ineffektiv sortering kan føre til at disse brønnene for å ha færre celler enn ønskelig.
    4. Kontroller at målinger fra standardbrønner er jevnt fordelt i logaritmisk plass (dvs. at C-t-verdier som er jevnt fordelt).
  • Etter å identifisere alle positive en-celleprøver, lage en "Sample Mixes" plate kartet for å kartlegge positive ett-cell prøver på en ny 96-brønns plate. Inkluder åtte brønner for standarder på denne platen kartet. Se figur 5 for et eksempel.
  • 9. Gene Expression Måling hjelp microfluidic qPCR

    MERK: For hvert trinn i denne delen, til pipette bare til første stopp minimalisere dannelsen av bobler i reagenser.

    1. Åpne en rad med 8 PCR-rørene. Hvis det er flere plater av prøvene, åpne en andre rad med 8 PCR rør og merke rørene 1-8. Denne raden vil være for pooling standarder fra flere plater.
    2. I et 1,5 ml tube, bland 360 mL av DNA-bindende fargestoff qPCR mester blanding med 36 mL av DNA bindende fargestoff utvalg lasting reagens. Vortex kort og spinn i 10 sek ved 2000 x g. Fordel denne blandingen (396 pl) inn i den umerkede raden av 8 PCR-rørene, å plassere 48 ul i hvert rør.
    3. Ved hjelp av en 8-kanals pipette, distribuere 3,3 mL av master mix / utvalg lasting reagent blandingen i hver brønnav en ny 96-brønners PCR-plate. Merk denne platen, "Sample mikser."
    4. For hver PCR plate prøver:
      1. Vortex platen i 10 sekunder og sentrifugering i 10 sekunder ved 500 x g. Ta av dekselet og overføre 2,7 mL av hver positiv 1-celleprøve til den tilsvarende godt på prøveblandinger plate for en celle brønner som er angitt på kartet plate.
      2. Hvis det er bare en plate av sampler, å overføre 2,7 ul av hver forsterket standard til den tilsvarende brønn på prøveblandinger plate ifølge kart plate.
      3. Hvis det er flere plater av prøver, overføres 2,7 ul av hver forsterket standard til den tilsvarende stilling i den merkede raden av PCR-rørene. Legg standarder fra dagens plate av prøvene til noen standarder som allerede er der. Tett plate av prøvene når det gjøres ved hjelp av en forsegling film.
    5. Hvis det er flere plater av prøver:
      1. Vortex raden av PCR-rør som inneholder standarder for10 sek, og spinn i 10 sekunder ved 2000 x g. Overfør 2,7 mL fra hver tube med blandede standarder i den tilsvarende godt på prøveblandinger plate ifølge kartet platen.
    6. Last inn NTC brønner med 2,7 mL av nukleasefritt vann der det er angitt på kartet plate. Tett prøveblandinger plate og oppbevares ved 4 ° C inntil nødvendig.
    7. Fjern klistremerket i bunnen av en ny microfluidic qPCR chip. Ved hjelp av en sprøyte med kontrollinje væske med hetten fortsatt på, trykk ned hver akkumulator våren for å løsne den, og injisere hver akkumulator med 150-200 ul kontrollinje væske.
    8. Sett chip i lastemaskin og kjør "Prime" script. Dette tar ~ 20 min.
    9. Når priming er gjort, Vortex og spinne ned platene analyse mikser (utarbeidet i trinn 1.6) og prøveblandinger.
    10. Ved hjelp av en 8-kanal pipette, overføres 4,5 ul av hver analyseblanding inn i den venstre siden av den mikrofluid qPCR Brikke i samsvar med diagrammet i g> Figur 6. Pipette meget nøye for å unngå å skape luftbobler i bunnen av brønnene. Når du er ferdig, forsegle plate av analyse mikser og oppbevar ved -20 ° C for fremtidig bruk.
    11. Overfør 4,5 ul av hver prøve blanding til høyre side av mikrofluid qPCR Brikke i samsvar med figur 6. Sett chip inn i lastemaskin og kjør "Load Mix" script. Dette tar ~ 90 min.
    12. Slå på microfluidic real-time PCR maskin, starter datainnsamling programvare, og slå på lampen for å varme den opp. Dette tar ~ 20 min.
    13. Når Load Mix manuset er ferdig, må du kontrollere at det ikke er noen linjer på tvers av chip-dette skulle tilsi en laste problem. Fjern forsiktig eventuelle støvpartikler fra brikken bruker Scotch tape eller lab tape. Sett chip inn i mikrofluid real-time PCR maskin og kjøre datainnsamling script. Bruk analyseprogramvare for å inspisere resultatene og eksportere data for videre analyse.
    _title "> 10. Data Analysis

    1. Fjern målingene som de qPCR forsterkning kurvene viser dårlig kvalitet (dvs. der kurvene ikke ligner standard sigmoidal amplifikasjonskurve) 20.
    2. Fjerne prøver med mer enn 30 dårlig kvalitet eller null-målinger, eller hvor det rengjøring genekspresjon (se trinn 1.1) er mye lavere enn de fleste andre prøver (figur 7).
    3. For hvert gen, beregne den korrekte smeltetopp sted som medianen av smelte peak steder fra hver prøve. Dersom en måling har en smelte topp ligger mer enn 1 ° C fra medianen, fjerne den målingen fra hensynet 20.
    4. For hvert gen, lage en standardkurve for å estimere mRNA teller i hver prøve å bruke et regneark eller skriptspråk 20.
      MERK: Standardene i dette eksperimentet består av 10, 100, 1000, eller 10.000 molekylerav dsDNA tilsvarer hver transkripsjon av interesse. Hvis revers transkripsjon var helt effektiv, ville de standarder som samsvarer med 20, 200, 2000 og 20.000 molekyler av mRNA, ettersom mRNA og cDNA er enkelt-trådet. I praksis er dette ikke tilfelle, så vi uttrykke målinger som et anslag i enheter av molekyler x E RT, hvor E RT er effektiviteten av revers transkripsjon.
      1. For hver standard brønn, identifisere m, antall molekyler av ssDNA (det dobbelte av antall molekyler av dsDNA) før amplifikasjon (for eksempel, 20 molekyler, 200 molekyler, etc.).
      2. For hver standard godt, identifisere C t verdi fra qPCR 20.
      3. Med verdiene for m og C t, utføre en lineær regresjon ved bruk av følgende ligning for å generere en standardkurve med parametrene a og b for hvert gen, og finner R2 verdi som enn indikator på egnethets:
        ligning 1
      4. Fra standardkurven, er å beregne det PCR effektiviteten E for hvert gen:
        ligning 2
        MERK: En verdi på E mye større enn 1,0 (f.eks E> 1,1) er ikke fysisk realistisk; en R 2 verdi for den lineære regresjon mye mindre enn 1,0 (f.eks R2 <0,985) betyr at standardene ikke arbeider pålitelig. Disse problemene vanligvis indikerer at den laveste amplicon standard faller under en grense for pålitelige, og dermed den laveste standard bør utelukkes fra den lineære regresjon. Hvis en tilstrekkelig lineær regresjon kan ikke fremstilles ved anvendelse av minst tre unike standarder, forkaste målinger for ekspresjon av genet.
      5. Dersom den lineære regresjon er tilstrekkelig, brukes den resulterende fit parametrene a og b </ em> for hvert gen for å anslå antallet av mRNA molekyler m est (i enheter av molekyler x E RT) for det tilsvarende gen i hver enkelt celleprøve fra den målte C t-verdi:
        ligning 3
      6. Utpeke noen måling m est <1 som m est = 0. Også utpeke en måling uten forsterkning i qPCR og dermed ingen C t verdi som m est = 0.
        MERK: Målinger med en m est mindre enn den laveste eller større enn den høyeste standarden som brukes i regresjonen er funnet ved ekstrapolering fra standardkurven. Disse anslagene er ikke nødvendigvis ugyldige, men bør betraktes med forsiktighet.
    5. Visualiser encellede genuttrykk data.
      1. Lag en beeswarm plot (Dorn, J. og hellige, T., 2012, http://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange / 37105), hvor hvert punkt representerer genekspresjon i en bestemt celle; et eksempel er vist i figur 8.
      2. Foreta en fiolin plot (Dorn, J., 2012, http://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/23661), hvor bredden på "fiolin" representerer frekvensen av genekspresjon målinger rundt et bestemt nivå i populasjon av celler som ble analysert; et eksempel er vist i figur 8.
        MERK: Mer avanserte analyser kan undersøke forholdene i uttrykk mellom par av gener 21, 22 og kan antyde genekspresjon nettverk.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

    En generell oversikt av protokollen er vist i figur 1, omfattende trinnene for cellebehandling, isolering av enkle celler ved FACS, generering og pre-amplifikasjon av cDNA-bibliotek fra enkelt-cellelysater, bekreftelse av enkelt-celle cDNA bibliotek i sorterte brønner, og måling av genekspresjon av qPCR.

    I forberedelse for enkeltcelleisolering og genekspresjon analyse, er det nødvendig først å identifisere gyldige oligonukleotid primerpar for hvert mål gen av interesse. Figur 2 viser to eksempler på primer kvalitetskontroll metoder. Smelte kurver er generert etter qPCR med primerpar som testes. Gyldige primere resulterer i en smeltekurve med en enkelt topp (figur 2A, grønn kurve). Hvis flere topper (Figur 2A, blå kurve) eller en kurve med en markert skulder (Figure 2A, rød kurve) er tilstede, indikerer dette nærvær av flere PCR-produkter, og primerne skal redesignet. Som en annen kvalitetskontroll metoden, kan agarosegel-elektroforese brukes til visuelt å bekrefte at et enkelt bånd med korrekt størrelse er til stede for hvert primerpar testet (figur 2B). Multiple bånd eller bånd av feil størrelse indikerer at primerne ikke er gyldige (figur 2B).

    Følgende primer validering og generering av biblioteker av qPCR standarder fra de riktige amplikonene, kan cellesortering utføres. Et eksempel sortering ordningen er vist i figur 3. Hver sortert Platen skal omfatte brønner inneholdende en fortynningsserie av amplikon standarder, med 10, 100, 1000, eller 10.000 kopier av hvert mål-amplikon. Det anbefales også å omfatte brønner i hvilke ingen celler, 10 celler eller 100 celler sorteres, i tillegg til de encellede brønner.På grunn av ineffektiviteten sortering, er det ofte nødvendig å identifisere brønnene i platen i enkeltceller som har med hell blitt avsatt. For dette valideringstrinnet, ved å følge prosedyren for revers transkripsjon og amplifikasjon bestemt mål, bør qPCR utføres for å måle ekspresjonen av et husholdningsgenet (figur 4). Brønnene for amplicon standarder (figur 4, sorte kurver) bør vise jevnt fordelt forsterkning kurver. Det bør også være klart skille i svingene som svarer til "no-celle" brønner (figur 4; røde kurver), "10-cell" brønner (figur 4; blå kurver), og "100-celle" brønner (figur 4 ; lilla kurvene). Et klart skille bør også skje for "en-celle" brønner tilsvarer vellykket celle nedfall (figur 4; grønne forsterkning kurver med C t-verdier mindre enn for de ikke-celle kontroller, men greater enn de for 10-cellekontroller) versus mislykket celle nedfall (figur 4; grønne kurver med C t-verdier nær de for no-cellekontroller). Når brønner med et enkelt cellelysat har blitt identifisert, kan cDNA fra brønnene (eventuelt fra flere plater) bli overført til et mikrofluid qPCR brikke, med en enkelt-celle-lysat per brønn. For eksempel, Figur 5 viser en hypotetisk matrise som kombinerer cDNA fra enkle celler fra tre forskjellige sortert 96-brønners plater i en enkelt ny plate for qPCR-analyse.

    For å analysere microfluidic qPCR resultatene, bør prøvene som sannsynligvis ikke har fått en celle først fjernes, som indikert av mange mangler eller null genuttrykk målinger (Figur 7, rader angitt med piler) eller uvanlig lav rengjøring genuttrykk. For hver analyse, målinger med smelte topper som ikke stemmer overens med other prøver i samme analysen bør også fjernes. Etter fjerning dårlige prøver og målinger, kan lineær regresjon utføres på målingene svarer til amplikonet standarder for å estimere absolutte telling av hvert transkript av interesse i hver enkelt-celle prøven. Figur 8 viser en visualisering av disse genuttrykk estimater, målt i enheter av molekyler × revers transkripsjon effektivitet, som beeswarm og fiolin plott. I dette eksempel ubehandlede celler viser et bredt spekter av CDKN1A ekspresjonsnivåer, med mange celler som ikke uttrykker CDKN1A i det hele tatt, og med andre uttrykker genet ved nivåer som strekker seg over to størrelsesordener. Etter behandling med neocarzinostatin (NCS) i 3 timer, de fleste cellene uttrykker CDKN1A ved mye høyere nivåer, og den variasjon synker til omtrent én størrelsesorden. Som varigheten av behandling øker, det gjennomsnittlige nivået på CDKN1A uttrykk minker og variasjonen i uttrykk utvides.

    Figur 1
    Figur 1: Oversikt over trinnene i encellede genuttrykk profilering. Behandlede celler blir høstet og sorteres via FACS direkte inn i lyseringsbuffer. mRNA-arter av interesse er revers-transkribert, og det resulterende cDNA amplifisert ved PCR. Rengjøring genekspresjon i hver prøve blir målt ved qPCR for å bestemme hvilke prøver faktisk mottatt en celle. I prøver passerer dette kvalitetskontrolltest, er det uttrykk for opp til 96 gener måles ved hjelp av mikrofluid qPCR. Dette tallet har blitt forandret fra en tidligere publikasjon 11. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

    19 / 55219fig2.jpg "/>
    Figur 2: Eksempel resultatene av primer testing. (A) Smelt kurver fra qPCR. Den blå kurven smelte (TNFRSF10D) har flere topper, og den røde smeltekurven (TRIM22) har en "skulder", som utgjør en andre topp i nærheten av den første topp. Dette tyder på at primerne som brukes i disse reaksjonene forsterke flere mål og trenger å bli redesignet. Den grønne smelte kurve (SCN3B) har en enkelt topp, i samsvar med primere som amplifiserer et enkelt mål. (B) amplifisert DNA kjørt på en agarose gel. Banene for SCN3B, TRIM22, og TRPM2 inneholde flere band; primere som brukes til å gjøre disse DNA amplikonene forsterke flere mål og må redesignet. Kjørefelt for TNFRSF10D har et enkelt band, i samsvar med primere som forsterker et enkelt mål. Det er verdt å merke seg at primere for SCN3B passere smeltekurve test, men mislykkes gelen test, mens de for TNFRSF10D bestå gel test, men mislykkes smeltekurvetest; disse to metodene for primer validering er komplementære. I dette eksempel kan man konkludere med at alle fire primersettene trenger å bli redesignet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

    Figur 3
    Figur 3: Plate kartet for cellesortering. Denne platen kartet inneholder en celle brønner (rød), 10- og 100-celle brønner (mørkere rød), standarder (grønn), og ingen-celle brønner (hvit). Inkludert to replikater av hver standard på hver plate hjelper til med å kompensere for variasjon i standarder. Inkludert 10-celle og 100-celle brønner er nyttig som en helsesjekk for genekspresjon. De ikke-celle brønner tjene som en negativ kontroll. Klikk her for å se en større versjon av thans skikkelse.

    Figur 4
    Figur 4: Eksempel på qPCR forsterkningskurver fra slags kvalitetskontroll måle GAPDH uttrykk. Ingen-celleprøver (rød) viser en bakgrunnsnivået av uttrykk. 1-celleprøver (grønn) deler seg opp i to adskilte grupper, ett med høy ekspresjon og en med lav uttrykk lik den ikke-celleprøver. Den høye uttrykk prøver mest sannsynlig fått en real celle under sortering; low-uttrykk prøver mest sannsynlig ikke. 10-cellers (blå) og 100-cellers (lilla) prøvene viser høyere uttrykk enn en-celleprøver; 10-celleprøver er nær de høyeste uttrykker en-celleprøver på grunn av sortering ineffektivitet. Standards (svart) er jevnt fordelt, som forventet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet. </ P>

    Figur 5
    Figur 5: Eksempel på prøveblandinger plate kartet. Denne platen kartet inneholder en celleprøver fra tre forskjellige plater (rader AG), standarder blandet fra alle tre plater (H1-H8), kontroller no-celle (H9-H10), og ingen mal kontroller for qPCR (H11-H12 ). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

    Figur 6
    Figur 6: Diagram av mikrofluid qPCR brikke med rekkefølgen av laste (1, 2, 3 ...). Hakket (A1) er øverste venstre hjørne av platen. Klikk her for å se en større versjon av this figuren.

    Figur 7
    Figur 7: Heat kart over qPCR resultatene. Hver rad representerer en 1-celleprøve, standard eller kontroll; hver kolonne representerer en målt transkripsjon. Rader med et uvanlig antall svarte firkanter eller Xs (piler) sannsynlig indikerer prøver som ikke får en faktisk celle. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

    Figur 8
    Figur 8: Beeswarm og fiolin plott. I en beeswarm plot (blå punkter), representerer hvert punkt genuttrykk i en bestemt celle. I en fiolin plot (grå form), bredden av "fiolin" representerer frekvensen av genekspresjon målerements rundt et bestemt nivå i en populasjon av celler som ble analysert. Lyseblå barer representerer lavest standard. Målinger over de blå søylene interpoleres mellom standardene, mens målingene i de blå søylene er ekstrapolert. Dataene som vises her er målinger av CDKN1A uttrykk i MCF-7 celler som uttrykker Venus-merket p53 behandlet med neocarzinostatin (NCS) i de angitte tidsrom for å indusere DNA dobbel-strand pauser. Dette tallet har blitt forandret fra forrige publisering 11. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

    Betingelse Temperatur Tid
    Holde 50 ° C 15 min
    Holde 95 ° C 2 min
    20 sykluser 95 ° C 15 sek
    60 ° C 4 min
    Holde 4 ° C

    Tabell 1: Revers transkripsjon og bestemt mål forsterkning (RTSTA) termisk sykling program.

    Betingelse Temperatur Tid
    Holde 37 ° C 30 min
    Holde 80 ° C 15 min
    Holde 4 ° C

    Tabell 2: Exonuklease I behandlingen (EXOI) termisk sykling program.

    Komponent Volum / brønn (il) 96 volumer m / 10% overskudd (pl)
    2x reaksjonsblanding 5,00 528,00
    Revers transkriptase / polymerase mix 0,20 21.12
    10x STA Primer Mix 1.00 105,60
    2,64 U / mL (fortynnet) RNase inhibitor 0,02 2,00
    Nukleasefritt vann 0,78 82,48
    Total 7,00 739,20

    Tabell 3: Komponenter av lyseringsbuffer for cellene.

    Komponent Volum / brønn (il) 96 volumer m / 10% overskudd (pl)
    Nukleasefritt vann 2,52 266,00
    Exonuklease I Reaksjonsbuffer (10x) 0,36 38.00
    Eksonuklease I (20 U / mL) 0,72 76.00
    Total 3,60 380.00

    Tabell 4: Komponenter av eksonuklease blande for å behandle de amplifiserte cDNA-prøvene.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

    Vi har presentert en metode for isolering av de enkelte pattedyrceller fra en populasjon av adherente celler dyrket i kultur, og for analysering av ekspresjon av ca. 96 gener i hver celle. God forhånd forberedelser er avgjørende for denne metoden til å fungere godt. Spesielt design og testing primerpar spesifikke transkripsjoner av interesse (trinn 1,2-1,3) er tidkrevende, men viktige skritt, som primere bestemme kvaliteten på encellede målinger. Når pålitelige primerpar er oppnådd, blir de brukt til å forsterke cDNA fra transkripsjoner av interesse; de amplikonene blir deretter satt sammen i ekvimolare mengder for å lage standarder (trinn 1.4). Dette trinnet er kritisk, da de standarder som er nødvendig for å beregne de absolutte tellinger transkripsjon; standarder bør gjøres en gang, porsjonert, og brukes for alle påfølgende runder av celle sortering og genuttrykk målinger. Likeledes, den dagen at cellene er sortert, er det spesielt important å fortynne standardene nøye ved hjelp av lav-bindende pipettespisser og mikrosentrifugerør når du gjør plater av lysis buffer (trinn 3.7 og 3.11). Sikter cellen sorter (trinn 4.2) er et annet kritisk punkt; Dette må gjøres meget omhyggelig for at cellene å kunne treffe målet av 9 ul lyseringsbuffer i en PCR-plate.

    Det er flere endringer i protokoll som kan gjøres for å tilpasse det til en rekke forskningsbehov. Her fokuserte vi på en DNA-bindende fargestoffbasert qPCR tilnærming, som gir en relativt rimelig metode for å kvantifisere genuttrykk. Imidlertid har denne fremgangsmåte den potensial for å skape et høyt bakgrunnssignal, siden enhver amplifisert DNA, også den av off-target-sekvenser, resulterer i et fluorescerende signal. En slik bakgrunn kan minimeres ved å sikre at den primerpar anvendt for å amplifisere en spesifikk mål gir en smeltekurve med en enkelt topp, og et enkelt PCR-produkt med korrekt størrelse (Figur 2). Hvis bakgrunnen er fortsatt en bekymring etter bruk av slike kvalitets-kontroll metoder, kan en sonde-baserte qPCR tilnærming brukes til å redusere off-target deteksjon, om enn på en større kostnad av reagenser. Et annet alternativ ville være et nestet PCR-metode, hvor ett sett av primere anvendes i RTSTA trinn til revers transkribering og forsterke et stort område av transkriptet og et andre sett av primere, som forsterker en mindre region inneholdt i det store området , brukes til å måle genekspresjon ved qPCR. Denne metoden har vist seg å forbedre spesifisiteten av DNA-bindende fargestoffbasert qPCR 23.

    Flere metoder er tilgjengelige for å isolere enkeltceller for genekspresjonsanalyse. Valget av celleisolasjon metode avhenger av flere faktorer, inkludert tilgjengeligheten av utstyr (for eksempel en fluorescens-aktivert cellesorterer), kilden til cellene som skal evalueres (for eksempel etablerte cellelinjer versus primære celler fra et vev), ellerhastigheten med hvilken cellene må isoleres. I det eksempel som presentert i denne protokollen, brukte vi FACS av en cellelinje som uttrykker en klart påvisbar fluorescens-merket protein. FACS har fordeler av sjeldne celle deteksjon og relativt rask celle isolasjon. En utfordring med denne metode er at avsetning av cellene av interesse inn i den nødvendige lille volumet av lyseringsbuffer i en 96-brønners PCR-plate kan være ineffektivt og kan kreve optimalisering av det cellesortering geometrien for å sikre en vellykket isolasjon. Alternative tilnærminger som kan føre til større presisjon i celle isolasjon ved lavere hastigheter og / eller høyere kostnader inkluderer micropipetting av individuelle celler, laser capture mikrodisseksjon av spesifikke celler fra en svulst prøve, eller bruk av microfluidic systemer (f.eks Fluidigm C1 system).

    En stor fordel med protokollen som er beskrevet her er at den interne kontroller, en fortynningsrekke av rensede PCR amplikonene, e nable estimering av det absolutte antall av hver karakterutskrift i hver celle. Uten disse standardene, kan kun relative nivåer av genekspresjon oppnås basert på beregninger som stammer fra C-t-verdier. Men med disse standardene, absolutte transkripsjons tellinger kan anslås, ideelt sett ved interpolasjon innenfor området på nøyaktig kvantifiserte amplikon standarder (figur 8). Som med en hvilken som helst PCR-basert metode for genekspresjon kvantifisering, krever nøyaktig kunnskap absolutt kvantifisering av effektiviteten av hver enkelt prosess, inkludert revers transkripsjon.

    En nåværende utfordring å kvantifisere transkripsjonsnivåer i enkeltceller er at deteksjonsgrensen for mange metoder er beregnet til 10-100 mRNA per celle 24, hindrer pålitelig kvantifisering av en betydelig andel av transcriptome. Som en alternativ fremgangsmåte kan man bruke smRNA FISH å kvantifisere mål av særlig interesseass = "xref"> 25, 26, inkludert de med svært få vitnemål. Fremskritt i smRNA FISH har utvidet antall distinkte transkripter som kan oppdages med en gang 27 og antall celler som kan bli profilert på en gang 28, gitt passende utstyr. Selv smRNA FISH har sine egne begrensninger (potensielle falske positive og falske negative karakter deteksjon, restriksjoner til bare noen få målgener per celle, kostnaden av utstyr og reagenser), kan det gi en kraftig metode for å utfylle og validere resultatene fra en qPCR-basert analyse av en undergruppe av målgener av interesse.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Acknowledgments

    Vi vil gjerne takke V. Kapoor i CCR ETIB flowcytometrisystemer Kjerne for hennes hjelp i å utføre cellesortering under utviklingen av denne protokollen. Vi takker også M. Raffeld og CCR LP Molecular Diagnostics Unit og J. Zhu og NHLBI DNA sekvensering og genomKjerne for deres hjelp i å utføre qPCR under utviklingen av denne protokollen. Denne forskningen ble støttet av egenutført Program for NIH.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    RNeasy Plus Mini Kit Qiagen 74134
    High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit with RNase Inhibitor ThermoFisher 4374966
    Phusion High-Fidelity DNA Polymerase New England BioLabs M0530S
    QIAquick Gel Extraction Kit Qiagen 28704
    Quant-iT High-Sensitivity dsDNA Assay Kit ThermoFisher Q33120 
    2.0 ml low adhesion microcentrifuge tubes USA Scientific 1420-2600
    DNA Suspension Buffer Teknova T0221
    Axygen 0.2 ml Maxymum Recovery Thin Wall PCR Tubes Corning PCR-02-L-C
    GE 96.96 Dynamic Array DNA Binding Dye Sample & Assay Loading Reagent Kit Fluidigm 100-3415
    HyClone RPMI 1640 media GE Healthcare Life Sciences SH30027.01
    Fetal Bovine Serum, Certified (US) ThermoFisher 16000-044
    Antibiotic-Antimycotic Solution Corning 30-004-CI
    Neocarzinostatin Sigma N9162
    ELIMINase Decon Labs 1101
    SUPERase-In ThermoFisher AM2696
    CellsDirect One-Step qRT-PCR Kit ThermoFisher 11753500
    E. coli DNA Affymetrix 14380 10 MG
    ThermalSeal Sealing Film, Sterile Excel Scientific STR-THER-PLT
    BD FACSAria IIu BD Biosciences
    HyClone Trypsin 0.05% GE Healthcare Life Sciences SH30236.01
    PBS, 1x Corning 21-040-CV
    Falcon 40 µm Cell Strainer Corning 352340
    Exonuclease I New England BioLabs M0293S
    SsoFast EvaGreen Supermix with Low ROX Bio-Rad 172-5210
    96.96 Dynamic Array IFC for Gene Expression (microfluidic qPCR chip) Fluidigm BMK-M-96.96
    IFC Controller HX (loading machine) Fluidigm
    BioMark or BioMark HD (microfluidic qPCR machine) Fluidigm
    Real-Time PCR Analysis software  Fluidigm
    MATLAB software MathWorks

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Feinerman, O., Veiga, J., Dorfman, J. R., Germain, R. N., Altan-Bonnet, G. Variability and Robustness in T Cell Activation from Regulated Heterogeneity in Protein Levels. Science. 321, (5892), 1081-1084 (2008).
    2. Spencer, S. L., Gaudet, S., Albeck, J. G., Burke, J. M., Sorger, P. K. Non-genetic origins of cell-to-cell variability in TRAIL-induced apoptosis. Nature. 459, (7245), 428-432 (2009).
    3. Geva-Zatorsky, N., Rosenfeld, N., et al. Oscillations and variability in the p53 system. Mol. Syst. Biol. 2, (1), (2006).
    4. Colman-Lerner, A., Gordon, A., et al. Regulated cell-to-cell variation in a cell-fate decision system. Nature. 437, (7059), 699-706 (2005).
    5. Chong, S., Chen, C., Ge, H., Xie, X. S. Mechanism of Transcriptional Bursting in Bacteria. Cell. 158, (2), 314-326 (2014).
    6. Raj, A., Peskin, C. S., Tranchina, D., Vargas, D. Y., Tyagi, S. Stochastic mRNA Synthesis in Mammalian Cells. PLoS Biol. 4, (10), e309+ (2006).
    7. Senecal, A., Munsky, B., et al. Transcription Factors Modulate c-Fos Transcriptional Bursts. Cell Rep. 8, (1), 75-83 (2014).
    8. Dey, S. S., Foley, J. E., Limsirichai, P., Schaffer, D. V., Arkin, A. P. Orthogonal control of expression mean and variance by epigenetic features at different genomic loci. Mol. Syst. Biol. 11, (5), 806+ (2015).
    9. Dar, R. D., Razooky, B. S., et al. Transcriptional burst frequency and burst size are equally modulated across the human genome. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, (43), 17454-17459 (2012).
    10. Thattai, M., van Oudenaarden, A. Stochastic gene expression in fluctuating environments. Genetics. 167, (1), 523-530 (2004).
    11. Porter, J. R., Fisher, B. E., Batchelor, E. p53 Pulses Diversify Target Gene Expression Dynamics in an mRNA Half-Life-Dependent Manner and Delineate Co-regulated Target Gene Subnetworks. Cell Syst. 2, (4), 272-282 (2016).
    12. Lahav, G., Rosenfeld, N., et al. Dynamics of the p53-Mdm2 feedback loop in individual cells. Nat. Genet. 36, (2), 147-150 (2004).
    13. Levine, A. J., Oren, M. The first 30 years of p53: growing ever more complex. Nat. Rev. Cancer. 9, (10), 749-758 (2009).
    14. Riley, T., Sontag, E., Chen, P., Levine, A. Transcriptional control of human p53-regulated genes. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9, (5), 402-412 (2008).
    15. Ye, J., Coulouris, G., Zaretskaya, I., Cutcutache, I., Rozen, S., Madden, T. L. Primer-BLAST: A tool to design target-specific primers for polymerase chain reaction. BMC Bioinf. 13, (1), 134 (2012).
    16. PCR Technologies: A Technical Guide. Sigma-Aldrich. St. Louis, MO. (2014).
    17. Sambrook, J., Russell, D. W. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2001).
    18. Batchelor, E., Mock, C. S., Bhan, I., Loewer, A., Lahav, G. Recurrent initiation: a mechanism for triggering p53 pulses in response to DNA damage. Mol. Cell. 30, (3), 277-289 (2008).
    19. Flow Cytometry: Principles and Applications. Humana Press. Totowa, NJ. (2007).
    20. Real-time PCR. Taylor & Francis. (2006).
    21. Song, L., Langfelder, P., Horvath, S. Comparison of co-expression measures: mutual information, correlation, and model based indices. BMC Bioinf. 13, (1), 328 (2012).
    22. Margolin, A. A., Nemenman, I., et al. ARACNE: An Algorithm for the Reconstruction of Gene Regulatory Networks in a Mammalian Cellular Context. BMC Bioinf. 7, (Suppl 1), (2006).
    23. Haff, L. A. Improved quantitative PCR using nested primers. PCR Methods Appl. 3, (6), 332-337 (1994).
    24. Hashimshony, T., Senderovich, N., et al. CEL-Seq2: sensitive highly-multiplexed single-cell RNA-Seq. Genome Biol. 17, 77 (2016).
    25. Ronander, E., Bengtsson, D. C., Joergensen, L., Jensen, A. T. R., Arnot, D. E. Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization (FISH). J. Vis. Exp. (68), e4073 (2012).
    26. Raj, A., van den Bogaard, P., Rifkin, S. A., van Oudenaarden, A., Tyagi, S. Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes. Nat. Methods. 5, (10), 877-879 (2008).
    27. Lubeck, E., Cai, L. Single-cell systems biology by super-resolution imaging and combinatorial labeling. Nat. Methods. 9, (7), 743-748 (2012).
    28. Battich, N., Stoeger, T., Pelkmans, L. Image-based transcriptomics in thousands of single human cells at single-molecule resolution. Nat. Methods. 10, (11), 1127-1133 (2013).
    Encellede Gene Expression Profilering hjelp FACS og qPCR med interne standarder
    Play Video
    PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

    Cite this Article

    Porter, J. R., Telford, W. G., Batchelor, E. Single-cell Gene Expression Profiling Using FACS and qPCR with Internal Standards. J. Vis. Exp. (120), e55219, doi:10.3791/55219 (2017).More

    Porter, J. R., Telford, W. G., Batchelor, E. Single-cell Gene Expression Profiling Using FACS and qPCR with Internal Standards. J. Vis. Exp. (120), e55219, doi:10.3791/55219 (2017).

    Less
    Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
    View Video

    Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

    Waiting X
    Simple Hit Counter